Summary
Этот протокол описывает ортотопическую имплантацию раковых клеток пациента в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом. Модель повторяет прогрессирующее метастатическое заболевание колоректального рака и позволяет оценивать новые терапевтические препараты в клинически значимом сценарии метастазов в легких и печени.
Abstract
За последнее десятилетие были созданы более сложные доклинические модели колоректального рака (КРР) с использованием раковых клеток, полученных от пациентов, и 3D-опухолей. Поскольку органоиды опухоли, полученные от пациента, могут сохранять характеристики исходной опухоли, эти надежные доклинические модели позволяют проводить скрининг лекарств от рака и изучать механизмы лекарственной устойчивости. Тем не менее, смерть, связанная с КРР, у пациентов в основном связана с наличием метастатического заболевания. Поэтому важно оценить эффективность противораковой терапии в соответствующих моделях in vivo , которые действительно повторяют ключевые молекулярные особенности метастазирования рака у человека. Мы создали ортотопическую модель, основанную на инъекции раковых клеток, полученных от пациентов с КРР, непосредственно в стенку слепой кишки мышей. Эти опухолевые клетки развивают первичные опухоли в слепой кишке, которые метастазируют в печень и легкие, что часто наблюдается у пациентов с прогрессирующим КРР. Эта мышиная модель КРР может быть использована для оценки реакции на лекарственные препараты, контролируемые с помощью микрокомпьютерной томографии (мкКТ), клинически значимого метода мелкомасштабной визуализации, который может легко идентифицировать первичные опухоли или метастазы у пациентов. В этой статье мы опишем хирургическую процедуру и необходимую методологию для имплантации раковых клеток, полученных от пациентов, в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом.
Introduction
Колоректальный рак (КРР) является второй по значимости причиной смерти отрака во всем мире1. Способность генерировать модели опухолей in vitro или in vivo, полученные из отдельных опухолевых клеток пациента, позволила продвинуть прецизионную медицину в онкологии. За последнее десятилетие органоиды, полученные от пациентов (PDO) или ксенотрансплантаты (PDX), использовались многими исследовательскими группами по всему миру2. ЗОП представляют собой многоклеточные структуры in vitro, которые напоминают особенности исходной опухолевой ткани и могут самоорганизовываться и самообновляться3. Эти многообещающие модели in vitro могут быть успешно использованы для скрининга лекарственных препаратов и содействия трансляционным исследованиям. С другой стороны, модели PDX точно повторяют исходный CRC на всех соответствующих уровнях, от гистологии до молекулярных признаков и реакции на лекарственное средство 2,4.
In vivo Модели PDX в основном выращиваются в виде подкожных опухолей у мышей с иммунодефицитом. Используя этот подход, PDX стали золотым стандартом в исследованиях рака, особенно для изучения чувствительности или резистентности к лекарственным препаратам. Тем не менее, смертельные случаи, связанные с КРР, в основном связаны с наличием метастатических поражений в печени, легких или брюшной полости, и ни один из двух подходов (PDO или PDX) не может повторить продвинутую клиническую ситуацию. Кроме того, было показано, что конкретный очаг роста опухоли определяет важные биологические характеристики, влияющие на эффективность препарата и прогноз заболевания2. В связи с этим существует острая необходимость в создании доклинических моделей, которые могут быть использованы для оценки эффективности противоопухолевых препаратов в клинически значимых метастатических условиях6.
Сканеры микрокомпьютерной томографии (мкКТ) могут функционировать как уменьшенные клинические компьютерные томографы, обеспечивая первичную визуализацию опухолей и метастазов у мышей с масштабированным разрешением изображения, пропорциональным разрешению КТ онкологических больных7. Для противодействия плохому контрастированию мягких тканей при методе μКТ можно использовать рентгенологические йодсодержащие контрастные вещества для улучшения контраста и оценки опухолевой нагрузки. Используя метод двойного контрастирования, йод вводится перорально и внутрибрюшинно в разное время. Контрастное вещество, вводимое перорально, помогает определить границы между опухолевой тканью и содержимым слепой кишки внутри кишечника. С другой стороны, контрастное вещество, вводимое внутрибрюшинно, позволяет определить внешние границы опухолевой массы, которая часто растет и прорастает в брюшину8.
