Summary
Denne protokol beskriver den ortopiske implantation af patientafledte kræftceller i cecumvæggen hos immundefekte mus. Modellen rekapitulerer avanceret kolorektal cancer metastatisk sygdom og giver mulighed for evaluering af nye terapeutiske lægemidler i et klinisk relevant scenario af lunge- og levermetastaser.
Abstract
I løbet af det sidste årti er der etableret mere sofistikerede prækliniske kolorektal cancer (CRC) modeller ved hjælp af patientafledte kræftceller og 3D-tumoroider. Da patientafledte tumororganoider kan bevare egenskaberne ved den oprindelige tumor, muliggør disse pålidelige prækliniske modeller screening af kræftmedicin og undersøgelse af lægemiddelresistensmekanismer. CRC-relateret død hos patienter er dog for det meste forbundet med tilstedeværelsen af metastatisk sygdom. Det er derfor vigtigt at evaluere effektiviteten af kræftbehandlinger i relevante in vivo-modeller , der virkelig rekapitulerer de vigtigste molekylære træk ved human kræftmetastase. Vi har etableret en ortopisk model baseret på injektion af CRC-patientafledte kræftceller direkte i musenes cecumvæg. Disse tumorceller udvikler primære tumorer i cecum, der metastaserer til leveren og lungerne, hvilket ofte observeres hos patienter med avanceret CRC. Denne CRC-musemodel kan bruges til at evaluere lægemiddelresponser overvåget af mikrocomputertomografi (μCT), en klinisk relevant billeddannelsesmetode i lille skala, der let kan identificere primære tumorer eller metastaser hos patienter. Her beskriver vi det kirurgiske indgreb og den nødvendige metode til at implantere patientafledte kræftceller i cecumvæggen hos mus, der er immundefekte.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræftdødpå verdensplan 1. Evnen til at generere in vitro eller in vivo tumormodeller afledt af individuelle patienttumorceller har avanceret præcisionsmedicin inden for onkologi. I løbet af det sidste årti er patientafledte organoider (PDO'er) eller xenotransplantater (PDX'er) blevet brugt af mange forskergrupper rundt om i verden2. BDO'er er multicellulære in vitro-strukturer, der ligner funktionerne i det oprindelige tumorvæv og kan selvorganisere og fornysig selv 3. Disse lovende in vitro-modeller kan med succes anvendes til lægemiddelscreening og til fremme af translationel forskning. På den anden side rekapitulerer PDX-modeller trofast den originale CRC på alle relevante niveauer, fra histologi til molekylære træk og lægemiddelrespons 2,4.
In vivo PDX-modeller dyrkes for det meste som subkutane tumorer i immundefekte mus. Ved hjælp af denne tilgang er PDX'er blevet guldstandarden inden for kræftforskning, især til at studere lægemiddelfølsomhed eller resistens. Imidlertid er CRC-relaterede dødsfald for det meste forbundet med tilstedeværelsen af metastatiske læsioner i leveren, lungen eller bughulen, og ingen af de to tilgange (BOB eller PDX) kan rekapitulere den avancerede kliniske indstilling. Derudover har det specifikke sted for tumorvækst vist sig at bestemme vigtige biologiske egenskaber, der har indflydelse på lægemiddeleffektivitet og sygdomsprognose2. Der er derfor et presserende behov for at etablere prækliniske modeller, der kan anvendes til at vurdere effekten af kræftlægemidler i en klinisk relevant metastatisk indstilling6.
Mikrocomputertomografi (μCT) scannere kan fungere som nedskalerede kliniske CT-scannere, der giver primær tumor- og metastasebilleddannelse hos mus ved en skaleret billedopløsning, der er proportional med CT-billeder af kræftpatienter7. For at modvirke den dårlige bløddelskontrast i μCT-teknikken kan radiologiske jodholdige kontrastmidler anvendes til at forbedre kontrasten og evaluere tumorbyrden. Ved hjælp af en dobbelt kontrast tilgang, oral og intraperitoneal jod administreres på forskellige tidspunkter. Kontrasten administreret oralt hjælper med at definere grænserne mellem tumorvæv og cecumindhold inde i tarmen. På den anden side tillader kontrasten administreret intraperitonealt identifikation af de ydre grænser for tumormassen, som ofte vokser og invaderer peritoneum8.
