Summary
瞳孔测量是一种简单且非侵入性的技术，被提出作为确定正常听力动物和各种听觉病理的动物模型中的噪声听觉阈值的方法。
Abstract
噪音暴露是感音神经性听力损失的主要原因。噪声引起的听力损失的动物模型已经对听力损失的潜在解剖学和生理病理学产生了机制见解。然而，将听力损失人类中观察到的行为缺陷与动物模型中的行为缺陷联系起来仍然具有挑战性。在这里，瞳孔测量法被提出作为一种能够直接比较动物和人类行为数据的方法。该方法基于一种改进的古怪范式 - 使受试者习惯于刺激的重复呈现，并间歇性地呈现与重复刺激以某种参数方式变化的偏差刺激。基本前提是，如果受试者检测到重复刺激和偏差刺激之间的变化，它将触发比重复刺激引起的更大的瞳孔扩张反应。这种方法在豚鼠中使用发声分类任务进行了演示，豚鼠是一种广泛用于听觉研究（包括听力损失研究）的动物模型。通过将一个发声类别的发声呈现为标准刺激，将另一个类别的发声呈现为嵌入不同信噪比的噪声中的古怪刺激，证明了响应古怪类别的瞳孔扩张幅度随信噪比单调变化。然后可以使用生长曲线分析来表征这些瞳孔扩张反应的时间过程和统计学意义。在该协议中，描述了使豚鼠适应设置，进行瞳孔测量和评估/分析数据的详细程序。尽管该技术在本协议中在正常听力的豚鼠中得到了证明，但该方法可用于评估每个受试者内各种形式的听力损失的感觉影响。然后，这些影响可能与同时进行的电生理测量和事后解剖观察相关联。
Introduction
瞳孔直径（PD）可能受到多种因素的影响，随时间变化的PD测量称为瞳孔测量法。PD由虹膜括约肌（参与收缩）和虹膜扩张肌（参与扩张）控制。收缩肌由副交感神经系统支配并涉及胆碱能投射，而虹膜扩张肌由涉及去甲肾上腺素能和胆碱能投射的交感神经系统支配1，2，3。诱导PD变化的最着名的刺激是亮度收缩，瞳孔的扩张反应可以通过环境光强度的变化产生2。PD也随焦距2而变化。然而，几十年来，人们已经知道PD也显示出与亮度无关的波动4，5，6，7。例如，内部精神状态的变化可以引起短暂的PD变化。瞳孔因情绪刺激而扩张，或随着唤醒而增加4，5，8，9。瞳孔扩张也可能与其他认知机制有关，例如增加脑力劳动或注意力10，11，12，13。由于瞳孔大小变化与精神状态之间的这种关系，PD变化已被探索为临床疾病的标志，例如精神分裂症14，15，焦虑症16，17，18，帕金森病19，20和阿尔茨海默病21等。在动物中，PD变化跟踪内部行为状态，并与皮质区域的神经元活动水平相关22，23，24，25。瞳孔直径也被证明是小鼠睡眠状态的可靠指标26。这些与唤醒和内部状态相关的PD变化通常发生在几十秒量级的长时间尺度上。
在听力研究领域，在正常听力和听力受损的受试者中，已经使用瞳孔测量法评估了听力努力和听觉感知。这些研究通常涉及训练有素的研究对象27，28，29，30，他们执行各种检测或识别任务。由于上述唤醒和PD之间的关系，增加的任务参与度和倾听努力已被证明与瞳孔扩张反应增加相关30，31，32，33，34，35。因此，瞳孔测量法已被用于证明增加的听力努力用于识别正常听力听众的频谱退化语音29，36。在听力受损的听众中，例如与年龄相关的听力损失27，30，37，38，39，40，41和人工耳蜗使用者42，43，瞳孔反应也随着语音清晰度的降低而增加;然而，与正常听力受试者相比，听力受损的听众在更容易的听力条件下表现出更大的瞳孔扩张27，30，37，38，39，40，41，42，43。但是，要求听众执行识别任务的实验并不总是可能的 - 例如，在婴儿或某些动物模型中。因此，在这些情况下，由声学刺激引起的非亮度相关瞳孔反应可能是评估听觉检测的可行替代方法44，45。早期的研究表明，短暂和刺激相关的瞳孔扩张是定向反射的一部分46。后来的研究表明，使用刺激相关的瞳孔扩张来推导出猫头鹰的频率敏感性曲线47，48。最近，这些方法已被应用于评估人类婴儿瞳孔扩张反应的敏感性48。瞳孔测量已被证明是一种可靠且非侵入性的方法，通过使用各种简单（音调）和复杂（GP发声）刺激来估计被动聆听豚鼠（GP）的听觉检测和辨别阈值49。这些与刺激相关的PD变化通常发生在几秒钟的较快时间尺度上，并与刺激时间有关。本文提出了刺激相关PD变化的瞳孔测量法，作为研究动物模型中各种听力障碍行为影响的方法。特别是，描述了用于GPs的瞳孔测量方案，一种各种类型的听觉病理学50，51，52，53，54，55，56的成熟动物模型（另见参考文献57以获得详尽的综述）。
虽然这种技术在正常听力全科医生中得到了证明，但这些方法可以很容易地适应其他动物模型和各种听觉病理的动物模型。重要的是，瞳孔测量法可以与其他非侵入性测量（如脑电图）以及侵入性电生理记录相结合，以研究可能的声音检测和感知缺陷的机制。最后，这种方法也可用于建立人类和动物模型之间的广泛相似性。
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Protocol
对于所有实验程序，请获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并遵守NIH关于实验动物护理和使用指南。在美利坚合众国，全科医生还受美国农业部 （USDA） 法规的约束。该协议中的所有程序均已获得匹兹堡大学IACUC的批准，并遵守NIH关于实验动物护理和使用指南。在本实验中，使用了三个雄性野生型，色素沉着的GPs，年龄在4至10个月之间，体重~600-1，000克。
1. 外科手术
- 在清醒、头部固定和被动聆听色素 GP 中进行所有瞳孔测量实验。 使用咔嗒声和纯音听脑干反应 （ABR） 记录验证实验对象的正常听力58.
