Summary
このプロトコルでは、一次正常および腫瘍乳腺組織から差動遠心分離によって上皮オルガノイドを生成するためのアプローチについて説明します。さらに、包埋オルガノイドの3次元培養および免疫蛍光イメージングのための説明書が含まれています。
Abstract
オルガノイドは、その自己組織化特性と、初代組織または幹細胞からの増殖後の機能と構造の保持により、臓器組織をモデル化するための信頼できる方法です。このオルガノイド生成方法は、複数の継代による単一細胞分化を放棄し、代わりに差動遠心分離を使用して、機械的および酵素的に解離した組織から乳腺上皮オルガノイドを分離します。このプロトコルは、コラーゲンおよび基底細胞外マトリックスへのオルガノイド埋め込みの技術に加えて、マウスおよびヒト乳腺組織の両方から大小の上皮オルガノイドを迅速に生成するための合理化された技術を提供します。さらに、オルガノイドの形態と密度を視覚化する目的で、ゲル内固定と免疫蛍光染色の指示が提供されています。これらの方法論は、免疫細胞との共培養やコラーゲン浸潤アッセイによるex vivo転移モデリングなど、無数のダウンストリーム分析に適しています。これらの解析は、細胞間の挙動をよりよく解明し、腫瘍微小環境内の相互作用をより完全に理解するのに役立ちます。
Introduction
in vitroで上皮細胞をモデル化する能力は、in vivoではアクセスできない細胞の特徴を捉えるため、現代の生物医学研究の基礎となっています。例えば、2次元平面で増殖する上皮細胞株は、増殖中に上皮細胞で起こる分子変化の評価を提供することができます1。さらに、シグナル伝達と遺伝子発現との間の動的調節を測定することは、in vivoシステム2において制限される。がん研究において、がん上皮細胞株モデリングにより、疾患進行の分子ドライバーと潜在的な創薬標的の同定が可能になりました3。しかし、2次元平面上で増殖する癌上皮細胞株には限界があり、ほとんどが遺伝的に不死化および改変されており、多くの場合、本質的にクローンであり、非生理学的条件で増殖する能力のために選択され、3次元(3D)腫瘍組織構造の評価に制限があり、現実的な組織環境内での微小環境相互作用を適切にモデル化していない4。これらの制約は、インビボで、遠隔臓器部位での浸潤、播種、循環、およびコロニー形成を含むいくつかの異なる生物学的段階を含む転移のモデリングにおいて特に明白である5。
癌上皮オルガノイドは、腫瘍の3D環境および挙動をよりよく再現するために開発されてきた6、7、8。オルガノイドは、単一のLRG5+腸陰窩細胞から最初に開発され、in vitroで小腸の階層構造を維持する陰窩絨毛ユニットの3D構造を表すように分化しました9。このアプローチにより、恒常性およびストレス条件下での自己組織化組織構造のリアルタイムの視覚化と特性評価が可能になりました。自然な拡張として、結腸直腸癌10、膵臓11、乳房12、肝臓13、肺14、脳15、および胃癌16を含む多くの異なる癌タイプをモデル化するために癌上皮オルガノイドが開発されました。癌上皮オルガノイドは、癌の進化17,18および転移時空間行動19,20を特徴づけ、腫瘍の不均一性21を調査し、化学療法をテストするために利用されてきました22。癌上皮オルガノイドはまた、進行中の臨床試験中に単離および収集され、抗癌剤および放射線療法に対する患者の反応を予測するためにex vivoで8、23、24、25である。さらに、癌上皮オルガノイドを組み込んだ系を免疫細胞などの他の非癌細胞と組み合わせて、腫瘍微小環境のより包括的なモデルを形成して相互作用をリアルタイムで視覚化し、癌上皮細胞がナチュラルキラー細胞などの細胞傷害性エフェクター免疫細胞の基本的な性質をどのように変化させるかを明らかにし、潜在的な免疫療法および抗体薬物依存性細胞傷害活性を試験することができる26、27,28。本稿では、継代やコラーゲンおよび基底細胞外マトリックス(ECM)への埋め込みを行わずに上皮オルガノイドを生成する方法を示します。さらに、単離されたオルガノイドの下流イメージングのための技術も共有されています。
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Protocol