Manuskriptet beskriver en protokol til udførelse af ortopisk implantation af patientafledte kræftceller i cecumvæggen hos immundefekte mus og metoden til overvågning af tarmtumorvækst ved hjælp af μCT-scanning. Dette manuskript viser, at modellen rekapitulerer det kliniske scenarie for fremskredne tarmtumorer og metastatisk sygdom hos CRC-patienter, som ikke kan studeres ved hjælp af BOB- eller PDXO-modeller. Da ortopiske PDX-modeller af CRC rekapitulerer det kliniske scenario for CRC-patienter, konkluderer vi, at de er de bedste til dato til at teste effekten af antitumorale lægemidler i avancerede tarmtumorer og metastatisk sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter. Projektet blev godkendt af den forskningsetiske komité på Vall d'Hebron Universitetshospital, Barcelona, Spanien (godkendelses-id: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Humane tyktarmsvævsprøver bestod af biopsier fra ikke-nekrotiske områder af primære adenokarcinomer eller levermetastaser, svarende til patienter med tyktarms- og endetarmskræft, der gennemgik tumorresektion. Forsøgene blev udført i henhold til EU's direktiv om dyrepleje (86/609/EØF) og blev godkendt af det etiske udvalg for dyreforsøg ved VHIR-Vall d'Hebron Research Institute (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA og 12/18 CEEA).
BEMÆRK: Kvindelig NIK-SCID (NIK. CB17-Prkdcscid/NcrCrl) mus fra 8 uger blev købt fra Charles River Laboratories.
1. Afledning af patientceller
- Tumor ekstraktion
BEMÆRK: Følgende procedure udføres i et biologisk skab ved stuetemperatur (RT) i dyreanlægget.- Få tumorprøver fra patienternes operationer eller biopsier og fra PDX'er, der vokser subkutant hos mus.
- Til den ortopiske injektion skal du forberede tumorcellerne fra etablerede subkutane PDX-tumormodeller i stedet for væv opnået direkte fra patienter9.
- Generer PDX-tumorer ved at inokulere en suspension af 1 x 105 tumorceller i fosfatbufret saltvand (PBS) (50 μL) blandet med Matrigel-matrix (50 μL) subkutant i flanken af NOD-SCID-mus2.
- Mål tumorvækst ved hjælp af en tykkelse hver anden dag.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at vores laboratorium har genereret en biobank med mere end 350 PDX-modeller. CRC-PDX-tumormodellerne, der anvendes i protokollen, er etablerede PDX-modeller i laboratoriet, der er blevet forstærket mere end tre passager i mus og bestået inklusions- / eksklusionskriterierne med et positivt resultat (tabel 1).
- Mål tumorvækst ved hjælp af en tykkelse hver anden dag.
- Aflive musene ved cervikal dislokation, når subkutane tumorer når den maksimale størrelse, der er fastsat af CEEA (1 cm diameter), eller når dyrene når endepunktskriterier.
- Uddrag tumoren og fjern den forsigtigt fra huden og omgivende ikke-tumorvæv ved hjælp af saks og tang.
- Opbevar de høstede tumorer i PBS ved 4 °C indtil næste trin.
BEMÆRK: Dissocier tumorerne i cellesuspension så hurtigt som muligt efter fjernelse fra deres oprindelige placering i patienternes læsioner eller subkutane xenotransplantater hos mus. Cellelevedygtigheden reduceres signifikant 24 timer efter fjernelse af væv, hvilket resulterer i en ineffektiv implantation i recipientmus.
- Celle forberedelse
BEMÆRK: Følgende procedure udføres i et biologisk skab ved stuetemperatur (RT) i vævskulturrummet.- Dissocier tumorerne ved hjælp af et blad i en 10 cm kulturplade med 1 ml komplet CoCSCM 6Ab-medium (tabel 2) (for at gøre hakning lettere). Den homogene dissocierede prøve anbringes i et 15 ml konisk rør.
- Der tilsættes komplet CoCSCM 6Ab-medium til et slutvolumen på 5 ml (brug højst 3 ml dissocieret prøve i samme glas).
