Summary
Dieses Protokoll beschreibt die orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in die Blinddarmwand von immundefizienten Mäusen. Das Modell rekapituliert fortgeschrittene metastasierende Darmkrebserkrankungen und ermöglicht die Evaluierung neuer therapeutischer Medikamente in einem klinisch relevanten Szenario von Lungen- und Lebermetastasen.
Abstract
In den letzten zehn Jahren wurden ausgefeiltere präklinische Darmkrebsmodelle (CRC) mit patienteneigenen Krebszellen und 3D-Tumoroiden etabliert. Da patienteneigene Tumororganoide die Eigenschaften des ursprünglichen Tumors beibehalten können, ermöglichen diese zuverlässigen präklinischen Modelle das Screening von Krebsmedikamenten und die Untersuchung von Arzneimittelresistenzmechanismen. Darmkrebsbedingte Todesfälle bei Patienten sind jedoch meist mit dem Vorhandensein einer metastasierten Erkrankung verbunden. Es ist daher wichtig, die Wirksamkeit von Krebstherapien in relevanten In-vivo-Modellen zu bewerten, die die wichtigsten molekularen Merkmale der menschlichen Krebsmetastasierung wirklich rekapitulieren. Wir haben ein orthotopes Modell etabliert, das auf der Injektion von Darmkrebszellen von Patienten direkt in die Blinddarmwand von Mäusen basiert. Diese Tumorzellen entwickeln Primärtumoren im Blinddarm, die in Leber und Lunge metastasieren, was häufig bei Patienten mit fortgeschrittenem Darmkrebs beobachtet wird. Dieses Darmkrebs-Mausmodell kann verwendet werden, um das Ansprechen von Medikamenten zu untersuchen, das durch Mikrocomputertomographie (μCT) überwacht wird, ein klinisch relevantes bildgebendes Verfahren im kleinen Maßstab, mit dem Primärtumoren oder Metastasen bei Patienten leicht identifiziert werden können. Hier beschreiben wir das chirurgische Vorgehen und die erforderliche Methodik, um patienteneigene Krebszellen in die Blinddarmwand von immundefizienten Mäusen zu implantieren.
Introduction
Darmkrebs (CRC) ist weltweit die zweithäufigste Krebstodesursache1. Die Fähigkeit, In-vitro- oder In-vivo-Tumormodelle zu generieren, die aus einzelnen Tumorzellen von Patienten abgeleitet werden, hat die Präzisionsmedizin in der Onkologie vorangetrieben. In den letzten zehn Jahren wurden von vielen Forschungsgruppen auf derganzen Welt von Patienten abgeleitete Organoide (PDOs) oder Xenotransplantate (PDXs) verwendet 2. PDOs sind multizelluläre In-vitro-Strukturen, die den Merkmalen des ursprünglichen Tumorgewebes ähneln und sich selbst organisieren und erneuern können3. Diese vielversprechenden In-vitro-Modelle können erfolgreich für das Wirkstoff-Screening und die translationale Forschung eingesetzt werden. Auf der anderen Seite rekapitulieren PDX-Modelle den ursprünglichen Darmkrebs auf allen relevanten Ebenen, von der Histologie über molekulare Merkmale bis hin zum Ansprechen auf Arzneimittel 2,4.
Im lebenden Organismus PDX-Modelle werden meist als subkutane Tumoren in immundefizienten Mäusen gezüchtet. Mit diesem Ansatz sind PDXs zum Goldstandard in der Krebsforschung geworden, insbesondere zur Untersuchung von Arzneimittelempfindlichkeit oder -resistenz. Todesfälle im Zusammenhang mit Darmkrebs sind jedoch meist mit dem Vorhandensein von metastasierten Läsionen in der Leber, der Lunge oder der Bauchhöhle verbunden, und keiner der beiden Ansätze (PDO oder PDX) kann das fortgeschrittene klinische Umfeld rekapitulieren. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass der spezifische Ort des Tumorwachstums wichtige biologische Merkmale bestimmt, die einen Einfluss auf die Wirksamkeit von Medikamenten und die Krankheitsprognose haben2. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Etablierung präklinischer Modelle, mit denen die Wirksamkeit von Krebsmedikamenten in einem klinisch relevanten metastasierten Setting beurteilt werdenkann 6.
