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Neuroscience

pupillometria per valutare la sensazione uditiva nelle cavie

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64581
Automatic Translation
1,2, 1,2,4, 1,2,6, 1,2,3,4,5
1Department of Neurobiology, University of Pittsburgh, 2Center for Neuroscience, University of Pittsburgh, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 4Center for Neural Basis of Cognition, University of Pittsburgh, 5Department of Communication Science and Disorders, University of Pittsburgh, 6Department of Transfer and Innovation, USC University Hospital Complex (CHUS), University of Santiago de Compostela

Summary

La pupillometria, una tecnica semplice e non invasiva, viene proposta come metodo per determinare le soglie uditive in animali udenti normali e modelli animali di varie patologie uditive.

Abstract

L'esposizione al rumore è una delle principali cause di perdita dell'udito neurosensoriale. I modelli animali di perdita dell'udito indotta dal rumore hanno generato informazioni meccanicistiche sulle patologie anatomiche e fisiologiche sottostanti della perdita dell'udito. Tuttavia, mettere in relazione i deficit comportamentali osservati negli esseri umani con perdita dell'udito e i deficit comportamentali nei modelli animali rimane difficile. Qui, la pupillometria è proposta come un metodo che consentirà il confronto diretto dei dati comportamentali animali e umani. Il metodo si basa su un paradigma stravagante modificato - abituando il soggetto alla presentazione ripetuta di uno stimolo e presentando in modo intermittente uno stimolo deviante che varia in qualche modo parametrico dallo stimolo ripetuto. La premessa fondamentale è che se il cambiamento tra lo stimolo ripetuto e deviante viene rilevato dal soggetto, innescherà una risposta di dilatazione della pupilla che è più grande di quella suscitata dallo stimolo ripetuto. Questo approccio è dimostrato utilizzando un compito di categorizzazione della vocalizzazione nelle cavie, un modello animale ampiamente utilizzato nella ricerca uditiva, compresi gli studi sulla perdita dell'udito. Presentando le vocalizzazioni di una categoria di vocalizzazione come stimoli standard e una seconda categoria come stimoli strani incorporati nel rumore a vari rapporti segnale-rumore, è dimostrato che l'entità della dilatazione della pupilla in risposta alla categoria oddball varia monotonamente con il rapporto segnale-rumore. Le analisi della curva di crescita possono quindi essere utilizzate per caratterizzare il decorso temporale e la significatività statistica di queste risposte di dilatazione della pupilla. In questo protocollo vengono descritte procedure dettagliate per acclimatare le cavie all'installazione, condurre la pupillometria e valutare / analizzare i dati. Sebbene questa tecnica sia dimostrata in cavie con udito normale in questo protocollo, il metodo può essere utilizzato per valutare gli effetti sensoriali di varie forme di perdita dell'udito all'interno di ciascun soggetto. Questi effetti possono quindi essere correlati con misure elettrofisiologiche concomitanti e osservazioni anatomiche post-hoc.

Introduction

Il diametro della pupilla (PD) può essere influenzato da un ampio numero di fattori e la misurazione del PD che cambia nel tempo è nota come pupillometria. Il PD è controllato dal muscolo sfintere dell'iride (coinvolto nella costrizione) e dal muscolo dilatatore dell'iride (coinvolto nella dilatazione). Il muscolo costrittivo è innervato dal sistema parasimpatico e comporta proiezioni colinergiche, mentre il dilatatore dell'iride è innervato dal sistema simpatico che coinvolge proiezioni noradrenergiche e colinergiche 1,2,3. Lo stimolo più noto per indurre cambiamenti di PD è la costrizione della luminanza e le risposte di dilatazione della pupilla possono essere prodotte da variazioni nell'intensità della luce ambientale2. Il PD cambia anche in funzione della distanza focale2. È noto da decenni, tuttavia, che il PD mostra anche fluttuazioni non legate alla luminanza 4,5,6,7. Ad esempio, i cambiamenti negli stati mentali interni possono provocare cambiamenti transitori di PD. La pupilla si dilata in risposta a stimoli emotivamente carichi o aumenta con l'eccitazione 4,5,8,9. La dilatazione della pupilla potrebbe anche essere correlata ad altri meccanismi cognitivi, come l'aumento dello sforzo mentale o dell'attenzione10,11,12,13. A causa di questa relazione tra variazioni delle dimensioni della pupilla e stati mentali, i cambiamenti del PD sono stati esplorati come marker di disturbi clinici come la schizofrenia 14,15, l'ansia 16,17,18, il morbo di Parkinson 19,20 e il morbo di Alzheimer 21 , tra gli altri. Negli animali, i cambiamenti di PD tracciano gli stati comportamentali interni e sono correlati con i livelli di attività neuronale nelle aree corticali22,23,24,25. Il diametro della pupilla ha anche dimostrato di essere un indicatore affidabile dello stato di sonno nei topi26. Questi cambiamenti PD legati all'eccitazione e allo stato interno si verificano tipicamente su lunghe scale temporali dell'ordine di diverse decine di secondi.

