Summary
간단하고 비침습적인 기술인 동공 측정법은 정상적인 청각 동물 및 다양한 청각 병리의 동물 모델에서 소음 내 청력 역치를 결정하는 방법으로 제안됩니다.
Abstract
소음 노출은 감각신경성 난청의 주요 원인입니다. 소음성 난청의 동물 모델은 난청의 근본적인 해부학적 및 생리학적 병리에 대한 기계론적 통찰력을 생성했습니다. 그러나 청력 손실이 있는 인간에서 관찰된 행동 결함을 동물 모델의 행동 결함과 연관시키는 것은 여전히 어려운 일입니다. 여기서 동공 측정법은 동물과 인간의 행동 데이터를 직접 비교할 수 있는 방법으로 제안됩니다. 이 방법은 변형된 괴짜 패러다임에 기초한다 - 자극의 반복적인 표현에 피험자를 습관화하고 반복된 자극으로부터 어떤 매개변수적 방식으로 변하는 일탈적 자극을 간헐적으로 제시한다. 기본 전제는 반복되는 자극과 비정상적인 자극 사이의 변화가 피험자에 의해 감지되면 반복된 자극에 의해 유도된 것보다 더 큰 동공 확장 반응을 유발한다는 것입니다. 이 접근법은 청력 손실 연구를 포함하여 청각 연구에 널리 사용되는 동물 모델인 기니피그의 발성 분류 작업을 사용하여 시연됩니다. 한 발성 범주의 발성을 표준 자극으로, 두 번째 범주를 다양한 신호 대 잡음비로 잡음에 포함된 괴상한 자극으로 제시함으로써, 괴상한 범주에 대한 동공 확장의 크기는 신호 대 잡음비에 따라 단조롭게 변한다는 것이 입증되었습니다. 그런 다음 성장 곡선 분석을 사용하여 이러한 동공 확장 반응의 시간 경과와 통계적 유의성을 특성화할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 기니피그를 설정에 적응시키고, 동공 측정을 수행하고, 데이터를 평가/분석하기 위한 자세한 절차를 설명합니다. 이 기술은 이 프로토콜에서 정상 청력을 가진 기니피그에서 입증되지만, 이 방법은 각 피험자 내에서 다양한 형태의 청력 손실의 감각 효과를 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 효과는 동시 전기생리학적 측정 및 사후 해부학적 관찰과 상관관계가 있을 수 있습니다.
Introduction
동공 직경(PD)은 다양한 요인의 영향을 받을 수 있으며 시간이 지남에 따라 변하는 PD 측정을 동공 측정법이라고 합니다. PD는 홍채 괄약근 근육(수축에 관여)과 홍채 확장근(확장에 관여)에 의해 제어됩니다. 수축 근육은 부교감 신경계에 의해 신경지배되고 콜린성 돌기를 포함하는 반면, 홍채 확장기는 노르아드레날린성 및 콜린성 돌기를 포함하는 교감신경계에 의해 신경지배된다 1,2,3. PD 변화를 유도하는 가장 잘 알려진 자극은 휘도-수축 및 동공의 팽창 반응은 주변광 강도의 변화에 의해 생성될 수 있다2. PD는 초점 거리2의 함수로도 변합니다. 그러나, PD는 또한 비휘도 관련 변동(4,5,6,7)을 나타낸다는 것이 수십 년 동안 알려져 왔다. 예를 들어, 내부 정신 상태의 변화는 일시적인 PD 변화를 이끌어 낼 수 있습니다. 동공은 감정적으로 충전된 자극에 반응하여 확장되거나 각성 4,5,8,9에 따라 증가합니다. 동공 확장은 또한 정신적 노력 또는 주의력 증가와 같은 다른 인지 메커니즘과 관련될 수 있습니다10,11,12,13. 동공 크기 변화와 정신 상태 사이의 이러한 관계 때문에 PD 변화는 정신분열증 14,15, 불안 16,17,18, 파킨슨병 19,20 및 알츠하이머병 21과 같은 임상 장애의 지표로 탐구되었습니다 , 무엇보다도. 동물에서 PD 변화는 내부 행동 상태를 추적하고 피질 영역22,23,24,25의 신경 활동 수준과 상관 관계가 있습니다. 동공 직경은 또한 생쥐의 수면 상태에 대한 신뢰할 수 있는 지표인 것으로 나타났습니다26. 각성 및 내부 상태와 관련된 이러한 PD 변화는 전형적으로 수십 초 정도의 긴 시간 척도에서 일어난다.