この原稿で利用されているすべてのマウス組織は、テキサス大学サウスウェスタン医療センターの施設内動物管理使用委員会(IACUC)の規制およびガイドラインに従って倫理的に収集されています。同様に、すべての患者は、治験審査委員会(IRB)の監督下で組織提供の前に同意し、サンプルは匿名化されました。
注:このプロトコルは、初代組織からのオルガノイドの生成について説明しています。
1.材料の一晩の準備
- 基底細胞外マトリックス(BECM)に包埋する場合は、BECMアリコートを4°Cで放置して解凍します。
2.コラゲナーゼおよびウシ血清アルブミン(BSA)コーティング溶液の調製
- 2.64% BSA/PBSコーティング溶液(BSA溶液)の調製:50 mL/0.2 μmのフィルターフラスコを使用して、滅菌フィルター50 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と4.10 mLの30%BSA溶液。このBSAソリューションは、フィルタリングして再度使用することができます。
- マウス乳腺組織用のコラゲナーゼ溶液を調製する:50 mL/0.2 μmフィルターフラスコを使用して、27 mLの基礎細胞培地、1.5 mLのウシ胎児血清(FBS)、30 μLの50 mg/mLゲンタマイシン、15 μLの10 mg/mLインスリン、600 μLの0.1 g/mLコラゲナーゼA、および600 μLの0.1 g/mLトリプシンを50 mL/0.2 μmのフィルターフラスコを使用して滅菌フィルターします。組織質量に応じて、マウスあたり10 mL〜30 mLのコラゲナーゼ溶液を割り当てます。
- ヒト乳房組織用のコラゲナーゼ溶液を調製する:滅菌フィルター18 mLのRPMI-1640、200 μLの100xペニシリン-ストレプトマイシン溶液(ペン/ストレプトマイシン溶液)、200 μLの10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)バッファー、1 mLのFBS、および50 mL/0.2 μmフィルターフラスコを使用した400 μLの0.1 g/mLコラゲナーゼA。組織質量に応じて、組織サンプルあたり10 mLから20 mLの間で割り当てます。
3. メディアの準備
- オルガノイド培地の調製:50 mL/0.2 μmフィルターフラスコを使用して、1%ペン/連鎖球菌および1%インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)を含む滅菌フィルター基底細胞培地。オルガノイド成長因子培地を作製するには、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を最終濃度2.5 nMまで添加します。
- 乳腺上皮培地の調製:100 mLの乳腺上皮培地を作製するには、1 mLの100xグルタミンサプリメント、1 mLのペン/連鎖球菌、1 mLの10 mM HEPESバッファー(7.3 pH)、250 μLの30%BSAストック、1 μLの1 mg / mLコレラ毒素ストック、1 mLの50 μg / mLヒドロコルチゾンストックをPBSに含みます。 150 mL/0.2 μmのフィルターフラスコを使用して、50 μLの10 mg/mLヒトインスリン溶液、10 μLの50 μg/mLの上皮成長因子(EGF)ストック、および1%FBS。培地を4°Cで保存し、最大2週間使用します。
- アムホテリシン洗浄の準備:2%ペン/連鎖球菌および2%アムホテリシンBを含む滅菌フィルターPBSを4°Cで保存します。
4.組織の収集と消化
- マウス乳腺組織
- CO 2チャンバーに2 〜5分間入れてマウスを安楽死させ、その後頸部脱臼を続けます。腹側を上に向けて、マウスの手足を広げ、4本の19 G針を使用して、吸収パッドで覆われたボードに足でマウスを固定します。70%エタノールをスプレーして、毛皮を滑らかにし、皮膚を消毒します。ガーゼパッドまたはティッシュで糞便を拭き取ります。
- 肛門生殖器領域のすぐ上から始めて、腹膜を突き刺さないように注意しながら、外科用ハサミを使用して正中線から上向きに切ります。あごに到達したら、鎖骨と後ろ足の両方を横方向に切り込み、マウスの皮膚をボードにぴんと張って固定して乳脂肪パッドを露出させます。
- 後肢の近くにある鼠径リンパ節を特定することにより、野生型マウスの鼠径乳腺脂肪パッドを見つけます。野生型マウスの胸部乳腺パッドを、前肢の下のより厚い血管新生組織として見つけます。
