Summary
Este protocolo describe la implantación ortotópica de células cancerosas derivadas del paciente en la pared del ciego de ratones inmunodeficientes. El modelo recapitula la enfermedad metastásica del cáncer colorrectal avanzado y permite la evaluación de nuevos fármacos terapéuticos en un escenario clínicamente relevante de metástasis pulmonares y hepáticas.
Abstract
Durante la última década, se han establecido modelos preclínicos de cáncer colorrectal (CCR) más sofisticados utilizando células cancerosas derivadas de pacientes y tumores 3D. Dado que los organoides tumorales derivados del paciente pueden conservar las características del tumor original, estos modelos preclínicos fiables permiten el cribado de fármacos contra el cáncer y el estudio de los mecanismos de resistencia a los fármacos. Sin embargo, la muerte relacionada con el CCR en los pacientes se asocia principalmente con la presencia de enfermedad metastásica. Por lo tanto, es esencial evaluar la eficacia de las terapias contra el cáncer en modelos in vivo relevantes que realmente recapitulen las características moleculares clave de la metástasis del cáncer humano. Hemos establecido un modelo ortotópico basado en la inyección de células cancerosas derivadas del paciente con CCR directamente en la pared del ciego de ratones. Estas células tumorales desarrollan tumores primarios en el ciego que hacen metástasis en el hígado y los pulmones, lo que se observa con frecuencia en pacientes con CCR avanzado. Este modelo de ratón con CCR se puede utilizar para evaluar las respuestas a los fármacos monitorizadas mediante microtomografía computarizada (μCT), un método de obtención de imágenes a pequeña escala clínicamente relevante que puede identificar fácilmente tumores primarios o metástasis en los pacientes. Aquí, describimos el procedimiento quirúrgico y la metodología requerida para implantar células cancerosas derivadas del paciente en la pared ciego de ratones inmunodeficientes.
Introduction
El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo1. La capacidad de generar modelos tumorales in vitro o in vivo derivados de células tumorales de pacientes individuales ha hecho avanzar la medicina de precisión en oncología. Durante la última década, los organoides derivados de pacientes (PDO) o xenoinjertos (PDX) han sido utilizados por muchos grupos de investigación de todo el mundo2. Las PDO son estructuras multicelulares in vitro que se asemejan a las características del tejido tumoral original y pueden autoorganizarse y autorrenovarse3. Estos prometedores modelos in vitro pueden utilizarse con éxito para el cribado de fármacos y facilitar la investigación traslacional. Por otro lado, los modelos PDX recapitulan fielmente el CCR original en todos los niveles relevantes, desde la histología hasta los rasgos moleculares y la respuesta al fármaco 2,4.
In vivo Los modelos PDX se cultivan principalmente como tumores subcutáneos en ratones inmunodeficientes. Con este enfoque, las PDX se han convertido en el estándar de oro en la investigación del cáncer, particularmente para estudiar la sensibilidad o la resistencia a los medicamentos. Sin embargo, las muertes relacionadas con el CCR se asocian principalmente con la presencia de lesiones metastásicas en el hígado, el pulmón o la cavidad peritoneal, y ninguno de los dos abordajes (PDO o PDX) puede recapitular el entorno clínico avanzado. Además, se ha demostrado que el sitio específico de crecimiento tumoral determina características biológicas importantes que tienen un impacto en la eficacia de los medicamentos y el pronóstico de la enfermedad2. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer modelos preclínicos que puedan ser utilizados para evaluar la eficacia de los fármacos anticancerígenos en un entorno metastásico clínicamente relevante6.
Los escáneres de microtomografía computarizada (μCT) pueden funcionar como escáneres de TC clínicos a escala reducida, proporcionando imágenes de tumores primarios y metástasis en ratones con una resolución de imagen a escala proporcional a la de las imágenes de TC de pacientes con cáncer7. Para contrarrestar el contraste deficiente de los tejidos blandos de la técnica μCT, se pueden utilizar agentes de contraste yodados radiológicos para mejorar el contraste y evaluar la carga tumoral. Utilizando un enfoque de doble contraste, el yodo oral e intraperitoneal se administra en diferentes momentos. El contraste administrado por vía oral ayuda a definir los límites entre el tejido tumoral y el contenido de ciego dentro del intestino. Por otro lado, el contraste administrado por vía intraperitoneal permite identificar los límites externos de la masa tumoral, que con frecuencia crece e invade el peritoneo8.
