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Behavior

वास्तविक समय शून्य स्पॉट परख

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

यह आलेख पारंपरिक शून्य स्पॉट परख में वीडियो निगरानी को शामिल करके माउस शून्यव्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक नई विधि का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण दिन के प्रकाश और अंधेरे चरणों के दौरान शून्यता की घटनाओं और माउस व्यवहार के विवरण पर लौकिक, स्थानिक और वॉल्यूमेट्रिक जानकारी प्रदान करता है।

Abstract

सामान्य शून्यता व्यवहार तंत्रिका तंत्र के उचित नियंत्रण के तहत मूत्राशय, मूत्रमार्ग और मूत्रमार्ग स्फिंक्टर्स के समन्वित कार्य का परिणाम है। माउस मॉडल में स्वैच्छिक शून्यता व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, शोधकर्ताओं ने शून्य स्पॉट परख (वीएसए) विकसित की है, एक विधि जो एक जानवर के पिंजरे के फर्श को अस्तर करने वाले फिल्टर पेपर पर जमा मूत्र के धब्बे की संख्या और क्षेत्र को मापती है। हालांकि तकनीकी रूप से सरल और सस्ती, इस परख की सीमाएं हैं जब अंत-बिंदु परख के रूप में उपयोग किया जाता है, जिसमें शून्यता की घटनाओं के अस्थायी समाधान की कमी और अतिव्यापी मूत्र धब्बे को निर्धारित करने में कठिनाइयां शामिल हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने एक वीडियो-मॉनिटर वीएसए विकसित किया, जिसे हम वास्तविक समय वीएसए (आरटी-वीएसए) कहते हैं, और जो हमें शून्यता आवृत्ति निर्धारित करने, शून्य मात्रा और शून्यपैटर्न का आकलन करने और दिन के अंधेरे और प्रकाश दोनों चरणों के दौरान 6 घंटे की समय खिड़कियों पर माप करने की अनुमति देता है। इस रिपोर्ट में वर्णित विधि को माउस-आधारित अध्ययनों की एक विस्तृत विविधता पर लागू किया जा सकता है जो स्वास्थ्य और रोग राज्यों में स्वैच्छिक माइक्रोट्यूरिटेशन के शारीरिक और न्यूरोबिहेवियरल पहलुओं का पता लगाते हैं।

Introduction

मूत्र भंडारण और अभ्रक को एक केंद्रीय सर्किटरी (केंद्रीय तंत्रिका तंत्र) द्वारा समन्वित किया जाता है जो श्रोणि और हाइपोगैस्ट्रिक नसों के माध्यम से मूत्राशय भरने की स्थिति के बारे में जानकारी प्राप्त करता है। यूरोथेलियम, एपिथेलियम जो गुर्दे की श्रोणि से समीपस्थ मूत्रमार्ग तक मूत्र पथ को रेखाबद्ध करता है, मूत्र में मौजूद चयापचय अपशिष्ट उत्पादों और रोगजनकों के लिए एक तंग बाधा बनाता है। यह एक संवेदी वेब का एक अभिन्न घटक है, जो मूत्राशय की भरने की स्थिति को अंतर्निहित ऊतकों और अभिवाही तंत्रिकाओं 1,2 को महसूस करता है और संचारकरता है। यूरोथेलियल बाधा का विघटन, या यूरोथेलियल मेकेनोट्रांसडक्शन मार्गों में परिवर्तन, कम मूत्र पथ के लक्षणों जैसे आवृत्ति, तात्कालिकता, नोक्टुरिया और असंयम 3,4,5,6,7 के साथ शून्यता का कारण बन सकता है। इसी तरह, उम्र बढ़ने, मधुमेह, कम मूत्र पथ के संक्रमण, अंतरालीय सिस्टिटिस, और अन्य रोग प्रक्रियाएं जो मूत्राशय को प्रभावित करती हैं, या संबंधित सर्किटरी जो इसके कार्य को नियंत्रित करती हैं, मूत्राशय की शिथिलता 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 के कारण जानी जाती हैं। 18,19. सामान्य और असामान्य शून्यता व्यवहार की बेहतर समझ उन तरीकों के विकास पर निर्भर करती है जो विभिन्न पेशाब पैटर्न के बीच मज़बूती से भेदभाव कर सकते हैं।

परंपरागत रूप से, चूहों के स्वैच्छिक शून्यीकरण व्यवहार का अध्ययन शून्य स्पॉट परख (वीएसए) का उपयोग करके किया गया है, जिसे डेस्जार्डिंस और सहयोगियों 20 द्वारा विकसित किया गया है, और मोटे तौर पर इसकी सादगी, कम लागत और गैर-आक्रामक दृष्टिकोण 8,21,22,23,24 के कारण अपनाया गया है। यह परख आम तौर पर एक समापन बिंदु परख के रूप में किया जाता है, जिसमें एक माउस एक फिल्टर पेपर द्वारा पंक्तिबद्ध पिंजरे में एक निर्धारित समय बिताता है, जिसे बाद में संख्या की गणना करके और मूत्र के धब्बों के आकार का आकलन करके विश्लेषण किया जाता है जब फिल्टर पेपर को पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत रखा जाता है (इन स्थितियों के तहत मूत्र के धब्बे फ्लोरेस)20।. इन कई फायदों के बावजूद, पारंपरिक वीएसए कुछ प्रमुख सीमाएं प्रस्तुत करता है। क्योंकि चूहे अक्सर एक ही क्षेत्र में पेशाब करते हैं, जांचकर्ताओं को परख की अवधि को अपेक्षाकृत कम समय (≤4 घंटे) 25 तक सीमित करना पड़ता है। यहां तक कि जब वीएसए को कम समय अवधि में किया जाता है, तो छोटे शून्य धब्बे (एसवीएस) को हल करना लगभग असंभव होता है जो बड़े शून्य धब्बे पर गिरते हैं या, पूंछ या पंजे से चिपके मूत्र के कैरीओवर से एसवीएस को अलग करना। यह भेद करना भी बहुत मुश्किल है कि क्या एसवीएस लगातार लेकिन व्यक्तिगत शून्यता की घटनाओं का परिणाम है (एक फेनोटाइप जो अक्सर सिस्टिटिस 4,26 के जवाब में देखा जाता है), या पोस्ट-माइक्रोट्यूरियन ड्रिबलिंग (मूत्राशय आउटलेट रुकावट 27 से जुड़ा एक फेनोटाइप) के कारण। इसके अलावा, काम के घंटों के दौरान परख को पूरा करने की इच्छा, रोशनी बंद होने पर आवास सुविधाओं तक पहुंचने में कठिनाइयों के साथ मिलकर, अक्सर इन परखों को 24 घंटे के सर्कैडियन चक्र की प्रकाश अवधि तक सीमित कर देती है। इस प्रकार, ये समय की बाधाएं अपने सक्रिय रात के चरण के दौरान माउस शून्यव्यवहार के मूल्यांकन को रोकती हैं, जिससे सर्कैडियन लय द्वारा नियंत्रित विशिष्ट जीन या उपचार का विश्लेषण करने की क्षमता कम हो जाती है।

इन सीमाओं में से कुछ को दूर करने के लिए, शोधकर्ताओं ने वास्तविक समय 26,28,29,30,31,32 में शून्यता व्यवहार का आकलन करने के लिए वैकल्पिक तरीके विकसित किए हैं। इनमें से कुछ दृष्टिकोणों में चयापचय पिंजरों26,28,29, या थर्मल कैमरों30 के उपयोग जैसे महंगे उपकरणों का उपयोग शामिल है; हालांकि, इनकी भी सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, चयापचय पिंजरों में, मूत्र जाल फर्श के तारों और फ़नल की दीवारों का पालन करता है, जिससे एकत्र और मापा जाने वाले मूत्र की मात्रा कम हो जाती है। इस प्रकार, छोटी रिक्तियों के बारे में सटीक रूप से डेटा एकत्र करना मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, चयापचय पिंजरे शून्यता की घटनाओं के स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं (यानी, कोनों में पेशाब बनाम कक्ष के केंद्र)। यह देखते हुए कि थर्मोग्राफिक कैमरों द्वारा उपयोग किए जाने वाले लंबी-तरंग दैर्ध्य अवरक्त विकिरण ठोस पदार्थों में प्रवेश नहीं करते हैं, वीडियो थर्मोग्राफी द्वारा मूल्यांकन की गई शून्यता गतिविधि को एक खुली प्रणाली में किया जाना चाहिए, जो सक्रिय चूहों के साथ चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि वे हवा में कई इंच कूद सकते हैं। एक अन्य प्रणाली कागज पर स्वचालित शून्य दाग (एवीएसओपी) दृष्टिकोण33 है, जिसमें रोल्ड फिल्टर पेपर होता है जो माउस पिंजरे के तार जाल फर्श के नीचे निरंतर गति से चलता है। यह दृष्टिकोण शास्त्रीय वीएसए में होने वाले पेपर क्षति और मूत्र के धब्बे के ओवरलैप को रोकता है, और इसका कार्यान्वयन अन्वेषक को कई दिनों तक प्रयोग करने की अनुमति देता है। हालांकि, यह अन्वेषक को शून्य घटनाओं के सटीक समय के साथ प्रदान नहीं करता है, और व्यवहार की जांच करने की कोई क्षमता नहीं है और यह स्पॉटिंग के साथ कैसे संबंधित है। इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए, शोधकर्ताओं ने वीडियो-मॉनिटरिंग को शून्य करने के लिए शामिल किया है, एक दृष्टिकोण जो माउस गतिविधि और पेशाब की घटनाओं31,32 के एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देता है। एक दृष्टिकोण में एक ब्लू लाइट एमिटिंग डायोड (एलईडी) और एक वीडियो-कैमरा रखा जाता है, जिसमें एक हरे रंग की प्रतिदीप्ति प्रोटीन फिल्टर होता है जो शून्यता की घटनाओं की कल्पना करने के लिए प्रयोगात्मक पिंजरे के नीचे सेट होता है, और माउस की स्थितिको कैप्चर करने के लिए पिंजरे के ऊपर एक इन्फ्रारेड एलईडी और एक वीडियो-कैमरा होता है। इस सेटअप का उपयोग फाइबर फोटोमेट्री करते समय शून्यता व्यवहार की निगरानी के लिए किया गया है; हालांकि, इस प्रणाली के उज्ज्वल रोशनी वाले वातावरण में जांचकर्ताओं को शून्यता को प्रोत्साहित करने के लिए मूत्रवर्धक एजेंट के साथ अपने चूहों का इलाज करने की आवश्यकता थी। एक अन्य प्रयोगात्मक डिजाइन में, क्रमशः माउस मोटर गतिविधि और पेशाब की घटनाओं की कल्पना करने के लिए प्रयोगात्मक पिंजरे के ऊपर और नीचे वाइड-एंगल कैमरे रखे गए थे। इस मामले में, पिंजरे के फर्श को अस्तर करने वाले फिल्टर पेपर पर जमा मूत्र के धब्बे पिंजरे31 के नीचे रखी यूवी रोशनी के साथ फिल्टर पेपर को रोशन करके प्रकट किए गए थे। इस सेटअप का उपयोग स्वैच्छिक शून्यीकरणव्यवहार में शामिल ब्रेनस्टेम न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए दिन के प्रकाश चरण के दौरान 4 मिनट की अवधि में किया गया था। अंधेरे चरण के दौरान या समय की अवधि >4 मिनट के लिए इसके उपयोग के लिए इस प्रणाली की उपयुक्तता की सूचना नहीं दी गई थी।