- 鉗子を使用して乳脂肪パッドを持ち上げます。下にある筋肉を集めることは避けてください。鋭利な鈍いはさみの鈍い端を使用して、乳房脂肪パッドの下に皮膚から離れたポケットを作成します。乳腺脂肪パッドを一枚に切り取ります。
- 乳脂肪パッドを取り除いたら、PBSですすいでから滅菌組織培養皿に入れます。組織培養フードに素早く移します。
注:乳腺腫瘍の場合は、PBSで濡らした綿棒を使用して、腫瘍を皮膚からそっと転がします。暗い変色は壊死を示し、健康なオルガノイドを生成しないため、暗い部分や柔らかい部分は避けてください。 - 乳腺腫瘍を#10または#11メスで細かく刻み、ペースト状の粘稠度に達するまで組織を緩めます。メスを使用して、ミンチ組織を10〜30 mLのコラゲナーゼ溶液を含むコニカルチューブに移します。すべての組織を確実に収集するために、1 mLのコラゲナーゼ溶液を組織培養プレートにピペットで移し、円錐形チューブに戻します。
注:より大きなオルガノイドを生成するには、機械的消化を最小限に抑え、目に見える小さな組織片をそのまま残す必要があります。あるいは、組織は、生存率の損失を最小限に抑えて、後のオルガノイド調製のために凍結保存することができる。これを行うには、PBSまたは基底細胞培地+ 1%FBSの溶液で組織を洗浄し、次に粗くミンチして表面積を増やします(組織を1つまたは2つの固体片に保ちます)。組織を凍結バイアルに移し、凍結培地(90%FBS + 10%ジメチルスルホキシド(DMSO))で上部を移動します。液体窒素での保管に移る前に、制御された速度の凍結容器でバイアルを一晩凍結します。 - コニカルチューブを37°Cのベンチトップ振とうインキュベーターに180 RPMで入れ、組織が糸状になり、コラゲナーゼ溶液が白濁するまで入れます。例えば、腫瘍からの大きな組織塊(約500〜800mg)は30〜60分かかる。野生型の乳脂肪パッドからのより小さな組織塊(約100〜300 mg)は約20〜30分かかります。不明な場合は、5分間隔で確認してください。
- インキュベーション後、コニカルチューブを室温(RT)で550 x g で10分間遠心分離します。
- 円錐管から上清を注意深く吸引する。
注:今後は、すべてのピペットチップ、血清学的ピペット、およびコニカルチューブをBSA溶液でプレコートして、プラスチックへの付着によるオルガノイドの損失を防ぎます。 - 8 mLの基礎細胞培地と80 μLのDNase溶液[2 U/μL]をチューブに加えます。1〜3分間静かに反転させます。
- 12 mLの基礎細胞培地をチューブに加え、ピペッティングで慎重に混合するか、チューブを15回ゆっくりと回転させて混合します。
- RTで550 x g で10分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、次いでペレットを12mLの基礎細胞培地に再懸濁する。
- 最も重い組織片を底に落ち着かせます。血清学的ピペットで上清を収集し、15 mLコニカルチューブに移します。この懸濁液には、上皮オルガノイドと間質/免疫細胞が含まれています。
- 人間の乳房組織
- ヒト乳房組織サンプルをオルガノイド用に処理するか、収集から24時間以内に保管します。サンプルを1%100倍抗生物質抗真菌剤を含むCO2非依存培地に4°Cで保存します。
- 組織を組織培養プレートに移します。プレートを傾けて余分な保存培地を吸引し、5 mLのアムホテリシンB洗浄液で組織を洗い流します。アムホテリシンBウォッシュをすぐに取り外します。
- 組織サンプルを#10または#11メスで細かく刻み、ペースト状の粘稠度に達するまで組織をほぐします。メスを使用して、ミンチ組織を10〜30 mLのコラゲナーゼ溶液を含むコニカルチューブに移します。すべての組織を確実に収集するために、1 mLのコラゲナーゼ溶液を組織培養プレートにピペットで移し、コニカルチューブに戻します。
注:より大きなオルガノイドを生成するには、機械的消化を最小限に抑え、目に見える小さな組織片をそのまま残す必要があります。このプロトコルの開始組織量は100〜250 mgの範囲でした。.あるいは、組織は、上記のように90%FBS+10%DMSO中でステップ4.2.2後の生存率の損失を最小限に抑えて、後のオルガノイド調製のために凍結保存することができる。 - コニカルチューブを37°Cのベンチトップ振とうインキュベーターに180 RPMで入れ、組織が小さくなりコラゲナーゼが濁るまで入れます。5分間隔で組織を確認してください。ヒトサンプルのコラゲナーゼ解離には約5〜20分かかります。