В статье описан протокол выполнения ортотопической имплантации раковых клеток пациента в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом, а также методика мониторинга роста опухоли кишечника с помощью μКТ-сканирования. В настоящей статье показано, что модель повторяет клинический сценарий распространенных опухолей кишечника и метастатических заболеваний у пациентов с КРР, которые не могут быть изучены с помощью моделей PDO или PDXO. Поскольку ортотопические PDX-модели КРР повторяют клинический сценарий пациентов с КРР, мы пришли к выводу, что они являются лучшими на сегодняшний день для тестирования эффективности противоопухолевых препаратов при распространенных опухолях кишечника и метастатических заболеваниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
От всех пациентов было получено письменное информированное согласие. Проект был одобрен Комитетом по этике исследований Университетской больницы Валь д'Эброн, Барселона, Испания (идентификатор одобрения: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Образцы тканей толстой кишки человека состояли из биоптатов из некротических участков первичных аденокарцином или метастазов в печени, соответствующих пациентам с раком толстой и прямой кишки, перенесшим резекцию опухоли. Эксперименты проводились в соответствии с директивой Европейского Союза по уходу за животными (86/609/EEC) и были одобрены Этическим комитетом по экспериментам на животных VHIR - Научно-исследовательского института Валь д'Эброн (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA и 12/18 CEEA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Самка NOD-SCID (NOD. Мыши CB17-Prkdcscid/NcrCrl) в возрасте 8 недель были приобретены в Charles River Laboratories.
1. Получение клеток пациента
- Удаление опухоли
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура проводится в биологическом шкафу при комнатной температуре (RT) в животноводческом помещении.- Получение образцов опухолей из операций или биопсии пациентов, а также из PDX, растущих подкожно у мышей.
- Для ортотопической инъекции готовят опухолевые клетки из установленных подкожных моделей опухолей PDX вместо ткани, полученной непосредственно от пациентов9.
- Генерация опухолей PDX путем посева суспензии из 1 x 10,5 опухолевых клеток в фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) (50 мкл) в смеси с матриксом Matrigel (50 мкл) подкожно в боку мышей NOD-SCID2.
- Измеряйте рост опухоли с помощью штангенциркуля через день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что наша лаборатория создала биобанк из более чем 350 моделей PDX. Модели опухолей CRC-PDX, используемые в протоколе, представляют собой установленные в лаборатории PDX-модели, которые были амплифицированы более трех пассажей у мышей и прошли критерии включения/исключения с положительным результатом (табл. 1).
- Измеряйте рост опухоли с помощью штангенциркуля через день.
- Усыпляют мышей путем вывиха шейки матки, когда подкожные опухоли достигают максимального размера, установленного CEEA (1 см в диаметре), или когда животные достигают критериев конечной точки.
- Извлеките опухоль и осторожно удалите ее с кожи и окружающих неопухолевых тканей с помощью ножниц и щипцов.
- Собранные опухоли хранят в PBS при температуре 4 °C до следующего этапа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциировать опухоли в клеточной суспензии как можно скорее после удаления с их первоначального места в поражениях пациентов или подкожных ксенотрансплантатах у мышей. Жизнеспособность клеток значительно снижается через 24 ч после удаления ткани, что приводит к неэффективной имплантации у мышей-реципиентов.
- Подготовка клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура проводится в биологическом кабинете при комнатной температуре (RT) в помещении для культивирования тканей.- Диссоциируют опухоли с помощью лезвия в 10-сантиметровой культуральной пробирке с 1 мл полной среды CoCSCM 6Ab (табл. 2) (для облегчения измельчения). Поместите однородный диссоциированный образец в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Добавьте полную среду CoCSCM 6Ab до конечного объема 5 мл (используйте не более 3 мл диссоциированного образца в той же пробирке).