청력 연구 영역에서는 정상 청력과 청각 장애인의 경우 동공 측정을 사용하여 청취 노력과 청각 지각을 평가했습니다. 이러한 연구는 전형적으로 다양한 종류의 탐지 또는 인식 작업을 수행하는 훈련된 연구 대상(27,28,29,30)을 포함한다. 앞서 언급한 각성과 PD 사이의 관계로 인해 증가된 과제 참여 및 듣기 노력은 증가된 동공 확장 반응과 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다30,31,32,33,34,35. 따라서, 동공 측정법은 정상 청력 청취자29,36에서 스펙트럼 저하 된 음성을 인식하기 위해 증가 된 청취 노력이 소비된다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 연령 관련 청력 손실이 있는 사람 27,30,37,38,39,40,41 및 인공와우 사용자 42,43와 같은 청각 장애가 있는 청취자에서 언어 명료도가 감소함에 따라 동공 반응도 증가했습니다. 그러나 청각 장애가 있는 청취자는 정상 청각 피험자에 비해 더 쉬운 청취 조건에서 더 큰 동공 확장을 보였습니다(27,30,37,38,39,40,41,42,43). 그러나 청취자가 인식 작업을 수행해야하는 실험은 예를 들어 유아 또는 일부 동물 모델에서 항상 가능한 것은 아닙니다. 따라서, 음향 자극에 의해 유발된 비휘도 관련 동공 반응은 이러한 경우 청각 감지를 평가하는 실행 가능한 대안 방법이 될 수 있습니다(44,45). 이전 연구에서는 방향 반사46의 일부로 일시적이고 자극과 관련된 동공 확장을 입증했습니다. 이후 연구에서는 올빼미47,48에서 주파수 감도 곡선을 도출하기 위해 자극 관련 동공 확장을 사용하는 것으로 나타났습니다. 최근에, 이들 방법은 인간 유아의 동공 확장 반응의 민감도를 평가하기 위해 채택되었다48. 동공 측정법은 광범위한 단순(음색) 및 복합(GP 발성) 자극을 사용하여 수동적으로 듣는 기니피그(GP)의 청각 감지 및 식별 임계값을 추정하는 신뢰할 수 있고 비침습적인 접근 방식인 것으로 나타났습니다49. 이러한 자극 관련 PD 변화는 일반적으로 몇 초 정도의 더 빠른 시간 척도에서 발생하며 자극 타이밍과 관련이 있습니다. 여기서는 동물 모델에서 다양한 종류의 청각 장애의 행동 영향을 연구하기 위한 방법으로 자극 관련 PD 변화의 동공 측정법을 제안합니다. 특히, GPs에서 사용하기 위한 동공 측정 프로토콜, 다양한 유형의 청각 병리의 잘 확립된 동물 모델 50,51,52,53,54,55,56 (또한 철저한 검토를 위해 참고 문헌 57 참조)이 기재되어 있다.
이 기술은 정상 청력 GP에서 입증되지만 이러한 방법은 다른 동물 모델 및 다양한 청각 병리의 동물 모델에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 중요한 것은 동공 측정법이 EEG와 같은 다른 비침습적 측정뿐만 아니라 가능한 소리 감지 및 지각 결함의 기본 메커니즘을 연구하기 위해 침습적 전기생리학적 기록과 결합될 수 있다는 것입니다. 마지막으로, 이 접근 방식은 인간과 동물 모델 간의 광범위한 유사성을 확립하는 데에도 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 절차에 대해 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받고 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침을 준수하십시오. 미국에서 GP는 추가로 미국 농무부 (USDA) 규정의 적용을받습니다. 이 프로토콜의 모든 절차는 University of Pittsburgh IACUC의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침을 준수했습니다. 이 실험을 위해, ~ 600-1,000 g 무게의 4 개월에서 10 개월 사이의 3 마리의 수컷 야생형, 색소 GP가 사용되었다.
1. 수술 절차
- 깨어 있고, 머리가 고정되고, 수동적으로 듣는 색소 GP에서 모든 동공 측정 실험을 수행하십시오. 클릭 및 순음 청각 뇌간 반응(ABR) 녹음을 사용하여 실험 대상의 정상 청력을 확인합니다58.
참고: 동공 측정 데이터 수집은 그 자체로 비침습적이지만 이 프로토콜에서는 시술 중 동물의 머리를 고정하기 위해 임플란트 수술 후 침습적 두부 사용이 사용됩니다. 대안은 토론 섹션에 제시되어 있습니다. - 먼저, 모든 실험 동물에게 이소플루란 마취 하에 머리 고정을 위한 스테인리스 스틸 헤드 포스트를 이식합니다. 무균 수술 기술을 사용하여 뼈 나사와 치과용 아크릴58의 조합을 사용하여 머리 기둥을 두개골에 고정합니다.
- 동물에게 전신 및 국소 진통제 투여를 포함한 수술 후 관리를 제공합니다. 2 주간의 회복 기간 후, 점차적으로 동물을 실험 설정에 순응시킵니다.
참고: 수술 절차는 GP58 및 다른 종59,60에 이전에 발표된 방법을 기반으로 하며 이 프로토콜의 초점이 아닙니다.
2. 실험 설정에 대한 동물 적응
알림: 실험은 일반적으로 소음이 감쇠된 챔버 또는 부스에서 이루어집니다( 재료 표 참조). 동물이 설정에 익숙해지는 데 필요한 시간은 주제마다 다릅니다. 일반적인 적응 시간은 다음과 같습니다. 잘 적응한 동물은 최소한의 신체 움직임으로 머리 고정을 견딜 수 있으며 동공 직경을 더 잘 측정할 수 있습니다.
- 2 주간의 회복 기간이 지난 후, 먼저 동물을 취급 및 운송에 익숙하게하십시오 (2-3 일). 이러한 순응은 스트레스와 불안을 줄이는 데 필수적입니다. 동물을 다루는 데 익숙해지려면 동물을 운송 용기에 넣는 시간(10-30분)을 늘리고 동물을 더 많은 시간(10-30분) 동안 다루십시오.
- 다음으로, 동물을 10-45분 동안 인클로저에 배치하여 실험 설정(2-3일)에 동물을 적응시킵니다(그림 1A). 인클로저는 실험 중 동물의 편안함을 위해 약간의 자세 이동을 허용해야 합니다. 실험 중 동물의 편안함을 위해 약간의 자세 이동을 허용합니다. 그러나, 동공 확장은 운동49에 선행하는 것으로 알려져 있다. 따라서 동물의 움직임을 측정하고 데이터 분석에서 이 움직임을 설명합니다(그림 1C).
- 이 적응의 일환으로, 동물이 머리를 고정시키는 것처럼 이식 된 머리 기둥을 수동으로 다루십시오. 지속 시간(10-60초)을 늘리기 위해 헤드 포스트를 잡습니다.
- 수동 적응 후 동물의 행동에 따라 임플란트 홀더를 사용하여 동물을 단단한 프레임에 고정하십시오.
