Summary
该方案描述了在免疫缺陷小鼠盲肠壁中将患者来源的癌细胞原位植入。该模型概括了晚期结直肠癌转移性疾病，并允许在肺和肝转移的临床相关情况下评估新的治疗药物。
Abstract
在过去的十年中，已经使用患者来源的癌细胞和 3D 类肿瘤建立了更复杂的临床前结直肠癌 （CRC） 模型。由于患者来源的肿瘤类器官可以保留原始肿瘤的特征，因此这些可靠的临床前模型能够进行癌症药物筛选和耐药机制研究。然而，患者中与结直肠癌相关的死亡主要与转移性疾病的存在有关。因此，在相关 体内 模型中评估抗癌疗法的疗效至关重要，这些模型真正概括了人类癌症转移的关键分子特征。我们建立了一个基于将CRC患者来源的癌细胞直接注射到小鼠盲肠壁中的原位模型。这些肿瘤细胞在盲肠中形成原发性肿瘤，并转移到肝脏和肺部，这在晚期结直肠癌患者中很常见。该CRC小鼠模型可用于评估显微计算机断层扫描（μCT）监测的药物反应，这是一种临床相关的小规模成像方法，可以轻松识别患者的原发性肿瘤或转移。在这里，我们描述了将患者来源的癌细胞植入免疫缺陷小鼠盲肠壁的外科手术和所需方法。
Introduction
结直肠癌 （CRC） 是全球癌症死亡的第二大原因1.从个体患者肿瘤细胞中生成体外或体内肿瘤模型的能力推动了肿瘤学的精准医学发展。在过去的十年中，患者来源的类器官 （PDO） 或异种移植物 （PDX） 已被世界各地的许多研究小组使用2。PDO是多细胞体外结构，类似于原始肿瘤组织的特征，可以自组织和自我更新3。这些有前途的体外模型可以成功地用于药物筛选和促进转化研究。另一方面，PDX 模型忠实地概括了所有相关水平的原始 CRC，从组织学到分子性状和药物反应 2,4。
体内研究 PDX模型主要在免疫缺陷小鼠中作为皮下肿瘤生长。使用这种方法，PDX已成为癌症研究的金标准，特别是用于研究药物敏感性或耐药性。然而，结直肠癌相关死亡主要与肝脏、肺或腹膜腔中存在转移性病变有关，两种方法（PDO或PDX）都不能概括晚期临床情况。此外，肿瘤生长的特定部位已被证明可以确定对药物疗效和疾病预后有影响的重要生物学特征2.因此，迫切需要建立临床前模型，用于评估抗癌药物在临床相关转移环境中的疗效6。
显微计算机断层扫描 （μCT） 扫描仪可以用作缩小的临床 CT 扫描仪，以与癌症患者 CT 图像成正比的缩放图像分辨率提供小鼠的原发肿瘤和转移成像7.为了抵消μCT技术的软组织对比度差，可以使用放射性碘造影剂来改善造影剂和评估肿瘤负荷。使用双重造影剂方法，在不同的时间口服和腹膜内给药碘。口服造影剂有助于确定肿瘤组织和肠内盲肠含量之间的界限。 另一方面，腹膜内给药的造影剂可以识别肿瘤肿块的外部限制，肿瘤肿块经常生长并侵入腹膜8。
该手稿描述了在免疫缺陷小鼠盲肠壁中进行患者来源的癌细胞原位植入的方案，以及使用μCT扫描监测肠道肿瘤生长的方法。本手稿表明，该模型概括了 CRC 患者晚期肠道肿瘤和转移性疾病的临床情况，这些情况无法使用 PDO 或 PDXO 模型进行研究。由于CRC的原位PDX模型概括了CRC患者的临床情况，因此我们得出结论，它们是迄今为止测试抗肿瘤药物在晚期肠道肿瘤和转移性疾病中的疗效的最佳模型。
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Protocol
获得所有患者的书面知情同意书。该项目已获得西班牙巴塞罗那Vall d'Hebron大学医院研究伦理委员会的批准（批准编号：PR（IR）79/2009 PR（AG）114/2014，PR（AG）18/2018）。人类结肠组织样本包括来自原发性腺癌或肝转移的非坏死区域的活检，对应于接受肿瘤切除的结肠癌和直肠癌患者。实验按照欧盟的动物护理指令（86/609/EEC）进行，并得到了VHIR-Vall d'Hebron研究所动物实验伦理委员会的批准（ID：40/08 CEEA，47/08/10 CEEA和12/18 CEEA）。
