Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kortlægning af pattedyrs 3D-genominteraktioner med Micro-C-XL

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/64579
Automatic Translation
1, 1, 1
1Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, University of Copenhagen

Summary

En protokol til kortlægning af den tredimensionelle genomorganisation med nukleosomopløsning ved hjælp af den genom-dækkende kromosomkonformationsfangstmetode Micro-C-XL præsenteres her.

Abstract

Tredimensionel (3D) kromosomorganisation er en vigtig faktor i genomregulering og celletypespecifikation. For eksempel menes cis-regulerende elementer, kendt som forstærkere, at regulere aktiviteten af distale promotorer via interaktion i 3D-rum. Genom-wide chromosome conformation capture (3C)-teknologier, såsom Hi-C, har ændret vores forståelse af, hvordan genomer er organiseret i celler. Den nuværende forståelse af 3D-genomorganisation er begrænset af den opløsning, hvormed den topologiske organisering af kromosomer i 3D-rummet kan løses. Micro-C-XL måler kromosomfoldning med opløsning på niveauet af nukleosomet, den grundlæggende enhed af kromatin, ved at anvende mikrokoknuklease (MNase) til at fragmentere genomer under kromosomkonformationsoptagelsesprotokollen. Dette resulterer i et forbedret signal-støj-forhold i målingerne, hvilket letter bedre detektion af isoleringssteder og kromosomsløjfer sammenlignet med andre genomdækkende 3D-teknologier. En visuelt understøttet, detaljeret, trinvis protokol til fremstilling af Micro-C-XL-prøver af høj kvalitet fra pattedyrceller præsenteres i denne artikel.

Introduction

Micro-C-XL er en genom-dækkende teknik til måling af 3D-genomkonformation med nukleosomopløsning. Micro-C-XL bygger på den udbredte nærhedsligationsbaserede Hi-C-teknologi, som har transformeret vores forståelse af, hvordan 3D-genomer er organiseret1. Micro-C-XL og dets første iteration, Micro-C, blev oprindeligt udviklet i Saccharomyces cerevisiae2,3 og senere tilpasset pattedyrs cellesystemer, for hvilke protokollen har vist sit fulde potentiale til at detektere kortrækkende træk ved 3D-genomet, såsom kromosomsløjfer og isoleringssteder. Denne version er baseret på nyere Micro-C-XL-publikationerfra pattedyr 4,5. Da Micro-C-XL erstatter Micro-C, omtales Micro-C-XL fremover som Micro-C i manuskriptet.

De største forskelle mellem Micro-C og Hi-C6 er som følger: 1) genomfragmentering med mikrokoknuklease (MNase) sammenlignet med restriktionsenzymer og 2) yderligere tværbindinger med større atomafstand mellem de reaktive grupper sammenlignet med kun formaldehyd. Begge trin bidrager væsentligt til det forbedrede signal-støj-forhold for Micro-C sammenlignet med konventionel Hi-C. Fragmenteringsstørrelsen begrænser den opløsning, som 3D-genomorganisationen kan løses til under nærhedsligeringsprotokollen. MNase er en nuklease, der fortrinsvis fordøjer tilgængeligt DNA og efterlader nukleosomalt beskyttet DNA intakt. Nukleosomfodaftryk ved hjælp af MNase-sekventering har vist, at nukleosomer fuldt ud dækker de fleste eukaryote genomer7. Da nukleosomer fordeles i hele genomet med en gennemsnitlig afstand på 160-220 bp, afhængigt af art og celletype, er MNase det ideelle enzym til kortlægning af genomarkitekturen i høj opløsning.

Anvendelsen af en yderligere tværbinding i kombination med formaldehyd (FA) i Micro-C-metoden forbedrer yderligere signal-støj-forholdet 2,8. Aminspecifikke tværbindinger med længere atomafstandsstykker mellem de reaktive grupper letter protein-protein-tværbindinger. Disse er typisk disuccinimidylglutarat (DSG) eller ethylenglycol bis-succinimidylsuccinat (EGS) med henholdsvis 7,7 Å og 16,1 Å afstandsstykker. Reduktionen af støj gennem EGS eller DSG er særlig tydelig i eksperimenter med høje fragmenteringshastigheder, såsom Micro-C, og forekommer formodentlig på grund af en reduktion i hastigheden af tilfældige ligeringshændelser8.

En nyligt udviklet Hi-C 3.0-protokol, der anvender ESG/DSG-tværbinding og flere kombinationer af restriktionsenzymer, reducerer støj i Hi-C-eksperimenter og forbedrer signifikant påvisningen af kromosomsløjfer og isoleringssteder 8,9. Alligevel fandt en sammenligning sted for sted af forskellige interaktionsdatafunktioner, at Micro-C havde overlegen detektion af kortrækkende funktioner, såsom kromosomsløjfer og isoleringssteder, sammenlignet med både Hi-C 3.0 og konventionel Hi-C8. Hi-C 3.0 forbedrer imidlertid detektionen af kortrækkende funktioner og opretholder stærk detektion af genomopdeling sammenlignet med konventionel Hi-C. Sammenfattende bør valget af en kromosomkonformationsfangstmetode bestemmes af det objektive og biologiske spørgsmål.

Her leverer vi en trin-for-trin protokol til vellykkede Micro-C-eksperimenter, der kan optrævle 3D-genomorganisation.