- 동물이 머리를 고정하는 동안 (10-45 일) 동물이 평온하고 비교적 고요해질 때까지 머리 고정 시간 (2-3 분)을 천천히 늘립니다.
- 동물에게 카메라, IR 광원 및 백색 광원 (1-2 일)의 존재에 익숙하게하십시오. 백색광을 켜고 지속 시간을 점차 늘립니다(10분에서 30분).
- 다양한 소리 수준(예: 순음, 클릭, 발성)을 다양한 소리 수준(1-2일, 2.6단계와 동시에)으로 재생하여 동물이 음향 자극에 익숙해지도록 합니다. 실험 자극에 대한 습관화를 최소화하려면 이 단계에서 동공 측정 실험에 대해 계획된 것과 다른 소리를 사용하십시오.
3. 동공 카메라 보정
알림: 동공 측정에 사용되는 카메라는 USB를 통해 동공 측정 소프트웨어 제품군으로 비디오를 출력합니다. 이 비디오에서 동공 직경은 동공 측정 소프트웨어 제품군에 의해 타원 맞춤과 사용자가 조정할 수 있는 임계값을 사용하여 추출됩니다( 재료 표 참조). 그런 다음 소프트웨어는 디지털-아날로그 카드와 인터페이스합니다. 카드는 동공 직경에 비례하는 아날로그 전압 값을 출력합니다. 이 전압 값을 길이 단위의 동공 직경으로 다시 변환하려면 교정이 필요합니다.
- 동공 측정 중에 GP의 눈이 위치할 동일한 위치에 알려진 직경의 검은색 디스크 이미지가 포함된 종이 한 장을 놓습니다. GP의 경우 PD는 4mm 범위에 있습니다. 따라서 3mm, 4mm 및 5mm 디스크를 사용하여 보정을 수행하십시오.
- 동공 측정 카메라( 재료 표 참조)를 실험이 수행될 동일한 거리(25cm)에 놓습니다. 카메라 조리개를 조정하고 직경이 알려진 디스크의 선명하게 초점이 맞춰진 이미지를 얻을 때까지 초점을 맞춥니다.
- 동공 측정 수집 소프트웨어( 재료 표 참조)에서 타원의 윤곽선이 이미징된 디스크와 거의 일치하도록 임계값을 조정하고 아날로그 출력 전압 값과 스케일링을 기록해 둡니다.
- 3mm, 4mm 및 5mm 디스크에 대해 이 절차를 반복합니다. 그런 다음 아날로그 출력 전압 값에 해당하는 실제 직경 값(mm)을 표로 만듭니다.
4. 동공 측정 데이터 수집
- 모든 실험은 소음이 감쇠된 부스 또는 챔버에서 수행하며 내벽은 무반향 폼으로 덮여 있습니다.
- 자유 필드 자극 전달을 위해 보정된 라우드스피커를 동물이 배치될 위치와 동일한 높이의 소음 감쇠 챔버 벽에 장착합니다.
알림: 확성기의 선택은 연구 중인 종과 계획된 자극에 따라 다릅니다. GP 발성의 경우 발성 주파수 범위가 0.5-3kHz인 비교적 평탄한(±3dB) 주파수 응답을 가진 풀레인지 드라이버 스피커를 사용합니다(그림 1A). - 큰 몸의 움직임이 불가능하도록 동물을 인클로저에 넣습니다(그림 1A). 2단계에서 설명한 대로 동물의 머리를 단단한 프레임에 고정합니다(그림 1A).
- 동물의 움직임을 감지하고 기록하기 위해 인클로저 아래에 압전 센서를 배치합니다(그림 1A).
- 에어 퍼프를 설정하려면 탁상에 부착된 홀더를 사용하여 동물의 앞 ~15cm에 피펫 팁을 놓습니다. 실리콘 튜브(직경 ~3mm)를 피펫 팁에 연결하고 튜브를 조절된 공기 실린더에 연결합니다.
- 실린더 공기압을 20psi에서 25psi 사이로 유지하십시오. 핀치 밸브를 통해 튜브를 통과시켜 컴퓨터 제어 릴레이를 사용하여 에어 퍼프의 타이밍과 지속 시간을 제어합니다.
- ~10cm 거리에 배치된 적외선 LED 어레이로 눈을 비춥니다. ~2,000cd/m2 강도의 백색 LED 조명을 사용하여 이미징된 눈을 비추고 기준선 PD를 ~3.5mm로 가져옵니다. 실험 세션 전반에 걸쳐 실험 챔버의 조명 조건을 일정하게 유지합니다.
참고: 일반 실험실 조명(~500cd/m2)에서 GP 동공은 상당히 확장되어 추가 자극 관련 확장을 관찰할 수 없습니다. 추가 조명을 사용하여 동공을 ~3.5mm의 기준 직경으로 가져와 자극 관련 확장을 관찰하기에 충분한 동적 범위를 허용합니다. 이것은 또한 세션과 주제 전반에 걸쳐 일관된 기준선을 보장합니다. - 동공 획득 소프트웨어를 열고 이미징된 눈에서 25cm 거리에 배치된 16mm 렌즈(0.15° 시야각의 공간 해상도)와 적외선(IR) 필터가 장착된 카메라를 사용하여 동공의 비디오(90fps)를 획득합니다. 눈이 이미지 영역의 중앙에 있는지 확인합니다.
- 이미지의 동공의 윤곽에 선명한 초점이 맞춰질 때까지 카메라의 조리개와 초점, IR 레벨을 조절합니다.
- 동공 획득 소프트웨어에서 마우스로 직사각형 영역을 선택하여 동공이 포함된 관심 영역을 정의합니다.