注意：尽管瞳孔测量数据采集本身是非侵入性的，但本协议中使用侵入性头部植入后手术在手术过程中固定动物的头部。“讨论”部分提供了替代方案。 - 首先，将所有实验动物植入不锈钢头柱，以便在异氟醚麻醉下进行头部固定。使用无菌手术技术将头柱固定在颅骨上，采用骨螺钉和牙科丙烯酸的组合58。
- 为动物提供术后护理，包括全身和局部镇痛药的给药。经过2周的恢复期后，逐渐使动物适应实验设置。
注意：外科手术基于GPs58以及其他物种59，60中先前发表的方法，不是本协议的重点。
2. 动物适应实验装置
注意：实验通常在隔音室或隔间中进行（见 材料表）。使动物熟悉设置所需的时间因主题而异。典型的适应时间如下。适应良好的动物将以最小的身体运动耐受头部固定，并导致更好的瞳孔直径测量。
- 经过2周的恢复期后，首先让动物熟悉处理和运输（2-3天）。这种适应对于减轻压力和焦虑至关重要。为了使动物熟悉处理，请将动物放入其运输容器中增加时间（10-30分钟），并增加处理动物的时间（10-30分钟）。
- 接下来，通过将动物置于围栏中10-45分钟，使动物适应实验设置（2-3天）（图1A）。围栏必须允许小的姿势变化，以使动物在实验过程中感到舒适。在实验过程中，允许小的姿势变化，以使动物感到舒适。然而，已知瞳孔扩张先于运动49。因此，测量动物的运动并在数据分析中考虑这种运动（图1C）。
- 作为这种适应的一部分，手动处理植入的头部柱，就好像动物将被头部固定一样。保持头柱增加持续时间（10-60 秒）。
- 手动适应后，根据动物的行为，尝试使用植入物支架将动物头部固定在刚性框架上。
- 慢慢增加头部固定持续时间（10-45分钟），直到动物在头部固定时平静且相对静止（2-3天）。
- 使动物适应相机，红外光源和白光源的存在（1-2天）。打开白灯，逐渐增加持续时间（10分钟至30分钟）。
- 通过在不同声级（1-2天，与步骤2.6同时进行）播放各种声音（例如，纯音，咔嗒声，发声），使动物习惯于声学刺激。为了尽量减少对实验刺激的习惯，请使用与此步骤中瞳孔测量实验计划的声音不同的声音。
3. 瞳孔相机校准
注意：用于瞳孔测量的相机 通过USB将 视频输出到瞳孔测量软件套件。从该视频中，瞳孔测量软件套件使用椭圆拟合和用户可调的阈值提取瞳孔直径（参见 材料表）。然后，软件与数模卡连接。该卡输出与瞳孔直径成比例的模拟电压值。需要校准以将该电压值转换回以长度单位的瞳孔直径。
- 将一张包含已知直径的黑色圆盘图像的纸放在全科医生眼睛在瞳孔测量期间所在的同一位置。对于GP，PD在4毫米范围内。因此，请使用 3 mm、4 mm 和 5 mm 圆盘进行校准。
- 将瞳孔测量相机（见 材料表）放置在将进行实验的相同距离（25厘米）处。调整相机光圈和对焦，直到获得已知直径的圆盘的清晰聚焦图像。
- 在瞳孔采集软件（见 材料表）中，调整阈值，使椭圆的轮廓与成像盘紧密匹配，并记下模拟输出电压值和缩放比例。
- 对 3 毫米、4 毫米和 5 毫米光盘重复此过程。然后，将对应于模拟输出电压值的实际直径值（以毫米为单位）制成表格。
4. 瞳孔测量数据采集
- 在隔音室或室内进行所有实验，内壁覆盖有消声泡沫。
- 对于自由场刺激传递，将校准的扬声器安装在消音室壁上，高度与放置动物的位置相同。
注意：扬声器的选择取决于所研究的物种和计划的刺激。对于 GP 发声，请使用在 0.5-3 kHz 发声频率范围内具有相对平坦 （±3 dB） 频率响应的全频驱动器扬声器（图 1A）。 - 将动物放在围栏内，确保无法进行大的身体运动（图1A）。如步骤2中所述将动物的头部固定在刚性框架上（图1A）。
- 在外壳下方放置一个压电传感器，以检测和记录动物运动（图 1A）。
- 要设置气吹器，请使用连接到桌面的支架将移液器吸头放在动物鼻子前方 ~15 厘米处。将硅管（~3 mm直径）连接到移液器吸头，并将管连接到调节气缸。
- 将气缸气压保持在 20 到 25 psi 之间。使用计算机控制的继电器将管子穿过夹管阀以控制气吹的时间和持续时间。
- 用放置在~10厘米距离处的红外LED阵列照亮眼睛。使用强度为 ~2，000 cd/m2 的白色 LED 照明来照亮成像的眼睛，并使基线 PD 达到 ~3.5 mm。在整个实验过程中保持实验室的恒定照明条件。
注意：在正常的实验室照明（~500 cd / m2）中，GP瞳孔相当散大，并且不允许观察进一步的刺激相关扩张。通过使用额外的照明，瞳孔被带到~3.5毫米的基线直径，允许足够的动态范围来观察刺激相关的扩张。这也确保了跨会话和主题的一致基线。 - 打开瞳孔采集软件，使用带有 16 mm 镜头（空间分辨率为 0.15° 视角）和红外 （IR） 滤光片的相机采集瞳孔的视频（90 fps），该镜头放置在距离成像眼睛 25 cm 的距离处。确保眼睛在成像区域中居中。
- 调节相机的光圈和焦点，以及红外电平，直到成像瞳孔的轮廓清晰对焦。
- 在瞳孔采集软件中，通过使用鼠标选择一个矩形区域来定义包含瞳孔的感兴趣区域。
- 使用瞳孔采集软件控制面板调整采集视频的亮度和对比度。将扫描密度设置为 5 并调整阈值，使椭圆拟合与视频中瞳孔的轮廓紧密匹配。
- 使用神经接口处理器软件，从PD迹线采集并保存模拟信号，从记录运动的压电传感器采集并保存电压迹线，刺激传递时间和空气吹传递时间。
5. 使用改进的古怪范式的呼入噪声检测和分类判别
注意：瞳孔测量实验的刺激包括记录在动物群体中的GP发声58。可以在以下存储库中找到发声示例：https://github.com/vatsunlab/CaviaVOX。特别是，使用呜呜声和呜呜声来引发代表性结果中显示的学生反应。从每个类别中，选择长度大致相等的发声。要解释发声的记录振幅和时间包络的差异，如果需要，请按发声的均方根 （r.m.s.） 振幅对发声进行归一化。