Protocol

1. Cellekultur og tværbinding

  1. Kulturceller i henhold til de eksperimentelle behov for at opnå mindst 1 x 107 celler. Her blev cellerne dyrket ved 37 °C med 5% CO2 i E14-medium (DMEM med pyruvat og L-glutamin, 15% FBS, 1x LIF, 1x NEAA, 1% pen-strep, 0,1 mM β-mercaptoethanol [se materialetabel]) og passeret hver anden dag.
    BEMÆRK: Denne protokol er blevet anvendt med succes på forskellige celletyper fra flere arter, såsom Homo sapiens og Mus musculus. I dette eksempel blev museembryonale stamceller (ES) brugt.
  2. Høst cellerne ved 70% -80% sammenløb ved at aspirere mediet. Vask en gang med 5 ml DPBS, og inkuber cellerne med 3 ml forvarmet 0,25% trypsin pr. 10 cm skål i 2-3 minutter ved 37 °C.
  3. Sluk trypsinet med 7 ml forvarmet E14-medium og overfør de løsrevne celler til et 50 ml rør.
  4. Ppellet cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i mediet. Tæl cellerne med en celletæller.
    BEMÆRK Protokollen er robust over for en vis variation i cellekoncentrationer, og forskellige celletællere er blevet brugt til at kvantificere celletallene; Vær dog opmærksom på det dynamiske område for den anvendte celletæller. Dette er typisk mellem 1 x 105-1 x 107 celler / ml. Mens centrifugeringshastigheden og varigheden er blevet testet for denne celletype, kan forskellige, mindre celler kræve en højere centrifugeringshastighed eller længere centrifugeringstider, og centrifugeringen bør justeres i overensstemmelse hermed.
  5. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved RT og resuspenderes cellerne i DPBS i en slutkoncentration på 1 x 106 celler/ml. Hvis udbyttet f.eks. er 1 x 107 celler, skal du resuspendere cellerne i 10 ml DPBS.
  6. Til det første tværbindingstrin tilsættes 37% formaldehyd (FA) til en slutkoncentration på 1% til cellesuspensionen, og cellesuspensionen inkuberes i 10 minutter ved RT med rotation (15-20 o / min); som et eksempel, hvis udbyttet er 1 x 107 celler, tilsættes 270 μL FA til 10 ml cellesuspensionen.
    BEMÆRK: FA-løsningen er typisk stabil hos RT i op til 3 måneder efter åbning.
  7. Reaktionen slukkes ved at tilsætte 2,5 M glycin til en slutkoncentration på 0,25 M og inkuberes i 5 minutter ved RT med rotation (15-20 omdr./min.). For eksempel, hvis udbyttet er 1 x 107 celler, tilsættes 1,027 ml 2,5 M glycin til cellesuspensionen.
  8. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved RT. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 5 ml DPBS. Centrifugeringstrinnet gentages én gang, og de pelleterede celler i DPBS resuspenderes til 4 x 106 celler/ml. Hvis udbyttet f.eks. er 1 x 107 celler, skal du resuspendere cellerne i 2,5 ml DPBS.
  9. Til det andet tværbindingstrin fremstilles en 0,3 M stamopløsning af ethylenglycol bis-succinimidylsuccinat (EGS) i DMSO (13,6 mg EGS i 100 μL DMSO). Der tilsættes EGS i en slutkoncentration på 3 mM til cellesuspensionen, og inkuberes ved RT i 40 minutter med rotation (15-20 omdr./min.). For eksempel, hvis udbyttet er 1 x 107 celler, tilsættes 25 μL 0,3 M EGS-stamopløsning til 2,5 ml cellesuspension.
    BEMÆRK: EGS afbalanceres til RT i mindst 20 minutter før vejning til klargøring af stamopløsningen.
  10. Reaktionen slukkes ved at tilsætte 2,5 M glycin til en slutkoncentration på 0,4 M, og inkuberes i 5 minutter ved RT med rotation (15-20 omdr./min.). For eksempel, hvis udbyttet er 1 x 107 celler, tilsættes 400 μL 2,5 M glycin til cellesuspensionen.
  11. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 minutter ved RT, og pelleterede celler resuspenderes i DPBS til 5 x 106 celler/ml. Fordel 5 x 10 6 celler/rør til præparative biblioteker og 1 x 106 celler/rør til titrering til MNase-fordøjelse.
    BEMÆRK: Det anbefales at titrere den optimale fordøjelsesgrad for hver tværbundet cellebatch. Ideelt set indsamles to til tre delprøver af 1 x 10 6 celler til MNase-titreringseksperimenter (trin 2) og to til fire alikvoter af 5 x 106 celler til præparative eksperimenter (trin 3).
  12. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 minutter ved RT og supernatanten fjernes. Snap-frys cellepillerne i flydende nitrogen, og opbevar dem ved -80 °C.
    BEMÆRK: Succesfulde Micro-C-biblioteker kan fremstilles ud fra prøver, der opbevares i op til 3 måneder.

2. MNase-titrering

BEMÆRK: Det er nødvendigt at udføre en MNase-titrering for at bestemme den optimale koncentration af MNase, før de dobbeltbundne cellers præparative bibliotek behandles.

  1. For at udføre MNase-titreringen skal du optø en pellet på 1 x 106 celler på is i 10 minutter og resuspendere cellerne i 500 μL DPBS (tilføj 1x BSA, hvis cellerne klæber til væggen). Inkuber cellesuspensionen på is i 20 minutter.
  2. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 10.000 x g i 5 minutter ved RT, og supernatanten fjernes. Resuspender de pelleterede celler i 500 μL MB#1 buffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2,0,2% NP-40, 1x proteasehæmmer [se materialetabel], pH 7,4).
  3. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 10.000 x g i 5 minutter, og supernatanten fjernes. Resuspender cellerne i 200 μL MB # 1 buffer, og del prøven i fire rør.
  4. Der optøs et hætteglas MNase (20 E/μL), og fortyndes med 10 mM Tris, pH 7,4, i en serie på 1:2, 1:4, 1:4 og 1:4 for at opnå koncentrationer på henholdsvis 10 U/μL, 2,5 U/μL, 0,625 U/μL og 0,1256 E/μL (én for hver fordøjelsestilstand). Med passende tidsintervaller (10-20 s) tilsættes 1 μL MNase-opløsning til en af de fire prøver, hvirvelstrømmen, og inkuberes på en termomixer ved 37 °C i 10 minutter (800 omdrejninger pr. minut). Der tilsættes 1 μL fra de resterende MNase-fortyndinger til de resterende cellealikvoter.
  5. Stop Mnase fordøjelsen ved at tilsætte 200 μL frisklavet STOP-buffer (150 μL 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μL 10 % SDS, 25 μL 20 mg/ml proteinase K, 2 μL 0,5 M EGTA) til hvert glas i samme rækkefølge og med samme tidsinterval, som MNase blev tilsat. Der inkuberes ved 65 °C i 2 timer.
  6. Der tilsættes 500 μL phenol-chloroform-isoamylalkohol (PCI) til hver prøve, og blandingen blandes grundigt ved hvirvelstrøm. Der centrifugeres ved 19.800 x g i 5 minutter ved RT for at adskille faserne, og den vandige fase overføres til nye glas (ca. 200 μL/prøve).
    FORSIGTIG: PCI indeholder adskillige giftige komponenter og bør kun håndteres i en kemisk sikkerhedshætte. Kontakt producenten for at få flere oplysninger.
  7. DNA'et renses ved hjælp af et kommercielt DNA-rensningssæt (se materialetabellen) i henhold til producentens anvisninger, og prøverne elueres i 12 μL elueringsbuffer.
    BEMÆRK: SDS-koncentrationen fra deproteiniseringstrinnet (trin 2.5) er hæmmende for nogle DNA-oprensningssæt. DNA-rensningssættet, der anvendes her, fungerer sammenligneligt med ethanoludfældning.
  8. Tilsæt 2-5 μL ilægningsfarvestof, og kør prøverne på en 1,5% agarosegel ved 120 V i 30-50 minutter (indtil de er korrekt adskilt; Figur 1A).
  9. Vælg den bedste grad af fordøjelse til eksperimentet, og fortsæt med den præparative MNase-fordøjelse. En optimal fordøjelsesgrad viser ringe eller ingen subnukleosomale fragmenter og et 70% -90% mono- til di-nukleosomforhold.
    BEMÆRK: I dette eksperiment blev fordøjelsesgraden af bane 4 i figur 1A bestemt til at være den optimale fordøjelse opnået med 0,625-1,25 U Mnase for 2,5 x 10 5 celler (= 2,5-5 U Mnase for 1 x 106 celler). For en detaljeret diskussion, se de repræsentative resultater.