इस लेख में, एक विधि का वर्णन किया गया है जो माउस शून्यव्यवहार की दीर्घकालिक वीडियो निगरानी की अनुमति देकर पारंपरिक वीएसए को बढ़ाता है। यह लागत प्रभावी दृष्टिकोण माउस व्यवहार 3,4,34 से संबंधित विवरण के साथ-साथ दिन के प्रकाश और अंधेरे चरणों के दौरान विस्तारित अवधि के लिए शून्यता की घटनाओं के बारे में लौकिक, स्थानिक और वॉल्यूमेट्रिक जानकारी प्रदान करता है। शून्यीकरण कक्षों के निर्माण, वास्तविक समय वीएसए (आरटी-वीएसए) के कार्यान्वयन और डेटा के विश्लेषण के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान की गई है। आरटी-वीएसए उन शोधकर्ताओं के लिए मूल्यवान है जो शारीरिक तंत्र को समझने की मांग करते हैं जो मूत्र प्रणाली के कार्य को नियंत्रित करते हैं, माइक्रोट्यूरियन को नियंत्रित करने के लिए औषधीय दृष्टिकोण विकसित करते हैं, और रोग प्रक्रियाओं के आणविक आधार को परिभाषित करते हैं जो निचले मूत्र पथ को प्रभावित करते हैं।

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Protocol

यूरोथेलियल पीज़ो 1/2 डबल नॉकआउट चूहे (पीजेड 1/2-केओ, जीनोटाइप: पीज़ो 1 एफएल / पीज़ो 2एफएल / Upk2CRE +/-) और नियंत्रण (Pz1/2-C, जीनोटाइप: Piezo1fl / fl; पीज़ो 2एफएल / अपके 2सीआरई -/-) जैक्स प्रयोगशालाओं से प्राप्त माता-पिता के उपभेदों से इन-हाउस उत्पन्न हुए थे (पीज़ो 1 एफएल/ एफएल स्ट्रेन # 029213; पीज़ो2 एफएल/एफएल स्ट्रेन # 027720; Upk2CRE +/- तनाव # 029281)। प्रयोगों में मादा (1.5-3 महीने और वजन में 17-20 ग्राम) और पुरुष (2-4 महीने और वजन में 23-29 ग्राम) चूहों दोनों का उपयोग किया गया था। साइक्लोफॉस्फेमाइड-प्रेरित सिस्टिटिस प्रयोगों के लिए, जंगली-प्रकार सी 57बीएल / 6 जे महिलाओं (3 महीने की उम्र और ~ 20 ग्राम वजन) का उपयोग किया गया था (जैक्सन प्रयोगशालाओं, तनाव # 000664)। जानवरों को रखा गया था और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के तहत पिट्सबर्ग पशु देखभाल सुविधा विश्वविद्यालय में प्रयोग किए गए थे। सभी पशु प्रयोग ों को प्रयोगशाला जानवरों की मानवीय देखभाल और उपयोग पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति और पशु कल्याण अधिनियम के प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किया गया था।

1. वास्तविक समय शून्य स्पॉट परख (आरटी-वीएसए) के लिए पिंजरों का संयोजन।

  1. आरटी-वीएसए रिग में एक यूवी स्टैंड होता है जिसमें दो यूवी लाइट बल्ब और दो वाइड-एंगल कैमरे (नीचे के कैमरे) होते हैं, जिनका उपयोग दिन के प्रकाश चरण के दौरान शून्यगतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है। स्टैंड पर आराम करने के लिए दो माउस कक्षों की व्यवस्था करें। प्रत्येक माउस कक्ष के ढक्कन पर वाइड एंगल कैमरे (शीर्ष कैमरे) संलग्न करें, जिसका उपयोग दिन के अंधेरे चरण के दौरान शून्यगतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है (चित्रा 1ए)।
  2. टी-स्लॉट एल्यूमीनियम प्रोफाइल में एक्स 1 में 1 से यूवी स्टैंड और माउस कक्षों के फ्रेम का निर्माण करें। दो माउस कक्षों और यूवी स्टैंड के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले घटकों की सूची के लिए तालिका 1 देखें और इकट्ठे घटकों और आयामों के विभिन्न दृश्यों के लिए चित्रा 1बी-डी देखें।
  3. प्रत्येक माउस कक्ष का निर्माण आठ टी-स्लॉट एल्यूमीनियम प्रोफाइल के साथ 10 इंच तक काटा जाता है और चार को 14.75 इंच तक काटा जाता है। माउस कक्ष के निचले भाग को इकट्ठा करके शुरू करें और चित्रा 1 के अनुसार टी-स्लॉट प्रोफाइल को इकट्ठा करने के लिए मानक अंत फास्टनरों (तालिका 1) का उपयोग करें। माउस कक्षों के फर्श का निर्माण करने के लिए प्रोफाइल के आंतरिक चैनल में ऐक्रेलिक संचारित करने वाले 38.5 सेमी x 26.5 सेमी यूवी को माउंट करें।
    नोट: मानक अंत फास्टनरों के साथ टी-स्लॉट प्रोफाइल को इकट्ठा करने के तरीके के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए, कंपनी के वेबपेज पर जाएं।
  4. बाकी प्रोफाइल के साथ माउस कक्ष की दीवारों का निर्माण करें। माउस कक्ष की बाहरी दीवारों को इकट्ठा करने के लिए प्रोफाइल में 38.5 सेमी x 21.5 सेमी और 26.5 सेमी x 21.5 सेमी घर्षण प्रतिरोधी (एआर) पॉली कार्बोनेट पैनलों को माउंट करें। माउस कक्ष के इंटीरियर का निर्माण करने के लिए 37.5 सेमी x 23.9 सेमी और 24.4 सेमी x 23.9 सेमी एआर पॉली कार्बोनेट पैनलों का उपयोग करें।
  5. मानक अंत फास्टनर 1/4-20 ट्रेड के साथ एआर पॉली कार्बोनेट पैनलों को सुरक्षित करें। चरण 1.3 के नोट में वेबपेज पर प्रोफाइल में पैनलों को माउंट करने के निर्देश देखें। आंतरिक पैनलों के बीच जंक्शनों को सील करने के लिए वाणिज्यिक सिलिकॉन कॉल्क का उपयोग करें।
  6. चित्र 1बी में दर्शाए अनुसार पिंजरे के ढक्कन को इकट्ठा करने के लिए टी-स्लॉट प्रोफाइल में दो 12 इंच और दो 14.75 का उपयोग करें। ढक्कन को पूरा करने के लिए प्रोफाइल के आंतरिक चैनल में 38.5 सेमी x 26.5 सेमी एआर पॉली कार्बोनेट पैनल माउंट करें।
  7. 12 इन कैमरा प्रोफाइल को पिंजरे के शीर्ष के लंबे अक्षों के लंबवत माउंट करें और कोने कोष्ठक के अंदर दो लाइट संक्रमण के साथ सुरक्षित करें (चित्रा 1बी में चिह्नित 3)। वेबकैम माउंटिंग समर्थन के रूप में एक सीधी फ्लैट प्लेट (चिह्नित 2) का उपयोग करें और इसे चित्र 1बी में दिखाए अनुसार माउंट करें। कैमरा माउंटिंग स्क्रू के साथ कैमरे को सपोर्ट से अटैच करें।
  8. माउस कक्ष के शरीर पर ढक्कन संलग्न करने के लिए 10 श्रृंखला मानक लिफ्ट-ऑफ हिंज दाएं हाथ की असेंबली का उपयोग करें (चित्र 1बी में 1 चिह्नित)।
  9. चित्र 1सी, डी के अनुसार, यूवी स्टैंड का निर्माण करें जिसमें चार टी-स्लॉट प्रोफाइल 40 इंच तक काटे गए हैं, चार टी-स्लॉट प्रोफाइल को 32 इंच तक काटा गया है, और चार टी-स्लॉट प्रोफाइल को 10 इंच तक काटा गया है। यूवी कक्ष के निचले हिस्से का निर्माण करने के लिए प्रोफाइल में 82.5 सेमी x 26.5 सेमी ऐक्रेलिक दर्पण शीट माउंट करें।
  10. यूवी स्टैंड की दीवार बनाने के लिए 82.5 सेमी x 30.5 सेमी और 26.5 सेमी x 30.5 सेमी ऐक्रेलिक मिरर शीट का उपयोग करें।
  11. यूवी स्टैंड को सुरक्षित करने के लिए 10 श्रृंखला पांच-छेद टी फ्लैट प्लेटों (चित्रा 1 सी में 2 चिह्नित), 10 श्रृंखला पांच-छेद एल फ्लैट प्लेटों (चित्रा 1 सी में चिह्नित 3), और 10 श्रृंखला पांच-छेद टी फ्लैट प्लेटों (चित्रा 1सी में 1 चिह्नित) को संलग्न करें।
  12. टी-स्लॉट डे प्रोफाइल में नीचे के कैमरों को 32 इंच तक काट दें और स्टैंड के निचले हिस्से में दो लाइट ट्रांजिशन कॉर्नर ब्रैकेट के साथ चिपका दें जैसा कि चित्र 1डी में दिखाया गया है। वेबकैम को टी-स्लॉट डे प्रोफ़ाइल में संलग्न करने के लिए सीधे फ्लैट प्लेटों का उपयोग करें।
  13. अंदर, सामने और पीछे प्रोफाइल पर यूवी लैंप माउंट करें, और चित्र 1डी में दिखाए गए अनुसार सीधे फ्लैट प्लेटों से संलग्न करें।
  14. चार वेबकैम को वीडियो निगरानी सॉफ्टवेयर चलाने वाले कंप्यूटर के यूएसबी पोर्ट से कनेक्ट करें।

2. प्रयोग से पहले पशु आवास

  1. चार के समूहों में घर प्रयोगात्मक चूहों, या तो उद्देश्य-नस्ल या बाहरी साइट से प्राप्त। जब संभव हो, इन प्रयोगों के लिए उम्र से मेल खाने वाली मादा या नर चूहों का उपयोग करें। यदि जानवरों को बाहरी स्रोत से प्राप्त किया जाता है, तो उन्हें किसी भी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का संचालन करने से पहले कम से कम 7 दिनों के लिए अनुकूलन करने की अनुमति दें।
  2. पशु सुविधा में अपने पूरे समय के दौरान, जानवरों को बिस्तर और संवर्धन (जैसे, प्लास्टिक इग्लू, पहिया, काटने के लिए कागज का टुकड़ा) वाले मानक पिंजरों में रखें और उन्हें 12 घंटे के दिन / रात चक्र के तहत रखें, जिसमें पानी और सूखे माउस चाउ एड लिबिटम तक पहुंच हो।

3. दिन के प्रकाश और अंधेरे चरणों के दौरान आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग

नोट: नीचे दिया गया प्रोटोकॉल दिन के प्रकाश और अंधेरे चरणों के दौरान माउस शून्यव्यवहार का आकलन करने के लिए आरटी-वीएसए के उपयोग का वर्णन करता है। जानवरों को 12 घंटे के प्रकाश और 12 घंटे के अंधेरे चक्र पर रखा जाता है, जिसमें Zeitgeber समय (ZT) = 0 सुबह 07:00 बजे होता है। रिकॉर्डिंग प्रकाश चरण प्रयोगों के लिए सुबह 10:30 बजे से 11:00 बजे (जेडटी = 3.5–4.0) के बीच और अंधेरे चरण प्रयोगों के लिए शाम 06:00 बजे और 06:30 बजे (जेडटी = 11.0–11.5) के बीच शुरू होती है। जब जानवरों को दोनों स्थितियों के तहत परीक्षण किया जाता है, तो प्रयोग आमतौर पर दो अलग-अलग दिनों में किए जाते हैं, जिसमें प्रकाश और अंधेरे परीक्षणों के बीच कम से कम 5 लगातार दिन होते हैं। प्रयोगों को उन दिनों में नहीं किया जाना चाहिए जब जानवरों के कमरे साफ किए जाते हैं या पिंजरों को बदल दिया जाता है, क्योंकि इनके परिणामस्वरूप तनाव हो सकता है जो शून्यता व्यवहार को प्रभावित करता है। सभी चरणों को चूहों के लिए न्यूनतम तनाव की स्थितियों के तहत किया जाना चाहिए।

  1. प्रयोगात्मक जानवरों को उनके आवास स्थान से प्रक्रिया कक्ष में ले जाएं जहां आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग कक्ष स्थित हैं।
  2. आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग कक्ष की तैयारी
    1. प्रत्येक आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग पिंजरे के तल में फिल्टर पेपर (24.3 सेमी x 36.3 सेमी) का एक टुकड़ा रखें। दिन के समय के आधार पर, पतले (हल्के चरण प्रयोग) या मोटे (अंधेरे चरण प्रयोग) फिल्टर पेपर का उपयोग करें।
      नोट: सक्रिय अंधेरे चरण के दौरान मोटे फिल्टर पेपर का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह पतले फिल्टर पेपर की तुलना में श्रेडिंग के लिए अधिक प्रतिरोधी है। अंधेरे चरण के दौरान मोटे फिल्टर पेपर पर जमा मूत्र के धब्बे की कल्पना करने के लिए शीर्ष कैमरों का उपयोग किया जाता है। इसके विपरीत, प्रकाश चरण के दौरान, नीचे के कैमरों का उपयोग किया जाता है क्योंकि परिवेश प्रकाश शीर्ष कैमरों को फिल्टर पेपर पर जमा मूत्र के धब्बे का पता लगाने से रोकता है। इस मामले में, पतले फिल्टर पेपर का उपयोग किया जाता है। हमने पाया कि नीचे के कैमरे मोटे फिल्टर पेपर पर जमा छोटी शून्यता की घटनाओं का पता लगाने में अप्रभावी हैं।
    2. फिल्टर पेपर के शीर्ष पर, निम्नलिखित वस्तुओं को रखें: एक प्लास्टिक इग्लू (जो सोने की जगह देता है), संवर्धन उद्देश्यों के लिए एक बाँझ 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, और एक 60 मिमी x 15 मिमी प्लास्टिक डिश जिसमें माउस ड्राई चाउ के दो या तीन टुकड़े और जेल-पैक के रूप में 14-16 ग्राम पानी होता है (गैर-गीला पानी जेल; चित्र 2)।
      नोट: संवर्धन उद्देश्यों के लिए 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले बाड़े के लिए विशिष्ट था।
    3. एक बार रिकॉर्डिंग कक्ष तैयार हो जाने के बाद, प्रयोगात्मक चूहों को फिल्टर पेपर पर धीरे से बिछाकर अंदर रखें। सुनिश्चित करें कि आवास पिंजरे से रिकॉर्डिंग पिंजरों में जानवरों का स्थानांतरण न्यूनतम तनाव के साथ होता है।
    4. एक बार जब सभी प्रयोगात्मक जानवर अपने रिकॉर्डिंग पिंजरों के अंदर होते हैं, तो उनके ढक्कन बंद होते हैं, तो प्लेक्सीग्लास ढक्कन की सतह पर प्रत्यक्ष परिवेश प्रकाश प्रतिबिंब को कम करने के लिए एक शोषक बेंच ब्लूपैड के साथ ढक्कन के शीर्ष को कवर करें।
    5. निचले कक्ष में यूवी लाइट चालू करें।
      नोट: जानवरों का यूवी प्रकाश के साथ कोई सीधा संपर्क नहीं है। अनुशंसित यूवी प्रकाश सामग्री अनुभाग में विस्तृत है।
  3. आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग
    1. ऊपर और नीचे के कैमरों से वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए, एक वीडियो निगरानी रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें, जिसे एक समय में कई वेबकैम या नेटवर्क कैमरों से रिकॉर्ड करने के लिए कॉन्फ़िगर किया जा सकता है।
    2. प्रोग्राम खोलने पर, प्रोग्राम विंडो में कमांड और आर दबाकर रिकॉर्डिंग शुरू करें। 1 फ्रेम प्रति सेकंड की दर से वीडियो रिकॉर्डिंग करें।
    3. रिकॉर्डिंग शुरू करने के तुरंत बाद, दरवाजे को धीरे से बंद करते हुए कमरे से बाहर निकलें। सुनिश्चित करें कि प्रयोग की पूरी अवधि के लिए कमरा शांत रहता है।
  4. आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग समाप्त करें
    1. 7 घंटे (प्रकाश चरण प्रयोगों) या अगली सुबह (अंधेरे चरण प्रयोगों) के बाद प्रक्रिया कक्ष में लौटें।
    2. कमांड और टी दबाकर रिकॉर्डिंग बंद करें। यूवी लाइट बंद कर दें।
    3. रिकॉर्डिंग को रोकने के बाद, सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से प्रत्येक कैमरे के लिए एक मूवी फ़ाइल (.m4v प्रारूप में) उत्पन्न करता है और इसे पहले से चयनित गंतव्य फ़ोल्डर में कैमरे के नाम के तहत सहेजता है। सत्यापित करें कि, प्रत्येक कैमरा फ़ोल्डर के भीतर, प्रयोगों को दिनांक के अनुसार फ़ोल्डरों में व्यवस्थित किया जाता है।
    4. प्रयोग फ़ोल्डर में, सत्यापित करें कि एक .m4v फ़ाइल और सभी अलग-अलग .jpeg फ़ाइलें हैं जो प्रत्येक चलचित्र फ़्रेम के अनुरूप हैं.
    5. नोट: चलचित्र फ़ाइलें दूषित होने की स्थिति में प्रयोग को पुनर्प्राप्त करने के लिए .jpeg फ़ाइलों का उपयोग किया जा सकता है।
    6. प्रयोग के नाम और दिनांक के साथ डेस्कटॉप पर एक फ़ोल्डर बनाएँ और सभी .m4v फ़ाइलों को इस फ़ोल्डर में स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो, तो चलचित्र फ़ाइलों को सहेजने और बैकअप लेने के बाद .jpeg फ़ाइलों को हटा दें।
    7. नोट: प्रकाश चरण प्रयोगों के लिए, सॉफ्टवेयर प्रति कैमरा एक फिल्म उत्पन्न करेगा, जबकि अंधेरे चरण प्रयोगों के लिए, यह प्रत्येक कैमरे के लिए दो फिल्में उत्पन्न करेगा। ऐसा इसलिए है क्योंकि मध्यरात्रि के बाद एक नई .m4v फ़ाइल उत्पन्न होती है जब तिथि बदल जाती है।
    8. किसी बाह्य कंप्यूटर में विश्लेषण के लिए चलचित्रों वाले फ़ोल्डर की फ़्लैश ड्राइव में प्रतिलिपि बनाएँ. इस चरण में कई मिनट लग सकते हैं और चरण 3.5.1 से 3.5.3 के समानांतर किया जा सकता है।
  5. रिकॉर्डिंग पिंजरों की सफाई और प्रयोगात्मक चूहों को उनके आवास स्थान पर वापस स्थानांतरित करना।
    1. पिंजरों के ढक्कन को कवर करने वाले ब्लूपैड को हटा दें। जानवरों को रिकॉर्डिंग पिंजरों से उनके आवास पिंजरे में स्थानांतरित करें।
    2. रिकॉर्डिंग कक्षों (यानी, प्लास्टिक इग्लू, प्लास्टिक ट्यूब, चाउ और पानी जेल के आराम के साथ पकवान, और फिल्टर पेपर) में सामान और खाद्य पदार्थों को हटा दें और उन्हें जैव-खतरनाक कचरे में निपटाएं।
    3. पिंजरे के तल पर मौजूद चाउ और फेकल छर्रों को हटाते हुए, हैंड वैक्यूम क्लीनर का उपयोग करके पिंजरों को साफ करें। फिर, पिंजरे के फर्श और आंतरिक दीवारों को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और नरम कपड़े के टुकड़े के साथ इंटीरियर को साफ करें। पिंजरों के ढक्कन को खुला छोड़ दें ताकि उन्हें हवा सूख ने दी जा सके।
    4. एक द्वितीयक कंटेनर में जानवरों के साथ आवास पिंजरे रखें और जानवरों को उनके आवास स्थान पर वापस ले जाएं।

4. अंशांकन वक्रों का उत्पादन

नोट: शून्य स्थान क्षेत्रों को मूत्र की मात्रा में परिवर्तित करने के लिए एक अंशांकन वक्र की आवश्यकता होती है। यदि दिन के प्रकाश और अंधेरे चरणों के दौरान प्रयोग ों का प्रदर्शन किया जाता है, तो दो अंशांकन वक्र उत्पन्न किए जाने चाहिए, प्रत्येक प्रकार के फिल्टर पेपर के लिए एक (पतला और मोटा फिल्टर पेपर)। अंशांकन वक्र डुप्लिकेट में उत्पन्न होते हैं। प्रत्येक प्रतिकृति को आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग कक्ष में रखे फिल्टर पेपर पर चलाया जाता है। इसकी जटिल संरचना, और यूवी उत्तेजना को देखते हुए, अंशांकन वक्र बनाने के लिए माउस मूत्र का उपयोग करें।

