Summary
Bu protokol, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu açıklar. Model, ilerlemiş kolorektal kanser metastatik hastalığını özetler ve klinik olarak anlamlı bir akciğer ve karaciğer metastazı senaryosunda yeni terapötik ilaçların değerlendirilmesine izin verir.
Abstract
Son on yılda, hasta kaynaklı kanser hücreleri ve 3D tümöroidler kullanılarak daha karmaşık klinik öncesi kolorektal kanser (KRK) modelleri oluşturulmuştur. Hasta kaynaklı tümör organoidleri orijinal tümörün özelliklerini koruyabildiğinden, bu güvenilir preklinik modeller kanser ilacı taramasını ve ilaç direnç mekanizmalarının incelenmesini sağlar. Bununla birlikte, hastalarda KRK'ye bağlı ölüm çoğunlukla metastatik hastalık varlığı ile ilişkilidir. Bu nedenle, anti-kanser tedavilerinin etkinliğini, insan kanseri metastazının temel moleküler özelliklerini gerçekten özetleyen ilgili in vivo modellerde değerlendirmek önemlidir. CRC hastadan türetilen kanser hücrelerinin doğrudan farelerin çekum duvarına enjekte edilmesine dayanan bir ortotopik model oluşturduk. Bu tümör hücreleri, çekumda karaciğer ve akciğerlere metastaz yapan primer tümörler geliştirir ve bu durum ilerlemiş KRK'li hastalarda sıklıkla görülür. Bu CRC fare modeli, hastalarda primer tümörleri veya metastazları kolayca tanımlayabilen, klinik olarak anlamlı küçük ölçekli bir görüntüleme yöntemi olan mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) ile izlenen ilaç yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerini implante etmek için cerrahi prosedürü ve gerekli metodolojiyi açıklıyoruz.
Introduction
Kolorektal kanser (KRK), dünya çapında kanser ölümlerinin ikinci önde gelen nedenidir1. Bireysel hasta tümör hücrelerinden türetilen in vitro veya in vivo tümör modelleri üretme yeteneği, onkolojide gelişmiş hassas tıbba sahiptir. Son on yılda, hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) veya ksenogreftler (PDX'ler) dünya çapında birçok araştırma grubu tarafından kullanılmıştır2. PDO'lar, orijinal tümör dokusunun özelliklerine benzeyen, kendi kendini organize edebilen ve yenileyebilen çok hücreli in vitro yapılardır3. Bu umut verici in vitro modeller, ilaç taraması ve translasyonel araştırmaları kolaylaştırmak için başarıyla kullanılabilir. Öte yandan, PDX modelleri, orijinal CRC'yi histolojiden moleküler özelliklere ve ilaç yanıtınakadar ilgili tüm seviyelerde aslına uygun olarak özetlemektedir 2,4.
İn vivo PDX modelleri çoğunlukla immün yetmezliği olan farelerde deri altı tümörler olarak büyütülür. Bu yaklaşımı kullanarak, PDX'ler, özellikle ilaç duyarlılığını veya direncini incelemek için kanser araştırmalarında altın standart haline gelmiştir. Bununla birlikte, KRK ile ilişkili ölümler çoğunlukla karaciğer, akciğer veya periton boşluğunda metastatik lezyonların varlığı ile ilişkilidir ve iki yaklaşımın hiçbiri (PDO veya PDX) ileri klinik ortamı özetleyemez. Ek olarak, spesifik tümör büyüme bölgesinin, ilaç etkinliği ve hastalık prognozu üzerinde etkisi olan önemli biyolojik özellikleri belirlediği gösterilmiştir2. Bu nedenle, klinik olarak anlamlı bir metastatik ortamda antikanser ilaçların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilecek klinik öncesi modellerin oluşturulmasına acil bir ihtiyaç vardır6.
Mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) tarayıcıları, kanser hastalarının BT görüntüleriyle orantılı ölçekli bir görüntü çözünürlüğünde farelerde primer tümör ve metastaz görüntülemesi sağlayan küçültülmüş klinik BT tarayıcıları olarak işlev görebilir7. μCT tekniğinin zayıf yumuşak doku kontrastına karşı koymak için, kontrastı iyileştirmek ve tümör yükünü değerlendirmek için radyolojik iyotlu kontrast ajanlar kullanılabilir. İkili kontrast yaklaşımı kullanılarak, oral ve intraperitoneal iyot farklı zamanlamalarda uygulanır. Ağızdan uygulanan kontrast, bağırsak içindeki tümör dokusu ve çekum içeriği arasındaki sınırları tanımlamaya yardımcı olur. Öte yandan, intraperitoneal olarak uygulanan kontrast, sıklıkla büyüyen ve peritonu invaze eden tümör kitlesinin dış sınırlarının belirlenmesine olanak tanır8.
Makale, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu gerçekleştirmek için bir protokolü ve μCT taraması kullanarak bağırsak tümörü büyümesini izleme metodolojisini açıklamaktadır. Bu makale, modelin PDO veya PDXO modelleri kullanılarak çalışılamayan KRK hastalarında ileri intestinal tümörler ve metastatik hastalıkların klinik senaryosunu özetlediğini göstermektedir. KRK'nin ortotopik PDX modelleri, KRK hastalarının klinik senaryosunu özetlediğinden, ileri intestinal tümörlerde ve metastatik hastalıkta anti-tümöral ilaçların etkinliğini test etmek için bugüne kadarki en iyi modeller oldukları sonucuna vardık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Proje, Barselona, İspanya'daki Vall d'Hebron Üniversite Hastanesi Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (onay kimliği: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). İnsan kolon dokusu örnekleri, tümör rezeksiyonu yapılan kolon ve rektum kanserli hastalara karşılık gelen primer adenokarsinomların veya karaciğer metastazlarının nekrotik olmayan alanlarından alınan biyopsilerden oluşuyordu. Deneyler, Avrupa Birliği'nin hayvan bakımı direktifine (86/609/EEC) uygun olarak gerçekleştirilmiş ve VHIR-Vall d'Hebron Araştırma Enstitüsü Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA ve 12/18 CEEA) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Dişi NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid / NcrCrl) 8 haftalık fareler Charles River Laboratuvarlarından satın alındı.
1. Hasta hücrelerinin türetilmesi
- Tümör ekstraksiyonu
NOT: Aşağıdaki prosedür, hayvan tesisinde oda sıcaklığında (RT) biyolojik bir kabinde gerçekleştirilir.- Hastaların ameliyatlarından veya biyopsilerinden ve farelerde deri altından büyüyen PDX'lerden tümör örnekleri alın.
- Ortotopik enjeksiyon için, doğrudan hastalardan elde edilen doku yerine yerleşik deri altı PDX tümör modellerinden tümör hücrelerini hazırlayın9.
- NOD-SCIDfarelerinin 2 yan tarafında deri altından Matrigel matrisi (50 μL) ile karıştırılmış fosfat tamponlu salin (PBS) (50 μL) içinde 1 x 105 tümör hücresinin bir süspansiyonunu aşılayarak PDX tümörleri oluşturun.
- Her gün bir kumpas kullanarak tümör büyümesini ölçün.
NOT: Daha da önemlisi, laboratuvarımız 350'den fazla PDX modelinden oluşan bir biyobanka oluşturmuştur. Protokolde kullanılan CRC-PDX tümör modelleri, farelerde üçten fazla pasajdan daha fazla amplifiye edilmiş ve dahil etme/dışlama kriterlerini pozitif sonuçla geçmiş laboratuvarda yerleşik PDX modelleridir (Tablo 1).
- Her gün bir kumpas kullanarak tümör büyümesini ölçün.
- Deri altı tümörler CEEA tarafından belirlenen maksimum boyuta (1 cm çap) ulaştığında veya hayvanlar son nokta kriterlerine ulaştığında fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın.
- Tümörü çıkarın ve makas ve forseps kullanarak deriden ve çevresindeki tümör olmayan dokudan dikkatlice çıkarın.
- Hasat edilen tümörleri bir sonraki adıma kadar PBS'de 4 °C'de saklayın.
NOT: Hücre süspansiyonundaki tümörleri, farelerde hastaların lezyonlarında veya deri altı ksenogreftlerinde orijinal konumlarından çıkarıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede ayırın. Doku çıkarıldıktan 24 saat sonra hücre canlılığı önemli ölçüde azalır ve bu da alıcı farelerde verimsiz bir implantasyona neden olur.