注：女性 NOD-SCID （NOD.从Charles River Laboratories购买来自8周龄的CB17-Prkdcscid / NcrCrl）小鼠。
1. 患者细胞的衍生
- 肿瘤提取
注意：以下程序在动物设施的室温（RT）生物柜中进行。- 从患者的手术或活检以及小鼠皮下生长的PDX中获取肿瘤样本。
- 对于原位注射，从已建立的皮下PDX肿瘤模型制备肿瘤细胞，而不是直接从患者9获得的组织。
- 通过将 1 x 105 个肿瘤细胞的悬浮液接种在与基质胶基质 （50 μL） 混合的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （50 μL） 中皮下注射在 NOD-SCID 小鼠2 的侧腹中产生 PDX 肿瘤。
- 每隔一天使用卡尺测量肿瘤生长。
注：重要的是，我们的实验室已经生成了一个包含350多个PDX模型的生物库。方案中使用的CRC-PDX肿瘤模型是在实验室中建立的PDX模型，已在小鼠中扩增超过三次，并通过了纳入/排除标准，结果为阳性（表1）。
- 每隔一天使用卡尺测量肿瘤生长。
- 当皮下肿瘤达到CEEA规定的最大尺寸（直径1cm）或当动物达到终点标准时，通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
- 取出肿瘤，然后用剪刀和镊子小心地将其从皮肤和周围的非肿瘤组织中取出。
- 将收获的肿瘤储存在4°C的PBS中，直至下一步。
注意：在小鼠皮下异种移植物中从患者病变或皮下异种移植物的原始位置移除后，尽快将肿瘤解离在细胞悬液中。组织切除后24小时细胞活力显着降低，导致受体小鼠植入效率低下。
- 细胞制备
注意：以下程序在组织培养室的室温（RT）生物柜中进行。- 在10cm培养板中使用刀片和1mL完全CoCSCM 6Ab培养基（表2）解离肿瘤（使切碎更容易）。将均匀的解离样品放入 15 mL 锥形管中。
- 加入完全 CoCSCM 6Ab 培养基至最终体积为 5 mL（在同一管中使用不超过 3 mL 的解离样品）。
注意：从患者身上切除的原发性结直肠癌自然被细菌和真菌污染。必须使用六种抗生素（青霉素、链霉素、真菌酮、卡那霉素、庆大霉素和制霉菌素）的混合物去除原始患者样本中存在的病原体。在免疫缺陷小鼠中注射被细菌污染的肿瘤细胞可能导致动物死亡。 - 用 50 μL DNase I （0.08 kU/mL） 和 50 μL 胶原酶 （1.5 mg/mL）（消化培养基; 表2）在37°C的细胞培养箱中，在45°位置放置1小时。孵育前每 15 分钟用 5 mL 移液管充分混合溶液。
注意：解离肿瘤组织并通过移液数次消化以获得单细胞溶液。这对于在注射受体小鼠之前对细胞进行计数至关重要，从而实现肿瘤细胞的均匀植入。 - 加入 5 mL 完全 CoCSCM 6Ab 培养基，并用 5 mL 移液管充分混合。
- 使用新的无菌 50 mL 管，用 100 μm 细胞过滤器对溶液进行分选。
- 在室温下以500× g 旋转分选的细胞8分钟。
- 吸出上清液。
- 将沉淀重悬于 3 mL 的 1x RBC 裂解缓冲液中。
- 在室温下孵育 10 分钟。
- 加入 3 mL 完全 CoCSCM 6Ab 培养基，移液样品，并在室温下以 500 x g 旋转 10 分钟。 吸出上清液。