3. Præparativ MNase-fordøjelse

  1. For at fragmentere kromatin til mononukleosomerne via MNase-fordøjelse optø tidligere dobbeltbundne 5 x 10 6-cellealikvoter og resuspendere i 1 ml DPBS. Inkuber på is i 20 minutter (tilsæt 1x BSA, hvis cellerne klæber til rørvæggen).
  2. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 10.000 x g i 5 minutter ved RT, og supernatanten kasseres. Opslæmp pellet igen i 500 μL MB # 1 buffer. Gentag centrifugeringstrinnet én gang. Opslæmp pellet igen i 1 ml MB # 1 buffer, og lav 200 μL alikvoter (1 x 106 celler pr. Alikvote).
  3. Baseret på MNase-titreringen (beskrevet i trin 2) fordøjes kromatinet ved at tilsætte en passende mængde MNase (sædvanligvis 2,5-10 E/μL pr. 1 x 106 celler) til hver delprøve. Bland godt (hvirvel og drej hurtigt), og inkuber på en termomixer ved 37 ° C i 10 minutter med 800 rpm omrystning.
  4. Stop MNase-fordøjelsen ved at tilsætte 1,6 μL 0,5 M EGTA (sidste 4 mM) til hver delprøve og inkubere på en termomixer ved 65 °C i 10 minutter med 800 omdrejninger pr. minut.
  5. Prøven opsamles ved centrifugering ved 10.000 x g i 5 minutter ved RT, og supernatanten kasseres. Cellepillen resuspenderes i 500 μL 1x NEBuffer 2.1.
  6. Poolprøver svarende til et input på 5 x 106 celler eller derunder til videre behandling.
    BEMÆRK: Hvis mere end 5 x 10 6 celler skal behandles, behandles disse prøver parallelt, da de enzymatiske forhold er optimeret til 5 x 106 celler.
  7. Før du fortsætter til nærhedsligeringstrinnene, skal du overføre 10% af prøven som en inputkontrol for at kontrollere MNase-fordøjelsesniveauet. Der tilsættes 150 μL 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μL 10% SDS og 25 μL 20 mg/ml proteinase K til denne prøve, og der inkuberes natten over ved 65 °C.

4. DNA-slutbehandling og nærhedsligering

  1. Den resterende prøve opsamles ved centrifugering ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Pellet resuspenderes i 90 μL frisklavet Micro-C master mix 1 (tabel 1), og inkuberes på en termomixer i 15 minutter ved 37 °C under omrystning ved 800 o/min.
  2. Der tilsættes 10 μL 5 E/μL Klenow Fragment, og inkuberes på en termomixer i 15 minutter ved 37 °C med 800 omdrejninger pr. minut.
  3. Der tilsættes 100 μL frisklavet Micro-C master mix 2 (tabel 2), og inkuberes på en termomixer i 45 minutter ved 25 °C under omrystning ved 800 o/min. Efter inkubation slukkes den enzymatiske reaktion ved at tilsætte EDTA til en slutkoncentration på 30 mM. Inkuber på en termomixer i 20 minutter ved 65 °C med 800 omdrejninger i minuttet.
  4. Prøven opsamles ved centrifugering ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Prøven resuspenderes i 500 μL frisklavet Micro-C-masterblanding 3 (tabel 3), og der inkuberes i 2,5 timer ved RT med rotation (15-20 omdr./min.).
  5. Prøven opsamles ved centrifugering ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Prøven resuspenderes i 200 μL frisklavet Micro-C-masterblanding 4 (tabel 4), og den inkuberes på en termomixer i 15 minutter ved 37 °C under omrystning ved 800 o/min.
  6. Til omvendt tværbinding og deproteinering tilsættes 25 μL 20 mg/ml proteinase K og 25 μL 10% SDS til prøven, og der inkuberes ved 65 °C natten over med intermitterende blanding.

5. Di-nukleosomal DNA-oprensning og størrelsesvalg

  1. Der tilsættes 500 μL PCI til prøverne og indgangskontrollen, og blandes ved hvirvelstrøm. Faserne adskilles ved centrifugering ved 19.800 x g i 5 minutter, og den øvre vandige fase overføres til et frisk glas.
  2. Koncentrer DNA'et enten ved hjælp af et DNA-rensningssæt eller ved ethanoludfældning. Eluer prøverne i 30 μL (trin 5.3) og inputkontrollerne (trin 3.11) i 15 μL, og der køres en 1,5 % agarosegel for at adskille mononukleosomerne og dinukleosomerne (figur 1B).
    BEMÆRK: SDS-koncentrationen fra deproteiniseringstrinnet er hæmmende for nogle DNA-oprensningssæt. DNA-rensningssættet, der anvendes her (se materialetabellen), fungerer sammenligneligt med ethanoludfældning. Afhængigt af antallet af anvendte celler kan indgangen variere fra 100 ng til 10 μg. Typisk ekstraheres 1-5 μg DNA fra 5 x 106 celler.
  3. Punktafgifter DNA-fragmenterne, der har en di-nukleosomal størrelse (ca. 300 bp). Brug et kommercielt tilgængeligt DNA-gelelueringssæt (se materialetabel) til at ekstrahere DNA'et fra agarosegelen og eluere i 150 μL.