Mikrocomputertomographen (μCT) können als verkleinerte klinische CT-Scanner fungieren und die Bildgebung von Primärtumoren und Metastasen bei Mäusen mit einer skalierten Bildauflösung ermöglichen, die proportional zu der von CT-Bildern von Krebspatienten ist7. Um dem schlechten Weichteilkontrast der μCT-Technik entgegenzuwirken, können radiologische jodhaltige Kontrastmittel eingesetzt werden, um den Kontrast zu verbessern und die Tumorlast zu beurteilen. Unter Verwendung eines dualen Kontrastansatzes wird orales und intraperitoneales Jod zu unterschiedlichen Zeitpunkten verabreicht. Das oral verabreichte Kontrastmittel hilft, die Grenzen zwischen Tumorgewebe und Blinddarmgehalt im Darm zu definieren. Auf der anderen Seite ermöglicht das intraperitoneal verabreichte Kontrastmittel die Identifizierung der äußeren Grenzen der Tumormasse, die häufig wächst und in das Peritoneum eindringt8.
Das Manuskript beschreibt ein Protokoll zur orthotopen Implantation von patienteneigenen Krebszellen in die Blinddarmwand immundefizienter Mäuse und die Methodik zur Überwachung des Darmtumorwachstums mittels μCT-Scans. Das vorliegende Manuskript zeigt, dass das Modell das klinische Szenario von fortgeschrittenen Darmtumoren und metastasierenden Erkrankungen bei Darmkrebspatienten rekapituliert, die nicht mit PDO- oder PDXO-Modellen untersucht werden können. Da orthotope PDX-Modelle des Darmkrebses das klinische Szenario von Darmkrebspatienten rekapitulieren, kommen wir zu dem Schluss, dass sie bisher die besten sind, um die Wirksamkeit von Antitumormedikamenten bei fortgeschrittenen Darmtumoren und metastasierenden Erkrankungen zu testen.
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Protocol
Von allen Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Das Projekt wurde von der Ethikkommission für Forschung des Universitätsklinikums Vall d'Hebron, Barcelona, Spanien, genehmigt (Genehmigung ID: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Menschliche Dickdarmgewebeproben bestanden aus Biopsien aus nicht-nekrotischen Bereichen von primären Adenokarzinomen oder Lebermetastasen, die Patienten mit Dickdarm- und Enddarmkrebs entsprachen, die sich einer Tumorresektion unterzogen hatten. Die Versuche wurden gemäß der Tierpflegerichtlinie der Europäischen Union (86/609/EWG) durchgeführt und von der Ethikkommission für Tierversuche des VHIR - des Forschungsinstituts Vall d'Hebron genehmigt (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA und 12/18 CEEA).
HINWEIS: Weibliches NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl) Mäuse im Alter von 8 Wochen wurden von Charles River Laboratories gekauft.
1. Ableitung von Patientenzellen
- Tumor-Extraktion
HINWEIS: Das folgende Verfahren wird in einem biologischen Schrank bei Raumtemperatur (RT) in der Tierhaltung durchgeführt.- Gewinnung von Tumorproben aus den Operationen oder Biopsien der Patienten und aus subkutan wachsenden PDXs bei Mäusen.
- Für die orthotope Injektion werden die Tumorzellen aus etablierten subkutanen PDX-Tumormodellen anstelle von Gewebe, das direkt von Patienten gewonnen wurde, präpariert9.
- Erzeugung von PDX-Tumoren durch Inokulation einer Suspension von 1 x 105 Tumorzellen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (50 μl), gemischt mit Matrigel-Matrix (50 μl), subkutan in der Flanke von NOD-SCID-Mäusen2.
- Messen Sie das Tumorwachstum jeden zweiten Tag mit einem Messschieber.
HINWEIS: Wichtig ist, dass unser Labor eine Biobank mit mehr als 350 PDX-Modellen erstellt hat. Bei den im Protokoll verwendeten CRC-PDX-Tumormodellen handelt es sich um etablierte PDX-Modelle im Labor, die mehr als drei Passagen in Mäusen amplifiziert wurden und die Ein-/Ausschlusskriterien mit einem positiven Ergebnis bestanden haben (Tabelle 1).
- Messen Sie das Tumorwachstum jeden zweiten Tag mit einem Messschieber.
- Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixluxation, wenn die subkutanen Tumoren die von der CEEA festgelegte maximale Größe (1 cm Durchmesser) erreichen oder wenn die Tiere die Endpunktkriterien erreichen.
- Entnehmen Sie den Tumor und entfernen Sie ihn vorsichtig mit Schere und Pinzette von der Haut und dem umgebenden Nicht-Tumorgewebe.
- Lagern Sie die entnommenen Tumore bis zum nächsten Schritt in PBS bei 4 °C.