- 使用 MATLAB 以适当的采样率呈现听觉刺激。对于GP，它们是低频听力动物，100 kHz的采样率就足够了。
- 从两种不同类别的发声（例如，呜呜叫声和呜呜声）中选择八个不同长度的 GP 发声示例。一类（八个示例）将作为标准刺激，另一类（八个示例）将作为古怪或偏差刺激（图2A）。
- 要生成嵌入在不同信噪比（SNR）水平下的噪声中的1 s长标准和偏差激励，请在呼叫中添加等长的白噪声（门控噪声）。本实验中采样的信噪比范围在-24 dB SNR和+40 dB SNR之间。
- 使用模块设计，在每个实验会话（~12分钟持续时间）中，获取对应于单个SNR水平的数据。在每个会话中，使用特定SNR下一个发声类别的八个示例作为标准刺激，并使用相同SNR水平的另一个发声类别的八个示例作为偏差刺激。
注意：典型的实验块持续~12分钟。根据动物的行为和对瞳孔反应的习惯，每天可以获取3-4个块（~45-60分钟）的数据。在整个过程中，通过瞳孔视频、运动轨迹以及直接在块之间密切监控动物。 - 对于每个会话，准备一个伪随机刺激演示序列，其中包含标准刺激>90%的时间。确保在偏差刺激之间，至少有20个标准刺激的试验（图2B）。
注意：根据实验的不同，刺激呈现序列中偏差刺激的顺序可以采用拉丁方格设计，以确保每个唯一的偏差刺激在每个会话中占据唯一的顺序位置。因此，对所有会话求平均值可以最小化整个刺激序列中偏差刺激位置的影响。 - 对所有刺激呈现使用固定的刺激强度（例如，85 dB SPL）。
注意：使用适当的数模转换器生成音频信号，使用可编程衰减器将其衰减到所需的声级，对信号进行功率放大并使用校准的扬声器（例如，硬件，请参阅 材料表）传输信号。 - 以高时间规律性呈现刺激（1 s刺激，然后3 s沉默，如代表性结果所示）。
注意：瞳孔扩张反应缓慢，通常在刺激发作后约1秒达到峰值，大约需要5秒才能恢复到基线49。刺激计划呈现率必须足够低，以应对这些缓慢的时间尺度。时间规律性很重要，因为中断时序模式本身可能是一种偏差刺激。 - 为了保持动物与刺激的接触并尽量减少习惯，可以选择在异常刺激后进行短暂的吹气（100 毫秒）。确保气吹的开始与刺激持续时间（刺激开始后 2.5 秒）充分分离，以便刺激诱发的瞳孔扩张反应在吹气诱导的眨眼伪影之前达到峰值。
注意：在经典的古怪范式中，不使用正强化或负强化。由于气吹在这里用作轻度厌恶增强以保持动物与听觉刺激的接触，因此该范式被称为改进的古怪范式。
6. 分析与统计
注意：所有分析均使用用 MATLAB 编写的自定义代码（可在 https://github.com/vatsunlab/GP_Pupil 获得）执行。描述了两种主要的分析方法，分别解决了学生反应的可靠性和时间过程。一种或两种方法的选择将由实验设计决定。
- 移动侦测和试验排除
- 使用代码 pupil_avg_JOVE.m，为每个会话执行运动检测和试用排除。为此，请运行代码并从弹出对话框中的单个会话中选择数据文件。
- 线性地去趋势PD迹线，并使用前面得出的校准表将单位从电压转换为千分尺（参见步骤3）。此外，在整个录制会话（~12 分钟）中线性去趋势跟踪。
- 通过在会话持续时间（~12分钟）内绘制瞳孔迹线（图1B - 顶行）和线性去趋势运动迹线（图1B-底行）来检查会话数据，并叠加在试验标记上。
- 测量运动轨迹的标准偏差 （SD）。使用 MATLAB 中的查找峰值函数获取运动跟踪峰值的时间。考虑超过5个SD阈值的峰值，并且与其他峰值相隔至少1 s作为运动事件49（图1B - 底部）。
- 放弃在运动事件后 7 秒内发生的任何瞳孔散大试验（标准和偏差）。如果由于运动相关的瞳孔散大而放弃了一半以上的异常试验，则放弃整个会话并重复。
- 数据预处理和可视化
- 使用代码 pupil_avg_JOVE.m 消除眨眼伪影，预处理数据，并获得跨会话的每个刺激的平均瞳孔扩张。为此，请运行代码并在弹出对话框中选择要分析的所有数据文件。
- 检测眼眨眼（PD 变化超过 400 μm/ms），并通过在以检测到的闪烁时间为中心的 200 ms 时间窗口中线性插值 PD 迹线来消除它们。如果超过一半的异常试验在刺激发作和吹气发作之间包含眨眼，则丢弃会话数据。
- 从 1，000 Hz 的采集采样率到 10 Hz 对 PD 数据进行下采样。
- 在刺激开始前 1 秒开始并在刺激偏移后持续 5 秒的窗口中提取 PD 迹线。计算刺激开始前 500 毫秒窗口内每个刺激的平均基线 PD。从这些迹线中减去基线PD，以获得刺激引起的PD变化。
- 平均每个动物内每个刺激条件的刺激诱发PD变化，然后在动物之间生成对每个刺激条件的平均瞳孔扩张反应（例如， 图3A）。
- 生长曲线分析（GCA），用于量化PD变化的时间过程
注意：该分析方法确定瞳孔扩张反应的大小和时间过程，并已用于人类受试者27，36，40以及豚鼠49的瞳孔测量研究。- 垂直连接所有会话、动物、信噪比和衰减的 pupil_avg_JOVE.m 的所有输出，以构建包含以下列的矩阵：动物 ID、信噪比、声级和瞳孔 （1-50） 直径值。使用代码 pupil_LME_JOVE.m，执行增长曲线分析 （GCA）27，36，40，49。
- 拟合线性混合效应模型，将主体级截距作为随机效应，将最多 2 阶的正交时间多项式作为固定效应，每个偏差 SNR 被视为一个单独的组，到瞳孔直径迹线的上升阶段（刺激开始后 0.1 至 2.1 秒）。