BEMÆRK: Primær CRC resekteret fra patienter er naturligt forurenet med bakterier og svampe. Det er vigtigt at fjerne patogener, der er til stede i den oprindelige patientprøve ved hjælp af en cocktail af seks antibiotika (penicillin, streptomycin, fungizon, kanamycin, gentamycin og nystatin). Injektion af tumorceller forurenet med bakterier i immundefekte mus kan resultere i dyredød. - Inkuber med 50 μL DNase I (0,08 kU/ml) og 50 μL collagenase (1,5 mg/ml) (fordøjelsesmedium; Tabel 2) i 1 time ved 37 °C i en cellekulturkuvøse i en position på 45 °. Bland opløsningen godt hvert 15. minut med en 5 ml pipette før inkubationen.
BEMÆRK: Dissocier tumorvævet og fordøje det ved pipettering flere gange for at opnå en enkelt celleopløsning. Dette er afgørende for at tælle cellerne før injektion i modtagermus og derfor opnå en homogen implantation af tumorceller. - Tilsæt 5 ml komplet CoCSCM 6Ab medium og bland godt med en 5 ml pipette.
- Sorter opløsningen med en 100 μm cellesi ved hjælp af et nyt sterilt 50 ml rør.
- Drej de sorterede celler ved 500 x g i 8 min ved RT.
- Opsug supernatanten.
- Resuspender pellet i 3 ml 1x RBC lysis bufferopløsning.
- Inkuber i 10 minutter ved RT.
- Der tilsættes 3 ml komplet CoCSCM 6Ab-medium, prøven pipetteres, og centrifugeres ved 500 x g i 10 minutter ved RT. Supernatanten suges op.
- Resuspender pellet med 5-10 ml komplet CoCSCM 6Ab-medium, og brug en celletæller til at beregne det samlede antal celler.
- Spin cellerne ved 500 x g i 10 minutter ved RT, og resuspender i 10 ml PBS.
- Resuspender pellet for at opnå en koncentration på 20 x 106 celler / ml, og bland godt for at opnå en homogen cellesuspension.
- Klargør 29 G sprøjter (0,5 ml U 100 kanyle, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) til cecuminjektion i vævskulturen (én sprøjte/mus). Kom 50 μL af tumorcellesuspensionen (1 x 106 celler/injektion) ned i sprøjten og læg den på is. Sørg for, at luftbobler fjernes fra cellesuspensionen.
BEMÆRK: Eliminering af luftbobler, når tumorcellerne er fyldt i sprøjten, er afgørende for at undgå injektion af et for stort volumen i cecumvæggen, hvilket kan resultere i vævsbrud og prøvetab. Det er bydende nødvendigt at blande cellesuspensionen godt, når sprøjten lægges for at undgå ujævn tumorstørrelse blandt mus i samme eksperiment.
2. Ortopisk injektion i cecum
BEMÆRK: Følgende procedure udføres på en bænk i et specifikt patogenfrit rum (SPF) på dyreanlægget. Det anvendte udstyr er tidligere rengjort og steriliseret. Derudover steriliseres den igen i en bærbar sterilisator mellem individer eller zoner i dyreanlægget.
- Rengør det kirurgiske sted ved at sprøjte med desinfektionsmiddel og aftørring.
- Depilere musenes mave ved hjælp af en hårfjerningsmaskine til musen.
- Placer musen i liggende stilling. Brug 2% isofluran til at bedøve dyret. Bekræft effekten af anæstesi ved forsigtigt at klemme ekstremiteten og observere fraværet af stimulering.
- Placer en 50-100 μL dråbe veterinærsalve (3 mg / g Lacryvisc) i øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
- Desinficer musens mave ved at skrubbe med chlorhexidin eller povidon-jod flere gange i en cirkulær bevægelse.
- Lav et 1 cm langsgående snit over underlivet ved hjælp af kirurgisaks. Adskil forsigtigt huden til hvert sted for at præsentere bughinden, der er under huden.
- Lav et 0,5-1 cm snit i peritoneummembranen, stort nok til at udvendiggøre cecum.
BEMÆRK: Udvendig cecum uden overdreven manipulation af de indre organer, hvilket dramatisk kan øge procedurens dødelighed. - Isoler forsigtigt cecum fra musen ved hjælp af en forudskåret, steril gasbind.
- Fugt cecum med saltopløsning gennem hele proceduren.
- Immobiliser cecum ved forsigtigt at tage fat i det med tang, og indfør nålen overfladisk i cecumvæggen. Undgå kapillærer og kar på injektionsstedet. Fjern bobler fra cellesuspensionen.