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичный КРР, резецированный у пациентов, естественным образом заражен бактериями и грибком. Необходимо удалить патогены, присутствующие в исходном образце пациента, с помощью коктейля из шести антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, фунгизон, канамицин, гентамицин и нистатин). Введение опухолевых клеток, зараженных бактериями, мышам с иммунодефицитом может привести к гибели животного. - Инкубируют с 50 мкл ДНКазы I (0,08 кЕд/мл) и 50 мкл коллагеназы (1,5 мг/мл) (среда для разложения; Таблица 2) в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе клеточных культур при 45°. Хорошо перемешивайте раствор каждые 15 минут пипеткой объемом 5 мл перед инкубацией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциируйте опухолевую ткань и переварите ее, пипетируя несколько раз, чтобы получить одноклеточный раствор. Это необходимо для подсчета клеток перед инъекцией мышам-реципиентам и, следовательно, для достижения гомогенной имплантации опухолевых клеток. - Добавьте 5 мл полной среды CoCSCM 6Ab и хорошо перемешайте пипеткой объемом 5 мл.
- Отсортируйте раствор с помощью ситечка для клеток 100 мкм, используя новую стерильную пробирку объемом 50 мл.
- Отжмите отсортированные клетки при 500 x g в течение 8 мин при RT.
- Аспирировать надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте гранулу в 3 мл буферного раствора для лизиса 1x эритроцитов.
- Инкубировать в течение 10 мин при RT.
- Добавьте 3 мл полной среды CoCSCM 6Ab, пипетку для образца и отжим при 500 x g в течение 10 мин при RT. Отсасывайте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте гранулу с 5-10 мл полной среды CoCSCM 6Ab и используйте счетчик клеток для расчета общего количества клеток.
- Вращайте клетки при 500 x g в течение 10 мин при RT и ресуспендируйте в 10 мл PBS.
- Ресуспендируйте гранулу до получения концентрации 20 x 106 клеток/мл и хорошо перемешайте до получения однородной клеточной суспензии.
- Подготовьте шприцы по 29 г (игла 0,5 мл U 100, 0,33 мм [29 г] x 12,7 мм) для инъекции слепой кишки в культуру тканей (один шприц/мышь). Загрузите в шприц 50 мкл суспензии опухолевых клеток (1 x 10,6 клеток/инъекция) и держите его на льду. Следите за тем, чтобы пузырьки воздуха были удалены из клеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление пузырьков воздуха при загрузке опухолевых клеток в шприц необходимо для того, чтобы избежать введения чрезмерного объема в стенку слепой кишки, что может привести к разрыву ткани и потере образца. Крайне важно хорошо перемешать клеточную суспензию при загрузке шприца, чтобы избежать неравномерного размера опухоли у мышей в одном и том же эксперименте.
2. Ортотопическая инъекция в слепую кишку
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется на скамейке в специальной комнате, свободной от патогенов (SPF) на животноводческом объекте. Используемое оборудование предварительно очищается и стерилизуется. Кроме того, он снова стерилизуется в переносном стерилизаторе между отдельными лицами или зонами в животноводческом помещении.
- Очистите место операции, распылив дезинфицирующее моющее средство и протерев.
- Депилируйте живот мыши с помощью аппарата для удаления волос мышей.
- Поместите мышь в положение лежа на спине. Используйте 2% изофлуран для обезболивания животного. Подтвердите эффект анестезии, аккуратно ущипнув конечность и наблюдая за отсутствием стимуляции.
- Капните 50-100 мкл ветеринарной мази (3 мг/г Lacryvisc) в глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Продезинфицируйте брюшко мыши, протерев хлоргексидином или повидон-йодом несколько раз круговыми движениями.
- Сделайте продольный разрез 1 см над нижней частью живота с помощью хирургических ножниц. Осторожно отделите кожу от каждого участка, чтобы представить брюшину, которая находится под кожей.
- Сделайте разрез 0,5-1 см в мембране брюшины, достаточно большой, чтобы экстериоризировать слепую кишку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экстериоризация слепой кишки без чрезмерных манипуляций с внутренними органами, что может резко увеличить летальность процедуры. - Осторожно изолируйте слепую кишку от мыши с помощью предварительно вырезанной стерильной марли.
- Смачивайте слепую кишку солевым раствором на протяжении всей процедуры.