  1. माउस मूत्र संग्रह
    1. लचीली पारदर्शी फिल्म (10 सेमी x 15 सेमी) का एक टुकड़ा लें और इसे एक बेंच पर रखें।
    2. एक माउस को उसकी पूंछ से उठाओ और उसे रगड़ो। पेशाब को प्रेरित करने के लिए पेट के निचले हिस्से की धीरे-धीरे मालिश करें। पारदर्शी फिल्म प्लास्टिक शीट की सतह पर मूत्र एकत्र करें।
    3. जानवर को धीरे से उसके पिंजरे के अंदर छोड़ दें। एक पिपेट का उपयोग करके, पारदर्शी फिल्म की सतह से मूत्र को बाँझ 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। कई चूहों के साथ प्रक्रिया को दोहराएं जब तक कि ~ 10 एमएल माउस मूत्र एकत्र न हो जाए, मूत्र को पूल करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रकाश और अंधेरे चरणों के लिए डुप्लिकेट अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए माउस मूत्र के कुल ~ 10 एमएल की आवश्यकता होती है। प्रयोगात्मक चूहों पर जोर देने से बचने के लिए, चूहों का उपयोग न करें जो मूत्र संग्रह के लिए आरटी-वीएसए प्रयोगों के अधीन होंगे।
  2. अंशांकन वक्र रिकॉर्डिंग
    1. चरण 4.1 में एकत्र किए गए मूत्र को पिघलाएं और इसे 10-15 सेकंड के लिए धीरे से भंवर करके मिलाएं।
    2. दो आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग पिंजरों में से प्रत्येक में पतले फिल्टर पेपर (24.3 सेमी x 36.3 सेमी) का एक टुकड़ा रखें।
    3. प्रत्येक फ़िल्टर पेपर पर निम्नलिखित मूत्र मात्रा (μL में) को पिपेट करें: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500, और 750। प्रसार के परिणामस्वरूप स्पॉट ओवरलैप को रोकने के लिए, धब्बों को एक दूसरे से पर्याप्त दूरी पर आवंटित करें।
    4. पिंजरों के ढक्कन को बंद करें और उन्हें पैड के साथ कवर करें।
    5. प्रयोगों को रिकॉर्ड करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान सॉफ़्टवेयर पैरामीटर (चरण 3.3.) को लागू करते हुए, कमांड और आर दबाकर रिकॉर्डिंग शुरू करें।
    6. मूत्र के धब्बों के अधिकतम प्रसार की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए अंशांकन वक्र पंजीकृत करें। रिकॉर्डिंग बंद करने के लिए कमांड और टी दबाएँ।
    7. डेस्कटॉप में एक नया फ़ोल्डर बनाएं, उसमें .m4v फ़ाइलें रखें, और फिर बाद के विश्लेषण के लिए डेटा को फ्लैश ड्राइव में स्थानांतरित करें।
    8. मोटे फिल्टर पेपर के साथ डुप्लिकेट कर्वउत्पन्न करने के लिए एक समान प्रक्रिया करें। इस मामले में, इंटीरियर को काला करने और अंधेरे चरण की स्थिति का अनुकरण करने के लिए पैड की अतिरिक्त परतें जोड़ें।
  3. अंशांकन वक्र रिकॉर्डिंग का विश्लेषण
    1. स्क्रीन को भरने के लिए विंडो को अधिकतम करते हुए, मूवी प्लेयर सॉफ़्टवेयर में .m4v फ़ाइलों को खोलें। मोटे फिल्टर पेपर पर किए गए अंशांकन वक्रों का विश्लेषण करने के लिए, शीर्ष कैमरों (चित्रा 3 ए) के साथ प्राप्त फ़ाइलों का उपयोग करें। पतले फ़िल्टर पेपर पर किए गए अंशांकन वक्रों का विश्लेषण करने के लिए, नीचे के कैमरों (चित्रा 3बी) के साथ प्राप्त फ़ाइलों का उपयोग करें।
    2. पूर्ण 1 घंटे अंशांकन वक्र फिल्म का अवलोकन प्राप्त करने के लिए टाइम स्लाइडर को आगे और पीछे ले जाते हुए .m4v फ़ाइल चलाएं।
    3. उस समय सीमा की पहचान करें जहां छोटे मूत्र धब्बे (<25 μL) की तीव्रता सबसे अधिक होती है और अधिकतम रूप से फैल ते हैं। इस समय सीमा के भीतर एक स्क्रीनशॉट लें। स्क्रीनशॉट फ़ाइल को नाम दें और इसे एक .png फ़ाइल (चित्रा 3ए, ऊपरी पैनल) के रूप में सहेजें।
      नोट: स्क्रीनशॉट कुंजी F6 दबाकर लिया जाता है। स्क्रीनशॉट अधिग्रहण के लिए F6 सेट अप करने के लिए: कीबोर्ड > शॉर्टकट > सिस्टम प्राथमिकताएँ चुनें, और फ़ाइल विकल्प के रूप में स्क्रीन के चित्र सहेजें के दाईं ओर पाए गए बॉक्स में F6 लिखें.
    4. उस समय सीमा की पहचान करें जहां मध्यम और बड़े मूत्र धब्बे (>50 μL) का अधिकतम क्षेत्र है और स्क्रीनशॉट लें। यह संभव है कि कुछ छोटे मूत्र धब्बे तब तक दिखाई नहीं देंगे जब तक कि बड़े मूत्र धब्बे अधिकतम प्रसार प्रदर्शित नहीं करते हैं। फ़ाइल को नाम दें और स्क्रीनशॉट को .png फ़ाइल (चित्रा 3ए, निचला पैनल) के रूप में सहेजें।
    5. ImageJ सॉफ़्टवेयर (NIH) खोलें और फिर छवि फ़ाइल (चित्रा 4 A) खोलने के लिए चरण 4.3.3 में प्राप्त .png फ़ाइल आइकन को खींचें और छोड़ दें।
    6. टूलबार से, बहुभुज चयन आइकन का चयन करें, और फ़िल्टर पेपर की सीमा को चित्रित करें।
    7. फिर, मेनू बार से विश्लेषण करें का चयन करें, विस्तारित मेनू से माप सेट करें चुनें, और उस विंडो से जो पॉप अप करती है क्षेत्र का चयन करें। क्लिक करें OK. यह चरण 4.3.8 निष्पादित होने पर क्षेत्र के मान प्राप्त करने की अनुमति देता है।
    8. इसके बाद, मेनू बार से फिर से विश्लेषण करें का चयन करें और विस्तारित विकल्पों में से माप चुनें। एक परिणाम विंडो पॉप अप होती है जिसमें एक स्तंभ क्षेत्र होता है जो पिक्सेल2 (चित्रा 4बी-डी) में क्षेत्र मान दिखाता है।
    9. टूलबार से फ्रीहैंड चयन आइकन का चयन करें और इसका उपयोग किसी व्यक्तिगत शून्य स्थान की परिधि के चारों ओर एक रेखा खींचने के लिए करें। चरण 4.3.8 के रूप में क्षेत्र को मापें। सॉफ्टवेयर परिणाम तालिका को अपडेट करता है क्योंकि नए माप किए जाते हैं। संख्याओं का नया सेट पिछले लोगों के नीचे दिखाई देता है। विश्लेषण किए गए प्रत्येक स्थान के लिए परिणाम विंडो के स्तंभ क्षेत्र के नीचे दिखाई देने वाली संख्या रिकॉर्ड करें (चित्रा 4ई-जी)।
    10. प्रत्येक प्रतिकृति स्पॉट के लिए चरण 4.3.5 से 4.3.7 दोहराएं।
    11. फिल्टर पेपर के कुल क्षेत्रफल को 100% के रूप में सेट करें और प्रत्येक मूत्र स्थान के लिए क्षेत्र (% क्षेत्र) के प्रतिशत की गणना करें। यह सामान्यीकरण उन त्रुटियों को ठीक करेगा जो कैमरों की ज़ूम या स्थिति में अंतर के परिणामस्वरूप हो सकती हैं।
    12. ग्राफ़िंग प्रोग्राम में एक नई XY तालिका बनाएँ और X स्तंभ में मूत्र की मात्रा (μL में) के मान और Y स्तंभ में % क्षेत्र के डुप्लिकेट मान सम्मिलित करें.
    13. फिर, विश्लेषण > विश्लेषण का चयन करें > नॉनलाइनियर रिग्रेशन (वक्र फिट) > एक्सवाई विश्लेषण करें। प्रकट होने वाले पैरामीटर विंडो से, मॉडल > बहुपद > द्वितीय क्रम बहुपद (द्विघात) का चयन करें।
    14. फिर, विधि टैब से, निम्न चयनों को चिह्नित करने के लिए क्लिक करें: कम से कम वर्ग प्रतिगमन, कोई भार नहीं, और प्रत्येक प्रतिकृति वाई मान को एक व्यक्तिगत बिंदु के रूप में मानें।
    15. विवश टैब से, B0 के लिए चयन करें, बाधा प्रकार > स्थिरांक के बराबर, और मान स्तंभ के अंतर्गत 0 टाइप करें. क्लिक करें OK.

5. प्रयोगात्मक चूहों की रिकॉर्डिंग का विश्लेषण

  1. विश्लेषण के लिए प्रकाश चरण (निचला कैमरा) या अंधेरे चरण (ऊपरी कैमरा) के दौरान एकत्र की गई एक फिल्म फ़ाइल खोलें।
  2. टाइम स्क्रॉलर को आगे और पीछे ले जाकर मूवी फ़ाइल की गुणवत्ता का आकलन करें, यह पुष्टि करते हुए कि विश्लेषण किए जाने वाले 6 घंटे के समय विंडो के दौरान फ़िल्टर पेपर बरकरार रहता है (बिना फटने या चबाने के)। यदि कागज फट गया है, तो कोई और विश्लेषण न करें, क्योंकि माउस ने उजागर प्लास्टिक पर पेशाब किया हो सकता है जिसे परिमाणित नहीं किया जा सकता है (चित्रा 5)।
  3. प्रकाश या अंधेरे चरणों में एकत्र किए गए प्रयोगों का विश्लेषण करने के लिए, वांछित समय विंडो पर जाने के लिए फास्ट-फॉरवर्ड कमांड या टाइम बार स्लाइडर का उपयोग करें। प्रकाश चरण के दौरान शून्यीकरण गतिविधि सुबह 11:00 बजे से शाम 05:00 बजे (जेडटी = 4.0–10.0) के बीच और मध्यरात्रि से 06:00 बजे के बीच अंधेरे चरण के दौरान दर्ज की जाती है (जेडटी = 17.0–23.0)।
  4. >> आइकन पर क्लिक करके (या मैन्युअल रूप से फिल्म के माध्यम से स्क्रॉल करें) फिल्म को फास्ट-फॉरवर्ड मोड में चलाएं, सबूत की तलाश में कि माउस शून्य हो रहा है। यह बताने का सबसे आसान तरीका है कि ऐसा हो रहा है, फिल्टर पेपर पर मूत्र के चमकीले धब्बों की अचानक उपस्थिति की तलाश करना है। एक अन्य संकेतक व्यवहार परिवर्तनों की तलाश करना है जिसमें पिंजरे के कोनों में आंदोलन और माउस शून्य होने पर निष्क्रियता की एक संक्षिप्त अवधि शामिल है।
    नोट: जैसे-जैसे कोई रिक्तियों का पता लगाने में बेहतर हो जाता है, वह स्क्रॉलिंग या तेजी से अग्रेषण की गति बढ़ा सकता है। हालांकि, बैक्टीरिया और रासायनिक रूप से प्रेरित सिस्टिटिस वाले चूहों में, जिनमें बहुत बड़ी संख्या में छोटी रिक्तियां 4,34 होती हैं, अगर कोई फिल्म के माध्यम से बहुत जल्दी आगे बढ़ता है तो कोई भी शून्य होने वाली घटनाओं को याद कर सकता है।
  5. उस समय को पंजीकृत करें जिस पर प्रत्येक शून्य होता है। एक परंपरा के रूप में, शून्य का समय पहले संकेत पर दर्ज किया जाता है कि मूत्र का पता लगाया जाता है (चित्रा 6ए, बी)।
  6. शून्य का माप करने के लिए, पहले समय में आगे (या पीछे) जाने के लिए स्क्रॉल बार का उपयोग करें, समय में उस बिंदु की तलाश करें जब मूत्र स्थान का अधिकतम प्रसार हुआ हो। इस बिंदु पर फिल्म को रोकें, और चरण 4.3.3 में वर्णित स्क्रीनशॉट लें। विश्लेषण के तहत स्थान पर कंप्यूटर माउस तीर रखें, इसलिए स्क्रीनशॉट (चित्रा 6 सी, डी) में रुचि का स्थान चिह्नित किया गया है।
  7. चलचित्र में उपस्थिति के क्रम के लिए सहसंबंधित संख्याओं का उपयोग करके स्क्रीनशॉट फ़ाइल को नाम दें।
  8. चलचित्र पर प्रत्येक शून्य स्थान के लिए चरण 5.5 और 5.7 को दोहराते हुए फ़ाइल का विश्लेषण जारी रखें. एक बार सभी शून्य स्थानों का विश्लेषण करने के बाद, स्क्रीनशॉट कैप्चर करके और 4.3.6 में वर्णित चरणों का उपयोग करके फ़िल्टर पेपर के कुल क्षेत्र को मापें।
  9. चरण 4.3.9 में वर्णित मूत्र धब्बों में से प्रत्येक के % क्षेत्र की गणना करें। चरण 4 में उत्पन्न अंशांकन वक्रों और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर में इंटरपोल फ़ंक्शन का उपयोग करके प्रत्येक शून्य स्थान के लिए % क्षेत्र के मूल्यों को मूत्र की मात्रा (μL) में बदलें।
    1. ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर में, अंशांकन वक्र के डेटा वाली XY तालिका खोलें और अंशांकन वक्र के अंतिम मान के नीचे Y स्तंभ में % क्षेत्र मान सम्मिलित करें (चित्रा 7A)।
    2. परिणाम तालिका टैब पर क्लिक करें, और मॉडल टैब के तहत, मानक वक्र से इंटरपोल अज्ञात का चयन करने के लिए क्लिक करें और OK दबाएँ. परिणाम टैब की तालिका के बगल में इंटरपोलेटेड एक्स माध्य मान नामक एक टैब दिखाई देता है। इस टैब में इंटरपोलेटेड मानों के साथ एक तालिका होती है जो प्रत्येक शून्य स्थान के लिए μL में मूत्र की मात्रा के अनुरूप होती है। (चित्र 7ए, बी)।
  10. सभी प्रयोगात्मक चूहों का विश्लेषण करने के लिए चरण 5.1 से 5.9 दोहराएं।
  11. एक कार्यपुस्तिका फ़ाइल बनाएँ जिसमें प्रति माउस एक स्प्रेडशीट (चित्रा 7C) का उपयोग करके चरण 5.5 से 5.10 से प्राप्त डेटा शामिल है। प्रकाश चरण प्रयोगों के लिए एक फ़ाइल बनाएं और अंधेरे चरण वाले लोगों के लिए दूसरी। इन मास्टर फ़ाइलों में आगे के विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले सभी कच्चे डेटा और आवश्यक गणना शामिल हैं।

