Summary
Denne protokollen beskriver den ortotopiske implantasjonen av pasientavledede kreftceller i cecumveggen hos immundefekte mus. Modellen rekapitulerer avansert metastatisk sykdom i kolorektal kreft og muliggjør evaluering av nye terapeutiske legemidler i et klinisk relevant scenario for lunge- og levermetastaser.
Abstract
I løpet av det siste tiåret har mer sofistikerte prekliniske kolorektal kreft (CRC) modeller blitt etablert ved hjelp av pasientavledede kreftceller og 3D-tumoroider. Siden pasientavledede tumororganoider kan beholde egenskapene til den opprinnelige svulsten, muliggjør disse pålitelige prekliniske modellene screening av kreftmedisiner og studiet av legemiddelresistensmekanismer. Imidlertid er CRC-relatert død hos pasienter hovedsakelig forbundet med tilstedeværelsen av metastatisk sykdom. Det er derfor viktig å evaluere effekten av anti-kreftbehandlinger i relevante in vivo-modeller som virkelig rekapitulerer de viktigste molekylære egenskapene til human kreftmetastase. Vi har etablert en ortotopisk modell basert på injeksjon av CRC-pasientavledede kreftceller direkte inn i cecumveggen hos mus. Disse tumorcellene utvikler primære svulster i cecum som metastaserer til leveren og lungene, noe som ofte observeres hos pasienter med avansert CRC. Denne CRC-musemodellen kan brukes til å evaluere legemiddelresponser overvåket av mikrocomputertomografi (μCT), en klinisk relevant småskala bildebehandlingsmetode som lett kan identifisere primære svulster eller metastaser hos pasienter. Her beskriver vi den kirurgiske prosedyren og den nødvendige metodikken for å implantere pasientavledede kreftceller i cecumveggen hos immundefekte mus.
Introduction
Kolorektal kreft (CRC) er den nest største årsaken til kreftdød over hele verden1. Evnen til å generere in vitro eller in vivo tumormodeller avledet fra individuelle pasienttumorceller har avansert presisjonsmedisin innen onkologi. I løpet av det siste tiåret har pasientavledede organoider (PUD) eller xenotransplantater (PDX) blitt brukt av mange forskningsgrupper rundt om i verden2. PUD er flercellede in vitro-strukturer som ligner funksjonene i det opprinnelige tumorvevet og kan selvorganisere og selvfornye3. Disse lovende in vitro-modellene kan med hell brukes til narkotikascreening og legge til rette for translasjonsforskning. På den andre siden rekapitulerer PDX-modellene trofast den opprinnelige CRC på alle relevante nivåer, fra histologi til molekylære egenskaper og legemiddelrespons 2,4.
In vivo PDX-modeller dyrkes for det meste som subkutane svulster i immundefekte mus. Ved hjelp av denne tilnærmingen har PDX blitt gullstandarden i kreftforskning, spesielt for å studere legemiddelfølsomhet eller resistens. Imidlertid er CRC-relaterte dødsfall hovedsakelig forbundet med tilstedeværelsen av metastaserende lesjoner i leveren, lungen eller bukhulen, og ingen av de to tilnærmingene (PUD eller PDX) kan rekapitulere den avanserte kliniske innstillingen. I tillegg har det spesifikke stedet for tumorvekst vist seg å bestemme viktige biologiske egenskaper som har innvirkning på legemiddeleffekt og sykdomsprognose2. Derfor er det et presserende behov for å etablere prekliniske modeller som kan brukes til å vurdere effekten av kreftmedisiner i en klinisk relevant metastatisk setting6.
Mikrocomputertomografiskannere (μCT) kan fungere som nedskalerte kliniske CT-skannere, og gir primærtumor- og metastaseavbildning hos mus med en skalert bildeoppløsning proporsjonal med CT-bilder av kreftpasienter7. For å motvirke den dårlige bløtvevskontrasten til μCT-teknikken, kan radiologiske joderte kontrastmidler brukes til å forbedre kontrasten og evaluere tumorbelastningen. Ved hjelp av en dobbel kontrasttilnærming administreres oralt og intraperitonealt jod på forskjellige tidspunkter. Kontrasten administrert oralt bidrar til å definere grensene mellom tumorvev og cecum innhold inne i tarmen. På den andre siden tillater kontrasten administrert intraperitonealt identifisering av de ytre grensene for tumormassen, som ofte vokser og invaderer bukhinnen8.