- Иммобилизуйте слепую кишку, осторожно захватив ее щипцами, и введите иглу поверхностно в стенку слепой кишки. Избегайте капилляров и сосудов в месте инъекции. Удалите пузырьки из клеточной суспензии.
- Медленно вводят все 50 мкл суспензии опухолевых клеток. Обычно введение занимает около 10 секунд. Избегайте перфорации просвета слепой кишки иглой, так как это приводит к выведению суспензии опухолевых клеток из организма через перистальтику кишечника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Введение суспензии опухолевых клеток в слепую кишку мышей является самым сложным этапом всей процедуры. В этой части протокола следует использовать яркий свет, сфокусированный на месте инъекции, и увеличительную лупу. Вводят иглу параллельно поверхности слепой кишки. Слепая кишка – очень хрупкая ткань; Поэтому иммобилизацию слепой кишки следует проводить с помощью хирургических щипцов и с легким надавливанием, чтобы избежать разрыва тканей, приводящего к кровоизлиянию. В результате успешной имплантации в стенке слепой кишки образуется белый пузырь (гранула клеток). Если пузырь не может быть визуализирован, это может указывать на то, что слепая кишка была перфорирована, и клетки закончились в просвете слепой кишки, что привело к их очищению кишечным трактом. - После инъекции медленно извлеките иглу из слепой кишки и слегка надавите на место инъекции аппликатором с ватным наконечником, чтобы избежать выхода опухолевых клеток и уменьшить небольшое кровотечение.
- Очистите слепую кишку солевым раствором, чтобы удалить мусор.
- Верните слепую кишку обратно в брюшную полость животного.
- Закройте брюшину швами 5/0.
- Закройте кожу живота швами 5/0.
- Назначают послеоперационные антибиотики (100 мг/кг амоксициллина или 20 мг/кг энрофлоксацина) и анальгетики (5 мг/мл метакам/мелоксикам) путем подкожной инъекции. Положите мышей на грелку и держите их там до полного выздоровления. Затем верните их в клетку с другими животными.
3. Оценка ортотопического роста опухоли с помощью μКТ-сканирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется на платформе доклинической визуализации (PIP) в животноводческом комплексе.
- Выполняйте все процедуры с животными в соответствии с правилами этического комитета.
- Начинайте контролировать объем опухоли с помощью μCT через 2 недели после введения клеток, а затем каждую неделю.
- Свежеразвести контрастное вещество иопамиро (300 мг/мл) в физиологическом растворе в соотношении 3:1 для обеих доз. Ввести 300 мл иопамиро через пероральный зонд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за плохого контраста мягких тканей микроКТ рекомендуется контрастное вещество для повышения чувствительности методики. Протокол включает пероральное введение йодсодержащего препарата (иопамиро) для определения внутрипросветной опухолевой нагрузки и вторичное внутрибрюшинное введение того же препарата для определения опухолевой нагрузки в висцеральной части кишечника. Ранее были проведены пилотные эксперименты по определению точного времени, за которое контрастное вещество должно прибыть в слепую кишку мышей до его элиминации. В случае иопамиро это около 2 ч. - Через 2 ч вводят внутрибрюшинную инъекцию 300 мл предварительно разведенного иопамиро. Введение помогает определить границы опухоли в теменной области лица.
- Обезболивайте животных, используя 2% изофлуран.
- Убедившись, что животное правильно обезболино, зажав лапку мыши, поместите животное в сканирующую кровать μCT. Лучшее положение – лежа на спине (лицом вверх).
- В управляющем программном обеспечении запустите режим реального времени (режим рентгеноскопии), чтобы поместить область живота в поле зрения (FOV) сканера. Для этого перемещайте кровать вперед, назад и вбок, пока не будет достигнуто желаемое положение. Поверните рентгеновскую трубку и детектор на 90° и переместите сканирующий стол по оси Y, чтобы полностью центрировать животное.
- Используйте следующие параметры для изображений микроКТ-сканирования: угол обзора 30 мм, время сбора 26 с, напряжение тока 90 кВ и сила тока 200 мкА при использовании системы визуализации FX μCT.
- Верните животных в клетки для восстановления после завершения сканирования. Обеспечьте тепловую поддержку и наблюдайте за животными до тех пор, пока они не оправятся от анестезии, прежде чем вернуться в жилье.