El manuscrito describe un protocolo para realizar la implantación ortotópica de células cancerosas derivadas de pacientes en la pared del ciego de ratones inmunodeficientes, y la metodología para monitorear el crecimiento tumoral intestinal mediante exploración por μCT. El presente manuscrito muestra que el modelo recapitula el escenario clínico de tumores intestinales avanzados y enfermedad metastásica en pacientes con CCR que no pueden ser estudiados con modelos PDO o PDXO. Dado que los modelos ortotópicos PDX de CCR recapitulan el escenario clínico de los pacientes con CCR, concluimos que son los mejores hasta la fecha para probar la eficacia de los fármacos antitumorales en tumores intestinales avanzados y enfermedad metastásica.
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Protocol
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. El proyecto fue aprobado por el Comité de Ética de la Investigación del Hospital Universitario Vall d'Hebron, Barcelona, España (aprobación ID: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Las muestras de tejido de colon humano consistieron en biopsias de áreas no necróticas de adenocarcinomas primarios o metástasis hepáticas, correspondientes a pacientes con cáncer de colon y recto sometidos a resección tumoral. Los experimentos se llevaron a cabo siguiendo la directiva de cuidado animal de la Unión Europea (86/609/CEE) y fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal del VHIR-Vall d'Hebron Institut de Recerca (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA y 12/18 CEEA).
NOTA: Hembra NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl) de 8 semanas de edad se compraron a Charles River Laboratories.
1. Derivación de células de pacientes
- Extracción de tumores
NOTA: El siguiente procedimiento se realiza en un gabinete biológico a temperatura ambiente (RT) en la instalación de animales.- Obtener muestras tumorales de las cirugías o biopsias de los pacientes y de PDX que crecen por vía subcutánea en ratones.
- Para la inyección ortotópica, prepare las células tumorales a partir de modelos tumorales subcutáneos PDX establecidos en lugar de tejido obtenido directamente de los pacientes9.
- Generar tumores PDX mediante la inoculación de una suspensión de 1 x 105 células tumorales en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (50 μL) mezclada con matriz Matrigel (50 μL) por vía subcutánea en el flanco de ratones NOD-SCID2.
- Mida el crecimiento del tumor con un calibrador cada dos días.
NOTA: Es importante destacar que nuestro laboratorio ha generado un biobanco de más de 350 modelos PDX. Los modelos tumorales de CRC-PDX utilizados en el protocolo son modelos PDX establecidos en el laboratorio que han sido amplificados más de tres veces en ratones y han superado los criterios de inclusión/exclusión con un resultado positivo (Tabla 1).
- Mida el crecimiento del tumor con un calibrador cada dos días.
- Sacrificar a los ratones por luxación cervical cuando los tumores subcutáneos alcancen el tamaño máximo establecido por el CEEA (1 cm de diámetro), o cuando los animales alcancen los criterios de criterio de valoración.
- Extraiga el tumor y retírelo cuidadosamente de la piel y del tejido circundante no tumoral con unas tijeras y fórceps.
- Almacene los tumores extraídos en PBS a 4 °C hasta el siguiente paso.
NOTA: Disociar los tumores en suspensión celular tan pronto como sea posible después de la extracción de su ubicación original en las lesiones de los pacientes o xenoinjertos subcutáneos en ratones. La viabilidad celular se reduce significativamente 24 h después de la extracción del tejido, lo que resulta en una implantación ineficiente en los ratones receptores.
- Preparación celular
NOTA: El siguiente procedimiento se realiza en un gabinete biológico a temperatura ambiente (RT) en la sala de cultivo de tejidos.- Disociar los tumores con una cuchilla en una placa de cultivo de 10 cm con 1 mL de medio CoCSCM 6Ab completo (Tabla 2) (para facilitar el picado). Colocar la muestra disociada homogénea en un tubo cónico de 15 mL.
- Agregue medio CoCSCM 6Ab completo a un volumen final de 5 mL (no use más de 3 mL de muestra disociada en el mismo tubo).