- インキュベーション後、円錐管をRTで550 x g で10分間回転させます。
- 円錐管から上清を注意深く吸引する。
注:今後は、プラスチックへの付着によるオルガノイドの損失を避けるために、すべてのピペットチップ、血清学的ピペット、およびコニカルチューブをBSA溶液でプレコーティングします。 - 4 mLの基礎細胞培地と40 μLのDNase溶液[2 U/μL]を円錐管に加えます。3分間穏やかに反転させます。
- 6 mLの基底細胞培地をチューブに加え、ピペッティングで慎重に混合するか、円錐チューブを15回静かに回転させて混合します。
- RTで550 x g で10分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、次いでペレットを10mLの基礎細胞培地に再懸濁する。
- 最も重い組織片を底に落ち着かせます。上清を集め、15 mLのコニカルチューブに移します。この懸濁液には、上皮オルガノイドと間質/免疫細胞が含まれています。
5.差動遠心分離
- RTで550 x g に3〜4秒間パルスし、上清を吸引し、ペレットを10 mLの基底細胞培地に再懸濁します。この手順をさらに3回繰り返します(合計4回のスピン)。
- 各遠心分離の後、ペレットがますます不透明になることを確認してください。この残りのペレットは上皮オルガノイドになります。
6.小さなオルガノイドの収集
- 上清を新鮮なBSAコーティングチューブに集め、次にRTで550 x gで3秒間パルスして、小さなオルガノイドをペレット化します。
7. BECMへのオルガノイドの埋め込み
- ウェルあたりのBECM量に対するオルガノイド密度に従って、オルガノイドの適切な懸濁液を微量遠心チューブに分注します(表1)。例えば、96ウェルプレートの1ウェルで20μLのBECMに対して50〜100個のオルガノイドを使用します。
注:オルガノイド密度は、次の式を使用してカウントできます:((オルガノイドの平均数)/ 50 μL)x希釈係数。 - 氷上ですべての手順を実行します。解凍したBECMを組織培養フード内の氷上に置きます。フードを準備しながら、すべてのピペットチップを氷の上に置いて冷まします。
- 微量遠心チューブをRTで300 x g で10分間遠心分離し、チューブから上清を廃棄します。オルガノイドペレットの入ったチューブを氷に移し、各微量遠心チューブに適切な量のBECMを加えます(表1)。
注意: BECMは粘性があるため、ピペットチップの損失を考慮して、BECMの追加ボリューム(ドームボリュームの約10%〜20%追加)を追加します。 - 気泡が発生しないように注意しながら、ゆっくりと上下にピペットでオルガノイドをBECMに再懸濁します。
- BECMで懸濁したオルガノイドをゆっくりと慎重にめっき表面にピペットで移します。ピペッティングしながら、ゆっくりとピペットを上げてドームを作ります。湿度を維持するために、空のウェルをすべてPBSで満たします。
- プレートを37°Cのインキュベーターに1時間入れてBECMを固化させた後、適切な量の培地で覆います(表1)。
8. コラーゲンへのオルガノイドの埋め込み
- 氷上ですべての手順を実行します。15 mLのコニカルチューブに375 μLの10x DMEM、100 μLの1 N水酸化ナトリウム(NaOH)、および3 mLのラットテールコラーゲンI溶液を順番に組み合わせて、コラーゲン溶液を調製します。泡を作らないように注意しながらピペットミックス。必要に応じて、少量(1〜3 μL刻み)のNaOHまたは10x DMEMを使用して、溶液を7.2〜7.4のpHに滴定します。
- ウェルの底を完全に覆うのに必要な最小限の量のコラーゲンでウェルの底をコーティングします。1つのアプローチは、少量のコラーゲンを配置し、プレートを左右に揺り動かしてコーティングすることです。コラーゲンの下敷きを37°Cで30分-2時間設定します。
- ウェルあたりのコラーゲン量に対するオルガノイド密度に従って、オルガノイドの適切な懸濁液をマイクロ遠心チューブに分注します(表1)。37°Cのインキュベーターに入れます。
- コラーゲン溶液を4°Cで保存し、10分ごとに顕微鏡下で繊維形成をチェックして重合をモニターします。コラーゲンは30分から2時間の間に適切な重合に達します。