- При съемке микроКТ для каждого сканирования получается файл размером 250 Мб. Созданные файлы данных имеют формат VOX. Для того, чтобы сделать их доступными для любого программного обеспечения для анализа изображений, преобразуйте файлы в формат DICOM с помощью программного обеспечения для управления базами данных μCT. Сохраните пакет созданных файлов на портативном жестком диске, чтобы проанализировать их с помощью любого компьютера с доступным программным обеспечением для работы с изображениями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время анализа изображений слепая кишка локализуется как расширенная кишка с радиоплотным содержимым (иопамиро), часто в левой части хвостовой части живота. При висцеральном изгибе слепой кишки наблюдается утолщение стенки, по сравнению с прилегающими отделами кишечника. Утолщение соответствует росту опухоли. - После того, как опухоль локализована, найдите наибольший диаметр в различных проекциях (аксиальной, корональной и сагиттальной). Измерьте эти три оси и рассчитайте объем опухоли по формуле эллипсоида: объем = 4/3π x (x-полуось x y-полуось x z-полуось)10.
4. Терапевтическое вмешательство у мышей с ортотопическими опухолями
- Еженедельно наблюдайте за мышами с ортотопическими опухолями.
- Когда у большинства мышей обнаружен сигнал μКТ-сканирования опухоли, проведите еще одно μКТ-сканирование на следующей неделе, чтобы подтвердить наличие опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время начала лечения зависит от используемой модели PDX и варьируется от 3 до 12 недель после инокуляции опухолевых клеток в слепую кишку. - Рандомизируйте мышей в четыре группы: группа транспортных средств (n = 10-15 мышей), группа тестирования лекарств (n = 10-15 мышей), группа стандартной химиотерапии (n = 10-15 мышей) и группа комбинированного лечения (n = 10-15 мышей).
- Обработать мышей внутрибрюшинно физиологическим раствором (транспортная группа), испытуемым препаратом (20 мг/кг) (испытуемая группа), иринотеканом (50 мг/кг) (стандартная группа лечения) или испытуемым препаратом (20 мг/кг) с иринотеканом (50 мг/кг) (комбинированная группа лечения). Выполняйте введение один раз в неделю до окончания эксперимента.
- Еженедельно контролируйте рост опухоли с помощью μКТ-сканирования на протяжении всего эксперимента.
- В конце эксперимента усыпите мышей путем вывиха шейки матки и соберите печень, легкие и любые другие возможные поражения в других органах.
- Поместите образцы тканей в кассеты и инкубируйте их в 4% формалине в течение ночи. В качестве контроля используют ткань кишечника мыши без опухоли в слепой кишке.
- Извлеките кассеты из формалина и инкубируйте с 70%-ным этиловым спиртом не менее 3 ч.
- Встраивают кассеты с парафином, используя стандартные протоколы гистопатологического аппарата.
- Выполняйте окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) слепой кишки, печени и легких, используя стандартные протоколы гистопатологического учреждения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышей, которым ортотопически имплантировали раковые клетки пациента, еженедельно проводили мониторинг с помощью μКТ-сканирования. По окончании эксперимента животных усыпили. Кишечник, слепую кишку (рис. 1А, Б), печень, легкие и любые другие возможные поражения собирали, помещали в кассету и фиксировали 4% формалином на ночь. В качестве контроля использовали ткань кишечника мыши без опухоли в слепой кишке (рис. 1С). Наконец, кассеты меняли на 70% этанол не менее чем на 3 ч и вставляли парафин. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) из слепой кишки, печени и легких проводили с использованием стандартных протоколов гистопатологического оборудования для идентификации опухолевых клеток (рис. 2, рис. 3 и рис. 4).