- 동공 획득 소프트웨어 제어판을 사용하여 획득한 비디오의 밝기와 대비를 조정합니다. 스캔 밀도를 5로 설정하고 타원 맞춤이 비디오의 동공 윤곽선과 거의 일치하도록 임계값을 조정합니다.
- 신경 인터페이스 프로세서 소프트웨어를 사용하여 PD 트레이스에서 아날로그 신호, 모션을 기록하는 압전 센서의 전압 트레이스, 자극 전달 시간 및 에어 퍼프 전달 시간을 수집하고 저장합니다.
5. Call-in-noise detection and categorical discrimination using a modified oddball paradigm
참고: 동공 측정 실험을 위한 자극은 동물 군체58에서 녹음된 GP 발성으로 구성되었습니다. 발성 샘플은 다음 저장소에서 찾을 수 있습니다: https://github.com/vatsunlab/CaviaVOX. 특히, 대표 결과에 나타난 동공 반응을 이끌어 내기 위해 쌕쌕 소리와 우는 소리를 사용했습니다. 각 범주에서 길이가 거의 같은 발성을 선택하십시오. 발성의 녹음 진폭과 시간적 엔벨로프의 차이를 설명하려면 필요한 경우 발성을 평균 제곱근(r.m.s.) 진폭으로 정규화합니다.
- MATLAB을 사용하여 적절한 샘플링 속도로 청각 자극을 제시합니다. 저주파 청각 동물 인 GP의 경우 100kHz의 샘플링 속도로 충분합니다.
- 두 가지 다른 범주의 발성(예: 쌕쌕거리는 소리 및 우는 소리)에서 비슷한 길이의 GP 발성의 8가지 다른 예를 선택합니다. 한 범주(8개의 예시)는 표준 자극으로 사용되고, 다른 범주(8개의 예시)는 괴상하거나 비정상적인 자극으로 사용됩니다(그림 2A).
- 서로 다른 신호 대 잡음비(SNR) 레벨에서 잡음에 포함된 1초 길이의 표준 및 편차 자극을 생성하려면 통화에 동일한 길이의 백색 잡음(게이트 잡음)을 추가합니다. 이 실험에서 샘플링된 SNR의 범위는 -24dB SNR과 +40dB SNR 사이입니다.
- 블록 설계를 사용하여 각 실험 세션(~12분 지속 시간)에서 단일 SNR 레벨에 해당하는 데이터를 수집합니다. 각 세션에서 특정 SNR에서 한 발성 범주의 8가지 예시를 표준 자극으로 사용하고 일탈 자극과 동일한 SNR 수준에서 다른 발성 범주의 8가지 예시를 사용합니다.
참고: 일반적인 실험 블록은 ~12분 동안 지속됩니다. 동물의 행동과 동공 반응의 습관에 따라 매일 3-4 블록 (~ 45-60 분)에 대한 데이터를 수집 할 수 있습니다. 이 기간 동안 동공 비디오, 모션 트레이스 및 블록 사이를 통해 동물을 면밀히 모니터링하십시오. - 각 세션에 대해 표준 자극을 포함하는 의사 무작위 자극 프레젠테이션 시퀀스를 준비합니다>90%의 시간. 비정상적인 자극 사이에 표준 자극을 사용한 시도가 최소 20회 있는지 확인합니다(그림 2B).
참고: 실험에 따라 자극 제시 시퀀스 내에서 이탈 자극의 순서는 라틴 정사각형 디자인을 채택하여 각각의 고유한 이탈 자극이 모든 세션에서 고유한 순차적 위치를 차지하도록 할 수 있습니다. 따라서 모든 세션에 대한 평균화는 전체 자극 시퀀스 내에서 이탈 자극 위치의 효과를 최소화할 수 있습니다. - 모든 자극 표현에 고정된 자극 강도(예: 85dB SPL)를 사용합니다.
알림: 적절한 디지털-아날로그 변환기를 사용하여 오디오 신호를 생성하고, 프로그래밍 가능한 감쇠기를 사용하여 원하는 사운드 레벨로 감쇠하고, 전원 amp신호를 liify 신호를 보정된 확성기를 사용하여 신호를 전달합니다(예:ample, 하드웨어, 재료 표 참조). - 높은 시간적 규칙성으로 자극을 제시합니다(대표 결과에서 볼 수 있듯이 1초 자극 후 3초 동안 침묵).
참고: 동공 확장 반응은 느리며 일반적으로 자극 시작 후 약 1초 후에 최고조에 달하고 기준선49로 돌아가는 데 약 5초가 걸립니다. 자극 제시 속도는 이러한 느린 시간 척도를 설명할 수 있을 만큼 충분히 낮아야 합니다. 시간적 규칙성은 타이밍 패턴을 방해하는 것 자체가 비정상적인 자극으로 작용할 수 있기 때문에 중요합니다. - 자극에 대한 동물의 참여를 유지하고 습관화를 최소화하기 위해 선택적으로 일탈 자극 후 짧은 공기 퍼프(100ms)를 전달합니다. 에어 퍼프의 시작이 자극 지속 시간(자극 시작으로부터 2.5초)과 충분히 분리되어 자극 유발 동공 확장 반응이 에어 퍼프로 인한 깜박임 아티팩트 전에 최고조에 도달하도록 합니다.
참고: 고전적인 괴짜 패러다임에서는 긍정적 또는 부정적 강화가 사용되지 않습니다. 공기 퍼프는 청각 자극에 대한 동물의 참여를 유지하기 위해 약간 혐오스러운 강화로 사용되기 때문에 패러다임을 수정 된 괴짜 패러다임이라고합니다.