- 使用以下公式36，49 对瞳孔迹线的上升阶段进行建模：
瞳孔扩张 = （截距 + 条件） + 时间 1 * （β 时间 1 + β 时间 1： 条件） + 时间 2* （β 时间 2+ β时间 2： 条件） + r（主体级截距）
其中， time1 和 time2 对应于正交线性和二次时间多项式， βs 对应于权重。 - 使用 MATLAB 中的 fitlme 函数估计平均权重 （βs） 及其标准误差。使用 coeftest 函数估计权重的统计显著性。
- 对于每个SNR，绘制对应于截距，线性和二次项的权重以可视化结果（图3B，C）。
- 显示瞳孔扩张有统计学意义的试验分析
注意：该分析方法确定了观察到具有统计学意义的瞳孔扩张反应的偏差试验的比例，并且对应于瞳孔扩张反应的可靠性。- 选择以瞳孔反应峰值为中心的适当分析窗口（0.5-1 s）（通常在刺激发作后~1.5 s）。在此分析窗口中计算所有标准和偏差试验的平均PD。
- 确定每个偏差试验的平均PD是否大于标准试验的平均PD值合并分布的2.33标准误。将超过此阈值的偏差试验计为显示显着瞳孔扩张的试验。
- 将显示显着瞳孔扩张的偏差试验数量除以偏差试验总数（针对每种情况），以量化与标准刺激试验相比，显示PD在统计学上显着增加的试验比例。
- 将所有具有显着瞳孔变化的试验的会话百分比放入细胞阵列的每个细胞中，其中细胞从低到高SNR排列。使用代码 pupil_threshold_estimate_JOVE.m，估计呼叫噪声分类阈值。
- 绘制显示PD作为SNR函数的统计学显着增加的试验比例（图3D）。对于这些数据，请使用fitnlm MATLAB函数（在统计工具箱中）来拟合形式61的心理测量函数：
Ψ（x; α， β， λ） = （1 -λ） * F（x; α， β）
其中，F 是威布尔函数，定义为
F（x; α， β） =
，α是移位参数，β是斜率参数，λ 是失效率。
，α是移位参数，β是斜率参数，λ 是失效率。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在三个男性色素GP中进行瞳孔测定，在实验过程中重量~600-1，000g。如该协议所述，为了估计呼叫噪声分类阈值，使用了一种奇怪的范式来表示刺激。在古怪的范式中，属于给定SNR下嵌入白噪声中的一类呼叫（呜呜声）被用作标准刺激（图2A），而来自同一SNR嵌入白噪声中的另一类（wheeks）的呼叫（图2A）作为偏差刺激。标准和偏差刺激从每个类别的八个样本中随机选择，并进行重新抽样。在每个实验会话中，刺激以高时间规律呈现（图2B），在偏差刺激之间至少有20个标准刺激呈现。在每个实验会话中获取对应于特定SNR水平的数据。在会话中，对各种干净和嘈杂的SNR进行了采样（-24，-18，-12，-6，-3，0，3，6，12，40 dB SNR）。
标准刺激的PD变化与基线没有显着差异（ 图3A中的蓝线）。与标准刺激（ 图3A中的灰线）引起的PD变化相比，偏差刺激引起的PD变化强劲且明显更大，反映了呼叫类别歧视。在最干净的信噪比处，反应幅度和具有统计学意义的瞳孔反应的试验百分比最高，并随着信噪比的降低而逐渐降低（图3A，B）。使用GCA，发现瞳孔对异常刺激的反应在信噪比高于-18 dB时具有统计学意义（图3C），这被认为是呼叫噪声分类阈值（ 图3A中的绿线）。每个测试的SNR水平的重要试验的百分比与心理测量功能非常吻合（图3D）。达到心理测量曲线的半最大值所需的信噪比水平约为-20 dB SNR（图3D）。有趣的是，在这种情况下，基于可靠性和基于时间过程的指标产生了相似的呼叫噪声分类阈值值。
图 1：瞳孔测量设置，以及刺激诱发和运动相关的 PD 变化。 （A）带有声音诱发瞳孔扩张的视频帧图像的瞳孔测量设置（顶部）。基线PD由绿色虚线圆圈表示。（B）来自单个实验会话的示例PD跟踪（顶部）和示例运动跟踪（底部）。垂直黑线对应于起始时间偏差刺激表现。红色勾号对应于自动检测到的运动事件。灰色水平虚线对应于 5 SD 阈值。（C）由偏差刺激（顶部）引起的PD变化（ΔPD）与一个实验会话中的运动事件（底部）相关。刺激发作用垂直黑线表示;运动事件的检测用垂直红线表示。请注意，瞳孔散大先于运动开始。请点击此处查看此图的大图。
图 2：呼叫频谱图和呼叫噪声分类范式结构。 （A） 豚鼠在清洁条件下和 0 和 -18 dB SNR 下发出呜呜声和呜呜声的代表性频谱图。通过添加白噪声获得嘈杂的呼叫。（B）用于估计呼叫噪声分类阈值的古怪范式的结构。呜呜声是从八个样本中随机选择的，并用作标准刺激。Wheek呼叫是从八个样本中随机选择的，并用作偏差。在每个实验会话中，噪声在不同的SNR水平（-24，-18，-12，-6，-3，0，3，6，12 dB SNR）下添加。呼叫时长为 1 秒，刺激间隔时间为 3 秒。请点击此处查看此图的大图。