6. Forberedelse af streptavidinperlerne

  1. Der overføres 10 μL streptavidinperler (se materialetabel) pr. prøve til et reaktionsrør.
  2. Anbring den i en passende magnet til 1,5 ml rør (se materialetabel). Når opløsningen er renset (1-2 min), fjernes supernatanten, og perlerne resuspenderes i 300 μL 1x TBW (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween 20) pr. prøve. Gentag dette trin én gang.
  3. Resuspender perlerne i 150 μL 2x B&W-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) pr. prøve, der er behandlet i trin 7.

7. Streptavidin pull-down og on-bead bibliotek forberedelse

  1. Der tilsættes 150 μL forberedte perler (trin 6.3) til 150 μL af prøven (trin 5.3). Inkuber i 20 minutter ved RT med rotation (15-20 o / min).
  2. Anbring rørene i en passende magnet, og vent, indtil opløsningen er ryddet (1-2 min). Supernatanten fjernes og perlerne resuspenderes i 300 μL 1x TBW. Gentag dette trin.
  3. Anbring rørene i en passende magnet, og vent, indtil opløsningen er ryddet (1-2 min). Supernatanten fjernes og perlerne resuspenderes i 100 μL 0,1x TE (1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).
  4. Anbring rørene i en passende magnet, og vent, indtil opløsningen er ryddet (1-2 min). Supernatanten fjernes, perlerne resuspenderes i 50 μL 0,1x TE, og de overføres til PCR-reagensglas.
    BEMÆRK: Det anvendte volumen på 0,1x TE (50 μL) svarer til inputvolumenet af DNA-sekventeringsbibliotekets forberedelsessæt (se materialetabel), der anvendes i denne protokol. Hvis der bruges et andet sæt eller en anden strategi, skal du justere lydstyrken i overensstemmelse hermed.
  5. Udfør DNA-manipulationstrinnene i sekventeringsbibliotekets forberedelsessæt i henhold til producentens protokol. Disse trin inkluderer typisk DNA-stumpning, A-tailing, adaptorligering og U-excision. Det sidste trin (U-udskæring) er specifikt for det sæt, der blev brugt i denne undersøgelse. Hvis du bruger dette sæt, skal du følge producentens instruktioner fra trin 1 til trin 2.6 i kitprotokollen ved hjælp af ikke-fortyndede adaptere og ikke overveje -20 °C opbevaring efter trin 2.6.
    BEMÆRK: De bufferændringer, der kræves af sekventeringssættene, skal udskiftes ved binding af perlerne til en magnet og vask (trin 7.3 til 7.4), da DNA stadig er bundet til streptavidinperlerne. Derudover, fordi DNA'et er bundet til de magnetiske perler, skal du ignorere eventuelle rensnings- og størrelsesvalgstrin efter adapterligering fra kitprotokollen. Fortsæt til trin 7.6 (denne protokol).
  6. Når adapterligeringen er fuldført, vaskes prøven som beskrevet i trin 7.2. Supernatanten kasseres, og perlerne resuspenderes i 20 μl 0,1x TE.

8. Estimering af de krævede PCR-cyklusser

BEMÆRK: Det anbefales at estimere de krævede PCR-cyklusser til biblioteksforstærkning. Typisk kræver et Micro-C-bibliotek 8-15 cyklusser af PCR. Selvom trinnet ikke er vigtigt, hjælper det med at undgå overforstærkning og reducerer risikoen for PCR-duplikater.

  1. For at definere det mindste antal PCR-cyklusser, der kræves, skal du udføre PCR med 1 μL streptavidin-biotin-DNA-prøve (trin 7.6). For at gøre dette tilsættes PCR-masterblanding (3,2 μLH2O, 0,4 μL i5-primer, 0,4 μL i7-primer og 5 μL Q5-high-fidelity-DNA-polymerase) til prøven. Udfør PCR med 16 cyklusser i henhold til producentens instruktioner for det anvendte DNA-biblioteksforberedelsessæt.
    BEMÆRK: De primere, der bruges her, købes i et separat sæt (se materialetabellen), der skal være kompatible med det anvendte biblioteksforberedelsessæt.
  2. Efter PCR'en samles perlerne med en passende magnet, og DNA-koncentrationen af 1 μL supernatant måles ved hjælp af et højfølsomt DNA-kvantificeringsinstrument (se materialetabellen). For at opnå den totale DNA-koncentration multipliceres denne værdi med 10 (totalt volumen af PCR-reaktionen). Anslå det krævede antal PCR-cyklusser som beskrevet i de repræsentative resultater.
  3. Der tilsættes 2 μL 6x belastningsbuffer til de resterende 9 μL PCR-blanding. Løs det PCR-forstærkede bibliotek på en 1% agarosegel for at bestemme vellykket adaptorligering, hvilket resulterer i en størrelse på ca. 450 bp (figur 1C).
    BEMÆRK: Gelen skal have et tydeligt bånd på ca. 420 bp (Micro-C-bibliotek plus adaptere). Bånd på 120 bp repræsenterer adapterdimerer og er tegn på biblioteker med lav kompleksitet. Bånd med lavere molekylvægt kan forekomme (mindre end 100 bp), og disse er ubrugte primere fra PCR-reaktionen.

9. Forstærkning af sekventeringsbibliotek

  1. Der tilsættes PCR-masterblanding (65 μLH2O, 100 μL Q5 high-fidelity DNA-polymerase, 8 μL i5-primer, 8 μL i7-primer) til de resterende 19 μL af streptavidin-biotin-DNA-prøven. Opdel reaktionsblandingen i 50-100 μL alikvoter.
    BEMÆRK: Den optimale lydstyrke for PCR afhænger af PCR-maskinen; 50 μL giver typisk den mest reproducerbare forstærkning i almindelige PCR-maskiner.
  2. Udfør PCR i henhold til producentens anvisninger fra DNA-bibliotekets forberedelsessæt med det antal cyklusser, der er bestemt i trin 8. Hvis trin 8 blev udeladt, anbefales 14 cyklusser til PCR.
  3. Rens DNA'et med paramagnetiske perler (se materialetabel) i et forhold på 1:0,9 i henhold til producentens protokol. Eluere i 20 μL 0,1% TE.
    BEMÆRK: Hvis adapterdimerer registreres i trin 8.5, skal du udføre rensning to gange med det samme forhold.
  4. Bestem DNA-koncentrationen og kør prøverne på et kvalitetskontrolsystem (se materialetabel). Sørg for god kvalitet af Micro-C-biblioteket ved tilstedeværelsen af et enkelt præcist bånd (figur 1D).
    BEMÆRK: Adapterdimerer er ualmindelige i præparater på perlebiblioteket på grund af prøvevaskningen før PCR. Således indikerer udseendet af adapterdimerer lav bibliotekskompleksitet. Hvis der observeres adapterdimerer, anbefales det stærkt at kvalitetskontrollere prøven med lav inputsekventering.