HINWEIS: Dissoziieren Sie die Tumoren in der Zellsuspension so schnell wie möglich nach der Entfernung von ihrer ursprünglichen Position in den Läsionen der Patienten oder subkutanen Xenotransplantaten bei Mäusen. Die Zellviabilität ist 24 Stunden nach der Gewebeentnahme signifikant reduziert, was zu einer ineffizienten Implantation bei Empfängermäusen führt.
- Vorbereitung der Zellen
HINWEIS: Das folgende Verfahren wird in einem biologischen Schrank bei Raumtemperatur (RT) im Gewebekulturraum durchgeführt.- Dissoziation der Tumore mit einer Klinge in einer 10 cm langen Kulturplatte mit 1 ml vollständigem CoCSCM 6Ab-Medium (Tabelle 2) (zur Erleichterung des Zerkleinerns). Geben Sie die homogene dissoziierte Probe in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
- Geben Sie das vollständige CoCSCM 6Ab-Medium zu einem Endvolumen von 5 ml hinzu (verwenden Sie nicht mehr als 3 ml dissoziierte Probe im selben Röhrchen).
HINWEIS: Primärer Darmkrebs, der von Patienten reseziert wird, ist von Natur aus mit Bakterien und Pilzen kontaminiert. Es ist wichtig, die in der ursprünglichen Patientenprobe vorhandenen Krankheitserreger mit einem Cocktail aus sechs Antibiotika (Penicillin, Streptomycin, Fungizon, Kanamycin, Gentamycin und Nystatin) zu entfernen. Die Injektion von Tumorzellen, die mit Bakterien kontaminiert sind, in immundefiziente Mäuse kann zum Tod von Tieren führen. - Inkubieren mit 50 μl DNase I (0,08 kU/ml) und 50 μl Kollagenase (1,5 mg/ml) (Aufschlussmedium; Tabelle 2) 1 h bei 37 °C in einem Zellkultur-Inkubator in einer 45°-Position. Mischen Sie die Lösung vor der Inkubation alle 15 Minuten gut mit einer 5-ml-Pipette.
HINWEIS: Dissoziieren Sie das Tumorgewebe und verdauen Sie es durch mehrmaliges Pipettieren, um eine Einzelzelllösung zu erhalten. Dies ist wichtig, um die Zellen vor der Injektion in Empfängermäuse zu zählen und so eine homogene Implantation von Tumorzellen zu erreichen. - Fügen Sie 5 ml des vollständigen CoCSCM 6Ab-Mediums hinzu und mischen Sie es gut mit einer 5-ml-Pipette.
- Sortieren Sie die Lösung mit einem 100-μm-Zellsieb unter Verwendung eines neuen sterilen 50-ml-Röhrchens.
- Die sortierten Zellen werden bei 500 x g für 8 min bei RT geschleudert.
- Saugen Sie den Überstand ab.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml 1x Erythrozyten-Lysepufferlösung.
- 10 Minuten bei RT inkubieren.
- Fügen Sie 3 ml des vollständigen CoCSCM 6Ab-Mediums hinzu, pipettieren Sie die Probe und schleudern Sie bei 500 x g für 10 Minuten bei RT. Saugen Sie den Überstand ab.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit 5-10 ml vollständigem CoCSCM 6Ab-Medium und verwenden Sie einen Zellzähler, um die Gesamtzahl der Zellen zu berechnen.
- Schleudern Sie die Zellen bei 500 x g für 10 Minuten bei RT und resuspendieren Sie sie in 10 ml PBS.
- Das Pellet wird resuspendiert, um eine Konzentration von 20 x 106 Zellen/ml zu erhalten, und gut mischen, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.
- Bereiten Sie 29-G-Spritzen (0,5 ml U 100-Nadel, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) für die Blinddarminjektion in die Gewebekultur (eine Spritze/Maus) vor. Geben Sie 50 μl der Tumorzellsuspension (1 x 106 Zellen/Injektion) in die Spritze und lassen Sie sie auf Eis. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen aus der Zellsuspension entfernt werden.
HINWEIS: Die Beseitigung von Luftblasen, wenn die Tumorzellen in die Spritze geladen werden, ist wichtig, um die Injektion eines übermäßigen Volumens in die Blinddarmwand zu vermeiden, was zu Geweberissen und Probenverlust führen kann. Es ist zwingend erforderlich, die Zellsuspension beim Laden der Spritze gut zu mischen, um eine ungleichmäßige Tumorgröße bei Mäusen im selben Experiment zu vermeiden.
2. Orthotope Injektion in den Blinddarm
HINWEIS: Das folgende Verfahren wird auf einem Tisch in einem speziellen pathogenfreien Raum (SPF) in der Tiereinrichtung durchgeführt. Die verwendeten Geräte werden zuvor gereinigt und sterilisiert. Zusätzlich wird es in einem tragbaren Sterilisator zwischen Personen oder Zonen in der Tieranlage wieder sterilisiert.