- Hücre hazırlığı
NOT: Aşağıdaki prosedür, doku kültürü odasında oda sıcaklığında (RT) biyolojik bir kabinde gerçekleştirilir.- 10 cm'lik bir kültür plakasında 1 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı (Tablo 2) içeren bir bıçak kullanarak tümörleri ayırın (kıymayı kolaylaştırmak için). Homojen ayrışmış numuneyi 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
- 5 mL'lik bir son hacme tam CoCSCM 6Ab ortamı ekleyin (aynı tüpte 3 mL'den fazla ayrışmış numune kullanmayın).
NOT: Hastalardan alınan primer KRK'ler doğal olarak bakteri ve mantar ile kontamine olur. Orijinal hasta örneğinde bulunan patojenlerin altı antibiyotikten (penisilin, streptomisin, mantar zonu, kanamisin, gentamisin ve nistatin) oluşan bir kokteyl kullanılarak uzaklaştırılması esastır. İmmün yetmezliği olan farelerde bakterilerle kontamine olmuş tümör hücrelerinin enjeksiyonu hayvan ölümüne neden olabilir. - 50 μL DNaz I (0.08 kU/mL) ve 50 μL kollajenaz (1.5 mg/mL) (sindirim ortamı; Tablo 2) bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat boyunca, 45 ° pozisyonda. İnkübasyondan önce çözeltiyi her 15 dakikada bir 5 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın.
NOT: Tümör dokusunu ayırın ve tek bir hücre çözeltisi elde etmek için birkaç kez pipetleyerek sindirin. Bu, alıcı farelere enjekte edilmeden önce hücrelerin sayılması ve dolayısıyla tümör hücrelerinin homojen bir implantasyonunun elde edilmesi için gereklidir. - 5 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı ekleyin ve 5 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın.
- Çözeltiyi 100 μm'lik bir hücre süzgeci ile yeni bir steril 50 mL tüp kullanarak sıralayın.
- Sıralanan hücreleri RT'de 8 dakika boyunca 500 x g'de döndürün.
- Süpernatanı aspire edin.
- Peletin 3 mL 1x RBC lizis tampon çözeltisi içinde yeniden süspanse edilmesi.
- RT'de 10 dakika inkübe edin.
- 3 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı ekleyin, numuneyi pipetleyin ve RT'de 10 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
- Peletleri 5-10 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı ile yeniden süspanse edin ve toplam hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayacı kullanın.
- Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün ve 10 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
- 20 x 106 hücre/mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için peleti yeniden süspanse edin ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için iyice karıştırın.
- Doku kültüründe çekum enjeksiyonu için 29 G şırınga (0,5 mL U 100 iğne, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) hazırlayın (bir şırınga/fare). Şırıngaya 50 μL tümör hücresi süspansiyonu (1 x 106 hücre/enjeksiyon) yükleyin ve buz üzerinde tutun. Hücre süspansiyonundan hava kabarcıklarının çıkarıldığından emin olun.
NOT: Tümör hücreleri şırıngaya yüklendiğinde hava kabarcıklarının ortadan kaldırılması, çekum duvarına doku yırtılmasına ve numune kaybına neden olabilecek aşırı hacim enjeksiyonunu önlemek için önemlidir. Aynı deneyde fareler arasında eşit olmayan tümör boyutundan kaçınmak için şırıngayı yüklerken hücre süspansiyonunu iyice karıştırmak zorunludur.
2. Çekumda ortotopik enjeksiyon
NOT: Aşağıdaki prosedür, hayvan tesisindeki belirli bir patojen içermeyen (SPF) odada bir tezgah üzerinde gerçekleştirilir. Kullanılan ekipman önceden temizlenir ve sterilize edilir. Ek olarak, hayvan tesisindeki bireyler veya bölgeler arasında portatif bir sterilizatörde tekrar sterilize edilir.
- Ameliyat bölgesini dezenfekte edici deterjan püskürterek ve silerek temizleyin.
- Bir fare epilasyon makinesi kullanarak farelerin karnını epilasyon yapın.
- Fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Hayvanı uyuşturmak için% 2 izofluran kullanın. Ekstremiteyi hafifçe sıkıştırarak ve stimülasyon yokluğunu gözlemleyerek anestezinin etkisini onaylayın.
- Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için gözlere 50-100 μL damla veteriner merhemi (3 mg/g Lacryvisc) damlatın.
- Dairesel hareketlerle birkaç kez klorheksidin veya povidon-iyot ile ovalayarak fare karnını dezenfekte edin.
- Ameliyat makası kullanarak alt karın üzerinde 1 cm uzunlamasına bir kesi yapın. Derinin altındaki peritonu sunmak için cildi her bölgeye dikkatlice ayırın.
- Periton zarında çekumu dışlayacak kadar büyük 0,5-1 cm'lik bir kesi yapın.
NOT: İç organları aşırı derecede manipüle etmeden çekumu dıştan çıkarın, bu da prosedürün ölümcüllüğünü önemli ölçüde artırabilir. - Önceden kesilmiş, steril bir gazlı bez kullanarak çekumu fareden dikkatlice izole edin.
- Tüm prosedür boyunca çekumu tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin.
- Cecumu forseps ile dikkatlice tutarak hareketsiz hale getirin ve iğneyi yüzeysel olarak çekum duvarına sokun. Enjeksiyon bölgesindeki kılcal damarlardan ve damarlardan kaçının. Hücre süspansiyonundaki kabarcıkları çıkarın.
- 50μL tümör hücresi süspansiyonunun tamamını yavaşça enjekte edin. Genellikle uygulanması yaklaşık 10 saniye sürer. Çekum lümenini iğne ile delmekten kaçının, çünkü bu, tümör hücresi süspansiyonunun bağırsak peristaltizmi yoluyla vücuttan atılmasıyla sonuçlanır.
NOT: Tümör hücresi süspansiyonunun farelerin çekumuna enjekte edilmesi, tüm prosedürün en zorlu adımıdır. Protokolün bu bölümünde enjeksiyon bölgesine odaklanmış parlak bir ışık ve büyüteç kullanılmalıdır. İğneyi çekum yüzeyine paralel olarak yerleştirin. Çekum çok kırılgan bir dokudur; Bu nedenle, çekumun immobilizasyonu cerrahi forseps kullanılarak ve kanama ile sonuçlanan doku yırtılmasını önlemek için hafif basınç uygulanarak yapılmalıdır. Başarılı implantasyon, çekum duvarında beyaz bir kabarcık (hücre peleti) ile sonuçlanır. Kabarcık görselleştirilemiyorsa, çekumun delindiğini ve hücrelerin çekum lümeninde sona erdiğini ve bağırsak yolu tarafından temizlenmelerine neden olduğunu gösterebilir. - Enjeksiyondan sonra, tümör hücrelerinin kaçmasını önlemek ve hafif kanamayı azaltmak için iğneyi çekumdan yavaşça çıkarın ve enjeksiyon bölgesine pamuk uçlu bir aplikatör ile hafif bir baskı uygulayın.
- Kalıntıları gidermek için çekumu tuzlu su çözeltisiyle temizleyin.
- Çekumu hayvanın karnına geri koyun.
- 5/0 sütür kullanarak peritonu kapatın.
- Karın derisini 5/0 dikişlerle kapatın.
- Ameliyat sonrası antibiyotikler (100 mg/kg amoksisilin veya 20 mg/kg enrofloksasin) ve analjezikler (5 mg/mL metacam/meloksikam) subkutan enjeksiyonla uygulanır. Fareleri bir ısıtma yastığına yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar orada tutun. Ardından, onları diğer hayvanlarla birlikte kafese geri koyun.
3. μCT taraması kullanılarak ortotopik tümör büyümesinin değerlendirilmesi
NOT: Aşağıdaki prosedür, hayvan tesisinden klinik öncesi görüntüleme platformunda (PIP) gerçekleştirilir.
- Tüm hayvan işlemlerini kurumsal etik kurul düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirir.
- Hücre enjeksiyonundan 2 hafta sonra ve daha sonra her hafta μCT ile tümör hacmini izlemeye başlayın.
- Kontrast madde iopamiro'yu (300 mg / mL) salin çözeltisi içinde, her iki doz için de 3: 1 oranında taze olarak seyreltin. Oral gavaj ile 300 mL iopamiro uygulayın.