NOTA: El CCR primario resecado de pacientes está contaminado naturalmente con bacterias y hongos. Es esencial eliminar los patógenos presentes en la muestra original del paciente mediante un cóctel de seis antibióticos (penicilina, estreptomicina, fungizona, kanamicina, gentamicina y nistatina). La inyección de células tumorales contaminadas con bacterias en ratones inmunodeficientes puede provocar la muerte de los animales. - Incubar con 50 μL de DNasa I (0,08 kU/mL) y 50 μL de colagenasa (1,5 mg/mL) (medio de digestión; Tabla 2) durante 1 h a 37 °C en una incubadora de cultivos celulares, en una posición de 45°. Mezclar bien la solución cada 15 min con una pipeta de 5 mL antes de la incubación.
NOTA: Disociar el tejido tumoral y digerirlo pipeteando varias veces para obtener una solución unicelular. Esto es esencial para contar las células antes de inyectarlas en ratones receptores y, por lo tanto, lograr una implantación homogénea de las células tumorales. - Agregue 5 ml de medio CoCSCM 6Ab completo y mezcle bien con una pipeta de 5 ml.
- Separe la solución con un filtro de células de 100 μm utilizando un nuevo tubo estéril de 50 ml.
- Gire las celdas ordenadas a 500 x g durante 8 minutos en RT.
- Aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el gránulo en 3 ml de 1 solución tampón de lisis de RBC.
- Incubar durante 10 min a RT.
- Añadir 3 ml de medio CoCSCM 6Ab completo, pipetear la muestra y centrifugar a 500 x g durante 10 min a RT. Aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el gránulo con 5-10 ml de medio CoCSCM 6Ab completo y use un contador de células para calcular el número total de células.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 10 min en RT y volver a suspender en 10 mL de PBS.
- Resuspender el pellet para obtener una concentración de 20 x 106 células/mL, y mezclar bien para obtener una suspensión celular homogénea.
- Prepare jeringas de 29 G (aguja U 100 de 0,5 ml, 0,33 mm [29 g] x 12,7 mm) para la inyección de ciego en el cultivo de tejidos (una jeringa/ratón). Cargue 50 μL de la suspensión de células tumorales (1 x 106 células/inyección) en la jeringa y manténgala en hielo. Asegúrese de eliminar las burbujas de aire de la suspensión de la celda.
NOTA: La eliminación de las burbujas de aire cuando las células tumorales están cargadas en la jeringa es esencial para evitar la inyección de un volumen excesivo en la pared del ciego, lo que podría provocar la rotura del tejido y la pérdida de la muestra. Es imperativo mezclar bien la suspensión celular al cargar la jeringa para evitar el tamaño desigual del tumor entre los ratones en el mismo experimento.
2. Inyección ortotópica en ciego
NOTA: El siguiente procedimiento se realiza en un banco en una sala libre de patógenos específicos (SPF, por sus siglas en inglés) en la instalación de animales. El equipo utilizado se limpia y esteriliza previamente. Además, se esteriliza de nuevo en un esterilizador portátil entre individuos o zonas en el animalario.
- Limpie el sitio quirúrgico rociando con detergente desinfectante y limpiando.
- Depila el abdomen de los ratones con una máquina de depilación de ratón.
- Coloque el ratón en posición supina. Utilizar isoflurano al 2% para anestesiar al animal. Confirme el efecto de la anestesia pellizcando suavemente la extremidad y observando la ausencia de estimulación.
- Coloque una gota de 50-100 μL de ungüento veterinario (3 mg/g de Lacryvisc) en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
- Desinfecte el abdomen del ratón frotando con clorhexidina o povidona yodada varias veces con movimientos circulares.
- Realice una incisión longitudinal de 1 cm sobre la parte inferior del abdomen con unas tijeras quirúrgicas. Separe cuidadosamente la piel a cada sitio para presentar el peritoneo que se encuentra debajo de la piel.
- Hacer una incisión de 0,5-1 cm en la membrana del peritoneo, lo suficientemente grande como para exteriorizar el ciego.
NOTA: Exteriorizar el ciego sin manipular excesivamente los órganos internos, lo que podría aumentar drásticamente la letalidad del procedimiento. - Aísle cuidadosamente el ciego del ratón con una gasa estéril precortada.
- Humedecer el ciego con solución salina durante todo el procedimiento.
- Inmovilizar el ciego agarrándolo cuidadosamente con unas pinzas, e introducir la aguja superficialmente en la pared del ciego. Evite los capilares y vasos en el lugar de la inyección. Retire las burbujas de la suspensión celular.