- Reinigen Sie die Operationsstelle, indem Sie sie mit einem desinfizierenden Reinigungsmittel besprühen und abwischen.
- Enthaaren Sie den Bauch der Mäuse mit einem Maushaarentfernungsgerät.
- Bringen Sie die Maus in Rückenlage. Verwenden Sie 2% Isofluran, um das Tier zu betäuben. Bestätigen Sie die Wirkung der Anästhesie, indem Sie die Extremität sanft kneifen und das Fehlen einer Stimulation beobachten.
- Geben Sie einen 50-100 μl Tropfen Veterinärsalbe (3 mg/g Lacryvisc) in die Augen, um Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern.
- Desinfizieren Sie den Bauch der Maus, indem Sie ihn mehrmals in kreisenden Bewegungen mit Chlorhexidin oder Povidon-Jod schrubben.
- Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt über dem Unterbauch mit einer chirurgischen Schere. Trennen Sie die Haut vorsichtig von jeder Stelle, um das Bauchfell unter der Haut zu präsentieren.
- Machen Sie einen 0,5-1 cm langen Schnitt in der Bauchfellmembran, der groß genug ist, um den Blinddarm zu exteriorisieren.
HINWEIS: Äußere den Blinddarm, ohne die inneren Organe übermäßig zu manipulieren, was die Letalität des Eingriffs dramatisch erhöhen könnte. - Isolieren Sie den Blinddarm vorsichtig von der Maus mit einer vorgeschnittenen, sterilen Gaze.
- Befeuchten Sie den Blinddarm während des gesamten Eingriffs mit Kochsalzlösung.
- Immobilisieren Sie den Blinddarm, indem Sie ihn vorsichtig mit einer Zange fassen, und führen Sie die Nadel oberflächlich in die Blinddarmwand ein. Vermeiden Sie Kapillaren und Gefäße an der Injektionsstelle. Entfernen Sie Blasen aus der Zellsuspension.
- Injizieren Sie die gesamten 50 μl Tumorzellsuspension langsam. Die Verabreichung dauert in der Regel etwa 10 Sekunden. Vermeiden Sie es, das Blinddarmlumen mit der Nadel zu perforieren, da dies zur Ausscheidung der Tumorzellsuspension aus dem Körper durch Darmperistaltik führt.
HINWEIS: Die Injektion der Tumorzellsuspension in den Blinddarm der Mäuse ist der schwierigste Schritt des gesamten Verfahrens. In diesem Teil des Protokolls sollte ein helles Licht, das auf die Injektionsstelle gerichtet ist, und eine Lupe verwendet werden. Führen Sie die Nadel parallel zur Blinddarmoberfläche ein. Der Blinddarm ist ein sehr zerbrechliches Gewebe; Daher sollte die Ruhigstellung des Blinddarms mit einer chirurgischen Zange und durch sanften Druck durchgeführt werden, um einen Geweberiss zu vermeiden, der zu Blutungen führt. Eine erfolgreiche Implantation führt zu einer weißen Blase (Zellpellet) in der Blinddarmwand. Wenn die Blase nicht sichtbar gemacht werden kann, kann dies darauf hindeuten, dass der Blinddarm perforiert wurde und die Zellen im Blinddarmlumen geendet haben, was dazu führt, dass sie vom Darmtrakt abgebaut werden. - Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel langsam aus dem Blinddarm und üben Sie mit einem Applikator mit Wattespitze sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, um das Austreten von Tumorzellen zu vermeiden und leichte Blutungen zu reduzieren.
- Reinigen Sie den Blinddarm mit Kochsalzlösung, um alle Ablagerungen zu entfernen.
- Führe den Blinddarm zurück in den Bauch des Tieres.
- Verschließen Sie das Bauchfell mit 5/0-Nähten.
- Verschließen Sie die Haut des Bauches mit 5/0-Nähten.
- Postoperative Verabreichung von Antibiotika (100 mg/kg Amoxicillin oder 20 mg/kg Enrofloxacin) und Analgetika (5 mg/ml Metacam/Meloxicam) durch subkutane Injektion. Legen Sie die Mäuse auf ein Heizkissen und halten Sie sie dort, bis sie sich vollständig erholt haben. Setze sie dann mit anderen Tieren in den Käfig zurück.
3. Beurteilung des orthotopen Tumorwachstums mittels μCT-Scanning
HINWEIS: Das folgende Verfahren wird in der präklinischen Bildgebungsplattform (PIP) der Tiereinrichtung durchgeführt.