6. 분석 및 통계
참고: 모든 분석은 MATLAB으로 작성된 사용자 지정 코드(https://github.com/vatsunlab/GP_Pupil 에서 사용 가능)를 사용하여 수행되었습니다. 학생 반응의 신뢰성과 시간 경과를 각각 다루는 두 가지 주요 분석 방법이 설명됩니다. 방법 중 하나 또는 둘 모두의 선택은 실험 설계에 의해 결정됩니다.
- 모션 감지 및 시험 제외
- 코드 pupil_avg_JOVE.m을 사용하여 모든 세션에 대해 동작 감지 및 시행 제외를 수행합니다. 이렇게 하려면 코드를 실행하고 팝업 대화 상자의 단일 세션에서 데이터 파일을 선택합니다.
- PD 트레이스를 선형적으로 디트렌드화하고 이전에 도출된 보정 테이블을 사용하여 단위를 전압에서 마이크로미터로 변환합니다(3단계 참조). 또한 전체 녹화 세션(~12분)에 걸쳐 모션 트레이스를 선형적으로 디트렌드합니다.
- 시험 마커에 오버레이된 세션 기간(~1분 ) 동안 동공 추적(그림 1B - 맨 위 행)과 선형적으로 추세가 제거된 동작 추적(그림 12B - 맨 아래 행)을 플로팅하여 세션 데이터를 검사합니다.
- 모션 트레이스의 표준 편차(SD)를 측정합니다. MATLAB의 findpeaks 함수를 사용하여 동작 추적 피크의 시간을 구합니다. 5SD의 임계값을 초과하고 다른 피크와 최소 1초 이상 분리된 피크를 모션 이벤트(49)로 간주합니다(그림 1B - 하단).
- 운동 이벤트의 7초 이내에 발생하는 동공 확장의 모든 시도(표준 및 이탈 모두)를 폐기하십시오. 움직임 관련 동공 확장으로 인해 일탈 시행 횟수의 절반 이상이 폐기된 경우 전체 세션을 폐기하고 반복합니다.
- 데이터 전처리 및 시각화
- 코드 pupil_avg_JOVE.m을 사용하여 눈 깜박임 아티팩트를 제거하고, 데이터를 사전 처리하고, 세션 전반에 걸쳐 각 자극에 대한 평균 동공 확장을 얻습니다. 이렇게 하려면 코드를 실행하고 팝업 대화 상자에서 분석할 모든 데이터 파일을 선택합니다.
- 눈 깜박임(400μm/ms를 초과하는 PD 변화)을 감지하고 감지된 깜박임 시간을 중심으로 200ms 시간 창에서 PD 트레이스를 선형으로 보간하여 제거합니다. 일탈 시도 수의 절반 이상이 자극 시작과 공기 퍼프 시작 사이에 눈 깜박임이 포함된 경우 세션 데이터를 삭제합니다.
- 1,000Hz의 수집 샘플링 속도에서 10Hz로 PD 데이터를 다운샘플링합니다.
- 자극 시작 1초 전부터 자극 오프셋 후 5초 동안 지속되는 창에서 PD 트레이스를 추출합니다. 자극이 시작되기 직전 500ms 창에서 각 자극에 대한 평균 기준선 PD를 계산합니다. 이러한 추적에서 기준선 PD를 빼서 PD의 자극 유발 변화를 얻습니다.
- 각 동물 내의 세션에 걸쳐 각 자극 조건에 대한 자극 유발 PD 변화를 평균화한 다음 동물 전체에 걸쳐 각 자극 조건에 대한 평균 동공 확장 반응을 생성합니다(예: 그림 3A).
- PD 변화의 시간 경과를 정량화하기 위한 성장 곡선 분석(GCA)
참고: 이 분석 방법은 동공 확장 반응의 크기와 시간 경과를 결정하며 인간 피험자 27,36,40 및 기니피그 49에 대한 동공 측정 연구에 사용되었습니다.- 모든 세션, 동물, SNR 및 감쇠에 대한 pupil_avg_JOVE.m의 모든 출력값을 수직으로 연결하여 animalID, SNR, 소음 수준 및 동공(1-50) 지름 값 열을 포함하는 행렬을 구성합니다. 코드 pupil_LME_JOVE.m을 사용하여 성장 곡선 분석(GCA)27,36,40,49를 수행합니다.
- 피험자 수준 절편을 무작위 효과로, 최대 2차의 직교 시간 다항식을 고정 효과로 사용하여 각 이탈 SNR을 별도의 그룹으로 처리하여 동공 직경 트레이스의 상승 단계(자극 시작 후 0.1-2.1초)에 맞춥니다.
- 다음 공식36,49를 사용하여 동공 추적의 상승 단계를 모델링합니다.
동공 확장 = (절편 + 조건) + 시간1 * (β 시간1 + β 시간1: 조건) + 시간2* (β 시간2+ β시간2: 조건) + r(subjectlevelintercept)
여기서, time1 및 time2 는 직교 선형 및 2차 시간 다항식에 해당하고, βs는 가중치에 대응한다. - MATLAB의 fitlme 함수를 사용하여 평균 가중치 (βs)와 표준 오차를 추정합니다. coeftest 함수를 사용하여 가중치의 통계적 유의성을 추정합니다.
- 각 SNR에 대해 절편, 선형 및 2차 항에 해당하는 가중치를 플로팅하여 결과를 시각화합니다(그림 3B, C).
- 통계적으로 유의미한 동공 확장을 보여주는 시험 분석
참고: 이 분석 방법은 통계적으로 유의미한 동공 확장 반응이 관찰되고 동공 확장 반응의 신뢰도에 해당하는 이탈 시도의 비율을 결정합니다.- 동공 반응의 피크(일반적으로 자극 시작 후 ~1.5초)를 중심으로 적절한 분석 창(0.5-1초)을 선택합니다. 이 분석 창에서 모든 표준 시행 및 이탈 시행에 대한 평균 PD를 계산합니다.