Manuskriptet beskriver en protokoll for å utføre ortotopisk implantasjon av pasientavledede kreftceller i cecumveggen hos immundefekte mus, og metodikken for å overvåke intestinal tumorvekst ved hjelp av μCT-skanning. Det foreliggende manuskriptet viser at modellen rekapitulerer det kliniske scenariet med avanserte tarmsvulster og metastatisk sykdom hos CRC-pasienter som ikke kan studeres ved hjelp av PUD- eller PDXO-modeller. Siden ortotopiske PDX-modeller av CRC rekapitulerer det kliniske scenariet for CRC-pasienter, konkluderer vi med at de er de beste til dags dato for å teste effekten av antitumorale legemidler i avanserte tarmtumorer og metastatisk sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det ble innhentet skriftlig informert samtykke fra alle pasientene. Prosjektet ble godkjent av forskningsetisk komité ved Vall d'Hebron universitetssykehus, Barcelona, Spania (godkjenning ID: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Vevsprøver fra humant tykktarm besto av biopsier fra ikke-nekrotiske områder av primære adenokarsinomer eller levermetastaser, svarende til pasienter med tykk- og endetarmskreft som var tumorreseksjonert. Forsøkene ble utført i henhold til EUs dyrepleiedirektiv (86/609/EØF) og ble godkjent av den etiske komiteen for dyreforsøk ved VHIR-Vall d'Hebron Research Institute (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA og 12/18 CEEA).
MERK: Kvinne NOD-SCID (NIKK. CB17-Prkdcscid/NcrCrl) mus fra 8 ukers alder ble kjøpt fra Charles Laboratories.
1. Derivasjon av pasientceller
- Tumor ekstraksjon
MERK: Følgende prosedyre utføres i et biologisk skap ved romtemperatur (RT) i dyreavdelingen.- Få tumorprøver fra pasientens operasjoner eller biopsier og fra PDX-er som vokser subkutant hos mus.
- For den ortotopiske injeksjonen, klargjør tumorcellene fra etablerte subkutane PDX-tumormodeller i stedet for vev oppnådd direkte fra pasienter9.
- Generer PDX-svulster ved å inokulere en suspensjon av 1 x 105 tumorceller i fosfatbufret saltvann (PBS) (50 μL) blandet med Matrigel matriks (50 μL) subkutant i flanken av NOD-SCID mus2.
- Mål tumorvekst ved hjelp av en tykkelse annenhver dag.
MERK: Det er viktig at laboratoriet vårt har generert en biobank med mer enn 350 PDX-modeller. CRC-PDX-tumormodellene som brukes i protokollen er etablerte PDX-modeller i laboratoriet som har blitt amplifisert mer enn tre passasjer hos mus, og bestått inklusjons-/eksklusjonskriteriene med positivt resultat (tabell 1).
- Mål tumorvekst ved hjelp av en tykkelse annenhver dag.
- Avlive musene ved cervikal dislokasjon når subkutane svulster når maksimal størrelse fastsatt av CEEA (1 cm diameter), eller når dyrene når endepunktskriterier.
- Trekk ut svulsten og fjern den forsiktig fra huden og det omkringliggende ikke-tumorvevet ved hjelp av saks og tang.
- Oppbevar de høstede svulstene i PBS ved 4 °C til neste trinn.
MERK: Dissosiere svulstene i cellesuspensjon så snart som mulig etter fjerning fra sin opprinnelige plassering i pasientens lesjoner eller subkutane xenotransplantater hos mus. Cellens levedyktighet reduseres betydelig 24 timer etter fjerning av vev, noe som resulterer i en ineffektiv implantasjon hos mottakermus.
- Cell forberedelse
MERK: Følgende prosedyre utføres i et biologisk skap ved romtemperatur (RT) i vevskulturrommet.- Dissosiere svulstene ved hjelp av et blad i en 10 cm dyrkningsplate med 1 ml komplett CoCSCM 6Ab-medium (tabell 2) (for å gjøre hakking enklere). Plasser den homogene dissosierte prøven i et 15 ml konisk rør.
- Tilsett komplett CoCSCM 6Ab-medium til et endelig volum på 5 ml (bruk ikke mer enn 3 ml dissosiert prøve i samme rør).