注:適切な重合は、マトリックス全体に分岐する繊維の存在によって決定できます。視野内にいくつかの繊維が観察されたら、すぐに手順8.5に進みます。 - 微量遠心チューブを300 x g でRTで10分間遠心分離し、チューブから上清を廃棄します。オルガノイドペレットを氷に移し、適切な量のコラーゲンを各微量遠心チューブに加えます(表1)。
注意: コラーゲンは粘性があるため、ピペットチップの損失を考慮して、コラーゲンの追加容量(ドームボリュームの約10%〜20%追加)を追加します。 - オルガノイドをコラーゲンに再懸濁させるためにゆっくりと上下にピペットで、泡が出ないように注意します。
- コラーゲン懸濁オルガノイドをゆっくりと慎重にめっき表面にピペットで移します。ピペッティングしながら、ゆっくりとピペットを上げてドームを作ります。湿度を維持するために、空のウェルをすべてPBSで満たします。
- プレートを37°Cのインキュベーターに1時間入れてコラーゲンを固化させた後、適切な量の培地で覆います(表1)。
- 注:オルガノイドは、3Dマトリックス中で最大7日間生存率を維持します。イメージングを解析に使用している場合は、手順 9 と 10 に進みます。
9. 埋め込みオルガノイドの固定
- ピペットを使用して、ECMドームと接触することなくウェルからすべての培地を除去します。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)/ PBS溶液で5分間固定します。
- ゆっくりと動くシェーカーに置いた後、PBSをウェルに塗布して2〜3回洗浄します。洗浄後、新鮮なPBSをドームに塗布し、プレートを4°Cで保管します。
10. 包埋オルガノイドの免疫蛍光染色
- 免疫蛍光染色用溶液の調製
- 透過処理バッファー:10%Triton X-100を含むPBS溶液を調製します。
- ブロッキングバッファー:10%FBSおよび0.2%トリトンX-100を含むPBS溶液を調製します。
- 抗体希釈バッファー:2% FBS および 0.2% Triton X-100 を含む PBS 溶液を調製します。
- 透過処理とブロッキング
- ECMドームを覆うのに十分な透過処理バッファーをピペットで入れる。ゆっくりと動くシェーカーでRTで1時間インキュベートします。
- ピペットで透過処理バッファーを除去し、同量のブロッキングバッファーを3時間適用します。
- 一次抗体インキュベーション
- ブロッキングバッファーをピペットで除去し、一次抗体を含む抗体希釈バッファーをメーカー指定の濃度で塗布します。ゆっくりと動くシェーカーでサンプルを4°Cで12〜16時間インキュベートします。
- 一次抗体溶液を取り出し、ゆっくりと動くシェーカーでRTでPBSでサンプルを10分間3回洗浄します。
- 二次抗体インキュベーションと核染色
- 残りのPBS洗浄液を吸引し、二次抗体を含む抗体希釈バッファーをメーカー指定の濃度で塗布します。さらに、DAPIまたはヘキスト(核を標識するため)またはファロイジン(アクチンを標識するため)を1:250の比率でバッファーに追加します。ゆっくりと動くシェーカーでRTで2〜4時間インキュベートします。
- 二次抗体溶液を取り出し、シェーカーのRTでPBSでサンプルを10分間3回洗浄します。イメージングするまでサンプルを4°CでPBSに保存します。
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Representative Results
図1に掲載されている画像は、ヒトおよびマウス組織からの野生型および腫瘍性乳腺上皮オルガノイドの例を示しています。図1Aの漫画のワークフローでは、差動遠心分離によって上皮オルガノイドを単離する方法の一目でわかる図が示されており、明視野画像に示すように、異なる種の一次組織をほぼ同じ方法で処理しながら上皮組織を生成できることを示しています(図1B).さらに、これらの種間組織組成の類似性は、図2A-Dに示される基底細胞外マトリックスまたはコラーゲンのいずれかに埋め込まれたオルガノイドの免疫蛍光画像に見ることができる。オルガノイド構造は、メンブレントマト(mTomato)標識またはアクチンのファロイジン染色のいずれかによって視覚化できます。これらの図は、この方法を使用して予想されるオルガノイドの組成とサイズも示しています。コラーゲンマトリックスに埋め込まれたオルガノイドは、図2Cに示すように、浸潤アッセイに使用でき、オルガノイド自体から分岐する巻きひげの膨張を追跡することによって分析できます。最後に、パラフィン包埋オルガノイドのヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色は、オルガノイドが乳癌の同じ組織像を維持することを示しています(図2E)。