В другом эксперименте мыши с ортотопическими опухолями находились под наблюдением еженедельно. Когда у большинства мышей был обнаружен сигнал μКТ-сканирования опухоли (около 2-4 недель, в зависимости от модели PDX), животных рандомизировали в четыре группы и лечили либо носителем, тестируемым препаратом (20 мг/кг), стандартным химиотерапевтическим препаратом иринотеканом (50 мг/кг), либо тестируемым препаратом иринотеканом. Препараты вводили внутрибрюшинно один раз в неделю до конца эксперимента. Рост опухоли контролировался еженедельно с помощью μКТ-сканирования на протяжении всего эксперимента. Результаты показали, что тестируемый препарат индуцировал уменьшение объема опухоли, рассчитанное по изображениям μКТ, и это усилилось в сочетании с лечением иринотеканом (рис. 5 и рис. 6).
Предыдущие исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали, что метастатический потенциал (канциноматоз, метастазирование в легкие и печень) ортотопических моделей CRC-PDX зависит от используемой модели PDX (табл. 3)2. В настоящем исследовании также оценивалась терапевтическая эффективность при образовании метастазов. Результаты показали, что тестируемый препарат иринотекан и его комбинация устраняли образование метастазов в легких и печени у мышей, получавших лечение (Таблица 4)11.
Рисунок 1: Макроскопические изображения кишечника мышей с ортотопическими опухолями CRC-PDX. Макроскопические изображения кишечника двух мышей с ортотопической опухолью PDX (A,B) в конце эксперимента. Опухоли слепой кишки на снимках обозначены красным цветом. (C) Снимок кишечника мыши без опухоли в слепой кишке в качестве контроля. Масштабные линейки = 5 мм (A,B); 1 см (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Гистологические изображения ортотопических опухолей CRC-PDX. Окрашивание H&E модели опухоли PDX в слепой кишке в конце эксперимента при малом (А) и большом (А) увеличении. Опухоли слепой кишки на снимках обозначены красным цветом. Масштабные линейки = 2,5 мм (А); 100 мм (а). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Гистологические изображения метастазов в легких, полученные при ортотопическом окрашивании опухоли CRC-PDX H&E легких мыши с ортотопической опухолью PDX. Метастазы в легких могут наблюдаться при низком (А) и большом (А) увеличении. Метастазы в легких на снимках обозначены красным цветом. Масштабные линейки = 250 мм (А); 100 мм (а). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистологические изображения метастазов в печени, полученные из ортотопических опухолей CRC-PDX. Окрашивание печени мыши с ортотопической опухолью PDX. Метастазы в печени могут наблюдаться при низком (А) и высоком (А) увеличении. Метастазы в печени на снимках обозначены красным цветом. На изображениях обозначены масштабные линейки. Масштабные линейки = 500 мм (А); 50 мм (а). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Терапевтическая эффективность тестируемого препарата в ортотопической модели CRC-PDX. Пример эксперимента с четырьмя группами (транспортное средство, тестируемый препарат, иринотекан и тестируемый препарат с иринотеканом)11. Объем опухоли, полученный с помощью изображений μКТ, представлен во времени (А) и в конце эксперимента (42-й день) (Б). Бары, ± SE (n = 15-30) и *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 по сравнению с транспортным средством (t-критерий, двусторонний). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Изображения мкКТ мышей с ортотопическими опухолями CRC-PDX, находящихся на лечении. Репрезентативные микроКТ-изображения мышей с ортотопическими опухолями, обработанных терапевтическим препаратом. На снимках видны слепая кишка (красный) и опухолевое образование (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Установление подкожной ПДХ. Пример трех PDX-моделей, созданных в лаборатории (P1, P2 и P3) из нашего биобанка2 из более чем 350 моделей PDX с количеством инокулированных клеток, частотой возникновения PDX и пассажами у мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Реагенты для приготовления факторов роста (GF) MIX 10X, CoCSCM 6Ab без EGF, FGF2 и факторов роста, полноценной среды CoCSCM 6Ab и среды для сбраживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 3: Метастатический потенциал ортотопических моделей CRC-PDX. Пример трех ортотопических моделей CRC-PDX, созданных в лаборатории (P1, P2 и P3) из нашего биобанка2. Здесь указывается количество инокулируемых клеток, частота образования опухолей слепой кишки, а также частота возникновения канциноматоза, метастазирования в легких или печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 4: Терапевтическая метастатическая эффективность тестируемого препарата в ортотопической модели CRC-PDX. Пример эксперимента с четырьмя группами (транспортное средство, тестируемый препарат, иринотекан и тестируемый препарат с иринотеканом)11. Здесь указывается количество мышей в каждой группе и у кого из них развился канциноматоз, метастазы в легкие или печень в конце эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
За последние несколько десятилетий было разработано и опробовано множество новых противоопухолевых методов лечения у пациентов с различными типами опухолей, включая колоректальный рак (КРР). Несмотря на то, что во многих случаях наблюдались многообещающие результаты на доклинических моделях, терапевтическая эффективность у пациентов с распространенным метастатическим КРР часто была ограничена. Поэтому существует острая необходимость в доклинических моделях, позволяющих тестировать эффективность новых терапевтических препаратов в клинически значимом метастатическом сценарии.