NOT: μCT'nin zayıf yumuşak doku kontrastı nedeniyle, tekniğin hassasiyetini artırmak için bir kontrast madde önerilir. Protokol, intraluminal tümör yükünü sınırlamak için iyot bazlı bir ajanın (iopamiro) oral uygulamasını ve bağırsağın viseral yüzündeki tümör yükünü tanımlamak için aynı ajanın ikincil intraperitoneal uygulamasını içerir. Kontrast maddenin eliminasyonundan önce farelerin çekumuna ulaşması gereken tam zamanı belirlemek için daha önce pilot deneyler yapılmıştır. Iopamiro durumunda, yaklaşık 2 saattir. - 2 saat sonra, 300 mL önceden seyreltilmiş iopamiro intraperitoneal enjeksiyonu uygulayın. Uygulama, parietal yüzdeki tümör sınırlarını tanımlamaya yardımcı olur.
- % 2 izofluran kullanarak hayvanları uyuşturun.
- Farenin ayağını sıkıştırarak hayvanın doğru şekilde uyuşturulduğunu onayladıktan sonra, hayvanı μCT'nin tarama yatağına yerleştirin. En iyi pozisyon sırtüstüdür (yüzü yukarı).
- Kontrol yazılımında, karın bölgesini tarayıcının görüş alanına (FOV) yerleştirmek için canlı modu (floroskopi modu) başlatın. Bunu yapmak için, istenen pozisyon elde edilene kadar yatağı ileri, geri ve yanal olarak hareket ettirin. X-ışını tüpünü ve dedektörü 90° döndürün ve hayvanı tamamen ortalamak için tarama yatağını y ekseninde hareket ettirin.
- Bir FX μCT görüntüleme sistemi kullanarak μCT tarama görüntüleri için aşağıdaki parametreleri kullanın: 30 mm FOV, 26 sn çekim süresi, 90 kV akım voltajı ve 200 μA akım amperajı.
- Tarama bittiğinde hayvanları iyileşmek için kafeslerine geri koyun. Termal destek sağlayın ve barınağa dönmeden önce anesteziden kurtulana kadar hayvanları izleyin.
- μCT alımı, her tarama için 250 Mb boyutunda bir dosya verir. Oluşturulan veri dosyaları bir VOX formatına sahiptir. Herhangi bir görüntüleme analiz yazılımı için erişilebilir hale getirmek için, μCT'nin veritabanı yönetim yazılımını kullanarak dosyaları DICOM formatına dönüştürün. Oluşturulan dosya grubunu, mevcut görüntüleme yazılımına sahip herhangi bir bilgisayarı kullanarak analiz etmek için taşınabilir bir sabit diskte saklayın.
NOT: Görüntü analizi sırasında çekum, sıklıkla kaudal karnın sol tarafında, radyoyoğun içeriğe (iopamiro) sahip genişlemiş bir bağırsak olarak lokalizedir. Çekumun visseral fleksurunda, komşu bağırsak bölgelerine göre bir duvar kalınlaşması gözlenir. Kalınlaşma, tümör büyümesine karşılık gelir. - Tümör lokalize olduktan sonra, farklı görünümlerde (aksiyal, koronal ve sagital) en yüksek çapı bulun. Bu üç ekseni ölçün ve elipsoid formülünü izleyerek tümör hacmini hesaplayın: hacim = 4/3π x (x-yarı eksenli x y-yarı eksenli x z-yarı eksen)10.
4. Ortotopik tümör taşıyan farelerde terapötik müdahale
- Ortotopik tümörleri taşıyan fareleri haftalık olarak izleyin.
- Farelerin çoğunda bir tümör μCT tarama sinyali tespit edildiğinde, tümörün varlığını doğrulamak için ertesi hafta başka bir μCT taraması yapın.
NOT: Tedaviye başlama süresi kullanılan PDX modeline bağlıdır ve çekumda tümör hücresi inokülasyonundan 3-12 hafta sonra değişir. - Fareleri dört gruba randomize edin: bir araç grubu (n = 10-15 fare), bir test ilaç grubu (n = 10-15 fare), standart bir bakım kemoterapi grubu (n = 10-15 fare) ve bir kombinasyon tedavi grubu (n = 10-15 fare).