Nel campo della ricerca sull'udito, sia nei soggetti con udito normale che in soggetti con problemi di udito, lo sforzo di ascolto e la percezione uditiva sono stati valutati utilizzando la pupillometria. Questi studi coinvolgono in genere soggetti di ricerca addestrati27,28,29,30 che svolgono vari tipi di compiti di rilevamento o riconoscimento. A causa della suddetta relazione tra eccitazione e PD, è stato dimostrato che l'aumento del coinvolgimento del compito e dello sforzo di ascolto è correlato con un aumento delle risposte di dilatazione della pupilla 30,31,32,33,34,35. Pertanto, la pupillometria è stata utilizzata per dimostrare che viene speso un maggiore sforzo di ascolto per riconoscere il parlato spettralmente degradato negli ascoltatori con udito normale29,36. Negli ascoltatori con problemi di udito, come gli esseri umani con perdita dell'udito legata all'età 27,30,37,38,39,40,41 e gli utenti di impianti cocleari 42,43, anche le risposte della pupilla sono aumentate con la diminuzione dell'intelligibilità del parlato; Tuttavia, gli ascoltatori con problemi di udito hanno mostrato una maggiore dilatazione della pupilla in condizioni di ascolto più facili rispetto ai normali soggetti uditivi 27,30,37,38,39,40,41,42,43. Ma gli esperimenti che richiedono all'ascoltatore di eseguire un compito di riconoscimento non sono sempre possibili, ad esempio nei neonati o in alcuni modelli animali. Pertanto, le risposte della pupilla non legate alla luminanza evocate da stimoli acustici potrebbero essere un metodo alternativo praticabile per valutare il rilevamento uditivo in questi casi44,45. Studi precedenti hanno dimostrato una dilatazione della pupilla transitoria e legata allo stimolo come parte del riflesso di orientamento46. Studi successivi hanno dimostrato l'uso di dilatazioni della pupilla legate allo stimolo per derivare curve di sensibilità alla frequenza nei gufi47,48. Recentemente, questi metodi sono stati adattati per valutare la sensibilità della risposta alla dilatazione della pupilla nei neonati umani48. La pupillometria ha dimostrato di essere un approccio affidabile e non invasivo per stimare le soglie di rilevamento e discriminazione uditiva nelle cavie (GP) che ascoltano passivamente utilizzando una vasta gamma di stimoli semplici (toni) e complessi (vocalizzazioni GP)49. Questi cambiamenti PD correlati allo stimolo si verificano tipicamente su scale temporali più veloci dell'ordine di diversi secondi e sono collegati alla tempistica dello stimolo. Qui, la pupillometria dei cambiamenti PD correlati allo stimolo viene proposta come metodo per studiare gli impatti comportamentali di vari tipi di problemi uditivi in modelli animali. In particolare, vengono descritti i protocolli di pupillometria per l'uso nei medici generici, un modello animale consolidato di vari tipi di patologie uditive 50,51,52,53,54,55,56 (vedi anche riferimento 57 per una revisione esaustiva).

Sebbene questa tecnica sia dimostrata nei medici di base con udito normale, questi metodi possono essere facilmente adattati ad altri modelli animali e modelli animali di varie patologie uditive. È importante sottolineare che la pupillometria può essere combinata con altre misurazioni non invasive come l'EEG, nonché con registrazioni elettrofisiologiche invasive al fine di studiare i meccanismi alla base di possibili deficit di rilevamento e percezione del suono. Infine, questo approccio può anche essere utilizzato per stabilire ampie somiglianze tra modelli umani e animali.

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Protocol

Per tutte le procedure sperimentali, ottenere l'approvazione dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e aderire alle linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Negli Stati Uniti d'America, i medici generici sono inoltre soggetti alle normative del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA). Tutte le procedure di questo protocollo sono state approvate dall'Università di Pittsburgh IACUC e hanno aderito alle linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Per questo esperimento, sono stati utilizzati tre GP maschi wildtype, pigmentati tra i 4 ei 10 mesi di età, con ~ 600-1.000 g di peso.

1. Procedura chirurgica

  1. Eseguire tutti gli esperimenti di pupillometria in medici generici pigmentati svegli, fissi sulla testa e in ascolto passivo. Verificare l'udito normale in soggetti sperimentali utilizzando registrazioni di clic e risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) a tono puro58.
    NOTA: Sebbene l'acquisizione dei dati della pupillometria sia di per sé non invasiva, in questo protocollo viene utilizzata una chirurgia post-impianto della testa invasiva per immobilizzare la testa dell'animale durante la procedura. Le alternative sono presentate nella sezione Discussione.
  2. In primo luogo, impiantare tutti gli animali da esperimento con un palo della testa in acciaio inossidabile per il fissaggio della testa in anestesia isoflurano. Utilizzare tecniche chirurgiche asettiche per ancorare il palo della testa al cranio impiegando una combinazione di viti ossee e acrilico dentale58.
  3. Fornire agli animali cure post-chirurgiche, compresa la somministrazione di analgesici sistemici e topici. Dopo un periodo di recupero di 2 settimane, acclimatare gradualmente gli animali alla configurazione sperimentale.
    NOTA: La procedura chirurgica si basa su metodi precedentemente pubblicati nei GP58 e in altre specie59,60 e non è al centro di questo protocollo.

2. Acclimatazione animale alla configurazione sperimentale

NOTA: Gli esperimenti si svolgono tipicamente in una camera o cabina acusticamente attenuata (vedi Tabella dei materiali). Il tempo necessario per familiarizzare un animale con l'impostazione varia da soggetto a soggetto. I tempi di acclimatazione tipici sono indicati di seguito. Un animale ben acclimatato tollererà la fissazione della testa con un movimento corporeo minimo e si tradurrà in migliori misurazioni del diametro della pupilla.