В статье подробно описана усовершенствованная ортотопическая PDX-модель КРР, основанная на имплантации опухолевых клеток пациента в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом12.
Методика отнимает много времени и требует концентрации. В среднем, инъекция в эксперимент с 30 мышами может занять в общей сложности около 11 часов, в том числе: 1) забор опухоли PDX (1 ч); обработка опухоли (4 ч); и имплантация слепой кишки (6 ч). Процедура должна проводиться в стерильных условиях, сводя к минимуму время на обработку опухоли и инъекцию, при этом очень осторожно манипулируя внутренними органами, чтобы избежать смертности, связанной с хирургическим вмешательством. Поэтому настоятельно рекомендуется провести несколько пилотных экспериментов с опухолевыми клеточными линиями или клетками PDX, чтобы обучить исследователей и ознакомить их с процедурой. Кроме того, в процедуре должны быть задействованы два исследователя: один для сбора и обработки опухоли, а также для помощи с наложением швов животным, а другой для проведения самой операции.
Также важно учитывать, что опухоли слепой кишки могут прорастать в просвет кишечника или внутри слепой кишки, в зависимости от модели PDX и конкретного места инъекции. Исход роста опухоли трудно контролировать, и он может значительно повлиять на выживаемость мышей, что приводит к уменьшению размеров опухолей и тяжелой кишечной непроходимости, когда опухоли растут внутри просвета. Поэтому мыши должны находиться под наблюдением еженедельно, начиная с недели после имплантации клеток. После того, как большинство мышей представят сигнал опухоли с помощью μКТ-сканирования, животные без сигнала должны быть исключены, а остальные рандомизированы в экспериментальные группы на основе объема опухоли. Для получения статистически значимых результатов в каждую опытную группу следует включать 12-15 мышей.
Мониторинг мышей с опухолью имеет важное значение для определения эффективности новых терапевтических агентов в клинически значимых ортотопических моделях. Микрокомпьютерная томография позволяет идентифицировать и количественно оценить объем первичной опухоли у мышей. Использование двойного контраста значительно повышает чувствительность метода μКТ, улучшая качество изображений8. Рост опухолевых клеток в слепой кишке может привести к внутрипросветным опухолям, если они растут по направлению к просвету кишечника, или внепросветным опухолям, если они растут из просвета кишечника. Оба сценария наблюдались в предыдущей методологии и зависят от используемой модели PDX и места внедрения. Мыши полностью выздоровели после сканирования, без каких-либо клинических признаков повреждения почек или других случаев. Результаты показывают, что микроКТ-визуализация может быть полезным инструментом для мониторинга развития и продольного роста КРР.
Ортотопические модели точно повторяют клинический КРР12 и очень полезны для проверки влияния новых терапевтических препаратов на рост первичной опухоли и метастазы в печени и легких 2,11. Тем не менее, подробного письменного протокола может быть недостаточно для новой исследовательской группы для создания таких сложных моделей. В связи с этим, настоящее видео призвано помочь исследовательским группам внедрить эту процедуру в свои исследования. Показана процедура имплантации клеток в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом и методика мониторинга роста опухоли кишечника с помощью μКТ-сканирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
Выражаем признательность за поддержку Фонду Cellex, сети CIBERONC и Instituto de Salud Carlos III. Кроме того, мы также благодарим платформу доклинической визуализации в Научно-исследовательском институте Валь д'Эброн (VHIR), где проводились эксперименты.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B.
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