- Fareleri intraperitoneal olarak salin (araç grubu), test ilacı (20 mg / kg) (test ilaç grubu), irinotekan (50 mg / kg) (standart bakım grubu) veya test ilacı (20 mg / kg) irinotekan (50 mg / kg) (kombinasyon tedavi grubu). Deneyin sonuna kadar uygulamayı haftada bir kez gerçekleştirin.
- Deney boyunca μCT taraması ile tümör büyümesini haftalık olarak izleyin.
- Deneyin sonunda, fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın ve karaciğerleri, akciğerleri ve diğer organlardaki diğer olası lezyonları toplayın.
- Doku örneklerini kasetlere dahil edin ve gece boyunca% 4 formalin içinde inkübe edin. Kontrol olarak çekumda tümör olmayan bir fareden alınan bağırsak dokusunu kullanın.
- Kasetleri formalinden çıkarın ve en az 3 saat% 70 etanol ile inkübe edin.
- Histopatoloji tesisi standart protokollerini kullanarak kasetleri parafin ile gömün.
- Histopatoloji tesisi standart protokollerini kullanarak çekum, karaciğer ve akciğerden hematoksilen ve eozin (H & E) boyaması gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hastadan türetilen kanser hücreleri ile ortotopik olarak implante edilen fareler, μCT taraması ile haftalık olarak izlendi. Deneyin sonunda hayvanlara ötenazi uygulandı. Bağırsaklar, çeka (Şekil 1A,B), karaciğerler, akciğerler ve diğer olası lezyonlar toplandı, bir kasete dahil edildi ve gece boyunca %4 formalin ile tespit edildi. Çekumda tümör saptanmayan bir fareden alınan bağırsak dokusu kontrol olarak kullanıldı (Şekil 1C). Son olarak, kasetler en az 3 saat boyunca% 70 etanol olarak değiştirildi ve parafin gömüldü. Tümör hücrelerini tanımlamak için histopatoloji tesisi standart protokolleri kullanılarak çeka, karaciğer ve akciğerlerden hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması gerçekleştirildi (Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4).
Başka bir deneyde, ortotopik tümör taşıyan fareler haftalık olarak izlendi. Farelerin çoğunda bir tümör μCT tarama sinyali tespit edildiğinde (PDX modeline bağlı olarak yaklaşık 2-4 hafta), hayvanlar dört gruba randomize edildi ve araç, test ilacı (20 mg / kg), bakım standardı kemoterapi irinotekan (50 mg / kg) veya irinotekan içeren test ilacı. İlaçlar, deneyin sonuna kadar haftada bir kez intraperitoneal olarak uygulandı. Tümör büyümesi, deney boyunca μCT taraması ile haftalık olarak izlendi. Sonuçlar, test ilacının μCT tarama görüntüleri ile hesaplanan tümör hacminde bir azalmaya neden olduğunu ve bunun irinotekan tedavisi ile kombinasyon halinde arttığını göstermiştir (Şekil 5 ve Şekil 6).
Laboratuvarımızda daha önce yapılan çalışmalar, ortotopik CRC-PDX modellerinin metastatik potansiyelinin (karsinomatozis, akciğer ve karaciğer metastazı) kullanılan PDX modeline bağlı olduğunu göstermiştir (Tablo 3)2. Bu çalışmada metastaz oluşumu üzerine terapötik etkinlik de değerlendirilmiştir. Sonuçlar, test ilacı, irinotekan ve kombinasyonun tedavi edilen farelerde akciğer ve karaciğer metastazı oluşumunu ortadan kaldırdığını göstermiştir (Tablo 4)11.