  1. Dopo un periodo di recupero di 2 settimane, prima familiarizzare gli animali alla manipolazione e al trasporto (2-3 giorni). Questo acclimatamento è essenziale per ridurre lo stress e l'ansia. Per familiarizzare l'animale con la manipolazione, posizionarlo nel suo contenitore di trasporto per quantità crescenti di tempo (10-30 min) e maneggiare l'animale per quantità crescenti di tempo (10-30 min).
  2. Quindi, acclimatare l'animale alla configurazione sperimentale (2-3 giorni) mettendo l'animale in un recinto per 10-45 minuti (Figura 1A). Il recinto deve consentire piccoli cambiamenti posturali per il comfort dell'animale durante l'esperimento. Consentire piccoli cambiamenti posturali per il comfort dell'animale durante l'esperimento. Tuttavia, è noto che la dilatazione della pupilla precede il movimento49. Pertanto, misurare il movimento dell'animale e tenere conto di questo movimento nell'analisi dei dati (Figura 1C).
  3. Come parte di questo acclimatamento, maneggiare manualmente il palo della testa impiantato, come se l'animale dovesse essere fissato alla testa. Tenere il palo di testa per durate crescenti (10-60 s).
  4. Dopo l'acclimatazione manuale e a seconda del comportamento dell'animale, provare a fissare l'animale su un telaio rigido usando il supporto dell'impianto.
  5. Aumentare lentamente la durata della fissazione della testa (10-45 min) fino a quando l'animale è calmo e relativamente immobile mentre è fissato con la testa (2-3 giorni).
  6. Abituare l'animale alla presenza della fotocamera, della sorgente luminosa IR e della fonte di luce bianca (1-2 giorni). Accendi la luce bianca, aumentando gradualmente la durata (da 10 minuti a 30 minuti).
  7. Abituare l'animale alla stimolazione acustica riproducendo una varietà di suoni (ad esempio, toni puri, clic, vocalizzazioni) a diversi livelli sonori (1-2 giorni, in concomitanza con il passo 2.6). Per ridurre al minimo l'assuefazione agli stimoli sperimentali, utilizzare suoni diversi da quelli pianificati per gli esperimenti di pupillometria in questa fase.

3. Calibrazione della telecamera pupillare

NOTA: la telecamera utilizzata per la pupillometria trasmette un video tramite USB alla suite software per pupillometria. Da questo video, il diametro della pupilla viene estratto utilizzando un adattamento ellittico e un valore di soglia regolabile dall'utente dalla suite software per pupillometria (vedere Tabella dei materiali). Il software si interfaccia quindi con una scheda digitale-analogica. La scheda emette un valore di tensione analogico proporzionale al diametro della pupilla. La calibrazione è necessaria per convertire questo valore di tensione nel diametro della pupilla in unità di lunghezza.

  1. Posizionare un foglio di carta contenente immagini di dischi neri di diametro noto nella stessa posizione in cui si troverà l'occhio del medico di famiglia durante la pupillometria. Per i GP, il PD è nell'intervallo di 4 mm. Pertanto, eseguire la calibrazione utilizzando dischi da 3 mm, 4 mm e 5 mm.
  2. Posizionare la telecamera pupillometrica (vedi Tabella dei materiali) alla stessa distanza (25 cm) alla quale verranno eseguiti gli esperimenti. Regolare l'apertura e la messa a fuoco della fotocamera fino ad ottenere un'immagine nitida di un disco di diametro noto.
  3. Nel software di acquisizione della pupillometria (vedere Tabella dei materiali), regolare la soglia in modo che il contorno dell'adattamento dell'ellisse corrisponda strettamente al disco di cui è stata eseguita l'immagine e annotare il valore della tensione di uscita analogica e il ridimensionamento.
  4. Ripetere questa procedura per i dischi da 3 mm, 4 mm e 5 mm. Quindi, tabulare i valori di diametro effettivo (in mm) corrispondenti ai valori di tensione di uscita analogici.

4. Acquisizione dati pupillometrici

  1. Esegui tutti gli esperimenti in una cabina o camera attenuata dal suono, con le pareti interne ricoperte di schiuma anecoica.
  2. Per l'erogazione dello stimolo in campo libero, montare un altoparlante calibrato sulla parete della camera attenuata dal suono, ad un'altezza uguale alla posizione in cui verrà posizionato l'animale.
    NOTA: La scelta dell'altoparlante dipende dalla specie studiata e dagli stimoli previsti. Per le vocalizzazioni GP, utilizzare un altoparlante driver full-range con una risposta in frequenza relativamente piatta (±3 dB) nella gamma di frequenza di vocalizzazione di 0,5-3 kHz (Figura 1A).
  3. Collocare l'animale nel recinto assicurandosi che non siano possibili grandi movimenti del corpo (Figura 1A). Fissare la testa dell'animale al telaio rigido come descritto al punto 2 (Figura 1A).
  4. Posizionare un sensore piezoelettrico sotto l'involucro per rilevare e registrare i movimenti degli animali (Figura 1A).
  5. Per impostare il soffio d'aria, utilizzare un supporto fissato al piano del tavolo per posizionare una punta di pipetta a ~ 15 cm davanti al muso dell'animale. Collegare un tubo di silicio (~ 3 mm di diametro) alla punta della pipetta e collegare il tubo a un cilindro pneumatico regolato.
  6. Mantenere la pressione dell'aria del cilindro tra 20 e 25 psi. Far passare il tubo attraverso una valvola a manicotto per controllare i tempi e la durata del soffio d'aria utilizzando un relè controllato da computer.
  7. Illuminare l'occhio con un array di LED a infrarossi posizionato a ~ 10 cm di distanza. Utilizzare l'illuminazione a LED bianca con un'intensità di ~2.000 cd/m2 per illuminare l'occhio ripreso e portare il PD di base a ~3,5 mm. Mantenere condizioni di illuminazione costanti nella camera sperimentale durante le sessioni sperimentali.
    NOTA: Nella normale illuminazione di laboratorio (~500 cd/m2), la pupilla GP è abbastanza dilatata e non consente l'osservazione di ulteriori dilatazioni legate allo stimolo. Utilizzando un'illuminazione aggiuntiva, la pupilla viene portata a un diametro di base di ~ 3,5 mm, consentendo una gamma dinamica sufficiente per osservare la dilatazione legata allo stimolo. Ciò garantisce anche linee di base coerenti tra sessioni e soggetti.
  8. Aprire il software di acquisizione della pupilla e acquisire il video (a 90 fps) della pupilla utilizzando una telecamera con obiettivo da 16 mm (risoluzione spaziale di 0,15° angolo visivo) e filtro a infrarossi (IR) posto a una distanza di 25 cm dall'occhio ripreso. Assicurati che l'occhio sia centrato nell'area visualizzata.
  9. Regolare l'apertura e la messa a fuoco della fotocamera, nonché il livello IR fino a quando il contorno della pupilla riprestata non è a fuoco nitido.
  10. Nel software di acquisizione pupille, definire l'area di interesse contenente la pupilla selezionando un'area rettangolare con il mouse.
  11. Utilizzare il pannello di controllo del software di acquisizione pupilla per regolare la luminosità e il contrasto del video acquisito. Impostare la densità di scansione su 5 e regolare la soglia in modo che l'adattamento dell'ellisse corrisponda strettamente al contorno della pupilla nel video.
  12. Utilizzando il software del processore di interfaccia neurale, acquisire e salvare il segnale analogico dalla traccia PD, la traccia di tensione dal movimento di registrazione del sensore piezoelettrico, i tempi di erogazione dello stimolo e i tempi di erogazione del soffio d'aria.