- Inyecte lentamente los 50 μL completos de suspensión de células tumorales. Por lo general, tarda alrededor de 10 segundos en administrarse. Evite perforar la luz del ciego con la aguja, ya que esto resulta en la eliminación de la suspensión de células tumorales del cuerpo a través del peristaltismo intestinal.
NOTA: La inyección de la suspensión de células tumorales en el ciego de los ratones es el paso más difícil de todo el procedimiento. En esta parte del protocolo se debe utilizar una luz brillante enfocada en el lugar de la inyección y una lupa de aumento. Introducir la aguja paralela a la superficie del ciego. El ciego es un tejido muy frágil; Por lo tanto, la inmovilización del ciego debe realizarse con pinzas quirúrgicas y aplicando una presión suave para evitar la rotura del tejido que provoque una hemorragia. La implantación exitosa da como resultado una burbuja blanca (gránulo de células) en la pared del ciego. Si la burbuja no se puede visualizar, puede indicar que el ciego ha sido perforado y las células han terminado en la luz del ciego, lo que resulta en su eliminación por el tracto intestinal. - Después de la inyección, retire lentamente la aguja del ciego y aplique una presión suave en el lugar de la inyección con un aplicador con punta de algodón, para evitar que las células tumorales se escapen y reducir el sangrado leve.
- Limpie el ciego con solución salina para eliminar cualquier residuo.
- Regrese el ciego al abdomen del animal.
- Cerrar el peritoneo con suturas 5/0.
- Cerrar la piel del abdomen con suturas 5/0.
- Administrar antibióticos postoperatorios (100 mg/kg de amoxicilina o 20 mg/kg de enrofloxacino) y analgésicos (5 mg/ml de metacam/meloxicam) mediante inyección subcutánea. Coloque los ratones en una almohadilla térmica y manténgalos allí hasta que se hayan recuperado por completo. Luego, devuélvelos a la jaula con otros animales.
3. Evaluación del crecimiento tumoral ortotópico mediante exploración por μCT
NOTA: El siguiente procedimiento se realiza en la plataforma de imágenes preclínicas (PIP) del animalario.
- Realizar todos los procedimientos con animales siguiendo las normas del comité de ética institucional.
- Comience a monitorear el volumen tumoral con μCT 2 semanas después de la inyección celular y cada semana a partir de entonces.
- Diluir el agente de contraste iopamiro (300 mg/ml) en solución salina, en una proporción de 3:1 para ambas dosis. Administrar 300 mL de iopamiro por sonda nasogástrica oral.
NOTA: Debido al escaso contraste de los tejidos blandos de la μCT, se recomienda un agente de contraste para mejorar la sensibilidad de la técnica. El protocolo incluye una administración oral de un agente a base de yodo (iopamiro) para delimitar la carga tumoral intraluminal, y una administración intraperitoneal secundaria del mismo agente para definir la carga tumoral en la cara visceral del intestino. Previamente se han realizado experimentos piloto para determinar el tiempo exacto que el agente de contraste necesita para llegar al ciego de los ratones antes de su eliminación. En el caso del iopamiro, es de alrededor de 2 h. - A las 2 h, administrar una inyección intraperitoneal de 300 mL de iopamiro previamente diluido. La administración ayuda a definir los límites tumorales en la cara parietal.
- Anestesiar a los animales con isoflurano al 2%.
- Después de confirmar que el animal está correctamente anestesiado pellizcando la pata del ratón, coloque al animal en la cama de escaneo del μCT. La mejor posición es en decúbito supino (boca arriba).
- En el software de control, inicie el modo en vivo (modo fluoroscopia) para colocar el área abdominal en el campo de visión (FOV) del escáner. Para ello, mueva la cama hacia adelante, hacia atrás y lateralmente hasta lograr la posición deseada. Gire el tubo de rayos X y el detector 90° y mueva la cama de escaneo en el eje Y para centrar completamente al animal.
- Utilice los siguientes parámetros para las imágenes de escaneo μCT: campo de visión de 30 mm, 26 s de tiempo de adquisición, 90 kV de voltaje de corriente y 200 μA de amperaje de corriente, utilizando un sistema de imágenes FX μCT.
- Regrese a los animales a sus jaulas para su recuperación cuando termine el escaneo. Proporcionar soporte térmico y monitorear a los animales hasta que se recuperen de la anestesia antes de regresar al alojamiento.