- Führen Sie alle Tierbehandlungen gemäß den Vorschriften der institutionellen Ethikkommission durch.
- Beginnen Sie mit der Überwachung des Tumorvolumens durch μCT 2 Wochen nach der Zellinjektion und danach jede Woche.
- Das Kontrastmittel Iopamiro (300 mg/ml) wird in Kochsalzlösung im Verhältnis 3:1 für beide Dosen frisch verdünnt. Verabreichen Sie 300 ml Iopamiro über eine orale Sonde.
HINWEIS: Aufgrund des schlechten Weichteilkontrasts des μCT wird ein Kontrastmittel empfohlen, um die Empfindlichkeit der Technik zu verbessern. Das Protokoll umfasst eine orale Verabreichung eines Wirkstoffs auf Jodbasis (Iopamiro) zur Abgrenzung der intraluminalen Tumorlast und eine sekundäre intraperitoneale Verabreichung desselben Wirkstoffs, um die Tumorlast in der viszeralen Seite des Darms zu definieren. In der Vergangenheit wurden Pilotversuche durchgeführt, um die genaue Zeit zu bestimmen, die das Kontrastmittel benötigt, um im Blinddarm von Mäusen anzukommen, bevor es ausgeschieden wird. Bei Iopamiro sind es etwa 2 Stunden. - Nach 2 h ist eine intraperitoneale Injektion von 300 ml zuvor verdünntem Iopamiro zu verabreichen. Die Verabreichung hilft, die Tumorgrenzen im Scheitelgesicht zu definieren.
- Betäuben Sie die Tiere mit 2% Isofluran.
- Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass das Tier korrekt betäubt ist, indem Sie den Fuß der Maus einklemmen, legen Sie das Tier in das Scanbett des μCT. Die beste Position ist Rückenlage (mit dem Gesicht nach oben).
- Starten Sie in der Steuerungssoftware den Live-Modus (Durchleuchtungsmodus), um den Bauchbereich in das Sichtfeld (FOV) des Scanners zu platzieren. Bewegen Sie dazu das Bett nach vorne, hinten und seitlich, bis die gewünschte Position erreicht ist. Drehen Sie die Röntgenröhre und den Detektor um 90° und bewegen Sie das Scanbett in der y-Achse, um das Tier vollständig zu zentrieren.
- Verwenden Sie die folgenden Parameter für die μCT-Scanbilder: 30 mm Sichtfeld, 26 s Aufnahmezeit, 90 kV Stromspannung und 200 μA Stromstärke unter Verwendung eines FX μCT-Bildgebungssystems.
- Bringen Sie die Tiere zur Erholung in ihre Käfige zurück, wenn der Scan abgeschlossen ist. Bieten Sie thermische Unterstützung und überwachen Sie die Tiere, bis sie sich von der Narkose erholt haben, bevor sie in den Stall zurückkehren.
- Die μCT-Erfassung ergibt für jeden Scan eine Datei mit einer Größe von 250 MB. Die erstellten Datendateien haben ein VOX-Format. Um sie für jede Bildanalysesoftware zugänglich zu machen, konvertieren Sie die Dateien mit der Datenbankverwaltungssoftware des μCT in das DICOM-Format. Speichern Sie den Stapel der erstellten Dateien auf einer tragbaren Festplatte, um sie mit jedem Computer mit verfügbarer Bildverarbeitungssoftware zu analysieren.
HINWEIS: Bei der Bildanalyse wird der Blinddarm als erweiterter Darm mit radiodichtem Inhalt (Iopamiro) lokalisiert, häufig in der linken Seite des kaudalen Abdomens. Bei der viszeralen Beugung des Blinddarms ist eine Wandverdickung im Vergleich zu den angrenzenden Darmregionen zu beobachten. Die Verdickung entspricht dem Tumorwachstum. - Sobald der Tumor lokalisiert ist, finden Sie den höchsten Durchmesser in den verschiedenen Ansichten (axial, koronal und sagittal). Messen Sie diese drei Achsen und berechnen Sie das Tumorvolumen nach der Ellipsoidformel: Volumen = 4/3π x (x-Halbachse x y-Halbachse x z-Halbachse)10.
4. Therapeutische Intervention bei Mäusen mit orthotopen Tumoren
- Überwachen Sie die Mäuse mit orthotopen Tumoren wöchentlich.
- Wenn bei den meisten Mäusen ein μCT-Scansignal des Tumors festgestellt wird, führen Sie in der folgenden Woche einen weiteren μCT-Scan durch, um das Vorhandensein des Tumors zu bestätigen.