5. Rilevamento del rumore di chiamata in entrata e discriminazione categoriale utilizzando un paradigma oddball modificato

NOTA: Gli stimoli per gli esperimenti di pupillometria consistevano in vocalizzazioni GP registrate in una colonia animale58. Gli esempi di vocalizzazione sono disponibili nel seguente repository: https://github.com/vatsunlab/CaviaVOX. In particolare, sono state utilizzate chiamate sibilanti e piagnucolose per suscitare le risposte degli alunni mostrate nei risultati rappresentativi. Da ogni categoria, scegli vocalizzazioni le cui lunghezze sono approssimativamente uguali. Per tenere conto delle differenze nell'ampiezza di registrazione e negli inviluppi temporali delle vocalizzazioni, normalizzare le vocalizzazioni in base alle loro ampiezze quadratiche medie (r.m.s.), se necessario.

  1. Presenta gli stimoli uditivi utilizzando MATLAB a una frequenza di campionamento appropriata. Per i medici generici, che sono animali udenti a bassa frequenza, è sufficiente una frequenza di campionamento di 100 kHz.
  2. Seleziona otto diversi esempi di vocalizzazioni GP di lunghezze simili da due diverse categorie di vocalizzazioni (ad esempio, chiamate wheek e chiamate di piagnistei). Una categoria (otto esemplari) servirà come stimoli standard e l'altra categoria (otto esemplari) servirà come stimoli strani o devianti (Figura 2A).
  3. Per generare stimoli standard e devianti lunghi 1 s incorporati nel rumore a diversi livelli di rapporto segnale-rumore (SNR), aggiungere rumore bianco di uguale lunghezza alle chiamate (rumore gated). L'intervallo di SNR campionati in questo esperimento è compreso tra -24 dB SNR e +40 dB SNR.
  4. Utilizzando un design a blocchi, in ogni sessione sperimentale (~ 12 min di durata), acquisire dati corrispondenti a un singolo livello SNR. In ogni sessione, utilizzare otto esemplari di una categoria di vocalizzazione in un particolare SNR come stimoli standard e otto esemplari dell'altra categoria di vocalizzazione allo stesso livello SNR come stimoli devianti.
    NOTA: Un tipico blocco sperimentale dura ~ 12 minuti. A seconda del comportamento dell'animale e dell'assuefazione alle risposte della pupilla, potrebbe essere possibile acquisire dati per 3-4 blocchi ogni giorno (~ 45 - 60 minuti). Per tutta questa durata, monitorare attentamente l'animale tramite il video della pupilla, la traccia di movimento e direttamente tra i blocchi.
  5. Per ogni sessione, prepara una sequenza di presentazione di stimoli pseudocasuali che contenga stimoli standard >90% delle volte. Assicurarsi che tra gli stimoli devianti, ci siano almeno 20 prove con stimoli standard (Figura 2B).
    NOTA: A seconda dell'esperimento, l'ordinamento degli stimoli devianti all'interno della sequenza di presentazione dello stimolo può adottare un disegno quadrato latino per garantire che ogni singolo stimolo deviante occupi una posizione sequenziale unica in ogni sessione. La media su tutte le sessioni può quindi ridurre al minimo l'effetto della posizione dello stimolo deviante all'interno della sequenza complessiva dello stimolo.
  6. Utilizzare un'intensità di stimolo fissa (ad esempio, 85 dB SPL) per tutte le presentazioni dello stimolo.
    NOTA: utilizzare un convertitore digitale-analogico appropriato per generare un segnale audio, attenuarlo al livello sonoro desiderato utilizzando un attenuatore programmabile, potenziare il segnale ed erogare il segnale utilizzando un altoparlante calibrato (ad esempio, hardware, vedere la tabella dei materiali).
  7. Presentare gli stimoli con elevata regolarità temporale (1 s di stimolo seguito da 3 s di silenzio come mostrato nei risultati rappresentativi).
    NOTA: Le risposte di dilatazione della pupilla sono lente, in genere raggiungono un picco di circa 1 s dopo l'inizio dello stimolo e impiegano circa 5 s per tornare al basale49. Il tasso di presentazione dello stimolo deve essere abbastanza basso da tenere conto di queste scale temporali lente. La regolarità temporale è importante perché è possibile che l'interruzione del modello temporale possa agire come uno stimolo deviante.
  8. Per mantenere l'impegno dell'animale con gli stimoli e ridurre al minimo l'assuefazione, facoltativamente fornire un breve soffio d'aria (100 ms) dopo lo stimolo deviante. Assicurarsi che l'inizio del soffio d'aria sia sufficientemente separato dalla durata dello stimolo (2,5 s dall'inizio dello stimolo) in modo che le risposte di dilatazione della pupilla evocate dallo stimolo raggiungano un picco prima che gli artefatti del soffio d'aria indotti dall'ammiccamento.
    NOTA: Nel classico paradigma stravagante, non vengono utilizzati rinforzi positivi o negativi. Poiché un soffio d'aria viene utilizzato qui come rinforzo leggermente avversivo per mantenere l'impegno dell'animale con gli stimoli uditivi, il paradigma è indicato come un paradigma strano modificato.