- La adquisición de μCT produce un archivo de 250 Mb de tamaño para cada escaneo. Los archivos de datos creados tienen un formato VOX. Con el fin de hacerlos accesibles para cualquier software de análisis de imágenes, convierta los archivos a formato DICOM utilizando el software de gestión de bases de datos del μCT. Almacene el lote de archivos creados en un disco duro portátil para analizarlos utilizando cualquier ordenador con el software de imágenes disponible.
NOTA: Durante el análisis de imágenes, el ciego se localiza como un intestino dilatado con un contenido radiodenso (iopamiro), frecuentemente en el lado izquierdo del abdomen caudal. En la flexión visceral del ciego, se observa un engrosamiento de la pared, en comparación con las regiones intestinales adyacentes. El engrosamiento corresponde al crecimiento tumoral. - Una vez localizado el tumor, busca el diámetro más alto en las diferentes vistas (axial, coronal y sagital). Mida estos tres ejes y calcule el volumen tumoral siguiendo la fórmula del elipsoide: volumen = 4/3π x (x-semieje x y-semieje x z-semieje)10.
4. Intervención terapéutica en ratones portadores de tumores ortotópicos
- Monitorizar semanalmente a los ratones portadores de tumores ortotópicos.
- Cuando se detecta una señal de exploración por μCT tumoral en la mayoría de los ratones, se realiza otra exploración por μCT la semana siguiente para confirmar la presencia del tumor.
NOTA: El tiempo para iniciar el tratamiento depende del modelo PDX utilizado, y varía de 3 a 12 semanas después de la inoculación de las células tumorales en el ciego. - Aleatorice los ratones en cuatro grupos: un grupo de vehículos (n = 10-15 ratones), un grupo de fármacos de prueba (n = 10-15 ratones), un grupo de quimioterapia estándar (n = 10-15 ratones) y un grupo de tratamiento combinado (n = 10-15 ratones).
- Tratar a los ratones por vía intraperitoneal con solución salina (grupo vehículo), el fármaco de prueba (20 mg/kg) (grupo de fármaco de prueba), irinotecán (50 mg/kg) (grupo de tratamiento estándar) o el fármaco de prueba (20 mg/kg) con irinotecán (50 mg/kg) (grupo de tratamiento combinado). Realizar la administración una vez a la semana hasta el final del experimento.
- Controle el crecimiento del tumor semanalmente mediante una exploración por tomografía computarizada durante el transcurso del experimento.
- Al final del experimento, se sacrifica a los ratones por dislocación cervical y se recogen hígados, pulmones y cualquier otra posible lesión en otros órganos.
- Incluir las muestras de tejido en casetes e incubarlas en formol al 4% durante la noche. Usar tejido intestinal de un ratón sin tumor en el ciego como control.
- Retire los casetes de formol e incube con etanol al 70% durante al menos 3 h.
- Incrustar los casetes con parafina, utilizando los protocolos estándar de las instalaciones de histopatología.
- Realizar la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) del ciego, el hígado y el pulmón, utilizando los protocolos estándar del centro de histopatología.
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Representative Results
Los ratones a los que se les implantaron ortotópicamente células cancerosas derivadas de pacientes se monitorizaron semanalmente mediante exploración por tomografía computarizada. Al final del experimento, los animales fueron sacrificados. Se recogieron intestinos, ciegos (Figura 1A,B), hígados, pulmones y cualquier otra posible lesión, se incluyeron en un casete y se fijaron con formol al 4% durante la noche. Se utilizó tejido intestinal de un ratón sin tumor en ciego como control (Figura 1C). Finalmente, los casetes se cambiaron a etanol al 70% durante al menos 3 h y se incrustaron en parafina. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de ciegos, hígados y pulmones se realizó utilizando los protocolos estándar de las instalaciones de histopatología para identificar las células tumorales (Figura 2, Figura 3 y Figura 4).
En otro experimento, los ratones portadores de tumores ortotópicos fueron monitoreados semanalmente. Cuando se detectó una señal de μCT tumoral en la mayoría de los ratones (alrededor de 2-4 semanas, dependiendo del modelo PDX), los animales se aleatorizaron en cuatro grupos y se trataron con el vehículo, el fármaco de prueba (20 mg/kg), la quimioterapia estándar irinotecán (50 mg/kg) o el fármaco de prueba con irinotecán. Los fármacos se administraron por vía intraperitoneal una vez a la semana hasta el final del experimento. El crecimiento tumoral se monitorizó semanalmente mediante exploración por μCT durante el transcurso del experimento. Los resultados indicaron que el fármaco de prueba indujo una reducción del volumen tumoral, calculada por las imágenes de la tomografía computarizada (μCT), y que se mejoró en combinación con el tratamiento con irinotecán (Figura 5 y Figura 6).
Estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado que el potencial metastásico (carcinomatosis, metástasis pulmonar y hepática) de los modelos ortotópicos de CRC-PDX depende del modelo PDX utilizado (Tabla 3)2. En el presente estudio, también se evaluó la eficacia terapéutica en la formación de metástasis. Los resultados indicaron que el fármaco de prueba, irinotecán, y la combinación erradicaron la formación de metástasis pulmonar y hepática en ratones tratados (Tabla 4)11.
Figura 1: Imágenes macroscópicas del intestino de ratones portadores de tumores ortotópicos de CCR-PDX. Imágenes macroscópicas del intestino de dos ratones portadores de un tumor ortotópico PDX (A,B) al final del experimento. Los tumores de ciego se definen en rojo en las imágenes. (C) Una imagen del intestino de un ratón sin un tumor en el ciego como control. Barras de escala = 5 mm (A,B); 1 cm (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes histológicas de tumores ortotópicos de CCR-PDX. Tinción de H&E de un modelo tumoral PDX en el ciego al final del experimento con aumento bajo (A) y alto (a). Los tumores de ciego se definen en rojo en las imágenes. Barras de escala = 2,5 mm (A); 100 mm (a). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes histológicas de metástasis pulmonares derivadas de la tinción ortotópica de H&E del tumor CRC-PDX de un pulmón de un ratón portador de un tumor ortotópico PDX. La metástasis pulmonar puede observarse a bajo (A) y alto (A) aumento. Las metástasis pulmonares se definen en rojo en las imágenes. Barras de escala = 250 mm (A); 100 mm (a). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes histológicas de metástasis hepáticas derivadas de tumores ortotópicos de CCR-PDX. Tinción de H&E de un hígado de un ratón portador de un tumor ortotópico PDX. La metástasis hepática puede observarse con aumentos bajos (A) y altos (A). Las metástasis hepáticas se definen en rojo en las imágenes. Las barras de escala se indican en las imágenes. Barras de escala = 500 mm (A); 50 mm (a). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Eficacia terapéutica de un fármaco de prueba en un modelo ortotópico de CRC-PDX. Ejemplo de un experimento con cuatro grupos (vehículo, fármaco de prueba, irinotecán y fármaco de prueba con irinotecán)11. El volumen tumoral obtenido a partir de las imágenes de la gammagrafía μCT se representa a lo largo del tiempo (A) y al final del experimento (día 42) (B). Barras, ± SE (n = 15-30) y *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 frente al vehículo (prueba t, de dos caras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes de μCT de ratones portadores de tumores ortotópicos de CRC-PDX en tratamiento. Imágenes representativas de μCT de ratones portadores de tumores ortotópicos tratados con un fármaco terapéutico. El ciego (rojo) y la masa tumoral (azul) se definen en las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Establecimiento de la PDX subcutánea. Ejemplo de tres modelos de PDX establecidos en el laboratorio (P1, P2 y P3) de nuestro biobanco2 de más de 350 modelos de PDX con el número de células inoculadas, la incidencia de establecimiento de PDX y los pasajes en ratones. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Reactivos para preparar los factores de crecimiento (GF) MIX 10X, el CoCSCM 6Ab sin EGF, FGF2 y factores de crecimiento, el medio completo CoCSCM 6Ab y el medio de digestión. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Potencial metastásico de los modelos ortotópicos de CRC-PDX. Ejemplo de tres modelos ortotópicos de CRC-PDX establecidos en el laboratorio (P1, P2 y P3) de nuestro biobanco2. Aquí se indica el número de células inoculadas, la incidencia de formación de tumores ciegos y la incidencia de generar carcinomatosis, metástasis pulmonares o metástasis hepáticas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 4: Eficacia terapéutica metastásica de un fármaco de prueba en un modelo ortotópico de CCR-PDX. Ejemplo de un experimento con cuatro grupos (vehículo, fármaco de prueba, irinotecán y fármaco de prueba con irinotecán)11. Aquí, se indica el número de ratones en cada grupo y cuáles de ellos desarrollaron carcinomatosis, metástasis pulmonar o metástasis hepática al final del experimento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
En las últimas décadas, se han desarrollado y probado muchas terapias nuevas contra el cáncer en pacientes con diferentes tipos de tumores, incluido el cáncer colorrectal (CCR). Aunque en muchos casos se han observado resultados prometedores en modelos preclínicos, la eficacia terapéutica en pacientes con CCR metastásico avanzado ha sido frecuentemente limitada. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de modelos preclínicos que permitan probar la eficacia de nuevos fármacos terapéuticos en un escenario metastásico clínicamente relevante.