HINWEIS: Die Zeit bis zum Beginn der Behandlung hängt vom verwendeten PDX-Modell ab und variiert zwischen 3 und 12 Wochen nach der Inokulation der Tumorzellen im Blinddarm. - Die Mäuse werden nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen eingeteilt: eine Vehikelgruppe (n = 10-15 Mäuse), eine Gruppe mit Testmedikamenten (n = 10-15 Mäuse), eine Gruppe mit Standard-Chemotherapie (n = 10-15 Mäuse) und eine Kombinationsbehandlungsgruppe (n = 10-15 Mäuse).
- Behandeln Sie die Mäuse intraperitoneal mit Kochsalzlösung (Vehikelgruppe), dem Testmedikament (20 mg/kg) (Testmedikamentengruppe), Irinotecan (50 mg/kg) (Standardbehandlungsgruppe) oder dem Testmedikament (20 mg/kg) mit Irinotecan (50 mg/kg) (Kombinationsbehandlungsgruppe). Führen Sie die Verabreichung einmal pro Woche bis zum Ende des Experiments durch.
- Überwachen Sie das Tumorwachstum wöchentlich durch μCT-Scans während des gesamten Experiments.
- Am Ende des Experiments werden die Mäuse durch Gebärmutterhalsverrenkung eingeschläfert und Lebern, Lungen und andere mögliche Läsionen in anderen Organen entnommen.
- Die Gewebeproben werden in Kassetten abgefüllt und über Nacht in 4% Formalin inkubiert. Verwenden Sie Darmgewebe von einer Maus ohne Tumor im Blinddarm als Kontrolle.
- Nehmen Sie die Kassetten von Formalin und inkubieren Sie mit 70%igem Ethanol für mindestens 3 Stunden.
- Betten Sie die Kassetten mit Paraffin ein, indem Sie die Standardprotokolle der histopathologischen Einrichtung verwenden.
- Führen Sie Hämatoxylin- und Eosinfärbungen (H&E) aus dem Blinddarm, der Leber und der Lunge unter Verwendung der Standardprotokolle der histopathologischen Einrichtung durch.
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Representative Results
Mäuse, denen orthotopische Krebszellen implantiert wurden, wurden wöchentlich durch μCT-Scans überwacht. Am Ende des Experiments wurden die Tiere eingeschläfert. Darm, Blinddarm (Abbildung 1A, B), Leber, Lunge und alle anderen möglichen Läsionen wurden gesammelt, in eine Kassette gegeben und über Nacht mit 4% Formalin fixiert. Als Kontrolle wurde Darmgewebe einer Maus ohne Tumor im Blinddarm verwendet (Abbildung 1C). Schließlich wurden die Kassetten für mindestens 3 h auf 70%iges Ethanol umgestellt und Paraffin eingebettet. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) aus Blinddarm, Leber und Lunge wurde unter Verwendung von Standardprotokollen der Histopathologieeinrichtung durchgeführt, um Tumorzellen zu identifizieren (Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4).
In einem anderen Experiment wurden Mäuse mit orthotopen Tumoren wöchentlich überwacht. Wenn bei den meisten Mäusen ein Tumor-μCT-Scan-Signal nachgewiesen wurde (etwa 2-4 Wochen, je nach PDX-Modell), wurden die Tiere in vier Gruppen randomisiert und entweder mit dem Vehikel, dem Testmedikament (20 mg/kg), dem Standard-Chemotherapeutikum Irinotecan (50 mg/kg) oder dem Testmedikament mit Irinotecan behandelt. Die Medikamente wurden bis zum Ende des Experiments einmal wöchentlich intraperitoneal verabreicht. Das Tumorwachstum wurde während des gesamten Experiments wöchentlich durch μCT-Scans überwacht. Die Ergebnisse zeigten, dass das Testmedikament eine Verkleinerung des Tumorvolumens induzierte, die durch die μCT-Scanbilder berechnet wurde und in Kombination mit einer Irinotecan-Behandlung verstärkt wurde (Abbildung 5 und Abbildung 6).
Frühere Studien in unserem Labor haben gezeigt, dass das Metastasierungspotenzial (Karzinomatose, Lungen- und Lebermetastasen) der orthotopen CRC-PDX-Modelle vom verwendeten PDX-Modell abhängt (Tabelle 3)2. In der vorliegenden Studie wurde auch die therapeutische Wirksamkeit auf die Metastasenbildung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass das Testmedikament Irinotecan und die Kombination die Bildung von Lungen- und Lebermetastasen bei behandelten Mäusen beseitigten (Tabelle 4)11.