6. Analisi e statistiche

NOTA: Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando codice personalizzato scritto in MATLAB (disponibile su https://github.com/vatsunlab/GP_Pupil). Vengono descritti due metodi di analisi principali, che affrontano rispettivamente l'affidabilità e il decorso temporale delle risposte degli alunni. La scelta di uno o entrambi i metodi sarà dettata dal disegno sperimentale.

  1. Rilevamento del movimento ed esclusione della prova
    1. Utilizzando il codice pupil_avg_JOVE.m, eseguire il rilevamento del movimento e l'esclusione della versione di prova per ogni sessione. Per fare ciò, eseguire il codice e selezionare il file di dati da una singola sessione nella finestra di dialogo popup.
    2. Detrend linearmente la traccia PD e convertire le unità da tensione a micrometri utilizzando la tabella di calibrazione derivata in precedenza (vedi passo 3). Inoltre, detrend linearmente la traccia di movimento sull'intera sessione di registrazione (~12 min).
    3. Ispezionare i dati della sessione tracciando la traccia della pupilla (Figura 1B - riga superiore) e la traccia del movimento linearmente detrended (Figura 1B- riga inferiore) sulla durata della sessione (~12 min), sovrapposta ai marcatori di prova.
    4. Misurare la deviazione standard (SD) della traccia di movimento. Ottieni i tempi dei picchi di traccia del movimento usando la funzione findpeaks in MATLAB. Si considerino i picchi che hanno superato una soglia di 5 SD e che sono separati dagli altri picchi di almeno 1 s come evento di movimento49 (Figura 1B - in basso).
    5. Scartare qualsiasi prova (sia standard che deviante) di dilatazione della pupilla che si verifica entro 7 secondi da un evento di movimento. Se più della metà del numero di prove devianti viene scartato a causa della dilatazione della pupilla correlata al movimento, scartare l'intera sessione e ripeterla.
  2. Pre-elaborazione e visualizzazione dei dati
    1. Utilizzare il codice pupil_avg_JOVE.m, per rimuovere gli artefatti del battito delle palpebre, pre-elaborare i dati e ottenere la dilatazione media della pupilla a ogni stimolo tra le sessioni. Per fare ciò, eseguire il codice e selezionare tutti i file di dati da analizzare nella finestra di dialogo popup.
    2. Rilevare le palpebre oculari (cambiamenti del PD superiori a 400 μm/ms) e rimuoverli interpolando linearmente la traccia PD in una finestra temporale di 200 ms centrata al momento del battito di ciglia rilevato. Scartare i dati della sessione se più della metà del numero di studi devianti contiene un battito di ciglia tra l'inizio dello stimolo e l'inizio del soffio d'aria.
    3. Downsampling dei dati PD dalla frequenza di campionamento di acquisizione da 1.000 Hz a 10 Hz.
    4. Estrarre le tracce di PD in una finestra che inizia 1 s prima dell'inizio dello stimolo e dura 5 s dopo l'offset dello stimolo. Calcola la PD basale media per ogni stimolo in una finestra di 500 ms appena prima dell'inizio dello stimolo. Sottrarre il PD basale da queste tracce per ottenere il cambiamento evocato dallo stimolo nel PD.
    5. Calcola la media dei cambiamenti di PD evocati dallo stimolo per ciascuna condizione di stimolo tra le sessioni all'interno di ciascun animale e quindi tra gli animali per generare la risposta media di dilatazione della pupilla a ciascuna condizione di stimolo (ad esempio, Figura 3A).
  3. Analisi della curva di crescita (GCA) per quantificare il decorso temporale delle variazioni del PD
    NOTA: Questo metodo di analisi determina l'entità e il decorso temporale delle risposte di dilatazione della pupilla ed è stato utilizzato negli studi pupillometrici su soggetti umani 27,36,40 e su cavie 49.
    1. Concatenare verticalmente tutte le uscite da pupil_avg_JOVE.m per tutte le sessioni, animali, SNR e attenuazioni per costruire una matrice contenente le seguenti colonne: animalID, SNR, livello sonoro e valori di diametro Pupilla (1-50). Utilizzando il codice pupil_LME_JOVE.m, eseguire l'analisi della curva di crescita (GCA)27,36,40,49.
    2. Adattare modelli lineari ad effetto misto con intercettazioni a livello di soggetto come effetti casuali e polinomi temporali ortogonali fino a due di ordine come effetti fissi, con ogni SNR deviante trattato come un gruppo separato, alla fase ascendente della traccia del diametro della pupilla (da 0,1 a 2,1 s dopo l'inizio dello stimolo).
    3. Modella la fase ascendente del tracciato pupillare usando la seguente formula36,49:
      Pupildilatazione = (Intercetta + Condizione) + tempo1 * (β tempo1 + β tempo1: Condizione) + tempo2* (β tempo2+ β tempo2: Condizione) + r(subjectlevelintercept)
      Dove, tempo1 e tempo2 corrispondono a polinomi temporali lineari e quadratici ortogonali e βs corrispondono a pesi.
    4. Stimare i pesi medi (βs) e i loro errori standard utilizzando la funzione fitlme in MATLAB. Stimare la significatività statistica dei pesi utilizzando la funzione coeftest.
    5. Per ogni SNR, tracciare i pesi corrispondenti ai termini di intercetta, lineari e quadratici per visualizzare i risultati (Figura 3B, C).
  4. Analisi degli studi che mostrano dilatazioni della pupilla statisticamente significative
    NOTA: Questo metodo di analisi determina la frazione di prove devianti in cui si osserva una risposta di dilatazione della pupilla statisticamente significativa e corrisponde all'affidabilità delle risposte di dilatazione della pupilla.
    1. Scegli una finestra di analisi appropriata (0,5-1 s) centrata attorno al picco della risposta della pupilla (di solito ~ 1,5 s dopo l'inizio dello stimolo). Calcolare la PD media in questa finestra di analisi per tutti gli studi standard e devianti.
    2. Determinare se la PD media per ciascuno degli studi devianti è maggiore di 2,33 errori standard della distribuzione aggregata dei valori medi di PD per gli studi standard. Conta le prove devianti che superano questa soglia come prove che mostrano una significativa dilatazione della pupilla.
    3. Dividere il numero di studi devianti che mostrano una significativa dilatazione della pupilla per il numero totale di studi devianti (per ogni condizione) per quantificare la frazione di studi che mostrano aumenti statisticamente significativi della malattia di Parkinson rispetto agli studi di stimolo standard.
    4. Metti tutta la percentuale di sessioni di prove con cambiamenti significativi della pupilla in ogni cella di un array di cellule, dove le cellule sono disposte da SNR inferiore a più alto. Utilizzando il codice pupil_threshold_estimate_JOVE.m, stimare la soglia di categorizzazione del rumore di chiamata.
    5. Tracciare la frazione di studi che mostrano un aumento statisticamente significativo del PD in funzione del SNR (Figura 3D). Per questi dati, utilizzare la funzione fitnlm MATLAB (nella casella degli strumenti delle statistiche) per adattare le funzioni psicometriche del modulo61:
      Ψ(x; α, β, λ) = (1 -λ) * F(x; α, β)
      Dove, F è la funzione di Weibull, definita come
      F(x; α, β) = Equation 1, α è il parametro di spostamento, β è il parametro di pendenza e λ è la velocità di caduta.