6. प्रयोगात्मक चूहों के पेशाब पैटर्न का विश्लेषण

  1. प्राथमिक और द्वितीयक शून्य स्पॉट प्रोफाइल उत्पन्न करें (चित्रा 8ए, बी और चित्रा 9)।
    नोट: आवृत्ति वितरण अध्ययन 23 के अनुसार, शून्य धब्बे जो ≥20 μL हैं, आमतौर पर कुल शून्य मात्रा का >95% प्रतिनिधित्व करते हैं और उन्हें प्राथमिक शून्य स्पॉट (PVS) 8,23,35 माना जाता है। शून्य धब्बे जो ≤20 μL हैं, उन्हें द्वितीयक या छोटे शून्य धब्बे (SVS) माना जाता है। पीवीएस और एसवीएस के बीच भेदभाव को शून्यफेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण दिखाया गया है। एसवीएस की बढ़ी हुई संख्या शून्यता को इंगित करती है35.
    1. रुचि के शून्य स्पॉट डेटा (प्रकाश चरण या अंधेरे चरण) वाली मास्टर फ़ाइल से, स्पॉट को उनके वॉल्यूम के आधार पर पीवीएस के रूप में वर्गीकृत करें जब उनकी मात्रा ≥20 μL हो, या SVS जब उनकी मात्रा <20 μL हो।
    2. संख्या की गणना करें और PVS के लिए औसत शून्य मात्रा और कुल मात्रा की गणना करें। संख्या की गणना करें और SVS के लिए कुल मात्रा की गणना करें।
    3. एक ग्राफ बार उत्पन्न करें जो गणना किए गए मापदंडों में से प्रत्येक के लिए इलाज किए गए चूहों के नियंत्रण की तुलना करता है: पीवीएस की संख्या, पीवीएस की शून्य मात्रा, पीवीएस की कुल मात्रा, एसवीएस की संख्या, एसवीएस की कुल मात्रा।
  2. वैकल्पिक: समय के साथ शून्यता व्यवहार दिखाने के लिए एक संचयी शून्य मात्रा प्लॉट (सीढ़ी फ़ंक्शन) उत्पन्न करें (चित्र 10 और चित्रा 11)।
    1. कार्यपुस्तिका मास्टर फ़ाइल खोलें और शून्यीकरण का समय, जो घंटे, मिनट और सेकंड में व्यक्त किया जाता है, दशमलव रूप में कनवर्ट करें. प्रत्येक समय बिंदु के लिए संचयी मूत्र मात्रा (μL में) की गणना करें।
    2. X कॉलम में दशमलव रूप में समय के साथ ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर में एक XY तालिका उत्पन्न करें और Y कॉलम में संचयी मूत्र मात्रा। तालिका में समय और मूत्र मात्रा डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ। (0; 0) और (6; अधिकतम मान) डेटा बिंदु जोड़ें. प्रयोग की शुरुआत में प्लॉट की क्षैतिज रेखाओं को पूरा करने के लिए ये बिंदु आवश्यक हैं (समय: 0 घंटे) जब शून्य मात्रा शून्य (0; 0) है, और प्रयोग के अंत में (समय: 6 घंटे) जब शून्य मूत्र का संचयी मूल्य अंतिम शून्यघटना (6; अधिकतम मूल्य) के लिए प्राप्त मूल्य के बराबर है।
    3. ग्राफ ़ पर डबल क्लिक करें; स्वरूप ग्राफ़ विंडो दिखाई देनी चाहिए. प्रकटन टैब का चयन करें, प्रतीक दिखाएँ बटन का चयन न करने के लिए क्लिक करें और कनेक्टिंग लाइन/वक्र दिखाएँ का चयन करने के लिए क्लिक करें. स्टाइल विकल्प पर क्लिक करें और सर्वाइवल चुनें।

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Representative Results

यूरोथेलियल पीज़ो 1/2 नॉकआउट चूहों का शून्यीकरण व्यवहार।

माइक्रोट्यूरियन चक्र के भंडारण चरण के दौरान, मूत्राशय में जमा मूत्र द्वारा लगाए गए तनाव को समझने और इस यांत्रिक उत्तेजना को सेलुलर प्रतिक्रियाओं जैसे सेरसल एटीपी रिलीज 1,3 में ट्रांसड्यूस करने के लिए यूरोथेलियम की परिकल्पना की जाती है। हमने पहले दिखाया है कि यांत्रिक रूप से सक्रिय PIEZO1 और PIEZO2 चैनल माउस यूरोथेलियम 3,36 में व्यक्त किए जाते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या यूरोथेलियल पाइज़ो चैनल सामान्य शून्यव्यवहार के लिए महत्वपूर्ण हैं, हमने यूरोथेलियल-सशर्त पीज़ो 1/2 डबल नॉकआउट चूहों (पीजेड 1/2-केओ) चूहों और आयु- और लिंग-मिलान नियंत्रण (पीजेड 1/2-सी) पर आरटी-वीएसए का प्रदर्शन किया। चित्र 9)। हमने दिन के अंधेरे और हल्के चरणों के दौरान 6 घंटे के लिए महिला और पुरुष चूहों दोनों का परीक्षण किया, और चरण 6.1 में वर्णित डेटा का विश्लेषण किया। जब हमने नियंत्रण समूहों के लिए दिन के प्रकाश और अंधेरे चरणों के बीच शून्यता गतिविधि की तुलना की, तो यह देखा गया कि महिलाओं और पुरुषों दोनों ने अपनी सक्रिय अवधि के दौरान पीवीएस की संख्या और कुल मात्रा में वृद्धि का प्रदर्शन किया। यह अवलोकन इंगित करता है कि, भले ही चूहे एक विदेशी वातावरण में थे, माउस शून्यव्यवहार की सर्कैडियन प्रकृति (उनके सक्रिय अंधेरे चरण के दौरान उच्चतम) संरक्षित थी। उनके निष्क्रिय प्रकाश चरण के दौरान, हमने नियंत्रण समकक्षों (Pz1/2-C) की तुलना में महिला या पुरुष Pz1/2-KO चूहों के लिए विश्लेषण किए गए किसी भी पैरामीटर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा। हालांकि, जब हमने सक्रिय अंधेरे चरण के दौरान जानवरों का परीक्षण किया, तो मादा और पुरुष पीजेड 1/2-केओ चूहों दोनों ने एक परिवर्तित शून्यफेनोटाइप दिखाया, जो संख्या में महत्वपूर्ण वृद्धि और एसवीएस की कुल मात्रा में वृद्धि की विशेषता है (चित्रा 9)। पीवीएस संख्या, प्रति पीवीएस औसत मात्रा, या उनके संबंधित नियंत्रणों की तुलना में महिला या पुरुष पीजेड 1/2-केओ में कुल पीवीएस मात्रा में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि यूरोथेलियल पीज़ो 1/2 चैनल माउस निष्क्रिय प्रकाश चरण के दौरान फ़ंक्शन को शून्य करने में महत्वपूर्ण भूमिका नहीं निभाते हैं, लेकिन उनके सक्रिय अंधेरे चरण के दौरान लगातार स्पॉटिंग को रोकने में महत्वपूर्ण हैं।

चित्रा 9 में प्रस्तुत परिणाम आरटी-वीएसए बनाम एंडपॉइंट वीएसए को नियोजित करने के दो फायदों को स्पष्ट करते हैं। सबसे पहले, यदि विश्लेषण केवल प्रकाश चरण के दौरान किया गया था, तो हमने गलत निष्कर्ष निकाला होगा कि यूरोथेलियल पीईजेडओ 1/2 चैनलों की फ़ंक्शन को शून्य करने में कोई भूमिका नहीं थी। दूसरा, अधिकांश समापन बिंदु वीएसए अध्ययनों में, एसवीएस को प्रयोगात्मक शोर के रूप में माना जाता था, और कुछ मामलों में बाद के विश्लेषणसे बाहर रखा गया था। आरटी-वीएसए में, हम यह निर्धारित कर सकते थे कि एसवीएस व्यक्तिगत घटनाएं थीं, पीवीएस के लिए द्वितीयक नहीं थीं (कैरीओवर या एंड माइक्रोट्यूरियन ड्रिब्लिंग) और इस अर्थ में स्वैच्छिक थीं कि जानवर पिंजरे की परिधि में चले गए, शून्य हो गए, और फिर छोड़ दिए गए। इस अवलोकन ने हमें Pz1/2-KO चूहों के फेनोटाइप के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान की जो अन्यथा छूट जाती।

बेसल स्थितियों के तहत और साइक्लोफॉस्फेमाइड उपचार के बाद मादा चूहों के व्यवहार को शून्य करना।