図1:サンプルオルガノイドを用いた上皮オルガノイド生成のワークフロー。 (A)継代なしのマウスまたはヒト組織からのオルガノイド生成のためのワークフローのスキーマ。(B)単離後の培地中のマウスWT乳腺、マウス乳腺腫瘍、およびヒト乳房腫瘍から単離された上皮オルガノイドの代表的な画像。各画像は、視覚化を強化するために、明るさとコントラストを個別に調整しました。画像は、10倍の倍率で倒立落射蛍光顕微鏡で明視野で撮影されました。スケールバーは20μmを表す。乳腺腫瘍はMMTV-PyMTマウスから単離された。正常な乳腺組織は、FVBマウスから単離した。マウスは8〜14週齢29の範囲であった。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:細胞外マトリックス中のオルガノイドのイメージング。各画像は、このコレクションの視覚化を強化するために、明るさとコントラストを個別に調整しました。イメージングの前に、サンプルを4%パラホルムアルデヒドで固定しました。野生型サンプルをファロイジン568で染色して細胞膜を可視化し、すべてのサンプルをヘキストで染色して核を可視化し、オルガノイドの形態と密度を示しました。画像は共焦点顕微鏡で10倍の倍率で撮影され、3.003のスキャンズームでさらに拡大されました。DAPIの検出に使用したレーザー波長は405 nmでパワー5で、ファロイジンの検出に使用されたレーザー波長は、パワー0.5のチャネル3で561.0 nmでした。共焦点ピンホールサイズは、すべての画像で19.16に維持されました。(A)0日目にBECMに埋め込まれたマウス乳腺WTオルガノイドの代表的な明視野画像。(A')1:250ヘキスト標識核および(A'')1:250ファロイジン標識アクチン免疫蛍光像A.スケールバーは20μmを表す。正常な乳腺組織をFVBマウスから単離した。マウスは8〜12週齢の範囲であった。(B)0日目のBECMに埋め込まれたマウス乳腺腫瘍オルガノイドの代表的な明視野画像。(B')1:250ヘキスト標識核および(B'')mTomato標識免疫蛍光像B.スケールバーは20μmを表す。乳腺腫瘍はMMTV-PyMTマウスから単離した。マウスは12〜14週齢の範囲であった。(C)3日目のコラーゲンIに埋め込まれたマウス乳腺腫瘍オルガノイドの代表的な明視野画像。画像は「侵襲的」特性を示すオルガノイドを表しています。(C ́)1:250ヘキスト標識核および(C ́)c.スケールバーのmTomato標識免疫蛍光像は20μmを表す。乳腺腫瘍はMMTV-PyMTマウスから単離した。マウスは12〜14週齢の範囲であった。(D)0日目のBECMに埋め込まれたヒト乳房腫瘍オルガノイドの代表的な明視野画像。(D')ヘキスト標識核および(D'')1:250アクチン標的化ファロイジン標識免疫蛍光像D.スケールバーは20μmを表す。 (E)BECMに包埋し、H&Eで染色したオルガノイドの切片化画像。スケールバーは20μmを表す。 H&E染色は、テキサス大学サウスウェスタン組織管理共有リソース30によって行った。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 培養プレート | ECMドームボリューム | 推奨オルガノイド数 | メディアボリューム |
| 6ウェルプレート | 200 μL | 300 | 3ミリリットル |
| 12ウェルプレート | 150 μL | 225 | 2ミリリットル |
| 24穴プレート | 100 μL | 150 | 1ミリリットル |
| 48ウェルプレート | 40 μL | 60 | 300 μL |
| 96ウェルプレート | 20 μL | 30 | 150 μL |
表1:ドーム用のECM成分の推奨量、オルガノイドの密度、およびさまざまな培養プレート上のウェルあたりに必要な培地の量。