- 각 이탈 시행에 대한 평균 PD가 표준 시행에 대한 평균 PD 값의 통합 분포의 2.33 표준 오차보다 큰지 여부를 확인합니다. 이 임계값을 초과하는 이탈 시험을 상당한 동공 확장을 보여주는 시험으로 계산합니다.
- 유의미한 동공 확장을 나타내는 이탈 시험의 수를 전체 이탈 시험 수(각 조건에 대해)로 나누어 표준 자극 시험과 비교하여 PD에서 통계적으로 유의미한 증가를 보이는 시험의 비율을 정량화합니다.
- 상당한 동공 변화가 있는 시험의 모든 세션별 백분율을 셀어레이의 각 셀에 넣고, 여기서 셀은 더 낮은 SNR에서 더 높은 SNR로 배열됩니다. 코드 pupil_threshold_estimate_JOVE.m을 사용하여 호출 소음 분류 임계값을 추정합니다.
- SNR의 함수로서 PD의 통계적으로 유의미한 증가를 보여주는 시행의 비율을 플로팅합니다(그림 3D). 이러한 데이터에 대해 fitnlm MATLAB 함수(통계 툴박스에 있음)를 사용하여 형식61의 계량 계수 함수를 피팅하십시오.
Ψ(x; α, β, λ) = (1 -λ) * F(x; α, β)
여기서, F는 Weibull 함수로, 다음과 같이 정의됩니다.
F(x; α, β) =
, α는 이동 모수, β는 기울기 모수, λ는 경과율입니다.
, α는 이동 모수, β는 기울기 모수, λ는 경과율입니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
동공 측정은 실험 과정에서 ~ 600-1,000 g의 무게를 가진 3 명의 남성 색소 GP에서 수행되었습니다. 이 프로토콜에 설명된 바와 같이, 콜-인-노이즈(call-in-noise) 분류 임계값을 추정하기 위해, 자극 제시를 위해 괴상한 패러다임이 사용되었다. 괴상한 패러다임에서는 주어진 SNR에서 백색 잡음에 포함된 한 범주(우는 소리)에 속하는 통화가 표준 자극으로 사용되었고(그림 2A), 동일한 SNR에서 백색 잡음에 포함된 다른 범주(천명음)의 통화(그림 2A)가 일탈 자극으로 사용되었습니다. 표준 자극과 이탈 자극은 각 범주의 8개 예시에서 재샘플링을 통해 무작위로 선택되었습니다. 각 실험 세션에서 자극은 높은 시간적 규칙성으로 제시되었으며(그림 2B), 이탈 자극 사이에 표준 자극이 최소 20회 제시되었습니다. 데이터는 각 실험 세션에서 특정 SNR 수준에 해당하는 데이터를 획득했습니다. 세션 전반에 걸쳐 광범위한 깨끗하고 잡음이 있는 SNR이 샘플링되었습니다(-24, -18, -12, -6, -3, 0, 3, 6, 12, 40dB SNR).
표준 자극에 대한 PD 변화는 기준선과 크게 다르지 않았습니다(그림 3A의 파란색 선). 일탈 자극은 표준 자극(그림 3A의 회색 선)에 의해 유도된 것보다 강력하고 훨씬 더 큰 PD 변화를 불러일으켰으며, 이는 통화 범주 차별을 반영합니다. 통계적으로 유의한 동공 반응을 보인 시험의 반응 규모와 비율은 가장 깨끗한 SNR에서 가장 높았고 SNR이 감소함에 따라 점진적으로 감소했습니다(그림 3A,B). GCA를 사용하여 일탈 자극에 대한 동공 반응은 -18dB 이상의 SNR에서 통계적으로 유의한 것으로 나타났으며(그림 3C), 이는 잡음 호출 분류 임계값(그림 3A의 녹색 선)으로 간주되었습니다. 테스트된 각 SNR 수준에서 유의한 시험의 비율은 심리 측정 기능에 의해 잘 맞았습니다(그림 3D). 심리 측정 곡선의 절반 최대치에 도달하는 데 필요한 SNR 수준은 약 -20dB SNR이었습니다(그림 3D). 일화적으로, 이 경우, 신뢰성 기반 및 시간 경과 기반 메트릭은 유사한 값인 통화 분류 임계값을 산출했습니다.
그림 1: 동공 측정 설정, 자극 유발 및 동작 관련 PD 변화. (A) 소리의 비디오 프레임 이미지가 있는 동공 측정 설정(위). 기준선 PD는 녹색 점선 원으로 표시됩니다. (B) 단일 실험 세션의 예시 PD 트레이스(위) 및 예시 모션 트레이스(아래). 검은색 수직 선은 시작 시간 이탈 자극 표현에 해당합니다. 빨간색 눈금은 자동으로 감지된 동작 이벤트에 해당합니다. 회색 수평 점선은 5 SD 임계값에 해당합니다. (C) 한 실험 세션에서 일탈 자극(위)에 의해 유발되고 운동 이벤트(아래)와 관련된 PD 변화(ΔPD). 자극 개시는 검은색 수직 선으로 표시됩니다. 움직임 감지 이벤트는 빨간색 세로선으로 표시됩니다. 동공 확장이 시작되고 운동이 시작된다는 점에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 통화 스펙트로그램 및 통화 소음 분류 패러다임 구조. (A) 기니피그의 대표적인 스펙트로그램은 깨끗한 조건과 각각 0dB 및 -18dB SNR에서 우는 소리와 쌕쌕거리는 소리입니다. 시끄러운 통화는 백색 소음을 추가하여 얻었습니다. (B) Call-in-Noise 분류 임계값을 추정하는 데 사용되는 괴상한 패러다임의 구조. 우는 소리는 8 개의 모형에서 무작위로 선택되어 표준 자극으로 사용되었습니다. Wheek 호출은 8 명의 모범에서 무작위로 선택되어 일탈자로 사용되었습니다. 각 실험 세션에서 노이즈는 다른 SNR 레벨(-24, -18, -12, -6, -3, 0, 3, 6, 12dB SNR)에서 추가되었습니다. 통화 시간은 1초이고 자극 사이의 시간은 3초입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 호출 소음 감지 및 분류 임계값에 대한 동공 측정 추정치 . (A) 세 마리의 동물에서 얻은 평균 동공 반응. 표준 우는 소리 자극에 대한 평균 동공 반응은 파란색 선으로 표시되며 음영은 평균의 ±1 표준 오차(s.e.m.)에 해당합니다. 회색 선과 음영은 비정상적인 쌕쌕거림 자극에 의해 유발되는 동공 반응의 평균 및 ±1 s.e.m.에 해당합니다. 회색 음영 강도는 SNR에 해당합니다. 녹색 선과 음영은 임계값 SNR(약 -18dB SNR)에서 평균 동공 추적에 해당합니다. 빨간색 수직선은 자극 시작에 해당합니다. 주황색 수직선은 에어 퍼프 시작에 해당합니다. 청록색 점선은 GCA 창에 해당합니다(PD가 상승 위상을 변경함). (B) PD 변화의 상승 단계에 적합한 GCA. 도트는 100ms 시간 빈의 평균 동공 직경이고 수염은 ±1 s.e.m에 해당합니다. 실선은 혼합 효과 모델 적합치에 해당합니다. A. (C) GCA 중량 추정치와 같은 선 색상. 절편의 가중치는 파란색, 기울기는 빨간색, 가속도는 보라색입니다. 수염은 ±1 s.e.m.에 해당합니다. 별표는 통계적으로 유의한 회귀 가중치를 나타냅니다(선형 회귀 모델 계수에 대한 선형 가설 검정). (D) SNR의 함수로서 일탈 자극에 의해 유도된 유의미한 PD 변화가 있는 시험의 비율에 맞는 심리 측정 기능. 수염은 ±1 s.e.m.에 해당합니다. 최대값의 50%는 약 -20dB SNR(녹색 점선)에서 도달합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 수동적으로 듣는 동물의 청각 역치를 추정하기 위한 비침습적이고 신뢰할 수 있는 방법으로 동공 측정법의 사용을 보여줍니다. 여기에 설명된 프로토콜에 따라 정상 청력 GP의 소음 호출 분류 임계값을 추정했습니다. 동공 측정법을 사용하여 추정된 역치는 조작적 훈련62를 사용하여 얻은 역치와 일치하는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 조작적 훈련과 비교할 때 동공 측정 프로토콜은 비교적 간단하고 데이터를 설정하고 수집하는 데 빠릅니다. 각 데이터 수집 세션(SNR 수준당)은 약 12분 동안 지속되었으며, 그 결과 동물당 하루에 1-2시간의 실험 세션(SNR 수준에 걸쳐)이 발생했습니다49. 데이터 수집은 약 7-10일 내에 완료될 수 있습니다(사용된 SNR 레벨 수에 따라 다름). 비록 괴상한 패러다임이 이 원고에서 콜-인-노이즈(call-in-noise) 분류 임계값 추정을 위해 사용되었지만, 이 동공 측정 프로토콜은 단지 하나의 호출 예시가 사용되는 괴상한 패러다임의 더 쉬운 버전들, 또는 광범위한 복잡하거나 단순한 자극들을 사용하는 다른 자극 패러다임들에 적응될 수 있다(49).
이 방법에는 단점이 없습니다. 첫째, 현재 프로토콜은 이러한 실험 중에 머리를 고정하기 위해 헤드 포스트를 이식해야 합니다. 임플란트 수술 후 머리 수술 및 회복은 실험 프로토콜의 타임라인에 최소 2주를 추가합니다. 이 단계는 실험 동안 깨어 있는 동물을 비침습적으로 고정시키는 다른 방법, 예를 들어 맞춤형 3D 프린팅 헬멧(63 ) 또는 변형 가능한 열가소성 플라스틱(64)을 사용함으로써 피할 수 있다. 이러한 솔루션을 탐색하려면 추가 실험이 필요합니다. 둘째, 동물은 비정상적인 자극에도 빠르게 익숙해 질 수 있으며, 그 결과 실험 세션 동안 동공 확장 반응이 감소합니다. 이 효과는 실험 세션을 짧은 기간(~12분)으로 제한하고 제한된 수(8)의 일탈 자극만 제시함으로써 최소화할 수 있습니다. 또한, 비정상적인 자극 후에 전달되는 공기 퍼프는 동물이 청각 자극에 계속 참여하도록 할 수 있습니다. 셋째, 이러한 빠른 습관화로 인해 데이터 수집을 완료하는 데 며칠이 필요할 수 있습니다. 심리 측정 곡선의 가장 가파른 부분을 조밀하게 샘플링하는 SNR 값만 테스트함으로써 총 실험 일수를 최소화할 수 있습니다. 넷째, 동물은 실험 중에 가만히 있지 않거나 실험 중에 과도하게 깜박이거나 눈을 감을 수 있습니다. 이러한 요인은 종과 순응의 함수이며 높은 수준의 개별 변동성을 보여줍니다. GP는 선천적으로 유순하며 실험 설정에 잘 적응함으로써 움직임 및 깜박임 아티팩트를 최소화 할 수 있습니다. 자발적인 깜박임과 단속은 일반적으로 기니피그에서 매우 드뭅니다49, 그러나 이것은 종의 기능일 수도 있습니다. 마지막으로, 앞서 언급했듯이 인간의 동공 역학은 여러 신경 정신 장애와 관련이 있습니다. 여기에 사용된 실험 동물은 신경형으로 가정되지만 결과를 해석할 때 이 주의 사항을 염두에 두어야 합니다.