El manuscrito describe en detalle un modelo avanzado de PDX ortotópico de CCR basado en la implantación de células tumorales de pacientes en la pared del ciego de ratones inmunodeficientes12.
La metodología requiere mucho tiempo y concentración. En promedio, la inyección de un experimento con 30 ratones puede tomar alrededor de 11 h en total, incluyendo: 1) recolección de tumores PDX (1 h); procesamiento tumoral (4 h); e implante de ciego (6 h). El procedimiento debe realizarse en condiciones estériles, minimizando el tiempo de procesamiento e inyección del tumor, mientras se manipulan los órganos internos con mucho cuidado para evitar la mortalidad relacionada con la cirugía. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que se realicen varios experimentos piloto con líneas celulares tumorales o células PDX, para capacitar a los investigadores y familiarizarlos con el procedimiento. Además, dos investigadores deben estar involucrados en el procedimiento, uno para recolectar y procesar el tumor, así como ayudar con las suturas de los animales, y el otro para realizar la cirugía propiamente dicha.
También es importante tener en cuenta que los tumores de ciego pueden crecer en la luz del intestino o dentro del ciego, dependiendo del modelo PDX y del sitio específico de la inyección. El resultado del crecimiento tumoral es difícil de controlar y puede afectar drásticamente la supervivencia de los ratones, lo que resulta en tumores más pequeños y una obstrucción intestinal grave cuando los tumores crecen dentro del lumen. Por lo tanto, los ratones deben ser monitoreados semanalmente, a partir de la semana posterior a la implantación celular. Una vez que la mayoría de los ratones presentan una señal tumoral mediante la exploración por μCT, los animales sin señal deben excluirse y el resto debe asignarse al azar en grupos experimentales según el volumen tumoral. Para obtener resultados estadísticamente significativos, cada grupo experimental debe incluir entre 12 y 15 ratones.
El seguimiento de ratones portadores de tumores es esencial para determinar la eficacia de nuevos agentes terapéuticos en modelos ortotópicos clínicamente relevantes. Las tomografías computarizadas permiten identificar y cuantificar el volumen tumoral primario en ratones. El uso de un doble contraste aumenta significativamente la sensibilidad de la técnica μCT, mejorando la calidad de las imágenes8. El crecimiento de células tumorales en el ciego puede dar lugar a tumores intraluminales si crecen hacia la luz del intestino, o tumores extraluminales si crecen fuera de la luz del intestino. Ambos escenarios se han observado con la metodología anterior, y dependen del modelo PDX utilizado y del lugar de inyección. Los ratones se recuperaron completamente de la exploración, sin evidencia clínica de daño renal u otras incidencias. Los resultados muestran que las imágenes por μCT pueden ser una herramienta útil para monitorizar el desarrollo y el crecimiento longitudinal del CCR.
Los modelos ortotópicos recapitulan con precisión el CCRclínico 12 y son muy útiles para probar el efecto de nuevos fármacos terapéuticos sobre el crecimiento tumoral primario y las metástasis hepáticas y pulmonares 2,11. Sin embargo, un protocolo escrito detallado puede no ser suficiente para que un nuevo grupo de investigación establezca modelos tan complejos. En respuesta, el presente video tiene como objetivo orientar a los grupos de investigación para que implementen este procedimiento en sus investigaciones. Muestra el procedimiento de implantación de células en la pared del ciego de ratones inmunodeficientes y la metodología para monitorizar el crecimiento tumoral intestinal mediante gammagrafía μCT.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo de la Fundación Cellex, de la red CIBERONC y del Instituto de Salud Carlos III. Además, también agradecemos a la plataforma de imagen preclínica del Vall d'Hebron Institut de Recerca (VHIR), donde se realizaron los experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
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- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
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- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B.
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