- 用 5-10 mL 完全 CoCSCM 6Ab 培养基重悬沉淀，并使用细胞计数器计算细胞总数。
- 在室温下以 500 x g 离心细胞 10 分钟，并重悬于 10 mL PBS 中。
- 重悬沉淀以获得浓度为 20 x 106 个细胞/mL 的浓度，并充分混合以获得均匀的细胞悬液。
- 准备 29 G 注射器（0.5 mL U 100 针头，0.33 mm [29 G] x 12.7 mm）用于组织培养物中的盲肠注射（一个注射器/小鼠）。将 50 μL 肿瘤细胞悬液（1 x 106 个细胞/注射）加载到注射器中并将其保持在冰上。确保从细胞悬液中去除气泡。
注意：当肿瘤细胞加载到注射器中时，消除气泡对于避免盲肠壁注射过多的体积至关重要，这可能导致组织破裂和样品丢失。加载注射器时必须充分混合细胞悬液，以避免在同一实验中小鼠之间的肿瘤大小不均匀。
2.盲肠原位注射
注意：以下程序在动物设施的特定无病原体 （SPF） 室的长凳上进行。所使用的设备事先经过清洁和消毒。此外，在动物设施中个体或区域之间的便携式灭菌器中再次对其进行灭菌。
- 通过喷洒消毒清洁剂并擦拭来清洁手术部位。
- 使用小鼠脱毛机去除小鼠腹部。
- 将鼠标置于仰卧位。使用2%异氟醚麻醉动物。通过轻轻捏住肢体并观察没有刺激来确认麻醉效果。
- 将 50-100 μL 兽药膏 （3 mg/g Lacryvisc） 滴入眼睛，以防止麻醉期间干燥。
- 用氯己定或聚维酮碘以圆周运动擦洗数次，对小鼠腹部进行消毒。
- 使用手术剪刀在下腹部做一个 1 厘米的纵向切口。小心地将皮肤分离到每个部位，以呈现皮肤下的腹膜。
- 在腹膜上做一个 0.5-1 厘米的切口，大到足以使盲肠外部化。
注意：在不过度操纵内脏器官的情况下将盲肠外化，这可能会显着增加手术的致死率。 - 使用预先切割的无菌纱布小心地将盲肠与小鼠分离。
- 在整个过程中用生理盐水润湿盲肠。
- 用镊子小心地抓住盲肠，固定盲肠，并将针头浅表插入盲肠壁。避免注射部位的毛细血管和血管。从细胞悬液中去除气泡。
- 缓慢注射整个50μL肿瘤细胞悬液。通常需要大约 10 秒才能完成。避免用针头穿孔盲肠腔，因为这会导致通过肠道蠕动从体内消除肿瘤细胞悬浮液。
注意：将肿瘤细胞悬浮液注射到小鼠的盲肠中是整个过程中最具挑战性的步骤。在协议的这一部分，应使用聚焦在注射部位的强光和放大镜。将针头平行于盲肠表面。盲肠是一种非常脆弱的组织;因此，盲肠的固定应使用手术钳进行，并轻轻按压，以避免组织破裂导致出血。成功植入会导致盲肠壁出现白色气泡（细胞颗粒）。如果气泡无法看到，则可能表明盲肠已穿孔，细胞已在盲肠腔内终止，导致它们被肠道清除。 - 注射后，将针头从盲肠中慢慢取出，并用棉签涂抹器轻轻按压注射部位，以避免肿瘤细胞逸出并减少轻微出血。
- 用生理盐水清洁盲肠以去除任何碎屑。
- 将盲肠放回动物的腹部。
- 使用 5/0 缝合线闭合腹膜。
- 使用 5/0 缝合线闭合腹部皮肤。
- 通过皮下注射给予术后抗生素（100 mg/kg 阿莫西林或 20 mg/kg 恩诺沙星）和镇痛药（5 mg/mL metacam/美洛昔康）。将小鼠放在加热垫上，并保持在那里，直到它们完全恢复。然后，将它们与其他动物一起放回笼子里。
3. 使用 μCT 扫描评估原位肿瘤生长
注意：以下程序在动物设施的临床前成像平台 （PIP） 中执行。
- 按照机构伦理委员会的规定执行所有动物程序。
- 在细胞注射后 2 周开始通过 μCT 监测肿瘤体积，此后每周一次。
- 在盐水溶液中新鲜稀释造影剂iopamiro（300mg / mL），两种剂量的比例为3：1。通过口服强饲法给予 300 mL 约帕米罗。