Abbildung 1: Makroskopische Aufnahmen des Darms von Mäusen mit orthotopen CRC-PDX-Tumoren. Makroskopische Darmbilder von zwei Mäusen mit einem orthotopen PDX-Tumor (A,B) am Ende des Experiments. Blinddarmtumoren sind in den Bildern rot definiert. (C) Ein Darmbild einer Maus ohne Tumor im Blinddarm als Kontrolle. Maßstabsbalken = 5 mm (A,B); 1 cm (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Histologische Aufnahmen von orthotopen CRC-PDX-Tumoren. H&E-Färbung eines PDX-Tumormodells im Blinddarm am Ende des Experiments bei niedriger (A) und hoher (a) Vergrößerung. Blinddarmtumoren sind in den Bildern rot definiert. Maßstabsbalken = 2,5 mm (A); 100 mm (a). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Histologische Aufnahmen von Lungenmetastasen aus orthotopen CRC-PDX-Tumoren H&E-Färbung einer Lunge einer Maus mit einem orthotopen PDX-Tumor. Lungenmetastasen können bei niedriger (A) und hoher (a) Vergrößerung beobachtet werden. Lungenmetastasen sind in den Bildern rot definiert. Maßstabsleisten = 250 mm (A); 100 mm (a). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Histologische Aufnahmen von Lebermetastasen aus orthotopen CRC-PDX-Tumoren. H&E-Färbung einer Leber einer Maus mit einem orthotopen PDX-Tumor. Lebermetastasen können bei niedriger (A) und hoher (a) Vergrößerung beobachtet werden. Lebermetastasen sind in den Bildern rot definiert. Maßstabsleisten sind in den Bildern angegeben. Maßstabsleisten = 500 mm (A); 50 mm (a). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Therapeutische Wirksamkeit eines Testmedikaments in einem orthotopen CRC-PDX-Modell. Beispiel für ein Experiment mit vier Gruppen (Vehikel, Testmedikament, Irinotecan und Testmedikament mit Irinotecan)11. Das aus den μCT-Scanbildern gewonnene Tumorvolumen wird über die Zeit (A) und am Ende des Experiments (Tag 42) (B) dargestellt. Balken, ± SE (n = 15-30) und *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 gegen Fahrzeug (t-Test, zweiseitig). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: μCT-Bilder von Mäusen mit orthotopen CRC-PDX-Tumoren in Behandlung. Repräsentative μCT-Bilder von Mäusen mit orthotopen Tumoren, die mit einem Therapeutikum behandelt wurden. Der Blinddarm (rot) und die Tumormasse (blau) sind in den Bildern definiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Etablierung der subkutanen PDX. Beispiel für drei im Labor etablierte PDX-Modelle (P1, P2 und P3) aus unserer Biobank2 von mehr als 350 PDX-Modellen mit der Anzahl der inokulierten Zellen, der Häufigkeit der PDX-Etablierung und den Passagen in Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Reagenzien zur Herstellung der Wachstumsfaktoren (GF) MIX 10X, des CoCSCM 6Ab ohne EGF, FGF2 und Wachstumsfaktoren, des CoCSCM 6Ab Komplettmediums und des Aufschlussmediums. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Metastasierungspotenzial von orthotopen CRC-PDX-Modellen. Beispiel für drei orthotope CRC-PDX-Modelle, die im Labor etabliert wurden (P1, P2 und P3) aus unserer Biobank2. Hier werden die Anzahl der inokulierten Zellen, die Häufigkeit der Blinddarmtumorbildung und die Inzidenz zur Entstehung von Karzinatose, Lungenmetastasen oder Lebermetastasen angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Therapeutische metastasierende Wirksamkeit eines Testmedikaments in einem orthotopen CRC-PDX-Modell. Beispiel für ein Experiment mit vier Gruppen (Vehikel, Testmedikament, Irinotecan und Testmedikament mit Irinotecan)11. Hier wird die Anzahl der Mäuse in jeder Gruppe angegeben und welche von ihnen am Ende des Experiments eine Karzinomatose, Lungenmetastasierung oder Lebermetastasierung entwickelt hat. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
In den letzten Jahrzehnten wurden viele neue Krebstherapien entwickelt und an Patienten mit verschiedenen Tumorarten, einschließlich Darmkrebs (CRC), getestet. Obwohl in präklinischen Modellen in vielen Fällen vielversprechende Ergebnisse beobachtet wurden, war die therapeutische Wirksamkeit bei Patienten mit fortgeschrittenem metastasiertem Darmkrebs häufig eingeschränkt. Daher besteht ein dringender Bedarf an präklinischen Modellen, die es ermöglichen, die Wirksamkeit neuer therapeutischer Medikamente in einem klinisch relevanten metastasierten Szenario zu testen.