图 3：呼叫噪声检测和分类阈值的瞳孔测量估计值 。 （A）三种动物的平均瞳孔反应。瞳孔对标准呜呜声刺激的平均反应用蓝线表示，阴影对应于平均值（s.e.m.）的±1标准误差。灰线和阴影对应于由异常喘息刺激引起的瞳孔反应的平均值和±1 s.e.m.。灰色阴影强度对应于信噪比。绿线和阴影对应于阈值信噪比（约-18 dB SNR）下的平均瞳孔迹线。红色垂直线对应于刺激开始;橙色垂直线对应于气吹开始;蓝绿色虚线对应于GCA窗口（PD改变上升相位）。（B）GCA适合PD变化的上升阶段。点是 100 毫秒时间箱中的平均瞳孔直径，晶须对应于 ±1 s.e.m。实线对应于混合效应模型拟合。线条颜色如 A. （C） GCA 权重估计值。截距的权重为蓝色，斜率为红色，加速度为紫色。晶须对应±1 s.e.m。星号显示具有统计显著性的回归权重（线性回归模型系数的线性假设检验）。（D）心理测量功能符合由偏差刺激引起的PD显着变化的试验的百分比作为SNR的函数。晶须对应±1 s.e.m。请注意，在大约-20 dB SNR（绿色虚线）时达到最大值的50%。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议展示了使用瞳孔测量法作为非侵入性和可靠的方法来估计被动聆听动物的听觉阈值。按照此处描述的协议，估计正常听力GP中的呼叫噪声分类阈值。发现使用瞳孔测量法估计的阈值与使用操作性训练获得的阈值一致62。然而，与操作性训练相比，瞳孔测量方案相对简单，可以快速设置和获取数据。每次数据采集会话（每个SNR水平）持续约12分钟，导致每只动物每天1-2小时的实验会话（跨SNR水平）49。数据采集可以在大约7-10天内完成（取决于所使用的SNR水平的数量）。尽管在本手稿中，古怪球范式用于呼叫噪声分类阈值估计，但该瞳孔测量协议可以适用于更简单版本的古怪模式，其中仅使用一个呼叫示例，或使用各种复杂或简单刺激的其他刺激范式49。
该方法并非没有缺点。首先，目前的协议要求在这些实验中植入头柱来固定头部。头部植入手术和恢复将使实验方案的时间线至少增加 2 周。在实验过程中使用其他非侵入性固定清醒动物的方法可以避免这一步 - 例如，通过使用定制的3D打印头盔63 或可变形的热塑性塑料64。需要进一步的实验来探索这些解决方案。其次，动物也可以迅速习惯于异常刺激，导致在实验过程中瞳孔扩张反应减少。通过将实验过程限制在短持续时间（~12分钟）并仅呈现有限数量的（8）异常刺激，可以将这种影响最小化。此外，在异常刺激后发出的气吹可以确保动物与听觉刺激保持接触。第三，由于这种快速习惯，可能需要几天时间才能完成数据采集。通过仅测试密集采样心理测量曲线最陡峭部分的SNR值，可以最大限度地减少实验天数。第四，动物在实验过程中可能不会保持静止，或者在实验过程中过度眨眼或闭上眼睛。这些因素是物种和驯化作用的函数，并显示出高度的个体变异性。全科医生天生温顺，通过使它们很好地适应实验设置，可以最大限度地减少运动和眨眼伪影。自发眨眼和扫视在豚鼠中通常非常罕见49，但这也可能是该物种的功能。最后，如前所述，人类的瞳孔动力学与许多神经精神疾病有关。虽然这里使用的实验动物被认为是神经典型的，但在解释结果时必须牢记这一警告。
虽然这里描述了瞳孔测量的一种硬件实现（使用市售的眼动仪和神经数据采集系统），但所需的设备昂贵且扩大规模不经济。然而，基于红外眼动追踪相同基本原理的其他定制解决方案也可用，更具成本效益。例如，一项研究使用自定义组件和自定义视频处理算法从录制的视频中提取瞳孔直径22，25。最近开发的深度学习算法也能够从视频数据中提取瞳孔直径65，66。这些解决方案可以将瞳孔测量仪的成本降低一半以上。这里的权衡是在费用和时间之间 - 虽然商业解决方案更昂贵，但它们是开箱即用的交钥匙解决方案。另一方面，自定义解决方案具有成本效益且可扩展，但需要专业知识进行设置，以及开发自定义分析管道所需的时间。
尽管此处详述的方案是在正常听力全科医生中进行的，但瞳孔测量法在适当改变刺激类型和参数后，在其他听力障碍动物模型中相对容易使用。这将允许表征听力损失对一系列刺激类型和物种的影响，这可能会产生新的观察结果。由于瞳孔测量是一种非侵入性技术，也已广泛用于人类，通过使用与动物受试者相同的刺激，瞳孔测量可用于比较跨物种各种听觉病理的影响。例如，最近对人类进行的一项荟萃分析表明，当使用复杂且时间变化的刺激时，最好观察到由适度噪声暴露引起的语音噪声感知缺陷67。这里演示的通过瞳孔测量法估计呼叫噪声分类阈值可以用作使用复杂刺激来评估噪声暴露对GP的影响的一项此类任务。使用这些方法在行为水平上评估听力将补充电生理和解剖学方法，并且可以成为评估各种已知听力障碍的标准工具包的一部分。
总之，以下几点对于成功获取瞳孔测量数据至关重要。首先，为了确保高数据产量，让动物熟悉实验设置至关重要。在此步骤中缺乏耐心可能会降低最终获得的数据质量，或者需要重复几次会话来弥补丢失的会话。其次，为了避免与亮度相关的局部放电变化，重要的是在恒定的照明条件下进行实验，尽可能在会话和受试者之间保持这些条件。第三，为了尽量减少所需的实验次数，重要的是进行试点实验以确定密集采样的关键参数范围。第四，为了尽量减少动物对刺激的习惯，重要的是在短时间内进行实验，只包含一些偏差刺激的表现。另外可以使用气吹来保持与听觉刺激的高度接触。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH（R01DC017141），宾夕法尼亚狮子会听力研究基金会以及匹兹堡大学耳鼻喉科和神经生物学系的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analog output board | Measurement Computing Corporation, Norton, MA | PCI-DDA02/12 | |
| Anechoic foam | Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN | ||
| Condenser microphone | Behringer, Willich, Germany | C-2 | |