注意：由于μCT的软组织对比度较差，建议使用造影剂来提高该技术的灵敏度。该方案包括口服碘基药物（iopamiro）以划定腔内肿瘤负荷，以及二次腹膜内给药相同药物以确定肠道内脏面的肿瘤负荷。先前已经进行了初步实验，以确定造影剂在消除之前需要到达小鼠盲肠的确切时间。在iopamiro的情况下，大约是2小时。 - 2小时后，腹膜内注射300mL先前稀释的碘帕米罗。该给药有助于确定顶面的肿瘤极限。
- 使用2%异氟醚麻醉动物。
- 通过捏住小鼠的脚确认动物被正确麻醉后，将动物置于μCT的扫描床上。最佳姿势是仰卧（面朝上）。
- 在控制软件中，启动实时模式（透视模式），将腹部区域置于扫描仪的视野 （FOV） 中。为此，请向前、向后和横向移动床，直到达到所需位置。将X射线管和探测器旋转90°，并在y轴上移动扫描床以使动物完全居中。
- 使用 FX μCT 成像系统对 μCT 扫描图像使用以下参数：30 mm FOV、26 s 采集时间、90 kV 电流电压和 200 μA 电流安培数。
- 扫描完成后，将动物放回笼子进行恢复。提供热支持并监测动物，直到它们从麻醉中恢复过来，然后再返回饲养室。
- μCT 采集每次扫描都会产生一个 250 Mb 大小的文件。创建的数据文件具有 VOX 格式。为了使任何成像分析软件都可以访问它们，请使用μCT的数据库管理软件将文件转换为DICOM格式。 将一批创建的文件存储在便携式硬盘中，以便使用任何具有可用成像软件的计算机对其进行分析。
注意：在图像分析过程中，盲肠被定位为具有放射致密内容物（iopamiro）的扩张肠，通常位于尾腹左侧。在盲肠的内脏弯曲中，与相邻的肠道区域相比，观察到壁增厚。增厚对应于肿瘤生长。 - 一旦肿瘤定位，在不同的视图（轴向、冠状面和矢状面）中找到最大直径。测量这三个轴并按照椭球体公式计算肿瘤体积：体积 = 4/3π x（x-半轴 x y-半轴 x z-半轴）10。
4.携带原位肿瘤的小鼠的治疗干预
- 每周监测携带原位肿瘤的小鼠。
- 当在大多数小鼠中检测到肿瘤μCT扫描信号时，在接下来的一周内进行另一次μCT扫描以确认肿瘤的存在。
注意：开始治疗的时间取决于所使用的PDX模型，并且在盲肠中接种肿瘤细胞后3-12周不等。 - 将小鼠随机分为四组：载体组（n = 10-15只小鼠），测试药物组（n = 10-15只小鼠），标准护理化疗组（n = 10-15只小鼠）和联合治疗组（n = 10-15只小鼠）。
- 用生理盐水（载体组），试验药物（20mg / kg）（试验药物组），伊立替康（50mg / kg）（标准护理组）或试验药物（20mg / kg）与伊立替康（50mg / kg）（联合治疗组）腹膜内治疗小鼠。每周进行一次给药，直到实验结束。
- 在整个实验过程中，每周通过μCT扫描监测肿瘤生长。
- 在实验结束时，通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并收集肝脏，肺和其他器官中任何其他可能的病变。
- 将组织样品包含在盒中，并在4%福尔马林中孵育过夜。使用盲肠中没有肿瘤的小鼠的肠组织作为对照。
- 从福尔马林中取出盒，并与70%乙醇孵育至少3小时。
- 使用组织病理学设施标准方案，用石蜡包埋盒。
- 使用组织病理学设施标准方案对盲肠、肝脏和肺进行苏木精和伊红 （H&E） 染色。
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Representative Results