इस पायलट प्रयोग में, हमने माउस स्वैच्छिक शून्यता व्यवहार पर साइक्लोफॉस्फेमाइड (सीवाईपी) के प्रभावों का परीक्षण किया। साइक्लोफॉस्फेमाइड, कैंसर या इम्यूनोलॉजिकल विकारों के कुछ रूपों के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली दवा, रोगियों और प्रयोगात्मक जानवरों में सिस्टिटिस का कारण बनने के लिए जानी जाती है, जिसके परिणामस्वरूप एक अतिसक्रिय मूत्राशय फेनोटाइप होता है जो कई, छोटी शून्यता की घटनाओं 26,37,38 की विशेषता है। बेसलाइन शून्यता व्यवहार को निर्धारित करने के लिए, हमने अंधेरे चरण के दौरान आरटी-वीएसए में एक अनुपचारित महिला माउस रखा। तीव्र सिस्टिटिस का कारण बनने के लिए 5 दिन बाद उसी माउस को सीवाईपी (150 मिलीग्राम / किग्रा) की खुराक के साथ इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन के तुरंत बाद, माउस को रिकॉर्डिंग के लिए आरटी-वीएसए पिंजरे में रखा गया था। शून्यीकरण व्यवहार को एक चरण भूखंड (चित्रा 11) में दर्शाया गया है, जिसमें ऊर्ध्वाधर रेखाएं शून्य मूत्र की मात्रा का प्रतिनिधित्व करती हैं और क्षितिज रेखाएं समय का प्रतिनिधित्व करती हैं। बेसल स्थितियों के तहत प्राप्त परिणामों की तुलना में, यह स्पष्ट है कि सीवाईपी उपचार के बाद प्रति शून्य जारी मूत्र की मात्रा कम है, और यह कि माइक्रोट्यूरियन घटनाएं बहुत अधिक बार होती हैं। इसे ग्राफ के इनसेट में बेहतर तरीके से सराहा जा सकता है, जहां विश्लेषण अवधि के पहले 30 मिनट (आधी रात से 00:30 बजे [7.0 से 7.5 घंटे पोस्ट इंजेक्शन] के अनुरूप) को बढ़ाया जाता है।

Figure 1
चित्र 1: आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग कक्ष। (ए) आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग सिस्टम में एक ऊपरी भाग शामिल है, जिसमें दो साइड-बाय-साइड, स्पष्ट, ऐक्रेलिक कक्ष और संबंधित ऊपरी कैमरे शामिल हैं। डिवाइस का निचला आधा हिस्सा एक एकल इकाई स्टैंड है जो ऊपरी माउस कक्षों को रखता है और इसमें नीचे के कैमरे और यूवी रोशनी होती है। स्टैंड की दीवारों का इंटीरियर दर्पण पैनलों से बना है जो पिंजरों के नीचे भी रोशनी प्रदान करने के लिए यूवी प्रकाश को प्रतिबिंबित करते हैं। चित्रित नहीं एक कंप्यूटर है जो कैमरों से वीडियो फ़ीड प्राप्त करता है और डेटा रिकॉर्ड करता है। (बी) घटकों और आयामों के साथ माउस कक्ष का मॉडल। 1) मानक लिफ्ट-ऑफ हिंज; 2) कैमरा माउंटिंग ब्रैकेट; और 3) लाइट संक्रमण कॉर्नर ब्रैकेट। यूवी के फ्रंट (सी) और टॉप (डी) दृश्य घटकों और आयामों के साथ खड़े हैं। यूवी लाइट्स सीधे फ्लैट प्लेटों के साथ फ्रंट और बैक प्रोफाइल के इंटीरियर में लगाई जाती हैं। कैमरों को माउंट करने के लिए दो लाइट ट्रांजिशन कॉर्नर ब्रैकेट के साथ स्टैंड मेन फ्रेम में सुरक्षित 32 इंच प्रोफाइल का उपयोग किया जाता है। सीधे फ्लैट प्लेटों का उपयोग कैमरों को प्रोफाइल में 32 से संलग्न करने के लिए किया जाता है। स्टैंड के इंटीरियर में एक प्रतिबिंबित पैनल लगाया गया है (दिखाया नहीं गया है)। 1) पांच-छेद टी फ्लैट प्लेट; 2) पांच-छेद टी फ्लैट प्लेट; और 3) पांच-छेद एल फ्लैट प्लेटें। प्रस्तुत सभी मान इंच में हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: आरटी-वीएसए माउस कक्ष। प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं से पहले, प्रत्येक प्रयोगात्मक माउस कक्ष को फ़िल्टर पेपर (क्रमांकित 1) के एक टुकड़े के साथ अस्तर करके तैयार किया जाता है। प्रयोग किए जाने वाले दिन की अवधि के आधार पर, उपयोग किया जाने वाला फिल्टर पेपर या तो मोटा (डार्क फेज) या पतला (लाइट फेज) होता है। कक्ष के केंद्र में एक प्लास्टिक गुंबद रखा जाता है (संख्या 2), पानी के साथ एक प्लास्टिक डिश (गैर-गीला पानी जेल के रूप में) और चाउ को गुंबद के एक तरफ रखा जाता है (संख्या 3), और एक प्लास्टिक 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, संवर्धन का एक रूप, विपरीत तरफ रखा जाता है (संख्या 4)। पिंजरे के भीतर तत्वों की प्रारंभिक व्यवस्था सभी प्रयोगों में सुसंगत रखी जाती है। ध्यान दें कि फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा दो पड़ोसी पिंजरों के बीच रखा गया है और तारांकन के साथ आकृति में चिह्नित किया गया है। यह पड़ोसी माउस से उत्पन्न दृश्य संकेतों के प्रभाव को रोकने के लिए है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: अंशांकन वक्र। मोटे (ए, बाएं पैनल) और पतले (बी, बाएं पैनल) फिल्टर पेपर की प्रतिनिधि छवियां माउस मूत्र की ज्ञात मात्रा के साथ देखी गईं। चित्र शीर्ष (ए, बाएं पैनल) या नीचे (बी, बाएं पैनल) कैमरों का उपयोग करके प्राप्त वीडियो रिकॉर्डिंग से स्क्रीनशॉट हैं। लाल तीर 2 μL मूत्र धब्बों को इंगित करते हैं, और धब्बों के नीचे की संख्या μL में स्पॉट वॉल्यूम मान हैं। ध्यान दें कि पैनल A की ऊपरी छवि में छोटे मूत्र धब्बे (<50 μL) जो मूत्र स्पॉटिंग (5 मिनट) के तुरंत बाद दिखाई देते हैं, अब 30 मिनट (निचले पैनल) के बाद ध्यान देने योग्य नहीं हैं। दाएं पैनल: मूत्र की मात्रा के कार्य के रूप में शून्य स्थान क्षेत्र (कुल फिल्टर पेपर क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में व्यक्त) का प्लॉट। जैसा कि दूसरों द्वारा उल्लेख किया गया है, मूत्र की मात्रा के कार्य के रूप में शून्य स्थान क्षेत्र का डेटा रैखिक संबंध30 का पालन नहीं करता है। इस प्रकार, हम नॉनलाइनर रिग्रेशन का उपयोग करके डेटा को दूसरे क्रम के बहुपद में फिट करते हैं। डेटा को इस तरह सीमित किया गया था कि X = 0 से Y = 0। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इमेजजे का उपयोग करके फिल्टर पेपर और मूत्र स्पॉट क्षेत्रों का निर्धारण। (ए) चित्रा 3ए में दिखाए गए अंशांकन वक्र का एक स्क्रीनशॉट इमेजजे में खोला गया। (ए) में बॉक्स किए गए क्षेत्र को (बी) में अधिक विस्तार से दिखाया गया है। (बी) फ़िल्टर पेपर की परिधि के साथ एक बहुभुज खींचने के लिए बहुभुज चयन आइकन का चयन (लाल रंग में वृत्त) किया जाता है (आंशिक दृश्य; चयन उपकरण द्वारा उत्पन्न नोड्स को इंगित करने वाले लाल तीर के साथ पीली रेखा)। (सी) बहुभुज का क्षेत्र फिल्टर पेपर के कुल क्षेत्रफल को दर्शाता है और विश्लेषण > माप (लाल सर्कल) का चयन करके मापा जाता है। (D) क्षेत्र का मान (पिक्सेल में) एक परिणाम विंडो (लाल सर्कल) में प्रकट होता है। (ई) किसी व्यक्तिगत शून्य स्थान के क्षेत्र को मापने के लिए, फ्रीहैंड चयन उपकरण चुना जाता है (लाल सर्कल) और (एफ) में स्थान की सीमा के चारों ओर एक रेखा खींचने के लिए उपयोग किया जाता है (लाल तीर घटनास्थल को इंगित करता है)। (सी) के समान कमांड का उपयोग करके, शून्य स्थान के क्षेत्र को मापा जाता है, परिणाम विंडो में एक नए मान के रूप में दिखाई देता है, जो अंतिम माप (पैनल जी, लाल सर्कल) के ठीक नीचे होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: आरटी-वीएसए प्रयोगों को पूरा करने के बाद फिल्टर पेपर की स्थिति का आकलन। आरटी-वीएसए प्रयोग के दौरान या बाद में फ़िल्टर पेपर की विभिन्न स्थितियों को दिखाने वाले माउस कक्ष की प्रतिनिधि छवियां। फ़िल्टर पेपर जो परीक्षण अवधि के अंत तक बरकरार रहा, (ए) में दिखाया गया है और सबसे आम स्थिति और उस स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है जिसके तहत एक प्रयोग का आगे विश्लेषण किया जा सकता है (हरा चेकमार्क)। क्षतिग्रस्त फिल्टर पेपर के उदाहरण (बी) और (सी) में दिखाए गए हैं, और उन प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं जिन्हें आगे विश्लेषण नहीं किया जाना चाहिए (लाल एक्स)। (बी) में, फ़िल्टर पेपर को कोनों में से एक में माउस (लाल तीर) द्वारा काटा गया था। धराशायी पीली रेखा पिंजरे के फर्श की सीमा को चिह्नित करती है। बॉक्स किए गए क्षेत्र को छवि में दाईं ओर बढ़ाया गया है। (सी) में, माउस द्वारा कोने में स्थानांतरित किए जा रहे गैर-गीला पानी जेल (लाल तीर) के परिणामस्वरूप प्रयोग की अखंडता से समझौता किया गया था, जिससे तीन बड़े पानी के धब्बे (लाल तारांकन) बच गए थे। वीडियो देखकर इन हरकतों की पुष्टि हुई। छवियां अंधेरे चरण के दौरान प्राप्त मूवी फ़ाइलों से स्क्रीनशॉट हैं, शीर्ष कैमरे का उपयोग करके, और पिंजरे के साथ मोटी फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: शून्य स्पॉट क्षेत्र माप के लिए शून्यीकरण और स्क्रीनशॉट के अधिग्रहण के समय का निर्धारण। (ए, बी) अपने कक्ष के