| 問題 | 考えられる原因 | 解決 | |||
| ECMドームは崩壊しました。 | プレートが揺れた、ECMボリュームが大きすぎてドーム形状を維持できなかった、またはドームが井戸の端に触れてくっついて落下した。 | ドームが固まる前にプレートを激しく動かしすぎないようにするか、オルガノイドの再懸濁に使用するECMの量を減らすか、プレートの中央にあるドームをピペットで固定するように細心の注意を払ってください。 | |||
| オルガノイドのようには見えない組織があります。 | 筋肉組織または神経は、乳脂肪パッドを収穫する過程で収集された可能性があります。 | 明らかに乳脂肪パッドであるものだけを切り取ります。皮膚にしっかりと付着している組織を取り除くことは避けてください。 | |||
| 多くの死んだオルガノイドがあります。 | 壊死性腫瘍組織を採取した。 | 壊死性、嚢胞性、過度に柔らかい、または色が濃い腫瘍から組織を採取することは避けてください。腫瘍組織はしっかりしているべきです。 | |||
| オルガノイドよりも多くの単一細胞があります。 | 組織が細かく刻まれすぎたか、コラゲナーゼ消化が長すぎた。 | 組織を過剰にミンチしたり、コラゲナーゼのインキュベーション時間を短縮したりしないでください。 | |||
| ECMにはバブルがあります。 | ピペッティングによる再懸濁は強すぎ、ドームをピペッティングする際の排出は速すぎました。 | ECMでオルガノイドをゆっくりと再懸濁し、ゆっくりとピペットでドームに入れます。問題が解決しない場合は、ピペッティング中に2番目のストップに行かないでください。 | |||
| コラーゲン内のオルガノイドの侵入はありません。 | コラーゲンが適切に重合または過剰重合していなかった。 | 適切に重合されるまで、オルガノイドをコラーゲンに再懸濁しないでください。30分ごとに確認してください。重合が見られない場合は、2時間マークで再懸濁し、すぐにプレートします。 | |||
| 重合を見ている間、コラーゲン繊維は見えません。 | 顕微鏡の設定は好ましくなかった。 | 位相差を調整して暗さを最大にしてから、顕微鏡の明るさを完全に上げます。さらに、倍率を上げると、表示が向上する場合があります。 | |||
| ECMドームは溶解しました。 | 固定時間が長すぎたか、ECM埋め込みサンプルからPFAが完全に除去されませんでした。 | ECMドームの固定時間を5分未満に保ち、回転シェーカーでそれぞれ5分間5回の洗浄でフォローアップします。 | |||
表 2: 潜在的な問題、原因、および解決策の表。
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Discussion
腫瘍オルガノイドを生成するための様々な方法が文献に記載されている。このプロトコルは、継代なしで腫瘍から直接腫瘍オルガノイドを生成する方法を強調しています。この方法を使用すると、腫瘍オルガノイドは、手順を開始してから数時間以内に生産可能であり、文献31で報告されている70%と比較して、ほぼ100%の生存可能なオルガノイドを生成します。比較すると、他の方法では、数週間にわたって細胞をオルガノイドに連続継代する必要があります。したがって、長期培養の影響を受けずに、同じ宿主からの一致したオルガノイドおよび免疫サンプルとの免疫細胞相互作用を決定および視覚化するなどのダウンストリームアプリケーションがより実現可能になります。さらに、 図2Cで強調されているように、腫瘍オルガノイドを異なる細胞外マトリックスに埋め込むことで、原発腫瘍からの浸潤など、転移カスケード全体にわたる重要な表現型の同定が可能になります。他の下流アプリケーションには、様々な上皮細胞の挙動を評価するための、分岐形態形成32、浸潤、播種、およびコロニー形成33 の表現型アッセイが含まれる。免疫相互作用は、これらのオルガノイドベースのアッセイで機能的および視覚的にキャプチャすることもできます。さらに、ゲルを溶解して埋め込み細胞を単離し、標準的な生化学的およびフローベースのアッセイを使用して遺伝子およびタンパク質含有量の下流分析を行うことができます。最後に、腫瘍組織から大量のオルガノイドを迅速に生成できるため、これらのアッセイは、薬物スクリーニングアプリケーションや臨床試験ワークフローへの統合に合わせて拡張できます。