- Injicer hele 50μL tumorcellesuspension langsomt. Det tager normalt omkring 10 sekunder at administrere. Undgå perforering af cecum lumen med nålen, da dette resulterer i eliminering af tumorcellesuspensionen fra kroppen gennem intestinal peristaltik.
BEMÆRK: Injektion af tumorcellesuspensionen i musenes cecum er det mest udfordrende trin i hele proceduren. Et stærkt lys fokuseret på injektionsstedet og en forstørrelseslampe bør anvendes i denne del af protokollen. Indfør nålen parallelt med cecumoverfladen. Cecum er et meget skrøbeligt væv; Derfor bør immobilisering af cecum udføres ved hjælp af kirurgiske tang og ved at anvende let tryk for at undgå vævsbrud, der resulterer i blødning. Vellykket implantation resulterer i en hvid boble (pellet af celler) i cecumvæggen. Hvis boblen ikke kan visualiseres, kan det indikere, at cecum er blevet perforeret, og cellerne er endt i cecum lumen, hvilket resulterer i deres clearance i tarmkanalen. - Efter injektionen fjernes nålen langsomt fra cecum og påføres let tryk på injektionsstedet med en applikator med bomuldsspids for at undgå, at tumorceller slipper ud og reducerer let blødning.
- Rengør cecum med saltopløsning for at fjerne snavs.
- Returner cecum tilbage i dyrets underliv.
- Luk bughinden ved hjælp af 5/0 suturer.
- Luk huden på maven ved hjælp af 5/0 suturer.
- Administrer postoperative antibiotika (100 mg/kg amoxicillin eller 20 mg/kg enrofloxacin) og analgetika (5 mg/ml metacam/meloxicam) ved subkutan injektion. Placer musene på en varmepude og hold dem der, indtil de er helt genoprettet. Derefter returneres dem til buret med andre dyr.
3. Evaluering af ortopisk tumorvækst ved hjælp af μCT-scanning
BEMÆRK: Følgende procedure udføres i den prækliniske billeddannelsesplatform (PIP) fra dyreanlægget.
- Udfør alle dyreforsøg i henhold til institutionelle etiske komitébestemmelser.
- Begynd at overvåge tumorvolumenet med μCT 2 uger efter celleinjektion og hver uge derefter.
- Kontrastmidlet iopamiro (300 mg/ml) fortyndes frisk i saltopløsning i forholdet 3:1 for begge doser. Der indgives 300 ml iopamiro med oral sonde.
BEMÆRK: På grund af μCT's dårlige bløddelskontrast anbefales et kontrastmiddel for at forbedre teknikkens følsomhed. Protokollen omfatter en oral administration af et jodbaseret middel (iopamiro) for at afgrænse den intraluminale tumorbyrde og en sekundær intraperitoneal administration af det samme middel for at definere tumorbyrden i tarmens viscerale overflade. Pilotforsøg er tidligere blevet udført for at bestemme det nøjagtige tidspunkt, hvor kontrastmidlet skal ankomme til musens cecum, før det elimineres. I tilfælde af iopamiro er det omkring 2 timer. - Efter 2 timer administreres en intraperitoneal injektion af 300 ml tidligere fortyndet iopamiro. Administrationen hjælper med at definere tumorgrænserne i parietalansigtet.
- Bedøv dyrene ved hjælp af 2% isofluran.
- Efter at have bekræftet, at dyret er korrekt bedøvet ved at klemme musens fod, skal du placere dyret i scanningssengen på μCT. Den bedste position er liggende (med forsiden opad).
- I kontrolsoftwaren skal du starte live-tilstand (fluoroskopitilstand) for at placere abdominalområdet i scannerens synsfelt (FOV). For at gøre det skal du flytte sengen frem og tilbage og sideværts, indtil den ønskede position er opnået. Drej røntgenrøret og detektoren 90°, og flyt scanningslejet i y-aksen for at centrere dyret fuldstændigt.
- Brug følgende parametre til μCT-scanningsbilleder: 30 mm FOV, 26 s anskaffelsestid, 90 kV strømspænding og 200 μA strømstyrke ved hjælp af et FX μCT-billeddannelsessystem.