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Representative Results

La pupillometria è stata eseguita in tre GP pigmentati maschili, del peso di ~ 600-1.000 g nel corso degli esperimenti. Come descritto in questo protocollo, per stimare le soglie di categorizzazione del call-in-noise, è stato utilizzato un paradigma stravagante per la presentazione dello stimolo. Nel paradigma oddball, i richiami appartenenti a una categoria (whines) incorporati nel rumore bianco in un dato SNR sono stati impiegati come stimoli standard (Figura 2A), e le chiamate da un'altra categoria (wheeks) incorporate nel rumore bianco allo stesso SNR (Figura 2A) come stimoli devianti. Gli stimoli standard e devianti sono stati scelti casualmente, con ricampionamento, da otto esemplari di ogni categoria. In ogni sessione sperimentale, gli stimoli sono stati presentati con elevata regolarità temporale (Figura 2B), con almeno 20 presentazioni di stimoli standard tra stimoli devianti. Sono stati acquisiti dati corrispondenti a un particolare livello SNR in ogni sessione sperimentale. Durante le sessioni, è stata campionata un'ampia gamma di SNR puliti e rumorosi (-24, -18, -12, -6, -3, 0, 3, 6, 12, 40 dB SNR).

Le modifiche del PD agli stimoli standard non differivano significativamente dalla linea di base (linea blu nella Figura 3A). Gli stimoli devianti hanno evocato cambiamenti di PD robusti e significativamente più grandi di quelli suscitati dagli stimoli standard (linee grigie nella Figura 3A), riflettendo la discriminazione della categoria di chiamata. L'entità della risposta e la percentuale di studi con risposte statisticamente significative della pupilla erano più alte al SNR più pulito e diminuivano gradualmente con la diminuzione dell'SNR (Figura 3A, B). Utilizzando GCA, le risposte della pupilla agli stimoli devianti sono risultate statisticamente significative a SNR superiori a -18 dB (Figura 3C), che è stata presa come soglia di categorizzazione del rumore di chiamata (linea verde nella Figura 3A). La percentuale di studi significativi a ciascun livello SNR testato era ben adattata da una funzione psicometrica (Figura 3D). Il livello SNR necessario per raggiungere il mezzo massimo della curva psicometrica era di circa -20 dB SNR (Figura 3D). Aneddoticamente, per questo caso, le metriche basate sull'affidabilità e sul corso del tempo hanno prodotto valori simili di soglie di categorizzazione del rumore di chiamata.