| Free-field microphone | Bruel & Kjaer, Denmark) | Type 4940 | |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA | 2018a version | |
| Monocular remote camera and illuminator system | Arrington Research, Scottsdale, AZ | MCU902 | Infrared LED array + camera with infrared filter |
| Multifunction I/O Device | National Instruments, Austin, TX | PCI-6229 | |
| Neural interface processor | Ripple Neuro, Salt Lake City, UT | SCOUT | |
| Piezoelectric motion sensor | SparkFun Electronics, Niwot, CO | SEN-10293 | |
| Pinch valve | Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL | EW98302-02 | |
| Programmable attenuator | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL | PA5 | |
| Silicon Tubing | Cole-Parmer | ~3 mm | |
| Sound attenuating chamber | IAC Acoustics | ||
| Speaker full-range driver | Tang Band Speaker, Taipei, Taiwan | W4-1879 | |
| Stereo Amplifier | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL | SA1 | |
| Tabletop - CleanTop Optical | TMC vibration control / Ametek, Peabody, MA | ||
| Viewpoint software | ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ |
References
- Steinhauer, S. R., Siegle, G. J., Condray, R., Pless, M. Sympathetic and parasympathetic innervation of pupillary dilation during sustained processing. International Journal of Psychophysiology. 52 (1), 77-86 (2004).
- Strauch, C., Wang, C. A., Einhäuser, W., Vander Stigchel, S., Naber, M. Pupillometry as an integrated readout of distinct attentional networks. Trends in Neurosciences. 45 (8), 635-647 (2022).
- Turnbull, P. R., Irani, N., Lim, N., Phillips, J. R. Origins of Pupillary Hippus in the autonomic nervous system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 197-203 (2017).
- Bradley, M. M., Miccoli, L., Escrig, M. A., Lang, P. J. The pupil as a measure of emotional arousal and autonomic activation. Psychophysiology. 45 (4), 602-607 (2008).
- Oliva, M., Anikin, A. Pupil dilation reflects the time course of emotion recognition in human vocalizations. Scientific Reports. 8 (1), 4871 (2018).
- Privitera, C. M., Renninger, L. W., Carney, T., Klein, S., Aguilar, M. Pupil dilation during visual target detection. Journal of Vision. 10 (10), 3 (2010).
- Zekveld, A. A., Koelewijn, T., Kramer, S. E. The pupil dilation response to auditory stimuli: Current state of knowledge. Trends in Hearing. 22, 2331216518777174 (2018).