Das Manuskript beschreibt detailliert ein fortgeschrittenes orthotopes Darmkrebs-PDX-Modell, das auf der Implantation von Patiententumorzellen in die Blinddarmwand immundefizienter Mäuse basiert12.
Die Methodik ist zeitaufwändig und konzentrationserfordernd. Im Durchschnitt kann die Injektion eines Experiments mit 30 Mäusen insgesamt etwa 11 Stunden dauern, einschließlich: 1) PDX-Tumorentnahme (1 Stunde); Tumorbearbeitung (4 h); und Blinddarmimplantation (6 h). Der Eingriff muss unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, um die Zeit für die Tumorbehandlung und Injektion zu minimieren und gleichzeitig die inneren Organe sehr sorgfältig zu manipulieren, um eine operationsbedingte Sterblichkeit zu vermeiden. Es wird daher dringend empfohlen, mehrere Pilotversuche mit Tumorzelllinien oder PDX-Zellen durchzuführen, um die Untersucher zu schulen und mit dem Verfahren vertraut zu machen. Darüber hinaus müssen zwei Forscher an dem Eingriff beteiligt sein, einer für die Entnahme und Verarbeitung des Tumors sowie für die Naht der Tiere und der andere für die Durchführung der eigentlichen Operation.
Es ist auch wichtig zu bedenken, dass Blinddarmtumore je nach PDX-Modell und spezifischer Injektionsstelle in das Lumen des Darms oder in den Blinddarm hineinwachsen können. Das Ergebnis des Tumorwachstums ist schwer zu kontrollieren und kann das Überleben der Mäuse dramatisch beeinflussen, was zu kleineren Tumoren und einem schweren Darmverschluss führt, wenn die Tumore im Lumen wachsen. Die Mäuse müssen daher ab der Woche nach der Zellimplantation wöchentlich überwacht werden. Sobald die meisten Mäuse durch den μCT-Scan ein Tumorsignal aufweisen, sollten Tiere ohne Signal ausgeschlossen und der Rest auf der Grundlage des Tumorvolumens in experimentelle Gruppen randomisiert werden. Um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten, sollte jede Versuchsgruppe 12-15 Mäuse umfassen.
Die Überwachung tumortragender Mäuse ist unerlässlich, um die Wirksamkeit neuer Therapeutika in klinisch relevanten orthotopen Modellen zu bestimmen. μCT-Scans ermöglichen die Identifizierung und Quantifizierung des Primärtumorvolumens bei Mäusen. Die Verwendung eines doppelten Kontrasts erhöht die Empfindlichkeit der μCT-Technik erheblich und verbessert die Qualität der Bilder8. Das Wachstum von Tumorzellen im Blinddarm kann zu intraluminalen Tumoren führen, wenn sie in Richtung des Darmlumens wachsen, oder zu extraluminalen Tumoren, wenn sie aus dem Darmlumen herauswachsen. Beide Szenarien wurden mit der vorherigen Methodik beobachtet und hängen vom verwendeten PDX-Modell und der Injektionsstelle ab. Die Mäuse erholten sich vollständig von dem Scan, ohne klinische Hinweise auf Nierenschäden oder andere Vorfälle. Die Ergebnisse zeigen, dass die μCT-Bildgebung ein nützliches Werkzeug sein kann, um die Entwicklung und das longitudinale Wachstum von Darmkrebs zu überwachen.
Orthotope Modelle rekapitulieren genau den klinischen Darmkrebs 12 und sind sehr nützlich, um die Wirkung neuer Therapeutika auf das Wachstum von Primärtumoren und Leber- und Lungenmetastasen zu testen 2,11. Ein detailliertes schriftliches Protokoll reicht für eine neue Forschungsgruppe jedoch möglicherweise nicht aus, um solch komplexe Modelle zu erstellen. Als Reaktion darauf zielt das vorliegende Video darauf ab, Forschungsgruppen dabei zu unterstützen, dieses Verfahren in ihrer Forschung umzusetzen. Es zeigt das Implantationsverfahren von Zellen in die Blinddarmwand von immundefizienten Mäusen und die Methodik zur Überwachung des Darmtumorwachstums mittels μCT-Scan.
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Disclosures
Nichts.
Acknowledgments
Wir danken der Stiftung Cellex, dem CIBERONC-Netzwerk und dem Instituto de Salud Carlos III für ihre Unterstützung. Darüber hinaus danken wir auch der präklinischen Bildgebungsplattform am Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), wo die Experimente durchgeführt wurden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
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