10. DNA-sekventering og databehandling

  1. Sekvensér Micro-C-biblioteket med parret sekvensering i henhold til sekventeringsudbyderens krav.
    BEMÆRK: Ideelt set sekventeres prøverne på en platform i parret endetilstand med 50 bp pr. Læsning. Ældre platforme, der tilbyder kortere læselængder, såsom 2 x 35 bp, er også blevet brugt med succes. Det er vigtigt, at hvis gentagne genomiske regioner undersøges, kan det være tilrådeligt at sekvensere med en længere læselængde.
  2. For at vurdere kvaliteten af Micro-C-biblioteket skal du udføre lav inputsekventering med 5 x 106 til 1 x 107 læsninger pr. Prøve.
  3. Behandl sekventeringsfilerne (fastq-filer) med Distiller10. Kortlæg læsningerne mod det relevante referencegenom, her mm10.
    BEMÆRK: Sekventeringsfilerne kan behandles ved hjælp af forskellige pipelines på lokale computere eller computerklynger. For prøver med lave sekventeringsdybder kan større placeringsstørrelser, f.eks. 10.000 bp, 50.000 bp, 100.000 bp og 500.000 bp, reducere computerkrav og filstørrelser. Distiller (brugt i denne undersøgelse) genererer alle de nødvendige filtyper til at vurdere kvaliteten af Micro-C-biblioteket. Den genererede *.stats-fil indeholder oplysninger om korthastigheden, cis-trans-forhold og læseretning stratificeret efter afstanden mellem læseparrene. Disse parametre visualiseres i figur 2, og vurderingen af Micro-C-bibliotekets kvalitet diskuteres i de repræsentative resultater. Behandlingssoftwaren genererer også mcool-filer, der kan indlæses direkte i HiGlass (https://docs.higlass.io/) for at generere interaktionsmatricer9.

Representative Results

Den vellykkede forberedelse af Micro-C-biblioteker kan evalueres i flere trin i protokollen. Det vigtigste skridt er valget af en ordentlig MNase fordøjelsesgrad. Derfor skal MNase-koncentrationen titreres for konsekvent at give 70% -90% mononukleosomer over di-nukleosomer for hver prøve. Det er vigtigt at bemærke, at kromatinfordøjelsen er forskellig for eu- og heterokromatin, hvor MNase fordøjer heterochromatin mindre effektivt. Den optimale fordøjelsesgrad afhænger således af kromatinområdet af interesse og den undersøgte celletype, da den relative andel af eu- og heterokromatin er celletypespecifik. Derfor tilrådes det omhyggeligt at titrere den krævede MNase-koncentration og først evaluere Micro-C-eksperimentets succes ved sekventering med lavt input.

Et typisk MNase-titreringsmønster for kromatin behandlet med faldende mængder MNase er vist i figur 1A. Her fordøjes kromatin fra 250.000 celler pr. reaktion med en firedobbelt fortynding af MNase. Den højeste koncentration (10 U af MNase, bane 2) viser overfordøjet kromatin, der næsten udelukkende består af mononukleosomalt DNA (~ 150 bp). Især løber midten af mononukleosombåndet lavere i agarosegelen sammenlignet med de tilsvarende bånd i prøverne med reducerede MNase-koncentrationer, hvilket indikerer en overfordøjelse af nukleosomalt DNA. Overfordøjede nukleosomer ligeres ineffektivt i nærhedsligationsreaktionen; derfor er prøven i bane 2 suboptimal til mikro-C-eksperimenter. Bane 3 (2,5 U af MNase) viser en næsten passende fordøjelsesgrad for Micro-C-eksperimenter. Her er mononukleosombåndet den dominerende art, og det subnukleosomale udtværing, der indikerer overfordøjede nukleosomer, reduceres; Det er dog stadig til stede. Fordøjelsesgraden i bane 4 (0,635 U MNase) er en ideel betingelse for et Micro-C-eksperiment i dette titreringseksempel. Et klart mononukleosomalt bånd uden subnukleosomalt DNA er til stede. Båndintensiteten for mono- og dinukleosom-DNA'et er næsten ens, hvilket indikerer et mononukleosomudbytte på 66% eller højere. Det er værd at bemærke, at det di-nukleosomale DNA er cirka dobbelt så stort som det mononukleosomale DNA (~ 320 bp vs. ~ 150 bp), så dets båndintensitet pr. Mol DNA er dobbelt så høj sammenlignet med dets mononukleosomale modstykke. Fordøjelsesgraden i bane 5 (0,156 U MNase) viser underfordøjet kromatin med næsten intet nukleosomalt DNA, og dette repræsenterer derfor en suboptimal prøve.

Afslutningsvis giver fordøjelsen af 2,5 x 105 mus ES-celler med 0,625 U MNase (svarende til 2,5 U MNase for 1 x 106 celler i 200 μL) i dette eksempel det mest lovende udgangspunkt for præparativ fordøjelse i Micro-C-eksperimenter. Der bør dog også overvejes en mellemliggende MNase-koncentration mellem de betingelser, der anvendes til prøverne i bane 3 og bane 4 (svarende til 5 U MNase for 1 x 106 celler i 200 μL). Det er vigtigt, at kromatinfordøjelsen med MNase ikke kan skaleres lineært, og det anbefales ikke at opskalere den præparative fordøjelse mere end 4x. For at forberede Micro-C-biblioteker fra mere end 1 x 10 6 celler anbefales det at fordøje kromatinet i alikvoter på 1 x 106 celler og samle dem efter MNase-inaktivering.

For at vurdere succesen med nærhedsligeringsprotokollen skal inputkontrollen, som er MNase-fordøjet og ikke nærhedsligeret (trin 3.8), sammenlignes med den nærhedsligerede prøve (trin 5.3) med 1,5% agarosegelelektroforese (figur 1B). Det nærhedsligerede mononukleosombånd har en omtrentlig størrelse på 300 bp, svarende til di-nukleosomer. Derfor bør mono- til dinukleosombåndets signalforhold skifte fra overvejende mononukleosomer (bane 1) mod dinukleosomer (bane 3 og bane 4). Da agarosegelen i dette trin er det dinukleosomale DNA, der udskæres og renses, anbefales det at opdele prøverne i flere baner for at undgå overbelastning.