- Alamia, A., VanRullen, R., Pasqualotto, E., Mouraux, A., Zenon, A. Pupil-linked arousal responds to unconscious surprisal. The Journal of Neuroscience. 39 (27), 5369-5376 (2019).
- Wang, C. A., et al. Arousal effects on pupil size, heart rate, and skin conductance in an emotional face task. Frontiers in Neurology. 9, 1029 (2018).
- Hess, E. H., Polt, J. M. Pupil size in relation to mental activity during simple problem-solving. Science. 143 (3611), 1190-1192 (1964).
- Kahneman, D., Beatty, J. Pupil diameter and load on memory. Science. 154 (3756), 1583-1585 (1966).
- Lisi, M., Bonato, M., Zorzi, M. Pupil dilation reveals top-down attentional load during spatial monitoring. Biological Psychology. 112, 39-45 (2015).
- Zhao, S., Bury, G., Milne, A., Chait, M. Pupillometry as an objective measure of sustained attention in young and older listeners. Trends in Hearing. 23, 2331216519887815 (2019).
- Steinhauer, S. R., Hakerem, G. The pupillary response in cognitive psychophysiology and schizophrenia. Annals of the New York Academy of Sciences. 658, 182-204 (1992).
- Thakkar, K. N., et al. Reduced pupil dilation during action preparation in schizophrenia. International Journal of Psychophysiology. 128, 111-118 (2018).
- Bitsios, P., Szabadi, E., Bradshaw, C. M. Relationship of the 'fear-inhibited light reflex' to the level of state/trait anxiety in healthy subjects. International Journal of Psychophysiology. 43 (2), 177-184 (2002).
- Burkhouse, K. L., Siegle, G. J., Gibb, B. E. Pupillary reactivity to emotional stimuli in children of depressed and anxious mothers. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 55 (9), 1009-1016 (2014).
- Nagai, M., Wada, M., Sunaga, N. Trait anxiety affects the pupillary light reflex in college students. Neuroscience Letters. 328 (1), 68-70 (2002).
- Giza, E., Fotiou, D., Bostantjopoulou, S., Katsarou, Z., Karlovasitou, A. Pupil light reflex in Parkinson's disease: evaluation with pupillometry. International Journal of Neuroscience. 121 (1), 37-43 (2011).
- You, S., Hong, J. H., Yoo, J. Analysis of pupillometer results according to disease stage in patients with Parkinson's disease. Scientific Reports. 11 (1), 17880 (2021).
- Fountoulakis, K. N., St Kaprinis, G., Fotiou, F. Is there a role for pupillometry in the diagnostic approach of Alzheimer's disease? a review of the data. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (1), 166-168 (2004).
- McGinley, M. J., David, S. V., McCormick, D. A. Cortical membrane potential signature of optimal states for sensory signal detection. Neuron. 87 (1), 179-192 (2015).
- McGinley, M. J., et al. Waking state: Rapid variations modulate neural and behavioral responses. Neuron. 87 (6), 1143-1161 (2015).
- Schwartz, Z. P., Buran, B. N., David, S. V. Pupil-associated states modulate excitability but not stimulus selectivity in primary auditory cortex. Journal of Neurophysiology. 123 (1), 191-208 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Yüzgeç, Ö, Prsa, M., Zimmermann, R., Huber, D. Pupil size coupling to cortical states protects the stability of deep sleep via parasympathetic modulation. Current Biology. 28 (3), 392-400 (2018).
- Kuchinsky, S. E., et al. Pupil size varies with word listening and response selection difficulty in older adults with hearing loss. Psychophysiology. 50 (1), 23-34 (2013).
- Winn, M. B., Wendt, D., Koelewijn, T., Kuchinsky, S. E. Best practices and advice for using pupillometry to measure listening effort: An introduction for those who want to get started. Trends in Hearing. 22, 2331216518800869 (2018).
- Zekveld, A. A., Kramer, S. E. Cognitive processing load across a wide range of listening conditions: insights from pupillometry. Psychophysiology. 51 (3), 277-284 (2014).
- Zekveld, A. A., Kramer, S. E., Festen, J. M. Cognitive load during speech perception in noise: the influence of age, hearing loss, and cognition on the pupil response. Ear and Hearing. 32 (4), 498-510 (2011).
- Koelewijn, T., Zekveld, A. A., Festen, J. M., Kramer, S. E. Pupil dilation uncovers extra listening effort in the presence of a single-talker masker. Ear and Hearing. 33 (2), 291-300 (2012).
- McCloy, D. R., Lau, B. K., Larson, E., Pratt, K. A. I., Lee, A. K. C. Pupillometry shows the effort of auditory attention switching. The Journal of the Acoustical Society of America. 141 (4), 2440 (2017).
- Piquado, T., Isaacowitz, D., Wingfield, A. Pupillometry as a measure of cognitive effort in younger and older adults. Psychophysiology. 47 (3), 560-569 (2010).
- Reilly, J., Kelly, A., Kim, S. H., Jett, S., Zuckerman, B. The human task-evoked pupillary response function is linear: Implications for baseline response scaling in pupillometry. Behavior Research Methods. 51 (2), 865-878 (2019).
- Zekveld, A. A., Kramer, S. E., Festen, J. M. Pupil response as an indication of effortful listening: the influence of sentence intelligibility. Ear and Hearing. 31 (4), 480-490 (2010).
- Winn, M. B., Edwards, J. R., Litovsky, R. Y. The impact of auditory Spectral Resolution on Listening Effort Revealed by Pupil Dilation. Ear and Hearing. 36 (4), 153-165 (2015).