Figure 1
Figura 1: Impostazione della pupillometria e cambiamenti PD evocati dallo stimolo e correlati al movimento. (A) L'impostazione della pupillometria con immagini video della dilatazione della pupilla evocata dal suono (in alto). La linea di base PD è mostrata da cerchi verdi tratteggiati. (B) Una traccia PD esemplare (in alto) e una traccia di movimento esemplare (in basso) da una singola sessione sperimentale. Le linee nere verticali corrispondono alle presentazioni di stimoli devianti nel tempo di inizio. I segni di spunta rossi corrispondono agli eventi di movimento rilevati automaticamente. La linea tratteggiata orizzontale grigia corrisponde alla soglia 5 SD. (C) I cambiamenti PD (ΔPD) evocati da stimoli devianti (in alto) e correlati a eventi di movimento (in basso) da una sessione sperimentale. L'inizio dello stimolo è mostrato dalla linea nera verticale; Il rilevamento dell'evento di movimento è mostrato da una linea rossa verticale. Si noti che l'inizio della dilatazione della pupilla precede l'inizio del movimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Spettrogrammi di chiamata e struttura del paradigma di categorizzazione del rumore di chiamata . (A) Spettrogrammi rappresentativi di un porcellino d'India che piagnucola e sibila, in condizioni pulite e a 0 e -18 dB SNR, rispettivamente. Le chiamate rumorose sono state ottenute aggiungendo rumore bianco. (B) Struttura del paradigma oddball utilizzato per stimare le soglie di categorizzazione del call-in-noise. I richiami di lamento sono stati scelti casualmente tra otto esemplari e utilizzati come stimoli standard. I richiami Wheek sono stati scelti casualmente tra otto esemplari e usati come devianti. In ogni sessione sperimentale, il rumore è stato aggiunto a un diverso livello SNR (-24, -18, -12, -6, -3, 0, 3, 6, 12 dB SNR). Le chiamate sono lunghe 1 s e il tempo tra gli stimoli è di 3 s. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Stime pupillometriche dei rilevamenti di rumore di chiamata in entrata e delle soglie di categorizzazione . (A) Risposte medie degli alunni di tre animali. Le risposte medie della pupilla agli stimoli di lamento standard sono rappresentate da una linea blu e l'ombreggiatura corrisponde all'errore medio ±1 (s.e.m.). Le linee grigie e le ombreggiature corrispondono alla media e ±1 s.e.m. delle risposte della pupilla evocate da stimoli sibilanti devianti. L'intensità dell'ombreggiatura dei grigi corrisponde a SNR. La linea verde e l'ombreggiatura corrispondono alla traccia media della pupilla alla soglia SNR (circa -18 dB SNR). La linea verticale rossa corrisponde all'inizio dello stimolo; la linea verticale arancione corrisponde all'inizio del soffio d'aria; le linee tratteggiate verde acqua corrispondono alla finestra GCA (PD cambia fase ascendente). (B) GCA adatta alla fase crescente dei cambiamenti del PD. I punti sono il diametro medio della pupilla in contenitori temporali di 100 ms, i baffi corrispondono a ±1 s.e.m. Le linee continue corrispondono ai modelli a effetti misti. Colori delle linee come in A. (C) Stime del peso GCA. I pesi dell'intercetta sono in blu, la pendenza è in rosso e l'accelerazione è in viola. I baffi corrispondono a ±1 s.e.m. Gli asterischi mostrano pesi di regressione statisticamente significativi (test di ipotesi lineare sui coefficienti del modello di regressione lineare). (D) Funzione psicometrica adatta alla percentuale di studi con cambiamenti significativi di PD indotti dallo stimolo deviante in funzione del SNR. I baffi corrispondono a ±1 s.e.m. Si noti che il 50% del massimo viene raggiunto a circa -20 dB SNR (linea tratteggiata verde). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo dimostra l'uso della pupillometria come metodo non invasivo e affidabile per stimare le soglie uditive in animali che ascoltano passivamente. Seguendo il protocollo qui descritto, sono state stimate le soglie di categorizzazione del rumore di chiamata nei medici generici con udito normale. Le soglie stimate utilizzando la pupillometria sono risultate coerenti con quelle ottenute utilizzando l'addestramento operante62. Rispetto alla formazione operativa, tuttavia, il protocollo di pupillometria era relativamente semplice e veloce da configurare e acquisire dati. Ogni sessione di acquisizione dati (per livello SNR) è durata circa 12 minuti, il che ha comportato 1-2 ore di sessioni sperimentali (attraverso i livelli SNR) per animale al giorno49. L'acquisizione dei dati potrebbe essere completata in circa 7-10 giorni (a seconda del numero di livelli SNR utilizzati). Sebbene il paradigma oddball sia stato utilizzato per la stima della soglia di categorizzazione call-in-noise in questo manoscritto, questo protocollo di pupillometria può essere adattato a versioni più semplici di paradigmi oddball, in cui viene utilizzato un solo esempio di chiamata, o ad altri paradigmi di stimolo che utilizzano una vasta gamma di stimoli complessi o semplici49.

Il metodo non è privo di svantaggi. In primo luogo, l'attuale protocollo richiede l'impianto di un palo della testa per fissare la testa durante questi esperimenti. La chirurgia post-impianto della testa e il recupero aggiungerebbero un minimo di 2 settimane alla tempistica del protocollo sperimentale. È possibile che questo passaggio possa essere evitato utilizzando altri metodi per immobilizzare in modo non invasivo gli animali svegli durante gli esperimenti, ad esempio utilizzando caschi personalizzati stampati in 3D63 o termoplastici deformabili64. Sono necessari ulteriori esperimenti per esplorare queste soluzioni. In secondo luogo, anche gli animali potrebbero rapidamente abituarsi a stimoli devianti, con conseguente diminuzione delle risposte di dilatazione della pupilla nel corso di una sessione sperimentale. Questo effetto potrebbe essere minimizzato limitando le sessioni sperimentali a brevi durate (~ 12 min) e presentando solo un numero limitato (8) di stimoli devianti. Inoltre, un soffio d'aria erogato dopo gli stimoli devianti può garantire che gli animali rimangano impegnati con gli stimoli uditivi. In terzo luogo, a causa di questa rapida abitudine, potrebbero essere necessari diversi giorni per completare l'acquisizione dei dati. Testando solo i valori SNR che campionano densamente le parti più ripide della curva psicometrica, il numero totale di giorni sperimentali può essere ridotto al minimo. In quarto luogo, gli animali non possono stare fermi durante gli esperimenti, o battere le palpebre eccessivamente o chiudere gli occhi durante gli esperimenti. Questi fattori sono una funzione delle specie e dell'acclimatazione e mostrano un alto grado di variabilità individuale. I medici generici sono naturalmente docili e, acclimatandoli bene alla configurazione sperimentale, è possibile ridurre al minimo gli artefatti di movimento e battito delle palpebre. I battiti di ciglia spontanei e le saccadi sono in genere piuttosto rari nelle cavie49, ma questa potrebbe essere anche una funzione della specie. Infine, come accennato in precedenza, le dinamiche della pupilla nell'uomo sono state associate a una serie di disturbi neuropsichiatrici. Mentre si presume che gli animali da esperimento utilizzati qui siano neurotipici, questo avvertimento deve essere tenuto presente durante l'interpretazione dei risultati.