Det anbefales at vurdere kvaliteten og kvantiteten af det forberedte sekventeringsbibliotek med minimal PCR. Her amplificeres DNA fra 1 μL perler (1/20 af den samlede prøve) i 16 cyklusser i 10 μL PCR-reaktion. Den samlede koncentration af det minimale PCR-bibliotek varierer typisk fra 50-500 ng efter 16 PCR-cyklusser. I teorien svarer dette til et 1-10 μg bibliotek fra den resterende 19 μL prøve, hvis det også blev forstærket i 16 cyklusser. Det anbefales at bruge det mindste antal PCR-cyklusser, der er nødvendigt for at generere et bibliotek på ca. 100 ng fra det samlede DNA. Under forudsætning af logaritmisk amplifikation i PCR kan den teoretiske koncentration af DNA'et opnået fra 19 μL-indgangen ved 16 cyklusser divideres successivt med to for at beregne antallet af PCR-cyklusser, der kræves for at generere et 100 ng bibliotek. For eksempel svarer et udbytte på 100 ng fra 1 μL efter 16 cyklusser til et udbytte på 1.900 ng forstærket fra 19 μL. I dette scenarie bør 12 cyklusser ideelt set generere et 118 ng sekventeringsbibliotek fra det samlede DNA (1.900 ng / [2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). Den resterende 9 μL prøve fra den minimale PCR kan derefter bruges til at vurdere bibliotekets kvalitet ved agarosegelelektroforese (figur 1C). Visualisering skal vise et særskilt bånd ved 420 bp og ingen bånd for adapterdimerer (120 bp). Mindre fragmenter kan også forekomme, og disse svarer til ubrugte PCR-primere.

Dernæst anbefales det at analysere og bekræfte vellykket Micro-C-prøveforberedelse ved sekventering med lavt input, før man forpligter sig til ressourceintensiv dyb sekventering. Biblioteker sekventeres typisk til en læsedybde på 5 x 106 til 1 x 107 og evalueres ud fra følgende kriterier: sekventeringslæsningsduplikationshastigheden, cis- versus transkromosominteraktionshastigheden og sekventeringslæseorienteringsfrekvensen. Micro-C-bibliotekerne behandles med Distiller, en pipeline med fuld service, der behandler dataene fra sekventering af læste filer (Fastq-format) til læseparfiler (Bedpe-format) og skalerbare interaktionsmatricer (Cool- og Mcool-formater) ved hjælp af køler, pairtools og cooltools10,11,12. Pipelinen genererer også en oversigtsfil, der er ideel til vurdering af kvaliteten af Micro-C-bibliotekerne10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). PCR-duplikeringshastigheden giver oplysninger om sekventeringsbibliotekets kompleksitet og kan udtrækkes fra den genererede *.stats-fil. Micro-C-biblioteker af høj kvalitet har mindre end 5% -10% PCR-duplikeringshastigheder, når de genereres fra 5 millioner eller flere celler. Især genererer nogle sekventeringsplatforme PCR-duplikater under klyngedannelse uafhængigt af sekventeringsbibliotekets kompleksitet. Figur 2A viser de relative duplikeringsrater for to eksperimenter: et, som vi betragter som en god prøve, og et dårligt forsøg. I dette eksempel viste begge eksempler acceptable korthastigheder. De næste kriterier for at vurdere kvaliteten af Micro-C-biblioteker er cis versus trans-forholdet og læseorienteringsfrekvenserne. Inden for kernen beboer kromosomer individuelle kromosomområder og interagerer således sjældent med andre kromosomer. En høj grad af detekterede transkromosomale interaktioner indikerer en høj grad af tilfældige ligationer. Det skal bemærkes, at den dårlige prøve på dette analyseniveau viste en høj grad af transkromosomale interaktioner sammenlignet med den gode prøve (figur 2B). For Micro-C er en 70% eller højere cis-kromosomal interaktionshastighed ønskelig.

Et Micro-C-bibliotek har en fragmentstørrelse svarende til det di-nukleosomale DNA-bånd, som kan co-rense med nærhedsligerede prøven og forurene eksperimentet. Disse forurenende stoffer er altid cis-kromosomale interaktioner. Derfor er det vigtigt også at evaluere læseorienteringshastighederne. Hastigheden af di-nukleosomal kontaminering kan estimeres ved lavinputsekventering. Di-nukleosomalt DNA stammer fra to nærliggende nukleosomer, der ikke er blevet spaltet af MNase. Således vil de resulterende sekventeringslæsninger altid vise en fremadvendt læseretning (F og R), og afstanden mellem læseparrene vil være omkring 320 bp. Nærhedsligerede fragmenter kan til sammenligning ligeres i fire retninger, hvilket giver læsepar med F-R, R-R, R-F og F-F, ideelt med lige stor overflod (figur 2C). Derudover viser de forskellige afstande mellem de to læsepar. For at estimere mængden af dinukleosomale kontanater kan hyppigheden af læseretninger beregnes ud fra *statsfilerne genereret af destilleriet (figur 2D). Især i dette arbejde var brøkdelen af F-R-læsninger (rød) højere i den dårlige prøve sammenlignet med den gode prøve, og dette blev mere tydeligt, da læseretningerne blev stratificeret efter afstand (figur 2E). F-R-fraktionen domineres af di-nukleosomale fragmenter sammenlignet med Micro-C-biblioteker, når læseparrene stratificeres i læsninger med afstande <562 bp eller ≥562 bp. Her domineres brøkdelen af aflæsninger med afstand <562 bp af F-R-læsninger, mens brøken med afstande ≥562 bp viser en jævn fordeling mellem de fire mulige retninger, hvilket indikerer, at den globale overrepræsentation af F-R-læsninger stammer fra di-nukleosomale forurenende stoffer. Valget af 562 bp som tærskel for underindstilling defineres af binning i den genererede *statsfil. Selvom det ikke er nødvendigt for denne kvalitetskontrol, kan mere defineret underindstilling opnås ved at udtrække afstandene fra *pairs-filen, som også genereres af destilleriet. Det er vigtigt at bemærke, at dinukleosomale aflæsninger ikke reducerer kvaliteten af Micro-C-prøven, da de kan identificeres og ignoreres under databehandling. De indeholder dog ikke værdifuld information om 3D-interaktioner, og de fortynder de informative læsninger.