एक कोने में एक माउस का स्क्रीनशॉट, एक शून्य स्थान के साथ जो अभी दिखाई दे रहा है। इस फ्रेम के समय को शून्यता के समय के रूप में एनोटेट किया गया है। (C, D) एक बार जब शून्य स्थान अधिकतम प्रसार तक पहुंच जाता है, तो शून्य की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्क्रीनशॉट लिया जाता है। छवियां शीर्ष कैमरे के साथ प्राप्त मूवी फ़ाइलों से स्क्रीनशॉट हैं, मोटी फिल्टर पेपर का उपयोग करके, और अंधेरे चरण के दौरान। विश्लेषण की अवधि मध्यरात्रि से 06:00 बजे तक थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: शून्य स्थान क्षेत्र का मूत्र की मात्रा में परिवर्तन और प्रयोगात्मक कच्चे डेटा के साथ एक वर्कशीट फ़ाइल का उत्पादन। (ए) कुल फिल्टर पेपर क्षेत्र (हरे रंग में उल्लिखित डेटा) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त शून्य स्थानों के लिए मान दिखाने वाली ग्राफिंग सॉफ्टवेयर विंडो का स्क्रीनशॉट। कार्यपत्रक (हरा तीर) डेटा तालिका अनुभाग के अंतर्गत सहेजा जाता है। (बी) मूत्र की मात्रा में कुल क्षेत्र के प्रतिशत का रूपांतरण (लाल रंग में उल्लिखित डेटा)। बाद के मूल्यों को परिणाम अनुभाग (लाल तीर) में दिखाया गया है और मानक वक्र फ़ंक्शन से इंटरपोल अज्ञात का उपयोग करके अंशांकन वक्र से गणना की जाती है। (सी) संकलित कच्चे और परिकलित डेटा के साथ एक कार्यपत्रक का स्क्रीनशॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: पीवीएस और एसवीएस में शून्य स्थानों का वर्गीकरण और उनका विश्लेषण। साइक्लोफॉस्फेमाइड (150 मिलीग्राम / किग्रा) (बी) की खुराक प्राप्त करने के बाद बेसल स्थितियों (ए) और 7 घंटे के तहत माउस से वर्कशीट (चित्रा 7 सी में दिखाए गए अनुसार उत्पन्न) के स्क्रीनशॉट। शून्य धब्बे को प्राथमिक शून्य धब्बे (PVS) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है यदि आयतन ≥20 μL है, या यदि आयतन <20 μL है, तो छोटे शून्य धब्बे (SVS) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। ध्यान दें कि अनुपचारित माउस (A) में, सभी शून्यीकरण घटनाएं PVS हैं, जबकि साइक्लोफॉस्फेमाइड-उपचारित जानवर में, अधिकांश रिक्तियां SVS हैं। प्रत्येक पैनल (लाल रूपरेखा) में वृत्त तालिका में निम्नलिखित सारांश आंकड़े शामिल हैं: रिक्तियों की संख्या, औसत शून्य मात्रा, और कुल शून्य मात्रा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: पीज़ो 1/2 नॉकआउट और नियंत्रण चूहों का शून्यव्यवहार। महिला (ए) और पुरुष (बी) पीज़ो 1/2 नॉकआउट (पीजेड 1/2-केओ) चूहों और नियंत्रण समकक्षों (पीजेड 1/2-सी) के शून्यव्यवहार को दिन के अंधेरे या प्रकाश चरण के दौरान 6 घंटे की समय विंडो के दौरान दर्ज किया गया था, और परिणाम चरण 6.1 में वर्णित के रूप में विश्लेषण किए गए थे। डेटा को माध्य ± मानक त्रुटि (एसईएम) के रूप में दिखाया गया है। मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करके डेटा की तुलना की गई थी। संक्षेप: पीवीएस = प्राथमिक शून्य स्थान; एसवीएस = छोटे शून्य स्थान; एनएस = महत्वपूर्ण नहीं; * पी < 0.05; ** पी < 0.01। इस आंकड़े को 3 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: समय के फ़ंक्शन के रूप में संचयी शून्य मात्रा की गणना और ग्राफिकल प्रतिनिधित्व के लिए कार्यपत्रक। (ए) चित्रा 7 सी में उत्पन्न वर्कशीट का स्क्रीनशॉट समय के कार्य के रूप में शून्य मूत्र की संचयी मात्रा के सीढ़ी फ़ंक्शन प्लॉट को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक गणना ओं को प्रदर्शित करता है। समय दशमलव स्वरूप (स्तंभ G, लाल वर्ग) में दर्ज किया जाना चाहिए. समय को दशमलव स्वरूप में बदलने के लिए, शून्य स्तंभ के समय के दाईं ओर तीन स्तंभ (लाल तीर) जोड़े गए ताकि घंटों (कॉलम डी), मिनट (कॉलम ई) और सेकंड (कॉलम एफ) के मानों को अलग-अलग एनोटेट किया जा सके, और दशमलव प्रारूप (कॉलम जी) में समय का अंतिम परिणाम। समय शून्यीकरण को दशमलव स्वरूप में बदलने के लिए, निम्न फ़ंक्शन का उपयोग करें: (h) + (min/60) + (s/3,600)। संचयी मूत्र मात्रा (नीला आयत) प्रदर्शित करने के लिए मूत्र की मात्रा स्तंभ के दाईं ओर एक कॉलम जोड़ा गया था, जिसकी गणना एक नई शून्यघटना (नए घटना मान सहित) के समय तक प्राप्त सभी मूत्र मात्रा (कॉलम जे) के योग के रूप में की जाती है। (बी) पैनल ए में वर्कशीट से कॉपी किए गए डेटा को दिखाने वाला स्क्रीनशॉट और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर प्रोजेक्ट में कॉलम एक्स (दशमलव प्रारूप में समय) और कॉलम वाई (संचयी मूत्र वॉल्यूम) में चिपकाया गया है। प्लॉट के पहले और अंतिम समय बिंदुओं को लाल तीरों द्वारा इंगित 0 और 6 (अधिकतम मान) पंक्तियों पर सेट किया गया है। (सी) एक चरण प्लॉट उत्पन्न करने के लिए, ग्राफ को शो प्रतीक फ़ील्ड का चयन करके, कनेक्टिंग लाइन / वक्र विकल्प को दिखाने में सक्षम करके और उत्तरजीविता शैली का चयन करके स्वरूपित किया जाता है, जैसा कि लाल रंग में घिरे क्षेत्रों में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: बेसल स्थितियों के तहत या साइक्लोफॉस्फेमाइड प्रशासन के बाद माउस शून्यीकरण व्यवहार के प्रतिनिधि परिणाम। माउस के स्वैच्छिक शून्यीकरण व्यवहार का मूल्यांकन आरटी-वीएसए द्वारा डार्क फेज (बेसल) के दौरान और साइक्लोफॉस्फेमाइड (सीवाईपी) प्रशासन के 7 घंटे बाद किया गया था, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित है। शून्यीकरण घटनाओं का समय और मात्रा एक चरण प्लॉट में दर्शाया गया है जो चरण 6.2 में वर्णित के रूप में उत्पन्न हुआ था। ग्राफ ़ का इनसेट एक हरे आयत के साथ चिह्नित भूखंड के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है और विश्लेषण की गई अवधि के पहले 30 मिनट से मेल खाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्रा 12: आरटी-वीएसए द्वारा अतिव्यापी मूत्र धब्बे की पहचान। आरटी-वीएसए प्रयोग (चित्र 1 और 2) के अंधेरे चरण में शीर्ष कैमरे के साथ कैप्चर किए गए वीडियो फ्रेम के स्क्रीनशॉट। छवि 2 में बॉक्स किए गए क्षेत्र को छवि 3 में बढ़ाया गया है। माउस अगले कुछ घंटों के दौरान दो अतिरिक्त बार उसी ऊपरी दाएं कोने में शून्य हो गया (चित्र 4-6)। शून्य स्थानों के ओवरलैप के बावजूद, आरटी-वीएसए का उपयोग करके व्यक्तिगत शून्यता की घटनाओं का आसानी से पता लगाया गया था। यह देखने के लिए कि ये घटनाएं समापन बिंदु परख के रूप में कैसे दिखाई देंगी, हमने फिल्टर पेपर के कोने को विभिन्न प्रकाश स्थितियों में उजागर किया। दृश्यमान, परिवेश प्रकाश के तहत, केवल एक एकल, बड़े शून्य स्थान की पहचान की जा सकती है (छवि 7)। इसी तरह, अगर इसी क्षेत्र की जांच यूवी प्रकाश के तहत की गई थी, तो केवल एक अंधेरे स्थान को अलग किया जा सकता था (छवि 8)। इस प्रकार, आरटी-वीएसए द्वारा एक ही क्षेत्र में कई रिक्तियों का आसानी से पता लगाया जाता है, लेकिन यदि विश्लेषण अंत-बिंदु परख के रूप में किया जाता है तो ऐसा भेदभाव संभव नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वीडियो-निगरानी का समावेश एक लागत प्रभावी संशोधन है जो शास्त्रीय वीएसए पर कई फायदे प्रस्तुत करता है। शास्त्रीय वीएसए में, जिसे आमतौर पर अंत-बिंदु परख के रूप में उपयोग किया जाता है, अतिव्यापी शून्य धब्बे को अलग करना मुश्किल है। यह एक तुच्छ चिंता नहीं है, क्योंकि चूहे एक ही क्षेत्र में कई बार पेशाब करते हैं जब परख कई घंटों तक लंबी होती है, आमतौर पर उनके पिंजरे के कोनों में। इस प्रकार, आरटी-वीएसए का पहला लाभ यह है कि जांचकर्ता आसानी से व्यक्तिगत स्थानों की पहचान कर सकता है जो आंशिक रूप से या पूरी तरह से एक दूसरे के ऊपर जमा किए गए हैं। यह चित्र 12 में दिखाए गए प्रयोग में अच्छी तरह से चित्रित किया गया है। इस मामले में, वीडियो रिकॉर्डिंग पुष्टि करती है कि माउस एक ही कोने में तीन बार शून्य हो गया, अतिव्यापी शून्य धब्बे जमा हो गया। यदि फिल्टर पेपर का विश्लेषण केवल प्रयोग के अंत में किया गया था, तो वीएसए के विशिष्ट तरीके से, केवल एक स्थान को अलग किया जा सकता है। इसलिए, जबकि शास्त्रीय, समापन बिंदु वीएसए शून्यव्यवहार में बड़े अंतर की पहचान करने में उपयोगी हो सकता है, यह अधिक सूक्ष्म फेनोटाइप के बीच भेदभाव करने में विफल हो सकता है। आनुवंशिकी और ट्रांसजेनिक जानवरों की पीढ़ी में वर्तमान प्रगति के साथ, उन तरीकों का विकास जो शून्यता व्यवहार का सही आकलन कर सकते हैं, आवश्यक है।