- Sæt dyrene tilbage i deres bure for at komme sig, når scanningen er afsluttet. Sørg for termisk støtte og overvåg dyrene, indtil de kommer sig efter anæstesi, inden de vender tilbage til boliger.
- μCT-anskaffelsen giver en fil på 250 Mb for hver scanning. De oprettede datafiler har et VOX-format. For at gøre dem tilgængelige for enhver billedanalysesoftware skal du konvertere filerne til DICOM-format ved hjælp af databasestyringssoftwaren til μCT. Gem batchen af oprettede filer på en bærbar harddisk for at analysere dem ved hjælp af enhver computer med tilgængelig billedbehandlingssoftware.
BEMÆRK: Under billedanalyse er cecum lokaliseret som en udvidet tarm med et radiodense indhold (iopamiro), ofte i venstre side af kaudale mave. I cecumets viscerale bøjning observeres en vægfortykkelse sammenlignet med de tilstødende tarmområder. Fortykkelsen svarer til tumorvækst. - Når tumoren er lokaliseret, skal du finde den højeste diameter i de forskellige visninger (aksial, koronal og sagittal). Mål disse tre akser og beregn tumorvolumenet efter ellipsoidformlen: volumen = 4/3π x (x-semiakse x y-semiakse x z-semiakse)10.
4. Terapeutisk indgreb hos mus, der bærer ortopiske tumorer
- Overvåg musene med ortopiske tumorer ugentligt.
- Når en tumor μCT-scanningssignal detekteres i de fleste mus, skal du udføre en anden μCT-scanning den følgende uge for at bekræfte tilstedeværelsen af tumoren.
BEMÆRK: Tiden til at starte behandlingen afhænger af den anvendte PDX-model og varierer fra 3-12 uger efter tumorcellepodning i cecum. - Randomiser musene i fire grupper: en køretøjsgruppe (n = 10-15 mus), en testlægemiddelgruppe (n = 10-15 mus), en kemoterapigruppe med standardpleje (n = 10-15 mus) og en kombinationsbehandlingsgruppe (n = 10-15 mus).
- Musene behandles intraperitonealt med saltvand (vehikelgruppe), testlægemidlet (20 mg/kg) (testlægemiddelgruppe), irinotecan (50 mg/kg) (standardbehandlingsgruppe) eller testlægemidlet (20 mg/kg) med irinotecan (50 mg/kg) (kombinationsbehandlingsgruppe). Udfør administrationen en gang om ugen indtil eksperimentets afslutning.
- Overvåg tumorvæksten ugentligt ved μCT-scanning i løbet af eksperimentet.
- Ved afslutningen af eksperimentet skal du aflive musene ved cervikal dislokation og indsamle lever, lunger og andre mulige læsioner i andre organer.
- Medtag vævsprøverne i kassetter og inkuber dem i 4% formalin natten over. Brug tarmvæv fra en mus uden tumor i cecum som kontrol.
- Kassetterne fjernes fra formalin og inkuberes med 70% ethanol i mindst 3 timer.
- Integrer kassetterne med paraffin, ved hjælp af histopatologiske facilitet standardprotokoller.
- Udfør hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning fra cecum, lever og lunge ved hjælp af histopatologiske facilitetsstandardprotokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus, ortopisk implanteret med patientafledte kræftceller, blev overvåget ugentligt ved μCT-scanning. Ved forsøgets afslutning blev dyrene aflivet. Tarme, ceca (figur 1A, B), lever, lunger og enhver anden mulig læsion blev opsamlet, inkluderet i en kassette og fikseret med 4% formalin natten over. Tarmvæv fra en mus uden tumor i cecum blev anvendt som kontrol (figur 1C). Endelig blev kassetter ændret til 70% ethanol i mindst 3 timer og paraffin indlejret. Hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning fra ceca, lever og lunger blev udført ved hjælp af histopatologiske facilitetsstandardprotokoller til identifikation af tumorceller (figur 2, figur 3 og figur 4).