Således er omhyggelig MNase-titrering og grundig kvalitetskontrol med lavinputsekventering de bedste værktøjer til at optimere kvaliteten af Micro-C-eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: Mellemliggende stadier af Micro-C-protokollen . (A) Agarosegelelektroforese af kromatin fra 2,5 x 105 ES-museceller fordøjet med varierende MNase-koncentrationer. Mono-, di- og trinukleosombåndene er angivet med pile. M: DNA-stige (bane 1/6); 10 U MNase pr. 250.000 celler (bane 2); 2,5 U MNase pr. 250.000 celler (bane 3); 0,625 U MNase pr. 250.000 celler (bane 4); 0,156 U MNase pr. 250.000 celler (bane 2). (B) 1,0% agarosegelelektroforese af Micro-C-forberedte prøver (bane 3 og bane 4) og MNase-fordøjet inputkontrol (bane 1). Bane 1 og bane 2 (M: DNA-stige) er forbedret for at understrege den relative ændring i mono- til di-nukleosomal fragmentintensitet. De mono- og di-nukleosomale bånd er angivet med pile. Det di-nukleosomale bånd i den nærhedsligerede prøve kombinerer di-nukleosomalt og Micro-C-biblioteks-DNA. (C) 1,0% agarosegelelektroforese fra Micro-C-sekventeringsbibliotekerne amplificeret fra 1 μL prøve for at evaluere kvaliteten. Bane 1 (M): DNA-stige; Bane 2 (S): Mirco-C bibliotek. D) Fragmentanalysatorspor af det endelige Micro-C-bibliotek. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Stikprøvestatistik for lav input-sekventering af en god stikprøve og en dårlig stikprøve . (A) Søjlediagram over procentdelen kortlagt (grøn) og ikke-kortlagt (rød) læser. (B) Normaliseret brøkdel af læsninger, kortlægning af cis og transkromosomale interaktioner. Datasættene blev normaliseret til cis-mapping-læsningen. Cis-kortlægningslæsningerne blev stratificeret efter afstanden mellem den første og den anden aflæsning af de parrede sekvenserede prøver: ≤1 kbp (gul), >1 kbp og ≤10 kbp (orange) og >10 kbp (rød). (C) Skematisk over de potentielle molekylære arter med de dinukleosomale størrelser. (D) Procentdele af læseparretninger for alle læsninger af den gode prøve og den dårlige prøve. (E) Samme som panel (D), men stratificeret efter afstande (venstre, <562 bp og højre, ≥562 bp). Klik her for at se en større version af denne figur.

Komponenter 1x 4,4x
10x NEBuffer 2,1, 10 μL 44 μL
2 μL 100 mM ATP 2 μL 8,8 μL
100 mM DTT 5 μL 22 μL
H2O 68 μL 299,2 μL
10 U/μL T4 PNK 5 μL 22 μL
Total 90 μL 396 μL

Tabel 1: Micro-C master mix 1. Sammensætning af masterblandingen til sluttygningsreaktionen.

Komponenter 1x 4,4x
1 mM Biotin-dATP 10 μL 44 μL
1 mM Biotin-dCTP 10 μL 44 μL
10 mM blanding af dTTP og dGTP 1 μL 4,4 μL
10x T4 DNA-ligasebuffer 5 μL 22 μL
200x BSA 0,25 μL 1,1 μL
H2O 23,75 μL 104,5 μL

Tabel 2: Micro-C master mix 2. Sammensætning af masterblandingen til slutmærkningsreaktionen.

Komponenter 1x 4,4x
10x NEB T4 ligase reaktionsbuffer 50 μL 220 μL
H2O 422,5 μL 1859 μL
T4 DNA-ligase 25 μL 110μL

Tabel 3: Micro-C master mix 3. Sammensætning af masterblandingen til nærhedsligeringsreaktionen.

Komponenter 1x 4,4x
10x NEBuffer 1,1 20 μL 88 μL
H2O 180 μL 792 μL
ExoIII-nuklease 10 μL 44 μL

Tabel 4: Micro-C master mix 4. Sammensætning af masterblandingen til biotinfjernelsesreaktionen.

Discussion

Succesen med et Micro-C-eksperiment afhænger af et par kritiske trin i protokollen, der skal udføres omhyggeligt. For det første kan tværbinding med den ekstra tværbinding DSG eller EGS føre til aggregering af celler afhængigt af celletypen. Tilføjelse af 0,1% -0,5% BSA til tværbindingsreaktionen reducerer aggregeringen betydeligt uden at påvirke tværbindingseffektiviteten. Ineffektiv tværbinding kan resultere i øgede hastigheder af transkromosomale interaktioner, der er tegn på tilfældige ligationer. Det andet, men mest afgørende trin i denne protokol er fordøjelsen af kromatin med MNase. Suboptimal kromatinfordøjelse fører til ineffektiv nærhedsligering (overfordøjelse) eller øgede hastigheder af ikke-nærhedsligerede dinukleosomer (underfordøjelse). Effektiviteten af ligeringsreaktionen kan evalueres ved agarosegelelektroforese (figur 1B) og estimeres desuden bedst ved sekventering med lavt input. Hvis sekventering med lavt input afslører enten en høj duplikeringshastighed (ineffektiv ligering) eller øgede dinukleosomhastigheder, bør MNase-fordøjelsesgraden revurderes. Især kan tabet af prøve ved udførelse af protokollen føre til reduceret bibliotekskompleksitet. Koncentrationen af en prøve evalueres bedst efter DNA-oprensning (trin 5.3) eller ved minimal PCR (trin 8). Det samlede udbytte af DNA fra 5 x 106 pattedyrceller efter DNA-oprensning er typisk >2 μg. DNA-koncentrationen bør kontrolleres efter MNase-fordøjelsen, ExoIII-fordøjelsen og DNA-oprensningen. Endogene nukleaser, hvis overflod er celletypespecifik og artsspecifik, kan være en kilde til DNA-nedbrydning. Derudover kan kolonnebaseret DNA-oprensning føre til prøvetab på grund af uforenelighed med SDS fra deproteineringsreaktioner. Ethanoludfældning kan overvejes, hvis DNA-koncentrationen er lav på dette trin.

Da Micro-C kræver prøvespecifik MNase-titrering, er det udfordrende at anvende Micro-C på småcellepopulationer, såsom med små organer fra forskellige modelorganismer, embryoner og enkeltceller, organoider eller patientbiopsier. Her tilbyder Hi-C 3.0 et veletableret alternativ ved hjælp af en endepunktsreaktion ved sekvensspecifikke restriktionsendonukleaser 8,9.