每周通过μCT扫描监测原位植入患者来源的癌细胞的小鼠。在实验结束时，动物被安乐死。收集肠、盲肠（图1A，B）、肝脏、肺和任何其他可能的病变，包括在盒中，并用4%福尔马林固定过夜。使用盲肠中没有肿瘤的小鼠的肠道组织作为对照（图1C）。最后，将盒更换为70%乙醇至少3小时并包埋石蜡。使用组织病理学设施标准方案对盲肠、肝脏和肺的苏木精和伊红 （H&E） 染色进行，以鉴定肿瘤细胞（图 2、图 3 和图 4）。
在另一项实验中，每周监测携带原位肿瘤的小鼠。当在大多数小鼠中检测到肿瘤μCT扫描信号时（约2-4周，取决于PDX模型），将动物随机分为四组，并用载体，测试药物（20mg / kg），标准护理化疗伊立替康（50mg / kg）或伊立替康测试药物治疗。药物每周腹膜内给药一次，直至实验结束。在整个实验过程中，每周通过μCT扫描监测肿瘤生长。结果表明，通过μCT扫描图像计算，测试药物诱导肿瘤体积减少，并且与伊立替康治疗联合使用时得到增强（图5 和 图6）。
我们实验室先前的研究表明，原位CRC-PDX模型的转移潜力（癌变，肺和肝转移）取决于所使用的PDX模型（表3）2。在本研究中，还评估了对转移形成的治疗效果。结果表明，试验药物伊立替康和联合用药根除治疗小鼠肺转移和肝转移的形成（表4）11。
图 1：携带原位 CRC-PDX 肿瘤的小鼠肠道的宏观图像。实验结束时来自两只携带原位PDX肿瘤（A，B）的小鼠的宏观肠道图像。盲肠肿瘤在图像中以红色定义。（C） 盲肠中没有肿瘤的小鼠的肠道图像作为对照。比例尺 = 5 mm （A，B）;1 厘米（C）。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：原位 CRC-PDX 肿瘤的组织学图像。 在实验结束时，在低 （A） 和高 （a） 放大倍率下对盲肠中的 PDX 肿瘤模型进行 H&E 染色。盲肠肿瘤在图像中以红色定义。比例尺 = 2.5 mm （A）;100 毫米（A）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：来自原位 CRC-PDX 肿瘤的肺转移的组织学图像 携带原位 PDX 肿瘤的小鼠肺部的 H&E 染色。 肺转移可以在低 （A） 和高 （a） 放大倍率下观察到。肺转移在图像中以红色定义。比例尺 = 250 mm （A）;100 毫米（A）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：源自原位 CRC-PDX 肿瘤的肝转移的组织学图像。 携带原位PDX肿瘤的小鼠肝脏的H&E染色。在低（A）和高（a）放大镜下可以观察到肝转移。肝转移在图像中以红色定义。比例尺在图像中表示。比例尺 = 500 mm （A）;50 毫米（A）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：原位 CRC-PDX 模型中测试药物的治疗效果。四组（载体、测试药物、伊立替康和伊立替康测试药物）的实验示例11。从μCT扫描图像获得的肿瘤体积随时间（A）和实验结束时（第42天）（B）表示。柱线，± SE （n = 15-30） 和 *p < 0.05，***p < 0.001，****p < 0.0001 与车辆（t 检验，双侧）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：来自正在治疗的原位 CRC-PDX 肿瘤的小鼠的 μCT 图像。 用治疗药物治疗的携带原位肿瘤的小鼠的代表性μCT图像。盲肠（红色）和肿瘤肿块（蓝色）在图像中定义。 请点击这里查看此图的较大版本.