दूसरा, आरटी-वीएसए अन्वेषक को शून्य घटनाओं के बारे में अस्थायी जानकारी प्रदान करता है। इस प्रकार, कोई भी वास्तविक सूक्ष्म आवृत्तियों को निर्धारित कर सकता है, साथ ही शून्य घटनाओं के बीच संबंध स्थापित कर सकता है। उदाहरण के लिए, ऐसी स्थिति में जहां शास्त्रीय वीएसए में एक बड़े पीवीएस के बगल में एसवीएस का एक समूह देखा जाता है, कोई भी आसानी से भेदभाव नहीं कर सकता है यदि प्रयोग के दौरान माउस कई बार शून्य हो जाता है (तीन छोटे और एक बड़े शून्य के साथ) या यदि जानवर ने एक बड़ी मूत्र मात्रा जमा की है, और तीन छोटे धब्बे पोस्ट-माइक्रोट्यूरियन ड्रिबलिंग या फर से कैरीओवर का परिणाम हैं।

तीसरा, आरटी-वीएसए शून्यीकरण घटना से पहले, दौरान और बाद में माउस के व्यवहार का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। अन्वेषक माउस व्यवहार ट्रैकर39 जैसे स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर के साथ आरटी-वीएसए रिकॉर्डिंग का विश्लेषण करके माउस की समग्र गतिविधि प्रोफ़ाइल की निगरानी भी कर सकता है। इसके अलावा, कोई यह भेदभाव कर सकता है कि क्या कोई जानवर पेशाब करना बंद कर देता है (मादाओं का विशिष्ट व्यवहार), क्या जानवर शून्यता के दौरान गति में है (जिसके परिणामस्वरूप पुरुषों में शून्य धब्बे का पता चल सकता है), या क्या यह अपने नींद / आराम चरण के दौरान खाली हो जाता है। हमने बाद के व्यवहार को देखा है, हालांकि यह सामान्य रूप से दुर्लभ है। इस प्रकार, यदि ठीक से मान्य और व्याख्या की जाती है, तो शून्यता व्यवहार का अवलोकन जांचकर्ता को शून्यता शिथिलता में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, उदाहरण के लिए, नोक्टुरिया या असंयम। आरटी-वीएसए (और वीएसए) जांचकर्ताओं को कोनों के विपरीत, पिंजरे के केंद्रीय क्षेत्र में होने वाली शून्य घटनाओं के अंश को निर्धारित करने की अनुमति देता है। आम तौर पर, केंद्र शून्यीकरण दुर्लभ है, और ऐसी घटनाओं की बढ़ती संख्या मूत्राशय की शिथिलता 8,22 का संकेत है। एक अपवाद प्रमुख अल्फा-पुरुष हैं, जो अक्सर पेशाब करते हैं और उनके बाड़ों की संपूर्णतामें 20 होते हैं। आरटी-वीएसए का उपयोग करके केंद्रीय शून्यता का विश्लेषण करने के लिए, किसी को भोजन पकवान को एक तरफ की दीवार पर ले जाने और गुंबद को हटाने पर विचार करना चाहिए (या इसे पिंजरे के एक विशेष क्षेत्र में ठीक करना चाहिए), ताकि पेशाब के स्थानिक पैटर्न को अधिक आसानी से स्थापित किया जा सके।

चौथा, आरटी-वीएसए शास्त्रीय वीएसए की तुलना में पिंजरे विनिमय से जुड़े तनावों को अधिक प्रभावी ढंग से प्रबंधित करने की अनुमति देता है। चूहे स्वभाव से सुस्त होते हैं और उन्हें संभालने या उन्हें एक नए वातावरण में स्थानांतरित करने से तनाव होता है, जो शून्यताव्यवहार को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है। इसकी प्रकृति से, मानक वीएसए में अनुकूलन की अवधि को शामिल करना मुश्किल है। इसके विपरीत, आरटी-वीएसए में, प्रत्येक प्रयोग में अनुकूलन की अवधि को आसानी से शामिल किया जा सकता है, और इस अवधि के दौरान किसी भी शून्यता की घटनाओं को विश्लेषण के दौरान अनदेखा किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में लागू आरटी-वीएसए का एक अतिरिक्त तनाव से राहत देने वाला पहलू उन स्थितियों का दोहराव है जिनके तहत चूहों को सामान्य रूप से रखा जाता है (यानी, भोजन और पानी एड लिबिटम, एक गुंबद और एक खिलौना तक पहुंच)। यह, हमारे ज्ञान के अनुसार, इस प्रकार के प्रयोग के लिए वर्णित सबसे अमीर वातावरण में से एक है। एक विशिष्ट समापन बिंदु वीएसए में, चूहों को पानी (और कभी-कभी भोजन से भी) 8,22 से वंचित किया जाता है, जिसे हम एड लिबिटम प्रदान करते हैं।

पांचवां, चूहों के तनाव के स्तर पर इस समृद्ध वातावरण के सकारात्मक प्रभाव के अलावा, यह जांचकर्ता को विस्तारित अवधि के लिए आरटी-वीएसए करने की अनुमति देता है, आमतौर पर 6 घंटे की समय खिड़कियों में; हालांकि, हाल ही में हम उन प्रयोगों का प्रदर्शन कर रहे हैं जो 24 घंटे तक चलते हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)। सर्कैडियन लयबद्धता के प्रभावों का आकलन करते समय या चूहों का अध्ययन करते समय यह आदर्श है जो एक अंडरएक्टिव मूत्राशय फेनोटाइप प्रदर्शित कर सकते हैं, और इस प्रकार अक्सर पेशाब करते हैं।

24 घंटे की वीडियो निगरानी के लिए, हम पतले फिल्टर पेपर का उपयोग करने और नीचे के कैमरों का उपयोग करके प्रयोगों का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं। कागज और कैमरे के प्रकार का यह संयोजन सबसे अच्छा विकल्प है जो अंधेरे और प्रकाश चरणों में पहचान की संवेदनशीलता की अनुमति देता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, नीचे के कैमरे मोटे फिल्टर पेपर पर शून्य धब्बे का आसानी से पता नहीं लगा सकते हैं और शीर्ष कैमरे प्रकाश चरण के दौरान शून्य धब्बे का विश्वसनीय रूप से पता नहीं लगाते हैं। यदि इन विस्तारित विश्लेषणों को किया जाता है, तो हम जानवरों को 05:00 बजे रिकॉर्डिंग पिंजरों में रखने, पहले दिन 06:00 बजे से विश्लेषण करने और अगले दिन 06:00 बजे प्रयोग पूरा करने का सुझाव देते हैं।

जबकि आरटी-वीएसए के कई सकारात्मक पहलू हैं, ध्यान देने योग्य कुछ चेतावनी हैं। जबकि हम इन विश्लेषणों को करते समय तनाव को सीमित करने का हर प्रयास करते हैं, हम माउस के निवास स्थान को पूरी तरह से दोहरा नहीं सकते हैं, क्योंकि जानवरों को सामान्य रूप से समूह-रखा जाता है। वे नॉन-वेटिंग वाटर जेल से पानी प्राप्त करने के बजाय एक बोतल से पानी पीते हैं। हालांकि, हमारा अवलोकन है कि चूहों में उनके निष्क्रिय प्रकाश चरण बनाम उनके सक्रिय अंधेरे चरण के दौरान कम रिक्तियां होती हैं, जो हमें इंगित करता है कि चूहे सर्कैडियन शून्यव्यवहारके अपने सामान्य पैटर्न को बनाए रखते हैं। उनकी आसानी से तनावग्रस्त प्रकृति को दर्शाते हुए, हमने पाया कि चूहे पिंजरे की सफाई के दिनों में बाधित शून्यता व्यवहार का प्रदर्शन करते हैं। इस प्रकार, किसी को विश्लेषण को समय की अवधि तक सीमित करना चाहिए जब जानवर नियमित पशुपालन से कम प्रभावित होंगे। विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक यह है कि क्या यूवी प्रकाश का शून्यीकरण समारोह पर कोई प्रभाव पड़ता है। क्योंकि हमारे निष्कर्ष प्रकाश और अंधेरे चरणों के बीच वीएसए मापदंडों में एक अलग सर्कैडियन अंतर दिखाते हैं, जो अन्य तकनीकों के अनुरूप हैं जो एक समान घटना का वर्णन करते हैं लेकिन यूवी प्रकाश40 का उपयोग नहीं करते हैं, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि यूवी प्रकाश रोशनी शून्यीकरण समारोह को प्रभावित नहीं करती है। ध्यान दें कि फिल्टर पेपर प्रकाश को निचले कक्ष से ऊपरी कक्ष तक गुजरने से रोकता है।

एक अतिरिक्त चेतावनी यह है कि चूहों को कक्ष में जितने लंबे समय तक रखा जाता है, उतनी ही अधिक संभावना होती है कि वे फिल्टर पेपर को चबाते हैं या नुकसान पहुंचाते हैं (कागज की मोटाई के बावजूद)। जबकि प्रकाश चरण के दौरान किसी भी जानवर ने पेपर को बाधित नहीं किया, लगभग 30% चूहों ने अंधेरे सक्रिय चरण के दौरान पेपर को नुकसान पहुंचाया। 24 घंटे के प्रयोगों के विश्लेषण में, हमने देखा कि कागज की क्षति के कारण प्रयोगों के एक समान अनुपात (एक तिहाई) का विश्लेषण नहीं किया जा सका, जिसका अर्थ है कि न केवल समय की मात्रा, बल्कि दिन का चरण भी जानवर के श्रेडिंग व्यवहार को प्रभावित करता है। दुर्भाग्य से, हमारे अनुभव में, हमने देखा है कि एक जानवर जो पिंजरे के कागज को बाधित करता है, वह फिर से परीक्षण पर भी ऐसा करना जारी रखेगा। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, चूहे कभी-कभी नंगे ऐक्रेलिक फर्श पर पेशाब करते हैं, और इस प्रकार कागज का नुकसान विश्लेषण को अधूरा और सीमित मूल्य का बनाता है।

इसके अलावा, पुरुष शून्यव्यवहार का विश्लेषण अधिक कठिन हो सकता है क्योंकि वे अधिक बार शून्य हो जाते हैं, वे शून्यहोने के बाद ड्रिबल कर सकते हैं, और अधिक आक्रामक अल्फा-पुरुष फेनोटाइप के साथ पुरुषों (20%) की आबादी होती है जो बड़ी संख्या में छोटी रिक्तियों की विशेषता होती है जो पिंजरे में वितरित की जाती हैं, जैसा कि पहले के प्रकाशन3 में चर्चा की गई थी।. चूंकि यह अल्फा-पुरुष व्यवहार शून्यता फेनोटाइप स्थापित करने के लिए एक भ्रामक कारक का गठन कर सकता है, इसलिए हम विश्लेषण से ≥50 (प्रकाश चरण प्रयोग) या ≥100 (अंधेरे चरण प्रयोग) रिक्तियों वाले जानवरों को बाहर करते हैं।

ऐसी स्थितियां हैं जिनमें उनकी मात्रा (यानी, पीवीएस बनाम एसवीएस) के आधार पर रिक्तियों का भेदभाव आवश्यक नहीं है। उदाहरण के लिए, हमारे अनुभव में, बैक्टीरियल या रासायनिक सिस्टिटिस वाले चूहे 4,34 को नियंत्रित करने की तुलना में छोटी मात्रा को शून्य करते हैं। हालांकि, अलग-अलग चूहों के बीच शून्य मात्रा में बहुत अंतर हैं; कुछ में, अधिकांश रिक्तियों में मात्रा ≤20 μL है, जबकि अन्य में बहुमत >20 μL है। नतीजतन, शून्य मात्रा का भेदभाव इन फेनोटाइप ्स के लक्षण वर्णन के लिए कोई लाभ प्रदान नहीं करता है।

संक्षेप में, आरटी-वीएसए स्वतंत्र रूप से मोबाइल चूहों में माउस शून्यव्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक आसान उपकरण है। सिस्टोमेट्री जैसे उपकरणों के विपरीत, इसे कैथेटर के सर्जिकल प्रत्यारोपण या मूत्राशय भरने की गैर-शारीरिक दरों की आवश्यकता नहीं होती है। यह चूहों के दोनों लिंगों में शून्यता व्यवहार के निर्धारण की अनुमति देता है, विस्तारित अवधि में, और दिन चक्र के प्रकाश और अंधेरे चरणों के दौरान। यह अपेक्षाकृत सस्ती भी है, खासकर जब चयापचय पिंजरों जैसे अधिक विशेष और महंगे उपकरणों की तुलना में। हालांकि इस उपकरण से जुड़ी चेतावनियां हैं, वे आम तौर पर प्रबंधित करना आसान है। अंत में, इस तकनीक को अन्य कृन्तकों सहित अन्य जानवरों की प्रजातियों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान R01DK119183 (जीए और एमडीसी को), P30DK079307 के माध्यम से एक पायलट प्रोजेक्ट अवार्ड (एमजीडी को), एक अमेरिकन यूरोलॉजी एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड और विंटर्स फाउंडेशन अनुदान (एनएम को), और पिट्सबर्ग सेंटर फॉर किडनी रिसर्च (P30DK079307) के सेल फिजियोलॉजी और मॉडल ऑर्गेनिज्म किडनी इमेजिंग कोर द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
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References

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Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

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