Şekil 1: Ortotopik CRC-PDX tümörleri taşıyan farelerin bağırsaklarının makroskopik görüntüleri. Deneyin sonunda ortotopik PDX tümörü (A,B) taşıyan iki fareden alınan makroskopik bağırsak görüntüleri. Çekum tümörleri resimlerde kırmızı ile tanımlanmıştır. (C) Kontrol olarak çekumda tümör olmayan bir farenin bağırsak görüntüsü. Ölçek çubukları = 5 mm (A,B); 1 cm (C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ortotopik CRC-PDX tümörlerinin histolojik görüntüleri. Deneyin sonunda çekumdaki bir PDX tümör modelinin düşük (A) ve yüksek (a) büyütmede H&E boyanması. Çekum tümörleri resimlerde kırmızı ile tanımlanmıştır. Ölçek çubukları = 2,5 mm (A); 100 mm (bir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ortotopik CRC-PDX tümöründen türetilen akciğer metastazının histolojik görüntüleri Ortotopik PDX tümörü taşıyan bir fareden alınan bir akciğerin H&E boyaması. Düşük (A) ve yüksek (a) büyütmede akciğer metastazı görülebilir. Akciğer metastazları görüntülerde kırmızı ile tanımlanmıştır. Ölçek çubukları = 250 mm (A); 100 mm (bir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ortotopik CRC-PDX tümörlerinden elde edilen karaciğer metastazının histolojik görüntüleri. Ortotopik PDX tümörü taşıyan bir fareden karaciğerin H&E boyaması. Karaciğer metastazı düşük (A) ve yüksek (a) büyütmelerde görülebilir. Karaciğer metastazları görüntülerde kırmızı ile tanımlanmıştır. Ölçek çubukları resimlerde belirtilmiştir. Ölçek çubukları = 500 mm (A); 50 mm (bir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Ortotopik bir CRC-PDX modelinde bir test ilacının terapötik etkinliği. Dört grupla yapılan bir deney örneği (araç, test ilacı, irinotekan ve irinotekan ile test ilac)11. μCT tarama görüntülerinden elde edilen tümör hacmi zaman içinde (A) ve deneyin sonunda (42. gün) (B) temsil edilir. Çubuklar, ± SE (n = 15-30) ve *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 araca karşı (t-testi, iki taraflı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Tedavi altındaki ortotopik CRC-PDX tümörleri taşıyan farelerden alınan μCT görüntüleri. Terapötik bir ilaçla tedavi edilen ortotopik tümörler taşıyan farelerin temsili μCT görüntüleri. Görüntülerde çekum (kırmızı) ve tümör kitlesi (mavi) tanımlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Subkutan PDX'in kurulması. Aşılanan hücre sayısı, PDX oluşumu insidansı ve farelerdeki pasajlar ile 350'den fazla PDX modelinden oluşan biyobanka2'mizden laboratuvarda kurulan üç PDX modeli örneği (P1, P2 ve P3). Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: Büyüme faktörlerini (GF) MIX 10X, EGF, FGF2 ve büyüme faktörleri içermeyen CoCSCM 6Ab, CoCSCM 6Ab tam ortamı ve sindirim ortamını hazırlamak için reaktifler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 3: Ortotopik CRC-PDX modellerinin metastatik potansiyeli. Biyobankamızdan laboratuvarda kurulan üç ortotopik CRC-PDX modeli örneği (P1, P2 ve P3)2. Burada aşılanan hücre sayısı, çekum tümörü oluşumu insidansı ve karsinomatozis, akciğer metastazı veya karaciğer metastazı oluşturma insidansı belirtilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 4: Ortotopik bir CRC-PDX modelinde bir test ilacının terapötik metastatik etkinliği. Dört grupla yapılan bir deney örneği (araç, test ilacı, irinotekan ve irinotekan ile test ilac)11. Burada, her gruptaki fare sayısı ve bunlardan hangisinde deney sonunda karsinomatozis, akciğer metastazı veya karaciğer metastazı geliştiği belirtilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son birkaç on yılda, kolorektal kanser (KRK) dahil olmak üzere farklı tümör tiplerine sahip hastalarda birçok yeni anti-kanser tedavisi geliştirilmiş ve test edilmiştir. Birçok vakada klinik öncesi modellerde umut verici sonuçlar gözlenmesine rağmen, ileri metastatik KRK'li hastalarda terapötik etkinlik sıklıkla sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, klinik olarak anlamlı bir metastatik senaryoda yeni terapötik ilaçların etkinliğinin test edilmesine izin veren klinik öncesi modellere acil bir ihtiyaç vardır.
El yazması, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta tümör hücrelerinin implantasyonuna dayanan gelişmiş bir CRC ortotopik PDX modelini ayrıntılı olarak açıklamaktadır12.