- Ayasse, N. D., Wingfield, A. A Tipping point in listening effort: Effects of linguistic complexity and age-related hearing loss on sentence comprehension. Trends in Hearing. 22, 2331216518790907 (2018).
- Koelewijn, T., Versfeld, N. J., Kramer, S. E. Effects of attention on the speech reception threshold and pupil response of people with impaired and normal hearing. Hearing Research. 354, 56-63 (2017).
- Kramer, S. E., Kapteyn, T. S., Festen, J. M., Kuik, D. J. Assessing aspects of auditory handicap by means of pupil dilatation. Audiology. 36 (3), 155-164 (1997).
- Kuchinsky, S. E., et al. Speech-perception training for older adults with hearing loss impacts word recognition and effort. Psychophysiology. 51 (10), 1046-1057 (2014).
- Wendt, D., Hietkamp, R. K., Lunner, T. Impact of noise and noise reduction on processing effort: A pupillometry study. Ear and Hearing. 38 (6), 690-700 (2017).
- Winn, M. B. Rapid release from listening effort resulting from semantic context, and effects of spectral degradation and cochlear implants. Trends in Hearing. 20, 2331216516669723 (2016).
- Winn, M. B., Moore, A. N. Pupillometry reveals that context benefit in speech perception can be disrupted by later-occurring sounds, especially in listeners with Cochlear implants. Trends in Hearing. 22, 2331216518808962 (2018).
- Selezneva, E., Brosch, M., Rathi, S., Vighneshvel, T., Wetzel, N. Comparison of pupil dilation responses to unexpected sounds in monkeys and humans. Frontiers in Psychology. 12, 754604 (2021).
- Wetzel, N., Buttelmann, D., Schieler, A., Widmann, A. Infant and adult pupil dilation in response to unexpected sounds. Developmental Psychobiology. 58 (3), 382-392 (2016).
- Sokolov, E. N. Higher nervous functions; the orienting reflex. Annual Review of Physiology. 25, 545-580 (1963).
- Bala, A. D., Takahashi, T. T. Pupillary dilation response as an indicator of auditory discrimination in the barn owl. Journal of Comparative Physiology A. 186 (5), 425-434 (2000).
- Bala, A. D. S., Whitchurch, E. A., Takahashi, T. T. Human auditory detection and discrimination measured with the pupil dilation Response. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 21 (1), 43-59 (2020).
- Montes-Lourido, P., Kar, M., Kumbam, I., Sadagopan, S. Pupillometry as a reliable metric of auditory detection and discrimination across diverse stimulus paradigms in animal models. Scientific Reports. 11 (1), 3108 (2021).
- Coomber, B., et al. Neural changes accompanying tinnitus following unilateral acoustic trauma in the guinea pig. European Journal of Neuroscience. 40 (2), 2427-2441 (2014).
- Fan, L., et al. Pre-exposure to lower-level noise mitigates cochlear synaptic loss induced by high-level noise. Frontiers in Systems Neuroscience. 14, 25 (2020).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Huetz, C., Guedin, M., Edeline, J. M. Neural correlates of moderate hearing loss: time course of response changes in the primary auditory cortex of awake guinea-pigs. Frontiers in Systems Neuroscience. 8, 65 (2014).
- Lin, H. W., Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the Guinea pig cochlea after reversible noise-induced threshold shift. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (5), 605-616 (2011).
- Shi, L., et al. Ribbon synapse plasticity in the cochleae of Guinea pigs after noise-induced silent damage. PLoS One. 8 (12), 81566 (2013).
- Naert, G., Pasdelou, M. P., Le Prell, C. G. Use of the guinea pig in studies on the development and prevention of acquired sensorineural hearing loss, with an emphasis on noise. The Journal of the Acoustical Society of America. 146 (5), 3743 (2019).
- Montes-Lourido, P., Kar, M., Pernia, M., Parida, S., Sadagopan, S. Updates to the guinea pig animal model for in-vivo auditory neuroscience in the low frequency regime. Hearing Research. 424, 108603 (2022).
- Gao, L., Wang, X. Intracellular neuronal recording in awake nonhuman primates. Nature Protocols. 15 (11), 3615-3631 (2020).
- Lu, T., Liang, L., Wang, X. Neural representations of temporally asymmetric stimuli in the auditory cortex of awake primates. Journal of Neurophysiology. 85 (6), 2364-2380 (2001).
- Wichmann, F. A., Hill, N. J. The psychometric function: I. Fitting, sampling, and goodness of fit. Perception & psychophysics. 63 (8), 1293-1313 (2001).
- Kar, M., et al. Vocalization categorization behavior explained by a feature-based auditory categorization model. bioRxiv. , 483596 (2022).
- Schaeffer, D. J., Liu, C., Silva, A. C., Everling, S. Magnetic resonance imaging of marmoset monkeys. ILAR Journal. 61 (2-3), 274-285 (2020).
- Drucker, C. B., Carlson, M. L., Toda, K., DeWind, N. K., Platt, M. L. Non-invasive primate head restraint using thermoplastic masks. Journal of Neuroscience Methods. 253, 90-100 (2015).
- Meyer, A. F., O'Keefe, J., Poort, J. Two distinct types of eye-head coupling in freely moving mice. Current Biology. 30 (11), 2116-2130 (2020).
- Nath, T., et al. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
- DiNino, M., Holt, L. L., Shinn-Cunningham, B. G. Cutting through the noise: Noise-Induced cochlear synaptopathy and individual differences in speech understanding among listeners with normal audiograms. Ear and Hearing. 43 (1), 9-22 (2022).