I et andet eksperiment blev mus, der bærer ortotopiske tumorer, overvåget ugentligt. Når et tumor μCT-scanningssignal blev påvist hos de fleste mus (ca. 2-4 uger afhængigt af PDX-modellen), blev dyrene randomiseret i fire grupper og behandlet med enten vehikel, testlægemidlet (20 mg / kg), standardbehandling kemoterapi irinotecan (50 mg / kg) eller testlægemidlet med irinotecan. Lægemidlerne blev administreret intraperitonealt en gang om ugen indtil eksperimentets afslutning. Tumorvækst blev overvåget ugentligt ved μCT-scanning i løbet af eksperimentet. Resultaterne indikerede, at testlægemidlet inducerede en reduktion af tumorvolumenet, beregnet ved μCT-scanningsbillederne, og det blev forbedret i kombination med irinotecanbehandling (figur 5 og figur 6).
Tidligere undersøgelser i vores laboratorium har vist, at det metastatiske potentiale (carcinomatose, lunge- og levermetastaser) af de ortopiske CRC-PDX-modeller afhænger af den anvendte PDX-model (tabel 3)2. I denne undersøgelse blev den terapeutiske effekt på metastasedannelse også evalueret. Resultaterne indikerede, at testlægemidlet, irinotecan, og kombinationen udryddede dannelsen af lunge- og levermetastaser hos behandlede mus (tabel 4)11.
Figur 1: Makroskopiske billeder af tarmen hos mus med ortopiske CRC-PDX-tumorer. Makroskopiske tarmbilleder fra to mus med en ortopisk PDX-tumor (A,B) i slutningen af eksperimentet. Cecum tumorer er defineret i rødt i billederne. (C) Et tarmbillede af en mus uden tumor i cecum som kontrol. Skalastænger = 5 mm (A, B); 1 cm (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Histologiske billeder af ortopiske CRC-PDX tumorer. H &E farvning af en PDX tumor model i cecum i slutningen af eksperimentet ved lav (A) og høj (a) forstørrelse. Cecum tumorer er defineret i rødt i billederne. Skalastænger = 2,5 mm (A); 100 mm (a). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Histologiske billeder af lungemetastase afledt af ortopisk CRC-PDX-tumor H&E-farvning af en lunge fra en mus, der bærer en ortopisk PDX-tumor. Lungemetastaser kan observeres ved lav (A) og høj (a) forstørrelse. Lungemetastaser er defineret med rødt i billederne. Skalastænger = 250 mm (A); 100 mm (a). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Histologiske billeder af levermetastaser afledt af ortopiske CRC-PDX-tumorer. H &E farvning af en lever fra en mus, der bærer en ortopisk PDX tumor. Levermetastaser kan observeres ved lav (A) og høj (a) forstørrelse. Levermetastaser er defineret med rødt på billederne. Skalabjælker er angivet på billederne. Skalastænger = 500 mm (A); 50 mm (a). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Terapeutisk effekt af et testlægemiddel i en ortopisk CRC-PDX-model. Eksempel på et eksperiment med fire grupper (vehikel, teststof, irinotecan og testlægemiddel med irinotecan)11. Tumorvolumen opnået fra μCT-scanningsbillederne er repræsenteret over tid (A) og ved afslutningen af eksperimentet (dag 42) (B). Stænger, ± SE (n = 15-30) og *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 versus køretøj (t-test, tosidet). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: μCT-billeder fra mus med ortopiske CRC-PDX-tumorer under behandling. Repræsentative μCT-billeder af mus med ortopiske tumorer behandlet med et terapeutisk lægemiddel. Cecum (rød) og tumormasse (blå) er defineret i billederne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Etablering af subkutan PDX. Eksempel på tre PDX-modeller etableret i laboratoriet (P1, P2 og P3) fra vores biobank2 af mere end 350 PDX-modeller med antallet af podede celler, forekomsten af PDX-etablering og passagerne i mus. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Reagenser til fremstilling af vækstfaktorer (GF) MIX 10X, CoCSCM 6Ab uden EGF, FGF2 og vækstfaktorer, CoCSCM 6Ab komplet substrat og fordøjelsesmediet. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Metastatisk potentiale af ortopiske CRC-PDX-modeller. Eksempel på tre ortopiske CRC-PDX-modeller etableret i laboratoriet (P1, P2 og P3) fra vores biobank2. Her angives antallet af podede celler, forekomsten af cecumtumordannelse og forekomsten af at generere carcinomatose, lungemetastase eller levermetastase. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Terapeutisk metastatisk effekt af et testlægemiddel i en ortopisk CRC-PDX-model. Eksempel på et eksperiment med fire grupper (vehikel, teststof, irinotecan og testlægemiddel med irinotecan)11. Her angives antallet af mus i hver gruppe, og hvilke af dem der udviklede carcinomatose, lungemetastase eller levermetastase i slutningen af eksperimentet. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løbet af de sidste par årtier er mange nye kræftbehandlinger blevet udviklet og testet hos patienter med forskellige tumortyper, herunder kolorektal cancer (CRC). Selvom lovende resultater i prækliniske modeller er blevet observeret i mange tilfælde, har den terapeutiske effekt hos patienter med avanceret metastatisk CRC ofte været begrænset. Derfor er der et presserende behov for prækliniske modeller, der gør det muligt at teste effekten af nye terapeutiske lægemidler i et klinisk relevant metastatisk scenario.