Metodoloji zaman alıcıdır ve konsantrasyon gerektirir. Ortalama olarak, 30 fare ile yapılan bir deneyin enjeksiyonu, aşağıdakiler dahil olmak üzere toplamda yaklaşık 11 saat sürebilir: 1) PDX tümör toplanması (1 saat); tümör işleme (4 saat); ve çekum implantasyonu (6 saat). Prosedür steril koşullarda yapılmalı, tümör işleme ve enjeksiyon süresini en aza indirmeli ve ameliyata bağlı mortaliteyi önlemek için iç organları çok dikkatli bir şekilde manipüle etmelidir. Bu nedenle, araştırmacıları eğitmek ve prosedüre alıştırmak için tümör hücre hatları veya PDX hücreleri ile birkaç pilot deney yapılması şiddetle tavsiye edilir. Ek olarak, biri tümörü toplamak ve işlemek, ayrıca hayvanların dikişlerine yardımcı olmak, diğeri ise gerçek ameliyatı gerçekleştirmek için prosedüre iki araştırmacı dahil edilmelidir.
Çekum tümörlerinin, PDX modeline ve enjeksiyonun spesifik bölgesine bağlı olarak bağırsağın lümenine veya çekumun içine doğru büyüyebileceğini düşünmek de önemlidir. Tümör büyümesinin sonucunu kontrol etmek zordur ve farelerin hayatta kalmasını önemli ölçüde etkileyebilir, bu da tümörler lümen içinde büyüdüğünde daha küçük tümörlere ve ciddi bir bağırsak tıkanıklığına neden olabilir. Bu nedenle fareler, hücre implantasyonundan sonraki haftadan başlayarak haftalık olarak izlenmelidir. Farelerin çoğu μCT taraması ile bir tümör sinyali sunduğunda, sinyali olmayan hayvanlar dışlanmalı ve geri kalanı tümör hacmine göre deney gruplarına randomize edilmelidir. İstatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için, her deney grubu 12-15 fare içermelidir.
Tümör taşıyan farelerin izlenmesi, klinik olarak anlamlı ortotopik modellerde yeni terapötik ajanların etkinliğini belirlemek için gereklidir. μCT taramaları, farelerde primer tümör hacminin tanımlanmasını ve ölçülmesini sağlar. Çift kontrast kullanımı, μCT tekniğinin duyarlılığını önemli ölçüde artırarak görüntülerin kalitesini iyileştirir8. Çekumdaki tümör hücrelerinin büyümesi, bağırsağın lümenine doğru büyürlerse intraluminal tümörlere veya bağırsağın lümeninden büyürlerse ekstraluminal tümörlere yol açabilir. Her iki senaryo da önceki metodoloji ile gözlemlenmiştir ve kullanılan PDX modeline ve enjeksiyon bölgesine bağlıdır. Fareler, böbrek hasarı veya diğer olaylara dair klinik bir kanıt olmaksızın taramadan tamamen iyileşti. Sonuçlar, μBT görüntülemenin KRK'nin gelişimini ve uzunlamasına büyümesini izlemek için yararlı bir araç olabileceğini göstermektedir.
Ortotopik modeller klinik CRC 12'yi doğru bir şekilde özetlemektedir ve yeni terapötik ilaçların primer tümör büyümesi ve karaciğer ve akciğer metastazları üzerindeki etkisini test etmek için çok yararlıdır 2,11. Bununla birlikte, ayrıntılı bir yazılı protokol, yeni bir araştırma grubunun bu tür karmaşık modeller oluşturması için yeterli olmayabilir. Buna cevaben, bu video, araştırma gruplarına araştırmalarında bu prosedürü uygulamaları için rehberlik etmeyi amaçlamaktadır. İmmün yetmezliği olan farelerin çekum duvarındaki hücrelerin implantasyon prosedürünü ve μCT taraması kullanarak bağırsak tümörü büyümesini izleme metodolojisini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse.
Acknowledgments
Cellex Vakfı'na, CIBERONC ağına ve Instituto de Salud Carlos III'e destekleri için teşekkür ederiz. Ayrıca, deneylerin yapıldığı Vall d'Hebron Araştırma Enstitüsü'ndeki (VHIR) klinik öncesi görüntüleme platformuna da teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B.
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