Micro-C er en bredt anvendelig højopløsningskromosomkonformationsteknologi med et højt dynamisk område og et lavt signal-støj-forhold, hvilket gør den særligt velegnet til undersøgelse af kortrækkende kromosomfunktioner 4,5,8, såsom kromosomsløjfer. Opløsningen af Micro-C giver mulighed for at fange promotor-forstærkersløjfer, som ligger uden for detektionsgrænsen for Hi-C, hvilket effektivt muliggør en mere detaljeret analyse af forholdet mellem genomorganisation og regulering13,14,15. Desuden er DNA-fangststrategier for nylig blevet kombineret med Micro-C for at øge den locus-specifikke opløsning af det målrettede genomiske loci til hidtil usete niveauer, hvilket afslører ny indsigt i ultrastrukturen af 3D-genomet16,17,18. Sammenfattende forestiller vi os, at Micro-C og dets derivater vil være en nøgleteknologi til dissekering af 3D-genomets rolle i transkriptionel regulering og følgelig celletypedifferentiering og vedligeholdelse.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Christl Gaubitz og Kathleen Stewart-Morgan for deres kritiske læsning af manuskriptet. Vi takker Anja Groth og Groth-laboratoriet for deres støtte til etableringen af vores laboratorium. Vi takker medarbejderne på CPR/reNEW Genomics Platform for støtte: H. Wollmann, M. Michaut og A. Kalvisa. Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) er støttet af Novo Nordisk Fondens bevillingsnummer NNF21CC0073729. Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research (CPR) er støttet af Novo Nordisk Fondens bevillingsnummer NNF14CC0001. Vi takker Brickman-laboratoriet på Novo Nordisk Center for Stamcellemedicin, reNEW Copenhagen, for musens ES-celler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mM Biotin dATP Jenna Bioscience  NU-835-Bio14-S
1 mM Biotin dCTP Jenna Bioscience NU-809-BioX-S
10 mM dGTP NEB N0442S
10 mM dTTP  NEB N0443S
10 U/ml T4 PNK NEB M0201L
100 U/L Exonuclease III NEB M0206L
10x NEBuffer 1.1 NEB B7001S
10x NEBuffer 2.1 NEB B7202S
10x T4 DNA Ligase buffer  NEB B0202A
1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ ThermoFisher  14190144
1x LIF
2_Mercaptoethanol 50 mM  Gibco 31350010 0.1 mM b-mercaptoethanol 
37% Formaldehyde  Sigma Aldrich 252549-500ML Caution. See manufactures MSDS
400 U/ml T4 DNA Ligase  NEB M0202L
5 U/ml Klenow Fragment NEB M0210L
Agarose BIO-RAD 1613102 Caution. See manufactures MSDS
BSA 20mg/ml NEB B9000S
CaCl2
cell counter
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D8418-100ML Caution. See manufactures MSDS
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes
DynaMag-PCR Magnet Invitrogen 492025 refered to as: magnet magnet for PCR tubes
EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 Invitrogen 15575-038
EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 BioWorld 40121266-1
Ethanol 96%  VWR Chemicals 20824365 quality control system 
Ethidium Bromide  Invitrogen 15585-011
Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) ThermoFisher 21565
Fetl Bovin Serum Sigma Aldrich F7524 15% FBS
Gel Loading dye purple (6X) NEB B7024S
Glycine  PanReac AppliChem A1067.0500
Halt Proteinase inhibitor (100x) ThermoFisher 78430 Caution. See manufactures MSDS
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich 18896-50ML
MgCl 1 M Invitrogen AM9530G
Micrococcal Nuclease (MNase) Worthington LS004798
mouse embryonic stem cells 
NaCl Sigma Aldrich S9888-1KG
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) NEB E7600S amplification primers for sequencing libraries
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina NEB E7645L sequencing library preparation kit 
NEBNext Ultra II Q5 Master mix  NEB M0544S Caution. See manufactures MSDS
Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050 1x NEAA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 1% Pen-Strep
Proteinase K (40 mg/ml) GoldBio P-480-1 Caution. See manufactures MSDS
QIAquick Gel extraction kit QIAgen 28706 refered to as: DNA gel elution kit 
QIAquick PCR purification kit QIAgen 28106 refered to as: commercial DNA purification kit 
Qubit dsDNA HS Assay kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA quantification instrument 
Quick load purple 1kb plus DNA Ladder NEB N0550S
SPRIselect size selection beads Beckman Coulter B23319 paramagnetic beads 
ThermoMixer C Eppendorf  5382000015 refered to as: thermomixer
Tris Merck 10708976001
Trypsin
Tween20 Sigma Aldrich P7949-100ML
Ultrapure 10% SDS Invitrogen 15553-035
Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) Invitrogen 15593-031
Fragment Analyzer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  2. Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: Assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
  3. Hsieh, T. -H. S., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
  4. Krietenstein, N., et al. Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
  5. Hsieh, T. -H. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).
  6. Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
  7. van Holde, K. E. Chromatin. , Springer. New York, NY. (1989).
  8. Oksuz, B. A. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18, 1046-1055 (2021).
  9. Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved protocol for genome-wide chromosome conformation capture. Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).
  10. Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P. Mirnylab/distiller-nf; v033. Zenodo. , (2019).
  11. Venev, S., et al. Open2c/cooltools: v0.4.1. Zenodo. , (2021).
  12. Abdennur, N., Mirny, L. A. Cooler: Scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays. Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2019).
  13. Zhang, S., Übelmesser, N., Barbieri, M., Papantonis, A. Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion. BioRxiv. , (2022).
  14. Barshad, G., et al. RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts. BioRxiv. , (2022).
  15. Hansen, A. S., et al. Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF. Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).
  16. Hua, P., et al. Defining genome architecture at base-pair resolution. Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).
  17. Downes, D. J. High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale. Nature Communications. 12, 531 (2021).
  18. Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments. BioRxiv. , (2022).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 201 Kromosomkonformation capture Micro-C-XL MNase nærhedsligering genomarkitektur opdeling TAD'er kromosomsløjfer cis-regulerende elementer
Kortlægning af pattedyrs 3D-genominteraktioner med Micro-C-XL
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Metelova, M., Jensen, R. R.,… More

Metelova, M., Jensen, R. R., Krietenstein, N. Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL. J. Vis. Exp. (201), e64579, doi:10.3791/64579 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter