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Neuroscience

Pupilometria para Avaliar a Sensação Auditiva em Cobaias

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64581
Automatic Translation
1,2, 1,2,4, 1,2,6, 1,2,3,4,5
1Department of Neurobiology, University of Pittsburgh, 2Center for Neuroscience, University of Pittsburgh, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 4Center for Neural Basis of Cognition, University of Pittsburgh, 5Department of Communication Science and Disorders, University of Pittsburgh, 6Department of Transfer and Innovation, USC University Hospital Complex (CHUS), University of Santiago de Compostela

Summary

A pupillometry, uma técnica simples e não invasiva, é proposta como método para determinar limiares auditivos com ruído em animais normo-ouvintes e modelos animais de várias patologias auditivas.

Abstract

A exposição ao ruído é uma das principais causas de perda auditiva neurossensorial. Modelos animais de perda auditiva induzida por ruído geraram uma visão mecanicista sobre as patologias anatômicas e fisiológicas subjacentes da perda auditiva. No entanto, relacionar déficits comportamentais observados em humanos com perda auditiva com déficits comportamentais em modelos animais permanece desafiador. Aqui, a pupilometria é proposta como um método que permitirá a comparação direta de dados comportamentais animais e humanos. O método baseia-se em um paradigma excêntrico modificado - habituando o sujeito à apresentação repetida de um estímulo e apresentando intermitentemente um estímulo desviante que varia de alguma forma paramétrica do estímulo repetido. A premissa fundamental é que, se a mudança entre o estímulo repetido e desviante for detectada pelo sujeito, ela desencadeará uma resposta de dilatação da pupila maior do que a provocada pelo estímulo repetido. Essa abordagem é demonstrada por meio de uma tarefa de categorização de vocalização em cobaias, modelo animal amplamente utilizado em pesquisas auditivas, inclusive em estudos de perda auditiva. Ao apresentar vocalizações de uma categoria de vocalização como estímulos padrão e uma segunda categoria como estímulos excêntricos embutidos no ruído em várias relações sinal-ruído, demonstra-se que a magnitude da dilatação da pupila em resposta à categoria excêntrico varia monotonicamente com a relação sinal-ruído. As análises da curva de crescimento podem então ser usadas para caracterizar o curso do tempo e a significância estatística dessas respostas de dilatação da pupila. Neste protocolo, são descritos procedimentos detalhados para aclimatar cobaias à configuração, realizar pupilometria e avaliar/analisar dados. Embora esta técnica seja demonstrada em cobaias ouvintes normais neste protocolo, o método pode ser utilizado para avaliar os efeitos sensoriais de várias formas de perda auditiva dentro de cada sujeito. Esses efeitos podem então ser correlacionados com medidas eletrofisiológicas concomitantes e observações anatômicas post-hoc.

Introduction

O diâmetro da pupila (DP) pode ser afetado por um grande número de fatores e a medida da DP que muda ao longo do tempo é conhecida como pupilometria. A DP é controlada pelo músculo do esfíncter da íris (envolvido na constrição) e pelo músculo dilatador da íris (envolvido na dilatação). O músculo de constrição é inervado pelo sistema parassimpático e envolve projeções colinérgicas, enquanto o dilatador da íris é inervado pelo sistema simpático envolvendo projeções noradrenérgicas e colinérgicas 1,2,3. O estímulo mais conhecido para induzir alterações da DP é a luminância-constrição e as respostas de dilatação da pupila podem ser produzidas por variações na intensidade da luz ambiente2. A DP também muda em função da distância focal2. Sabe-se há décadas, no entanto, que a DP também apresenta flutuações não relacionadas à luminância 4,5,6,7. Por exemplo, mudanças nos estados mentais internos podem provocar alterações transitórias da DP. A pupila dilata-se em resposta a estímulos emocionalmente carregados ou aumenta com a excitação 4,5,8,9. A dilatação da pupila também pode estar relacionada a outros mecanismos cognitivos, como o aumento do esforço mental ou da atenção10,11,12,13. Devido a essa relação entre as variações do tamanho da pupila e os estados mentais, as alterações da DP têm sido exploradas como marcadores de distúrbios clínicos como esquizofrenia 14,15, ansiedade16,17,18, doença de Parkinson 19,20 e doença de Alzheimer 21 , entre outros. Em animais, as alterações da DP acompanham estados comportamentais internos e estão correlacionadas com os níveis de atividade neuronal em áreas corticais 22,23,24,25. O diâmetro da pupila também demonstrou ser um indicador confiável do estado de sono em camundongos26. Essas mudanças de DP relacionadas à excitação e ao estado interno geralmente ocorrem em longas escalas de tempo da ordem de várias dezenas de segundos.

No domínio da pesquisa auditiva, tanto na audição normal quanto em indivíduos com deficiência auditiva, o esforço auditivo e a percepção auditiva têm sido avaliados por meio da pupilometria. Esses estudos geralmente envolvem sujeitos de pesquisa treinados27,28,29,30 que realizam vários tipos de tarefas de detecção ou reconhecimento. Devido à relação supracitada entre excitação e DP, o aumento do engajamento da tarefa e do esforço de escuta tem se mostrado correlacionado com o aumento das respostas de dilatação pupilar 30,31,32,33,34,35. Assim, a pupilometria tem sido utilizada para demonstrar que o aumento do esforço de escuta é despendido para reconhecer a fala espectralmente degradada em ouvintes normo-ouvintes29,36. Em ouvintes com deficiência auditiva, como humanos com perda auditiva relacionada à idade 27,30,37,38,39,40,41 e usuários de implante coclear 42,43, as respostas dos alunos também aumentaram com a diminuição da inteligibilidade de fala; no entanto, os ouvintes com deficiência auditiva apresentaram maior dilatação pupilar em condições de escuta mais fáceis em comparação com os indivíduos normo-ouvintes 27,30,37,38,39,40,41,42,43. Mas experimentos que exigem que o ouvinte execute uma tarefa de reconhecimento nem sempre são possíveis - por exemplo, em bebês ou em alguns modelos animais. Assim, as respostas não relacionadas à luminância das pupilas evocadas por estímulos acústicos poderiam ser um método alternativo viável para avaliar a detecção auditiva nesses casos44,45. Estudos anteriores demonstraram uma dilatação pupilar transitória e ligada a estímulos como parte do reflexo orientador46. Estudos posteriores demonstraram o uso de dilatações pupilares ligadas a estímulos para derivar curvas de sensibilidade de frequência em corujas47,48. Recentemente, esses métodos foram adaptados para avaliar a sensibilidade da resposta de dilatação da pupila em lactentes humanos48. A pupilometria tem se mostrado uma abordagem confiável e não invasiva para estimar os limiares de detecção e discriminação auditiva em cobaias (GPs) que ouvem passivamente, utilizando uma ampla gama de estímulos simples (tons) e complexos (vocalizações GP)49. Essas alterações de DP relacionadas ao estímulo geralmente ocorrem em escalas de tempo mais rápidas da ordem de vários segundos e estão ligadas ao tempo do estímulo. Aqui, a pupilometria de alterações da DP relacionadas a estímulos é proposta como um método para estudar os impactos comportamentais de vários tipos de deficiência auditiva em modelos animais. Em particular, os protocolos de pupilometria para uso em GPs, um modelo animal bem estabelecido de vários tipos de patologias auditivas 50,51,52,53,54,55,56 (ver também a referência 57 para uma revisão exaustiva) é descrito.

Embora esta técnica seja demonstrada em clínicos gerais de audição normal, esses métodos podem ser facilmente adaptados a outros modelos animais e modelos animais de várias patologias auditivas. É importante ressaltar que a pupilometria pode ser combinada com outras medidas não invasivas, como o EEG, bem como com registros eletrofisiológicos invasivos, a fim de estudar os mecanismos subjacentes a possíveis déficits de detecção e percepção sonora. Finalmente, essa abordagem também pode ser usada para estabelecer amplas semelhanças entre modelos humanos e animais.

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Protocol

Para todos os procedimentos experimentais, obtenha a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e siga as Diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório. Nos Estados Unidos da América, os GPs também estão sujeitos aos regulamentos do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA). Todos os procedimentos deste protocolo foram aprovados pela IACUC da Universidade de Pittsburgh e aderiram às Diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório. Para este experimento, foram utilizados três GPs do gênero macho tipo selvagem, pigmentados entre 4 e 10 meses de idade, com ~600-1.000 g de peso.

1. Procedimento cirúrgico

  1. Realizar todos os experimentos de pupilometria em GPs pigmentados acordados, fixados na cabeça e ouvindo passivamente. Verificar a audição normal em indivíduos experimentais usando gravações de resposta auditiva de tronco encefálico (PEATE) de clique e tom puro58.
    NOTA: Embora a aquisição de dados de pupilometria seja, por si só, não invasiva, uma cirurgia invasiva pós-implante de cabeça é utilizada neste protocolo para imobilizar a cabeça do animal durante o procedimento. As alternativas são apresentadas na seção Discussão.
  2. Primeiro, implante todos os animais experimentais com um poste de cabeça de aço inoxidável para fixação da cabeça sob anestesia com isoflurano. Utilizar técnicas cirúrgicas assépticas para ancorar o poste cefálico ao crânio empregando uma combinação de parafusos ósseos e acrílico dentário58.
  3. Fornecer aos animais cuidados pós-cirúrgicos, incluindo a administração de analgésicos sistêmicos e tópicos. Após um período de recuperação de 2 semanas, aclimate gradualmente os animais à configuração experimental.
    NOTA: O procedimento cirúrgico é baseado em métodos previamente publicados em GPs58, bem como em outras espécies59,60, e não é o foco deste protocolo.

2. Aclimatação animal à instalação experimental

NOTA: Os experimentos geralmente ocorrem em uma câmara ou cabine atenuada pelo som (consulte Tabela de Materiais). O tempo necessário para familiarizar um animal com a configuração varia de assunto para assunto. Os tempos típicos de aclimatação são observados abaixo. Um animal bem aclimatado tolerará a fixação da cabeça com o mínimo de movimento corporal e resultará em melhores medições do diâmetro da pupila.

  1. Após um período de recuperação de 2 semanas, primeiro familiarize os animais com o manuseio e transporte (2-3 dias). Essa aclimatação é essencial para reduzir o estresse e a ansiedade. Para familiarizar o animal com o manuseio, coloque o animal em seu recipiente de transporte por quantidades crescentes de tempo (10-30 min) e manuseie o animal por quantidades crescentes de tempo (10-30 min).
  2. Em seguida, aclimate o animal à instalação experimental (2-3 dias), colocando-o em um recinto por 10-45 min (Figura 1A). O compartimento deve permitir pequenas mudanças posturais para o conforto do animal durante a experiência. Permita pequenas mudanças posturais para o conforto do animal durante o experimento. No entanto, sabe-se que a dilatação da pupila precede o movimento49. Portanto, meça o movimento do animal e leve em conta esse movimento na análise dos dados (Figura 1C).
  3. Como parte dessa aclimatação, manuseie manualmente o poste de cabeça implantado, como se o animal fosse ser fixo na cabeça. Segure o poste principal por durações crescentes (10-60 s).
  4. Após a aclimatação manual e dependendo do comportamento animal, tente fixar o animal a uma estrutura rígida usando o suporte do implante.
  5. Aumente lentamente a duração da fixação da cabeça (10-45 min) até que o animal esteja calmo e relativamente imóvel enquanto estiver fixo na cabeça (2-3 dias).
  6. Acostume o animal à presença da câmera, fonte de luz IR e fonte de luz branca (1-2 dias). Acenda a luz branca, aumentando gradualmente a duração (10 min a 30 min).
  7. Acostume o animal à estimulação acústica tocando uma variedade de sons (por exemplo, tons puros, cliques, vocalizações) em diferentes níveis sonoros (1-2 dias, concomitantemente com a etapa 2.6). Para minimizar a habituação a estímulos experimentais, utilizar sons diferentes dos planejados para os experimentos de pupilometria nesta etapa.

3. Calibração da câmara pupilar

NOTA: A câmara utilizada para a pupilometria envia um vídeo via USB para o conjunto de software de pupilometria. A partir deste vídeo, o diâmetro da pupila é extraído usando um ajuste de elipse e um valor de limiar ajustável pelo usuário pelo conjunto de software de pupilometria (consulte Tabela de materiais). O software então faz interface com uma placa digital-para-analógica. A placa produz um valor de tensão analógico que é proporcional ao diâmetro da pupila. A calibração é necessária para converter esse valor de tensão de volta ao diâmetro da pupila em unidades de comprimento.

  1. Coloque uma folha de papel contendo imagens de discos pretos de diâmetro conhecido no mesmo local onde o olho do GP estará localizado durante a pupilometria. Para GPs, PD está na faixa de 4 mm. Portanto, execute a calibração usando discos de 3 mm, 4 mm e 5 mm.
  2. Coloque a câmara de pupilometria (ver Tabela de Materiais) à mesma distância (25 cm) a que os experimentos serão realizados. Ajuste a abertura e o foco da câmera até obter uma imagem nitidamente focada de um disco de diâmetro conhecido.
  3. No software de aquisição de pupilometria (consulte Tabela de Materiais), ajuste o limiar para que o contorno do ajuste da elipse corresponda de perto ao disco fotografado e anote o valor da tensão de saída analógica e o dimensionamento.
  4. Repita este procedimento para os discos de 3 mm, 4 mm e 5 mm. Em seguida, tabular os valores de diâmetro real (em mm) correspondentes aos valores de tensão de saída analógica.

4. Aquisição de dados de pupilometria

  1. Realize todos os experimentos em uma cabine ou câmara atenuada pelo som, com as paredes internas cobertas com espuma anecoica.
  2. Para a entrega de estímulos em campo livre, monte um alto-falante calibrado na parede da câmara atenuada pelo som, a uma altura igual à posição em que o animal será colocado.
    NOTA: A escolha do alto-falante depende da espécie a ser estudada e dos estímulos planejados. Para vocalizações GP, use um alto-falante de driver de alcance completo que tenha uma resposta de frequência relativamente plana (±3 dB) na faixa de frequência de vocalização de 0,5-3 kHz (Figura 1A).
  3. Coloque o animal no recinto garantindo que não sejam possíveis grandes movimentos do corpo (Figura 1A). Fixar a cabeça do animal à estrutura rígida, conforme descrito na etapa 2 (Figura 1A).
  4. Colocar um sensor piezoelétrico sob o invólucro para detectar e registrar os movimentos dos animais (Figura 1A).
  5. Para configurar o sopro de ar, use um suporte preso à mesa para colocar uma ponta de pipeta a ~15 cm na frente do focinho do animal. Conecte um tubo de silício (~ 3 mm de diâmetro) à ponta da pipeta e conecte o tubo a um cilindro de ar regulado.
  6. Mantenha a pressão de ar do cilindro entre 20 e 25 psi. Passe o tubo através de uma válvula de pinça para controlar o tempo e a duração do sopro de ar usando um relé controlado por computador.
  7. Ilumine o olho com uma matriz de LED infravermelho colocada a uma distância de ~10 cm. Use iluminação LED branca a uma intensidade de ~2.000 cd/m2 para iluminar o olho fotografado e trazer a linha de base PD para ~3,5 mm. Mantenha condições de iluminação constantes na câmara experimental durante as sessões experimentais.
    NOTA: Na iluminação normal do laboratório (~ 500 cd / m2), a pupila do GP é bastante dilatada e não permite a observação de dilatação adicional ligada a estímulos. Usando iluminação adicional, a pupila é levada a um diâmetro basal de ~ 3,5 mm, permitindo uma faixa dinâmica suficiente para observar a dilatação ligada ao estímulo. Isso também garante linhas de base consistentes entre sessões e assuntos.
  8. Abra o software de aquisição da pupila e adquira o vídeo (a 90 fps) da pupila usando uma câmera com uma lente de 16 mm (resolução espacial de ângulo visual de 0,15°) e filtro infravermelho (IR) colocado a uma distância de 25 cm do olho fotografado. Certifique-se de que o olho está centrado na área da imagem.
  9. Regule a abertura e o foco da câmera, bem como o nível de infravermelho até que o contorno da pupila fotografada esteja em foco nítido.
  10. No software de aquisição da pupila, defina a área de interesse que contém a pupila selecionando uma área retangular com o mouse.
  11. Use o painel de controles do software de aquisição da pupila para ajustar o brilho e o contraste do vídeo adquirido. Defina a densidade de varredura como 5 e ajuste o limite de modo que o ajuste da elipse corresponda de perto ao contorno da pupila no vídeo.
  12. Usando o software do processador de interface neural, adquira e salve o sinal analógico do traço PD, o traço de tensão do movimento de gravação do sensor piezoelétrico, os tempos de entrega do estímulo e os tempos de entrega do sopro de ar.

5. Detecção de call-in-noise e discriminação categórica usando um paradigma excêntrico modificado

NOTA: Os estímulos para os experimentos de pupilometria consistiram em vocalizações GP que foram registradas em uma colônia animal58. As amostras de vocalização podem ser encontradas no seguinte repositório: https://github.com/vatsunlab/CaviaVOX. Em particular, os gritos de wheek e whine foram usados para obter as respostas dos alunos mostradas nos resultados representativos. De cada categoria, escolha vocalizações cujos comprimentos sejam aproximadamente iguais. Para explicar as diferenças na amplitude de gravação e nos envelopes temporais das vocalizações, normalize as vocalizações por suas amplitudes quadradas médias radiculares (r.m.s.), se necessário.

  1. Apresentar os estímulos auditivos utilizando o MATLAB a uma taxa de amostragem adequada. Para os GPs, que são animais ouvintes de baixa frequência, uma taxa de amostragem de 100 kHz é suficiente.
  2. Selecione oito exemplos diferentes de vocalizações GP de comprimentos semelhantes de duas categorias diferentes de vocalizações (por exemplo, chamadas wheek e chamadas choramingando). Uma categoria (oito exemplares) servirá como estímulo padrão, e a outra categoria (oito exemplares) servirá como estímulo excêntrico ou desviante (Figura 2A).
  3. Para gerar estímulos padrão e desviantes de 1 s de comprimento embutidos no ruído em diferentes níveis de relação sinal-ruído (SNR), adicione ruído branco de igual comprimento às chamadas (ruído fechado). A gama de SNRs amostrados neste experimento está entre -24 dB SNR e +40 dB SNR.
  4. Usando um desenho de bloco, em cada sessão experimental (~ 12 min de duração), adquira dados correspondentes a um único nível de SNR. Em cada sessão, use oito exemplares de uma categoria de vocalização em um SNR particular como estímulos padrão, e oito exemplos da outra categoria de vocalização nesse mesmo nível de SNR como estímulos desviantes.
    NOTA: Um bloco experimental típico dura ~12 minutos. Dependendo do comportamento do animal e da habituação das respostas das pupilas, pode ser possível adquirir dados para 3-4 blocos por dia (~ 45 - 60 minutos). Durante toda essa duração, monitore o animal de perto através do vídeo da pupila, o traço de movimento, bem como diretamente entre os blocos.
  5. Para cada sessão, prepare uma sequência de apresentação de estímulos pseudoaleatórios que contenha estímulos padrão >90% do tempo. Certifique-se de que, entre os estímulos desviantes, haja pelo menos 20 tentativas com estímulos padrão (Figura 2B).
    NOTA: Dependendo do experimento, a ordenação de estímulos desviantes dentro da sequência de apresentação do estímulo pode adotar um desenho quadrado latino para garantir que cada estímulo desviante único ocupe uma posição sequencial única em cada sessão. A média de todas as sessões pode, assim, minimizar o efeito da posição do estímulo desviante dentro da sequência geral do estímulo.
  6. Use uma intensidade de estímulo fixo (por exemplo, 85 dB NPS) para toda a apresentação do estímulo.
    NOTA: Use um conversor digital-analógico apropriado para gerar um sinal de áudio, atenuá-lo ao nível de som desejado usando um atenuador programável, amplificar o sinal e entregar o sinal usando um alto-falante calibrado (por exemplo, hardware, consulte Tabela de materiais).
  7. Apresentar os estímulos com alta regularidade temporal (estímulo 1 s seguido de 3 s de silêncio como mostram os resultados representativos).
    NOTA: As respostas de dilatação da pupila são lentas, tipicamente atingindo um pico de cerca de 1 s após o início do estímulo e levando cerca de 5 s para retornar à linha de base49. A taxa de apresentação do estímulo deve ser baixa o suficiente para explicar essas escalas de tempo lentas. A regularidade temporal é importante porque é possível que a interrupção do padrão de tempo possa atuar como um estímulo desviante.
  8. Para manter o envolvimento do animal com os estímulos e minimizar a habituação, opcionalmente dê um breve sopro de ar (100 ms) após o estímulo desviante. Certifique-se de que o início do sopro de ar esteja suficientemente separado da duração do estímulo (2,5 s do início do estímulo) para que as respostas de dilatação da pupila evocadas pelo estímulo atinjam um pico antes que os artefatos de piscar induzidos pelo sopro de ar.
    NOTA: No paradigma clássico excêntrico, não são utilizados reforços positivos ou negativos. Uma vez que um sopro de ar é usado aqui como um reforço levemente aversivo para manter o envolvimento do animal com os estímulos auditivos, o paradigma é referido como um paradigma excêntrico modificado.

6. Análise e estatística

NOTA: Todas as análises foram realizadas utilizando código personalizado escrito em MATLAB (disponível em https://github.com/vatsunlab/GP_Pupil). Dois métodos principais de análise são descritos, que abordam a confiabilidade e o curso temporal das respostas dos alunos, respectivamente. A escolha de um ou ambos os métodos será ditada pelo desenho experimental.

  1. Detecção de movimento e exclusão de ensaios
    1. Usando o código pupil_avg_JOVE.m, execute a detecção de movimento e a exclusão de teste para cada sessão. Para fazer isso, execute o código e selecione o arquivo de dados de uma única sessão na caixa de diálogo pop-up.
    2. Reduzir a tendência do traço PD e converter as unidades de tensão em micrômetros usando a tabela de calibração derivada anteriormente (consulte a etapa 3). Além disso, detenda linearmente o traço de movimento ao longo de toda a sessão de gravação (~ 12 min).
    3. Inspecione os dados da sessão plotando o traço da pupila (Figura 1B - linha superior) e o traço de movimento linearmente destendido (Figura 1B - linha inferior) ao longo da duração da sessão (~12 min), sobrepostos em marcadores de teste.
    4. Meça o desvio padrão (DP) do traço de movimento. Obtenha os tempos de picos de rastreamento de movimento usando a função findpeaks no MATLAB. Considere os picos que cruzaram um limiar de 5 DPs e que estão separados de outros picos por pelo menos 1 s como um evento de movimento49 (Figura 1B - abaixo).
    5. Descarte quaisquer ensaios (padrão e desviante) de dilatação da pupila que ocorra dentro de 7 s de um evento de movimento. Se mais da metade do número de ensaios desviantes for descartado devido à dilatação da pupila relacionada ao movimento, descarte toda a sessão e repita-a.
  2. Pré-processamento e visualização de dados
    1. Use o código pupil_avg_JOVE.m, para remover artefatos de piscar os olhos, pré-processar os dados e obter a dilatação média da pupila para cada estímulo nas sessões. Para fazer isso, execute o código e selecione todos os arquivos de dados a serem analisados na caixa de diálogo pop-up.
    2. Detecte piscar os olhos (alterações de DP superiores a 400 μm/ms) e remova-os interpolando linearmente o traço de DP em uma janela de tempo de 200 ms centrada no tempo de piscar detectado. Descartar os dados da sessão se mais da metade do número de ensaios desviantes contiver um piscar de olhos entre o início do estímulo e o início do sopro de ar.
    3. Reduzir a amostra de dados de DP da taxa de amostragem de aquisição de 1.000 Hz a 10 Hz.
    4. Extraia traços de DP em uma janela começando 1 s antes do início do estímulo e durando 5 s após a compensação do estímulo. Calcule a DP basal média para cada estímulo em uma janela de 500 ms imediatamente antes do início do estímulo. Subtraia a DP basal desses traços para obter a mudança evocada por estímulo na DP.
    5. A média das mudanças na DP evocada por estímulo para cada condição de estímulo em todas as sessões dentro de cada animal e, em seguida, entre os animais para gerar a resposta média de dilatação da pupila a cada condição de estímulo (por exemplo, Figura 3A).
  3. Análise da curva de crescimento (ACG) para quantificar o curso temporal das alterações da DP
    NOTA: Este método de análise determina a magnitude e o curso temporal das respostas de dilatação da pupila e tem sido utilizado em estudos pupilométricos de seres humanos27,36,40, bem como em cobaias 49.
    1. Concatenar verticalmente todas as saídas de pupil_avg_JOVE.m para todas as sessões, animais, SNRs e atenuações para construir uma matriz contendo as seguintes colunas: animalID, SNR, nível sonoro e valores de diâmetro da pupila (1-50). Utilizando o código pupil_LME_JOVE.m, realizar a análise da curva de crescimento (ACG)27,36,40,49.
    2. Ajustar modelos lineares de efeitos mistos com interceptos em nível de sujeito como efeitos aleatórios e polinômios ortogonais de tempo de até ordem dois como efeitos fixos, com cada SNR desviante tratado como um grupo separado, para a fase ascendente do traço do diâmetro da pupila (0,1 a 2,1 s após o início do estímulo).
    3. Modele a fase ascendente do traço pupilar utilizando a seguinte fórmula36,49:
      Pupildilatação = (Intercepto + Condição) + tempo1 * (β tempo1 + β tempo1: Condição) + tempo2* (β tempo2+ βtempo2: Condição) + r(subjectlevelintercept)
      Onde, tempo1 e tempo2 correspondem a polinômios ortogonais lineares e quadráticos de tempo, e βs correspondem a pesos .
    4. Estimar pesos médios (βs) e seus erros-padrão usando a função fitlme no MATLAB. Estimar a significância estatística dos pesos usando a função coeftest.
    5. Para cada SNR, plote os pesos correspondentes aos termos intercepto, linear e quadrático para visualizar os resultados (Figura 3B, C).
  4. Análise de ensaios que mostraram dilatações da pupila estatisticamente significativas
    NOTA: Este método de análise determina a fração de ensaios desviantes em que uma resposta de dilatação da pupila estatisticamente significativa é observada e corresponde à confiabilidade das respostas de dilatação da pupila.
    1. Escolha uma janela de análise apropriada (0,5-1 s) centrada em torno do pico da resposta da pupila (geralmente ~ 1,5 s após o início do estímulo). Calcule a DP média nesta janela de análise para todos os ensaios padrão e desviantes.
    2. Determine se a DP média para cada um dos ensaios desviantes é maior que 2,33 erros padrão da distribuição agrupada dos valores médios de DP para ensaios padrão. Conte os ensaios desviantes que excedem esse limiar como ensaios que mostram uma dilatação significativa da pupila.
    3. Divida o número de ensaios desviantes que mostram uma dilatação significativa da pupila pelo número total de ensaios desviantes (para cada condição) para quantificar a fração de ensaios que mostram aumentos estatisticamente significativos na DP em comparação com os ensaios de estímulo padrão.
    4. Coloque toda a porcentagem de ensaios com mudanças significativas na pupila em cada célula de uma matriz celular, onde as células são organizadas de SNR inferior a superior. Usando o código pupil_threshold_estimate_JOVE.m, estime o limite de categorização de chamada em ruído.
    5. Plotar a fração de ensaios que mostram um aumento estatisticamente significativo na DP em função do SNR (Figura 3D). Para esses dados, use a função fitnlm MATLAB (na caixa de ferramentas de estatísticas) para ajustar as funções psicométricas do formulário61:
      Ψ(x; α, β, λ) = (1 -λ) * F(x; α, β)
      Onde, F é a função de Weibull, definida como
      F(x; α, β) = Equation 1, α é o parâmetro shift, β é o parâmetro slope e λ é a taxa de lapso.

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Representative Results

A pupilometria foi realizada em três GPs pigmentados do sexo masculino, pesando ~600-1.000 g ao longo dos experimentos. Conforme descrito neste protocolo, para estimar os limiares de categorização call-in-noise, um paradigma excêntrico foi utilizado para a apresentação do estímulo. No paradigma excêntrico, chamadas pertencentes a uma categoria (wheeks) embutidas em ruído branco em um determinado SNR foram empregadas como estímulos padrão (Figura 2A), e chamadas de outra categoria (wheeks) embutidas em ruído branco no mesmo SNR (Figura 2A) como estímulos desviantes. Estímulos padrão e desviantes foram escolhidos aleatoriamente, com reamostragem, a partir de oito exemplares de cada categoria. Em cada sessão experimental, os estímulos foram apresentados com alta regularidade temporal (Figura 2B), com pelo menos 20 apresentações de estímulos padrão entre estímulos desviantes. Os dados foram adquiridos correspondendo a um determinado nível de SNR em cada sessão experimental. Ao longo das sessões, uma ampla gama de SNRs limpos e barulhentos foram amostrados (-24, -18, -12, -6, -3, 0, 3, 6, 12, 40 dB SNR).

As alterações da DP nos estímulos padrão não diferiram significativamente da linha de base (linha azul na Figura 3A). Os estímulos desviantes evocaram alterações robustas e significativamente maiores na DP do que as provocadas pelos estímulos padrão (linhas cinzas na Figura 3A), refletindo a discriminação da categoria de chamada. A magnitude da resposta e a porcentagem de ensaios com respostas pupilares estatisticamente significativas foram maiores no SNR mais limpo e diminuíram gradualmente com a diminuição do SNR (Figura 3A,B). Utilizando a ACG, as respostas dos alunos aos estímulos desviantes mostraram-se estatisticamente significativas em SNRs acima de -18 dB (Figura 3C), que foi considerado o limiar de categorização call-in-noise (linha verde na Figura 3A). A porcentagem de ensaios significativos em cada nível de SNR testado foi bem ajustada por uma função psicométrica (Figura 3D). O nível de SNR necessário para atingir a metade máxima da curva psicométrica foi de cerca de -20 dB SNR (Figura 3D). Curiosamente, para este caso, as métricas baseadas em confiabilidade e tempo de curso produziram valores semelhantes de limiares de categorização de chamada em ruído.

Figure 1
Figura 1: Configuração da pupilometria e alterações da DP evocada por estímulos e relacionadas ao movimento. (A) A configuração da pupilometria com imagens de quadro de vídeo de dilatação da pupila evocada por som (parte superior). A DP basal é mostrada por círculos verdes tracejados. (B) Um traço de PD exemplar (em cima) e um traço de movimento exemplar (em baixo) de uma única sessão experimental. Linhas pretas verticais correspondem a apresentações de estímulos desviantes no tempo de início. Os carrapatos vermelhos correspondem a eventos de movimento detectados automaticamente. A linha tracejada horizontal cinza corresponde ao limite de 5 DP. (C) As alterações da DP (ΔPD) evocadas por estímulo desviante (em cima) e relacionadas a eventos de movimento (em baixo) de uma sessão experimental. O início do estímulo é mostrado pela linha preta vertical; a detecção do evento de movimento é mostrada por linha vermelha vertical. Observe que o início da dilatação da pupila precede o início do movimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Espectrogramas de chamada e estrutura do paradigma de categorização de chamada em ruído . (A) Espectrogramas representativos de um choramingo e chiado de cobaia, em condições limpas e em SNR de 0 e -18 dB, respectivamente. Chamadas ruidosas foram obtidas pela adição de ruído branco. (B) Estrutura do paradigma excêntrico usado para estimar os limiares de categorização de call-in-noise. As chamadas de lamento foram escolhidas aleatoriamente entre oito exemplares e utilizadas como estímulos padrão. As chamadas Wheek foram escolhidas aleatoriamente entre oito exemplares e usadas como desviantes. Em cada sessão experimental, o ruído foi adicionado em um nível diferente de SNR (-24, -18, -12, -6, -3, 0, 3, 6, 12 dB SNR). As chamadas são de 1 s de comprimento e o tempo entre os estímulos é de 3 s. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Estimativas de pupilometria das detecções de ruído de chamada e limiares de categorização . (A) Respostas médias dos alunos de três animais. As respostas médias das pupilas aos estímulos padrão do lamento são representadas por linha azul, e o sombreamento corresponde ao erro padrão ±1 da média (s.e.m.). Linhas cinzentas e sombreamento correspondem a média e ±1 s.e.m. de respostas pupilares evocadas por estímulos desviantes. A intensidade do sombreamento cinza corresponde ao SNR. A linha verde e o sombreamento correspondem ao traço médio da pupila no limiar SNR (cerca de -18 dB SNR). A linha vertical vermelha corresponde ao início do estímulo; a linha vertical laranja corresponde ao início do sopro de ar; linhas tracejadas azul-petróleo correspondem à janela GCA (PD muda de fase ascendente). (B) A ACG se encaixa na fase ascendente das mudanças na DP. Os pontos são diâmetro médio da pupila em caixas de tempo de 100 ms, os bigodes correspondem a ±1 s.e.m. Linhas sólidas correspondem a ajustes de modelos de efeitos mistos. Cores de linha como em A. (C) estimativas de peso GCA. Os pesos do intercepto estão em azul, a inclinação está em vermelho e a aceleração está em roxo. Bigodes correspondem a ±1 s.e.m. Os asteriscos mostram pesos de regressão estatisticamente significativos (teste de hipótese linear em coeficientes de modelo de regressão linear). (D) A função psicométrica se ajusta à porcentagem de ensaios com alterações significativas da DP provocadas pelo estímulo desviante em função da SNR. Bigodes correspondem a ±1 s.e.m. Note que 50% do máximo é atingido em cerca de -20 dB SNR (linha tracejada verde). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo demonstra o uso da pupilometria como método não invasivo e confiável para estimar limiares auditivos em animais ouvintes passivos. Seguindo o protocolo aqui descrito, foram estimados os limiares de categorização call-in-noise em GPs ouvintes normais. Os limiares estimados por meio da pupilometria mostraram-se consistentes com os obtidos com o treinamento operante62. Em comparação com o treinamento operante, no entanto, o protocolo de pupilometria foi relativamente simples e rápido de configurar e adquirir dados. Cada sessão de aquisição de dados (por nível de SNR) durou cerca de 12 min, o que resultou em 1-2 h de sessões experimentais (através dos níveis de SNR) por animal por dia49. A aquisição de dados pode ser concluída em cerca de 7-10 dias (dependendo do número de níveis de SNR usados). Embora o paradigma excêntrico tenha sido utilizado para a estimação do limiar de categorização call-in-noise neste manuscrito, esse protocolo de pupilometria pode ser adaptado para versões mais fáceis de paradigmas excêntricos, onde apenas um exemplo de chamada é usado, ou para outros paradigmas de estímulo usando uma ampla gama de estímulos complexos ou simples49.

O método não é isento de desvantagens. Primeiro, o protocolo atual requer o implante de um poste de cabeça para fixar a cabeça durante esses experimentos. A cirurgia e a recuperação do pós-implante da cabeça adicionariam um mínimo de 2 semanas ao cronograma do protocolo experimental. É possível que essa etapa possa ser evitada usando outros métodos de imobilização não invasiva de animais acordados durante experimentos - por exemplo, usando capacetes personalizados impressos em 3D63 ou termoplásticos deformáveis64. Mais experimentos são necessários para explorar essas soluções. Em segundo lugar, os animais também poderiam se habituar rapidamente a estímulos desviantes, resultando em respostas decrescentes de dilatação da pupila ao longo de uma sessão experimental. Esse efeito poderia ser minimizado restringindo as sessões experimentais a curtas durações (~12 min) e apresentando apenas um número limitado (8) de estímulos desviantes. Além disso, um sopro de ar entregue após os estímulos desviantes pode garantir que os animais permaneçam envolvidos com os estímulos auditivos. Em terceiro lugar, devido a essa rápida habituação, vários dias podem ser necessários para concluir a aquisição de dados. Testando apenas os valores de SNR que densamente amostram as partes mais íngremes da curva psicométrica, o número total de dias experimentais pode ser minimizado. Em quarto lugar, os animais podem não ficar parados durante os experimentos, ou piscar excessivamente ou fechar os olhos durante os experimentos. Esses fatores são uma função da espécie e da aclimatação e apresentam um alto grau de variabilidade individual. Os GPs são naturalmente dóceis e, aclimatando-os bem à configuração experimental, os artefatos de movimento e piscar podem ser minimizados. Piscadas espontâneas e sacadas são tipicamente bastante raras em cobaias49, mas isso também pode ser uma função da espécie. Finalmente, como mencionado anteriormente, a dinâmica pupilar em humanos tem sido associada a uma série de distúrbios neuropsiquiátricos. Embora os animais experimentais aqui utilizados sejam considerados neurotípicos, essa ressalva deve ser mantida em mente ao interpretar os resultados.

Embora uma implementação de hardware da pupilometria seja descrita aqui (usando um rastreador ocular comercialmente disponível e um sistema de aquisição de dados neurais), o equipamento necessário é caro e não econômico para expansão. No entanto, outras soluções personalizadas baseadas no mesmo princípio subjacente de rastreamento ocular baseado em infravermelho que são mais econômicas estão disponíveis. Por exemplo, um estudo utilizou componentes personalizados e algoritmos de processamento de vídeo personalizados para extrair o diâmetro da pupila do vídeo gravado22,25. Algoritmos de aprendizagem profunda recentemente desenvolvidos também são capazes de extrair o diâmetro da pupila a partir de dados videográficos65,66. Essas soluções poderiam reduzir mais da metade o custo das plataformas de pupilometria. O trade-off aqui é entre despesa e tempo – enquanto as soluções comerciais são mais caras, elas são soluções turn-key que podem ser usadas fora da caixa. Por outro lado, as soluções personalizadas são econômicas e escaláveis, mas exigem experiência para configurar e o tempo necessário para desenvolver pipelines de análise personalizados.

Embora o protocolo aqui detalhado tenha sido realizado em clínicos gerais de audição normal, a pupilometria pode ser relativamente fácil de usar em outros modelos animais de deficiência auditiva com alterações apropriadas no tipo e nos parâmetros do estímulo. Isso permitiria caracterizar os efeitos da perda auditiva em uma variedade de tipos de estímulos e espécies, o que poderia potencialmente produzir novas observações. Como a pupilometria é uma técnica não invasiva que também tem sido amplamente utilizada em humanos, usando os mesmos estímulos usados para animais, a pupilometria pode ser usada para comparar os efeitos de várias patologias auditivas entre espécies. Por exemplo, uma metanálise recente em humanos mostrou que os déficits de percepção de fala no ruído decorrentes da exposição moderada ao ruído foram melhor observados quando estímulos complexos e temporalmente variados foram utilizados67. A estimativa dos limiares de categorização call-in-noise por pupilometria aqui demonstrada poderia ser utilizada como uma dessas tarefas utilizando estímulos complexos para avaliar os efeitos da exposição ao ruído em GPs. A avaliação da audição em um nível comportamental usando esses métodos complementaria os métodos eletrofisiológicos e anatômicos e poderia fazer parte do kit de ferramentas padrão para avaliar vários distúrbios auditivos conhecidos.

Em conclusão, os seguintes pontos são críticos para o sucesso da aquisição de dados pupilométricos. Primeiro, para garantir um alto rendimento de dados, é fundamental familiarizar bem os animais com a configuração experimental. A falta de paciência nesta etapa pode degradar a qualidade dos dados que eventualmente são obtidos ou exigir a repetição de várias sessões para compensar as sessões perdidas. Em segundo lugar, para evitar alterações de DP relacionadas à luminância, é importante realizar experimentos em condições de iluminação constante, mantendo essas condições entre as sessões e os sujeitos, tanto quanto possível. Em terceiro lugar, para minimizar o número de sessões experimentais necessárias, é importante realizar experimentos piloto para identificar faixas de parâmetros críticos para amostragem densa. Em quarto lugar, para minimizar a habituação dos animais aos estímulos, é importante realizar experimentos em sessões curtas contendo apenas algumas apresentações de estímulos desviantes. Um sopro de ar pode ser adicionalmente usado para manter um alto envolvimento com os estímulos auditivos.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo NIH (R01DC017141), pela Pennsylvania Lions Hearing Research Foundation e por fundos dos Departamentos de Otorrinolaringologia e Neurobiologia da Universidade de Pittsburgh.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analog output board Measurement Computing Corporation, Norton, MA PCI-DDA02/12
Anechoic foam Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN
Condenser microphone Behringer, Willich, Germany C-2
Free-field microphone Bruel & Kjaer, Denmark)  Type 4940 
Matlab Mathworks, Inc., Natick, MA 2018a version
Monocular remote camera and illuminator system Arrington Research, Scottsdale, AZ MCU902 Infrared LED array + camera with infrared filter
Multifunction I/O Device  National Instruments, Austin, TX PCI-6229
Neural interface processor Ripple Neuro, Salt Lake City, UT SCOUT
Piezoelectric motion sensor SparkFun Electronics, Niwot, CO SEN-10293
Pinch valve  Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL EW98302-02
Programmable attenuator Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL PA5
Silicon Tubing Cole-Parmer ~3 mm
Sound attenuating chamber IAC Acoustics
Speaker full-range driver Tang Band Speaker, Taipei, Taiwan W4-1879
Stereo Amplifier Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL SA1
Tabletop - CleanTop Optical TMC vibration control / Ametek, Peabody, MA
Viewpoint software ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ

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Neurociência Edição 191
Pupilometria para Avaliar a Sensação Auditiva em Cobaias
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Pernia, M., Kar, M., Montes-Lourido, P., Sadagopan, S. Pupillometry to Assess Auditory Sensation in Guinea Pigs. J. Vis. Exp. (191), e64581, doi:10.3791/64581 (2023).

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