このプロトコルにとって重要ないくつかの重要なステップがあります。まず、コラゲナーゼ消化に必要な時間は、組織組成と消化される組織の量に依存します。例えば、ヒト乳房腫瘍手術サンプル(平均100〜250mg)のようなより小さな組織片を扱う場合、より短い消化時間が必要である。ただし、マウスから採取された乳腺腫瘍はサイズがはるかに大きく(500〜800 mg)、30〜60分の酵素消化が必要になる場合があります。第二に、上皮オルガノイドの最大収量を確保するためには、プラスチックへの細胞接着による損失を避けるために、すべてのピペットチップと血清学的ピペットをBSAでコーティングすることも重要です。第三に、短い遠心分離時間の差は、非上皮組織成分を排除するために重要です。このアプローチにより、より重い上皮オルガノイドをペレット化し、より軽い間質および免疫コンパートメントが上清に残ります。オルガノイドをコラーゲンに埋め込むことによって侵襲アッセイを作成するには、オルガノイドを埋め込む前にコラーゲンの適切な重合を可能にすることが重要です。このステップは、光学顕微鏡でコラーゲン線維の形成を確認することにより、視覚的に確認する必要があります。最後に、最良のイメージング結果を得るには、ECMおよびメッキでオルガノイドを再懸濁するときに気泡が生成されないように注意してください。気泡はゲル内のオルガノイドを覆い隠し、画像を歪めます。 表 2 に、発生した潜在的な問題と、これらの課題を克服するための解決策を示します。
プロトコルの特定のステップでは、生成されるオルガノイドのサイズをカスタマイズしたり、プロトコルの実行に必要な時間を短縮したりするための変更が可能です。例えば、機械的消化時間の持続時間を長くすると、コラゲナーゼ消化時間が短くなり、オルガノイドが小さくなり、個々の細胞が多くなります。コラゲナーゼ消化後の遠心分離は、大量の腫瘍組織を扱う場合、5分に短縮できます。オルガノイドの培養および成長に使用される培地は、オルガノイド生成ステップ中の時間を節約するために、前日に調製することができる。同様に、腫瘍組織は、オルガノイド調製前に適切な培地中で最大24時間保存することができる。時間が極端に限られている場合、このプロトコルには、収集日に腫瘍組織を凍結することによる一時停止ステップが含まれます。そして、これらの凍結組織は、後日、生存可能なオルガノイドを生成するために使用することができる。凍結組織由来のオルガノイドの約90%は生存可能であり、光学顕微鏡およびトリパンブルー溶液で視覚的に確認された。
このプロトコルにはいくつかの制限があります。このアプローチは生存可能なオルガノイドを迅速に生成するが、生成されるオルガノイドの量は腫瘍組織の量によって制限される。この制限は、腫瘍組織の量が少ない、または時には少数の細胞に制限されている臨床サンプルを扱う場合に特に顕著になります。出発物質として回収できる細胞が少ない極端なケースでは、継代がより良い選択肢となる可能性があります。もう一つの制限は、この方法の還元主義的アプローチです。線維芽細胞や内皮細胞などの間質区画の除去は、上皮オルガノイドの生成を豊かにします。しかしながら、これらの細胞集団は腫瘍の機能にとって重要である。したがって、それらの除去は、上皮オルガノイドモデルのみに由来する腫瘍生物学の解釈を制限する。結論として、このプロトコルは、ダウンストリームイメージング、機能的(免疫相互作用を含む)、および薬物スクリーニングアプリケーションですぐに使用するための上皮オルガノイドの迅速な生成のためのアプローチを提供します。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、METAvivor、Peter Carlson Trust、Theresa's Research Foundation、NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543から提供された資金提供によって支援された。我々は、シモンズ総合がんセンターの共有リソースであるテキサス大学南西部組織管理共有リソースの支援を認め、授与番号P30 CA142543の下で国立がん研究所によって部分的に支援されています。チャンラボのすべてのメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
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