Manuskriptet beskriver detaljeret en avanceret CRC ortotopisk PDX-model baseret på implantation af patienttumorceller i cecumvæggen hos immundefekte mus12.
Metoden er tidskrævende og koncentrationskrævende. I gennemsnit kan injektionen af et forsøg med 30 mus tage omkring 11 timer i alt, herunder: 1) PDX tumoropsamling (1 time); tumorbehandling (4 timer); og cecumimplantation (6 timer). Proceduren skal udføres under sterile forhold, hvilket minimerer tiden til tumorbehandling og injektion, mens man manipulerer indre organer meget omhyggeligt for at undgå kirurgisk relateret dødelighed. Det anbefales derfor stærkt, at flere pilotforsøg udføres med tumorcellelinjer eller PDX-celler for at træne efterforskerne og gøre dem fortrolige med proceduren. Derudover skal to forskere være involveret i proceduren, den ene til at indsamle og behandle tumoren samt hjælpe med dyrenes suturer, og den anden til at udføre selve operationen.
Det er også vigtigt at overveje, at cecumtumorer kan vokse ind i tarmens lumen eller inde i cecum, afhængigt af PDX-modellen og det specifikke injektionssted. Resultatet af tumorvæksten er vanskelig at kontrollere og kan dramatisk påvirke musenes overlevelse, hvilket resulterer i mindre tumorer og en alvorlig tarmobstruktion, når tumorerne vokser inde i lumen. Musene skal derfor overvåges ugentligt, startende fra ugen efter celleimplantation. Når de fleste mus præsenterer et tumorsignal ved μCT-scanningen, bør dyr uden signal udelukkes, og resten randomiseres i eksperimentelle grupper baseret på tumorvolumen. For at opnå statistisk signifikante resultater skal hver forsøgsgruppe omfatte 12-15 mus.
Overvågning af tumorbærende mus er afgørende for at bestemme effekten af nye terapeutiske midler i klinisk relevante ortopiske modeller. μCT-scanninger muliggør identifikation og kvantificering af primær tumorvolumen hos mus. Brugen af en dobbelt kontrast øger følsomheden af μCT-teknikken betydeligt, hvilket forbedrer billedernes kvalitet8. Væksten af tumorceller i cecum kan føre til intraluminale tumorer, hvis de vokser mod tarmens lumen, eller ekstraluminale tumorer, hvis de vokser ud af tarmens lumen. Begge scenarier er blevet observeret med den tidligere metode og afhænger af den anvendte PDX-model og injektionsstedet. Musene kom sig fuldstændigt efter scanningen uden kliniske tegn på nyreskade eller andre hændelser. Resultaterne viser, at μCT-billeddannelse kan være et nyttigt værktøj til overvågning af CRC's udvikling og vækst i længderetningen.
Ortopiske modeller rekapitulerer nøjagtigt klinisk CRC12 og er meget nyttige til at teste effekten af nye terapeutiske lægemidler på primær tumorvækst og lever- og lungemetastaser 2,11. En detaljeret skriftlig protokol er dog muligvis ikke tilstrækkelig til, at en ny forskergruppe kan etablere sådanne komplekse modeller. Som svar har denne video til formål at guide forskergrupper til at implementere denne procedure i deres forskning. Det viser implantationsproceduren for celler i cecumvæggen hos immundefekte mus og metoden til overvågning af tarmtumorvækst ved hjælp af μCT-scanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi anerkender Cellex Foundation, CIBERONC-netværket og Instituto de Salud Carlos III for deres støtte. Desuden takker vi også den prækliniske billeddannelsesplatform på Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), hvor eksperimenterne blev udført.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B.
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