表 1：皮下 PDX 的建立。 在实验室中从我们的生物样本库2 中建立的 350 多个 PDX 模型的三个 PDX 模型（P1、P2 和 P3）的示例，包括接种的细胞数量、PDX 建立的发生率和小鼠传代次数。 请按此下载此表格。
表 2：制备生长因子 （GF） MIX 10X、不含 EGF、FGF2 和生长因子的 CoCSCM 6Ab、CoCSCM 6Ab 完全培养基和酶解培养基的试剂。 请按此下载此表格。
表3：原位CRC-PDX模型的转移潜力。 在我们的生物样本库2 中实验室建立的三个原位 CRC-PDX 模型（P1、P2 和 P3）示例。这里指出了接种的细胞数量、盲肠肿瘤形成的发生率以及产生癌变、肺转移或肝转移的发生率。 请按此下载此表格。
表 4：原位 CRC-PDX 模型中测试药物的治疗转移功效。 四组（载体、测试药物、伊立替康和伊立替康测试药物）的实验示例11。在这里，指示每组小鼠的数量以及其中哪些小鼠在实验结束时发生癌变，肺转移或肝转移。 请按此下载此表格。
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Discussion
在过去的几十年里，许多新的抗癌疗法已经在不同肿瘤类型的患者中开发和测试，包括结直肠癌（CRC）。尽管在许多病例中已经观察到临床前模型的有希望的结果，但晚期转移性结直肠癌患者的治疗效果经常受到限制。因此，迫切需要临床前模型，以测试新治疗药物在临床相关转移情况下的疗效。
该手稿详细描述了一种先进的CRC原位PDX模型，该模型基于将患者肿瘤细胞植入免疫缺陷小鼠的盲肠壁12。
该方法耗时且需要集中注意力。平均而言，用30只小鼠注射实验总共可能需要约11小时，包括：1）PDX肿瘤收集（1小时）;肿瘤处理（4小时）;和盲肠植入（6 小时）。该手术必须在无菌条件下进行，最大限度地减少肿瘤处理和注射的时间，同时非常小心地操纵内脏器官以避免与手术相关的死亡。因此，强烈建议使用肿瘤细胞系或PDX细胞进行几次试点实验，以培训研究人员并使他们熟悉该程序。此外，必须有两名研究人员参与手术，一名负责收集和处理肿瘤，并帮助动物缝合，另一名负责进行实际手术。
同样重要的是要考虑到盲肠肿瘤可以生长到肠腔或盲肠内部，具体取决于 PDX 模型和注射的特定部位。肿瘤生长的结果难以控制，并且会极大地影响小鼠的存活，当肿瘤在管腔内生长时，会导致肿瘤变小和严重的肠梗阻。因此，必须从细胞植入后的一周开始每周监测小鼠。一旦大多数小鼠通过μCT扫描呈现肿瘤信号，应排除没有信号的动物，其余的根据肿瘤体积随机分配到实验组。为了获得具有统计学意义的结果，每个实验组应包括12-15只小鼠。
在临床相关的原位模型中，监测荷瘤小鼠对于确定新治疗药物的疗效至关重要。μCT扫描能够识别和量化小鼠的原发肿瘤体积。双重对比度的使用显着提高了 μCT 技术的灵敏度，提高了图像质量8.盲肠中肿瘤细胞的生长如果向肠腔生长，则会导致腔内肿瘤，如果它们从肠腔生长出来，则会导致腔外肿瘤。使用先前的方法已经观察到这两种情况，并且取决于所使用的PDX模型和注射部位。小鼠从扫描中完全恢复，没有肾损伤或其他事件的临床证据。结果表明，μCT成像可以作为监测CRC发生和纵向生长的有用工具。
原位模型准确地概括了临床 CRC 12，对于测试新治疗药物对原发性肿瘤生长和肝肺转移的影响非常有用 2,11。然而，对于一个新的研究小组来说，详细的书面协议可能不足以建立如此复杂的模型。作为回应，本视频旨在指导研究小组在他们的研究中实施这一程序。它显示了免疫缺陷小鼠盲肠壁中细胞的植入过程以及使用μCT扫描监测肠道肿瘤生长的方法。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们感谢 Cellex 基金会、CIBERONC 网络和 Instituto de Salud Carlos III 的支持。此外，我们还要感谢进行实验的Vall d'Hebron研究所（VHIR）的临床前成像平台。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
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