동공 측정법의 한 하드웨어 구현이 여기에 설명되어 있지만(상업적으로 이용 가능한 시선 추적기 및 신경 데이터 수집 시스템 사용) 필요한 장비는 비싸고 확장하기에 경제적이지 않습니다. 그러나 더 비용 효율적인 적외선 기반 시선 추적의 동일한 기본 원칙을 기반으로 하는 다른 맞춤형 솔루션을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 한 연구는 사용자 정의 구성 요소 및 사용자 정의 비디오 처리 알고리즘을 사용하여 녹화된 비디오(22,25)에서 동공 직경을 추출했습니다. 최근에 개발된 딥러닝 알고리즘은 또한 비디오그래픽 데이터로부터 동공 직경을 추출할 수 있다(65,66). 이러한 솔루션은 동공 측정 장비의 비용을 절반 이상 줄일 수 있습니다. 여기서 절충안은 비용과 시간 사이의 절충안이며, 상용 솔루션은 더 비싸지 만 즉시 사용할 수있는 턴키 솔루션입니다. 반면, 맞춤형 솔루션은 비용 효율적이고 확장 가능하지만 설정에 대한 전문 지식과 맞춤형 분석 파이프라인을 개발하는 데 필요한 시간이 필요합니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 정상적인 청력 GP에서 수행되었지만, 동공 측정은 자극 유형 및 매개 변수에 대한 적절한 변경으로 청각 장애의 다른 동물 모델에서 비교적 쉽게 사용할 수 있습니다. 이를 통해 다양한 자극 유형 및 종에 걸쳐 청력 손실의 영향을 특성화할 수 있으며, 이는 잠재적으로 새로운 관찰을 도출할 수 있습니다. 동공 측정법은 인간에게도 광범위하게 사용된 비침습적 기술이기 때문에 동물 대상에 사용된 것과 동일한 자극을 사용하여 동공 측정법을 사용하여 종 전반에 걸친 다양한 청각 병리의 효과를 비교할 수 있습니다. 예를 들어, 인간을 대상으로 한 최근의 메타 분석에 따르면 중간 정도의 소음 노출로 인한 소음 인식 장애는 복잡하고 시간적으로 다양한 자극을 사용할 때 가장 잘 관찰되는 것으로 나타났습니다67. 여기에서 입증 된 동공 측정법에 의한 소음 호출 분류 임계 값의 추정은 GP에서 소음 노출의 영향을 평가하기 위해 복잡한 자극을 사용하는 작업 중 하나로 사용될 수 있습니다. 이러한 방법을 사용하여 행동 수준에서 청력을 평가하면 전기 생리학적 및 해부학적 방법을 보완할 수 있으며 알려진 다양한 청력 장애를 평가하기 위한 표준 툴킷의 일부가 될 수 있습니다.
결론적으로, 동공 측정 데이터를 성공적으로 수집하려면 다음 사항이 중요합니다. 첫째, 높은 데이터 수율을 보장하려면 동물이 실험 설정에 잘 익숙해지는 것이 중요합니다. 이 단계에서 인내심이 부족하면 최종적으로 얻는 데이터의 품질이 저하되거나 손실된 세션을 보충하기 위해 여러 세션을 반복해야 할 수 있습니다. 둘째, 휘도 관련 PD 변화를 피하기 위해서는 일정한 조명 조건에서 실험을 수행하고 세션과 피험자 간에 이러한 조건을 최대한 유지하는 것이 중요합니다. 셋째, 필요한 실험 세션의 수를 최소화하기 위해 파일럿 실험을 수행하여 조밀한 샘플링을 위한 중요한 매개변수 범위를 식별하는 것이 중요합니다. 넷째, 자극에 대한 동물의 습관화를 최소화하기 위해, 비정상적인 자극의 몇 가지 표현만을 포함하는 짧은 세션에서 실험을 수행하는 것이 중요합니다. 청각 자극과의 높은 참여를 유지하기 위해 에어 퍼프를 추가로 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH(R01DC017141), 펜실베니아 라이온스 청력 연구 재단, 피츠버그 대학교 이비인후과 및 신경생물학과의 기금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analog output board | Measurement Computing Corporation, Norton, MA | PCI-DDA02/12 | |
| Anechoic foam | Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN | ||
| Condenser microphone | Behringer, Willich, Germany | C-2 | |
| Free-field microphone | Bruel & Kjaer, Denmark) | Type 4940 | |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA | 2018a version | |
| Monocular remote camera and illuminator system | Arrington Research, Scottsdale, AZ | MCU902 | Infrared LED array + camera with infrared filter |
| Multifunction I/O Device | National Instruments, Austin, TX | PCI-6229 | |
| Neural interface processor | Ripple Neuro, Salt Lake City, UT | SCOUT | |
| Piezoelectric motion sensor | SparkFun Electronics, Niwot, CO | SEN-10293 | |
| Pinch valve | Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL | EW98302-02 | |
| Programmable attenuator | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL | PA5 | |
| Silicon Tubing | Cole-Parmer | ~3 mm | |
| Sound attenuating chamber | IAC Acoustics | ||
| Speaker full-range driver | Tang Band Speaker, Taipei, Taiwan | W4-1879 | |
| Stereo Amplifier | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL | SA1 | |
| Tabletop - CleanTop Optical | TMC vibration control / Ametek, Peabody, MA | ||
| Viewpoint software | ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ |
References
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