Mentre un'implementazione hardware della pupillometria è descritta qui (utilizzando un eye tracker disponibile in commercio e un sistema di acquisizione dati neurale), l'attrezzatura richiesta è costosa e non economica da scalare. Tuttavia, sono disponibili altre soluzioni personalizzate basate sullo stesso principio di base del tracciamento oculare a infrarossi che sono più convenienti. Ad esempio, uno studio ha utilizzato componenti personalizzati e algoritmi di elaborazione video personalizzati per estrarre il diametro della pupilla dal video registrato22,25. Algoritmi di deep learning recentemente sviluppati sono anche in grado di estrarre il diametro della pupilla dai dati videografici65,66. Queste soluzioni potrebbero più che dimezzare il costo delle piattaforme di pupillometria. Il compromesso qui è tra spese e tempo: mentre le soluzioni commerciali sono più costose, sono soluzioni chiavi in mano che possono essere utilizzate immediatamente. D'altra parte, le soluzioni personalizzate sono convenienti e scalabili, ma richiedono competenze per la configurazione e il tempo necessario per sviluppare pipeline di analisi personalizzate.

Sebbene il protocollo qui descritto sia stato eseguito in medici di base dell'udito normale, la pupillometria potrebbe essere relativamente facile da usare in altri modelli animali di deficit uditivo con modifiche appropriate al tipo di stimolo e ai parametri. Ciò consentirebbe di caratterizzare gli effetti della perdita dell'udito in una gamma di tipi di stimoli e specie, che potrebbero potenzialmente produrre nuove osservazioni. Poiché la pupillometria è una tecnica non invasiva che è stata ampiamente utilizzata anche negli esseri umani, utilizzando gli stessi stimoli utilizzati per i soggetti animali, la pupillometria può essere utilizzata per confrontare gli effetti di varie patologie uditive tra le specie. Ad esempio, una recente meta-analisi negli esseri umani ha mostrato che i deficit di percezione del parlato nel rumore derivanti da una moderata esposizione al rumore sono stati meglio osservati quando sono stati utilizzati stimoli complessi e temporalmente variabili67. La stima delle soglie di categorizzazione del rumore di chiamata in chiamata mediante pupillometria dimostrata qui potrebbe essere utilizzata come uno di questi compiti utilizzando stimoli complessi per valutare gli effetti dell'esposizione al rumore nei medici generici. La valutazione dell'udito a livello comportamentale utilizzando questi metodi completerebbe i metodi elettrofisiologici e anatomici e potrebbe far parte del toolkit standard per la valutazione di vari disturbi dell'udito noti.

In conclusione, i seguenti punti sono fondamentali per il successo dell'acquisizione dei dati pupillometrici. In primo luogo, per garantire un'elevata resa dei dati, è fondamentale familiarizzare bene gli animali con la configurazione sperimentale. Una mancanza di pazienza in questo passaggio potrebbe degradare la qualità dei dati che alla fine vengono ottenuti o richiedere la ripetizione di diverse sessioni per compensare le sessioni perse. In secondo luogo, per evitare cambiamenti di PD legati alla luminanza, è importante eseguire esperimenti in condizioni di illuminazione costante, mantenendo queste condizioni tra sessioni e soggetti il più possibile. In terzo luogo, per ridurre al minimo il numero di sessioni sperimentali necessarie, è importante eseguire esperimenti pilota per identificare intervalli di parametri critici per il campionamento denso. In quarto luogo, per ridurre al minimo l'assuefazione degli animali agli stimoli, è importante eseguire esperimenti in brevi sessioni contenenti solo poche presentazioni di stimoli devianti. Un soffio d'aria può essere utilizzato anche per mantenere un elevato coinvolgimento con gli stimoli uditivi.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH (R01DC017141), dalla Pennsylvania Lions Hearing Research Foundation e dai fondi dei Dipartimenti di Otorinolaringoiatria e Neurobiologia dell'Università di Pittsburgh.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analog output board Measurement Computing Corporation, Norton, MA PCI-DDA02/12
Anechoic foam Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN
Condenser microphone Behringer, Willich, Germany C-2
Free-field microphone Bruel & Kjaer, Denmark)  Type 4940 
Matlab Mathworks, Inc., Natick, MA 2018a version
Monocular remote camera and illuminator system Arrington Research, Scottsdale, AZ MCU902 Infrared LED array + camera with infrared filter
Multifunction I/O Device  National Instruments, Austin, TX PCI-6229
Neural interface processor Ripple Neuro, Salt Lake City, UT SCOUT
Piezoelectric motion sensor SparkFun Electronics, Niwot, CO SEN-10293
Pinch valve  Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL EW98302-02
Programmable attenuator Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL PA5
Silicon Tubing Cole-Parmer ~3 mm
Sound attenuating chamber IAC Acoustics
Speaker full-range driver Tang Band Speaker, Taipei, Taiwan W4-1879
Stereo Amplifier Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL SA1
Tabletop - CleanTop Optical TMC vibration control / Ametek, Peabody, MA
Viewpoint software ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ

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Neuroscienze Numero 191
pupillometria per valutare la sensazione uditiva nelle cavie
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