MERK: Primær CRC resektert fra pasienter er naturlig forurenset med bakterier og sopp. Det er viktig å fjerne patogener som er tilstede i den opprinnelige pasientprøven ved hjelp av en cocktail av seks antibiotika (penicillin, streptomycin, fungizon, kanamycin, gentamycin og nystatin). Injeksjon av tumorceller forurenset med bakterier i immundefekte mus kan føre til dyredød. - Inkuber med 50 μL DNase I (0,08 kU / ml) og 50 mikrol kollagenase (1,5 mg / ml) (fordøyelsesmedium; Tabell 2) i 1 time ved 37 °C i en cellekulturinkubator, i 45° stilling. Bland løsningen godt hvert 15. minutt med en 5 ml pipette før inkubasjonen.
MERK: Dissociate tumorvevet og fordøye det ved pipettering flere ganger for å oppnå en enkelt celle løsning. Dette er viktig for å telle cellene før injeksjon i mottakermus og dermed oppnå en homogen implantasjon av tumorceller. - Tilsett 5 ml komplett CoCSCM 6Ab medium og bland godt med en 5 ml pipette.
- Sorter løsningen med en 100 μm cellesil ved hjelp av et nytt sterilt 50 ml rør.
- Spinn de sorterte cellene ved 500 x g i 8 min ved RT.
- Aspirer supernatanten.
- Resuspender pelleten i 3 ml 1x RBC lysisbufferløsning.
- Inkuber i 10 min ved RT.
- Tilsett 3 ml komplett CoCSCM 6Ab-medium, pipetter prøven og roter ved 500 x g i 10 minutter ved RT. Aspirer supernatanten.
- Resuspender pelleten med 5-10 ml komplett CoCSCM 6Ab-medium, og bruk en celleteller til å beregne totalt antall celler.
- Spinn cellene ved 500 x g i 10 minutter ved RT, og resuspender i 10 ml PBS.
- Resuspender pelleten for å oppnå en konsentrasjon på 20 x 106 celler/ml, og bland godt for å oppnå en homogen cellesuspensjon.
- Klargjør sprøyter på 29 G (0,5 ml E 100 kanyle, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) for cecuminjeksjon i vevskultur (én sprøyte/mus). Legg 50 μL av tumorcellesuspensjonen (1 x 106 celler/injeksjon) inn i sprøyten og oppbevar den på is. Sørg for at luftbobler fjernes fra cellesuspensjonen.
MERK: Eliminering av luftbobler når tumorcellene er lastet i sprøyten er viktig for å unngå injeksjon av for høyt volum i cecumveggen, noe som kan føre til vevsbrudd og prøvetap. Det er viktig å blande cellesuspensjonen godt når du legger sprøyten for å unngå ujevn tumorstørrelse blant mus i samme eksperiment.
2. Ortotopisk injeksjon i cecum
MERK: Følgende prosedyre utføres på en benk i et spesifikt patogenfritt (SPF) rom på dyreavdelingen. Utstyret som brukes er tidligere rengjort og sterilisert. I tillegg steriliseres det igjen i en bærbar sterilisator mellom individer eller soner i dyreavdelingen.
- Rengjør operasjonsstedet ved å spraye med desinfiserende vaskemiddel og tørke.
- Depilate musens mage ved hjelp av en mushårfjerningsmaskin.
- Plasser musen i liggende stilling. Bruk 2% isofluran til å bedøve dyret. Bekreft effekten av anestesi ved forsiktig å klemme ekstremiteten og observere fraværet av stimulering.
- Drypp en 50-100 μl dråpe veterinærsalve (3 mg/g Lacryvisc) i øynene for å unngå tørrhet under anestesi.
- Desinfiser musens mage ved å skrubbe med klorhexidin eller povidon-jod flere ganger i en sirkulær bevegelse.
- Lag et 1 cm langsgående snitt over underlivet ved hjelp av kirurgisaks. Forsiktig skille huden til hvert sted for å presentere bukhinnen som er under huden.
- Lag et 0,5-1 cm snitt i bukhinnen, stor nok til å eksteriorisere cecum.
MERK: Eksteriorisere cecum uten overdreven manipulere de indre organene, noe som kan dramatisk øke dødeligheten av prosedyren. - Isoler forsiktig cecum fra musen ved hjelp av en forhåndskuttet, steril gasbind.
- Fukt cecum med saltoppløsning gjennom hele prosedyren.
- Immobiliser cecum ved forsiktig å ta tak i den med tang, og før nålen overfladisk inn i cecumveggen. Unngå kapillærer og kar på injeksjonsstedet. Fjern bobler fra cellesuspensjonen.
- Injiser hele 50μL tumorcellesuspensjonen sakte. Det tar vanligvis rundt 10 s å administrere. Unngå perforering av cecum lumen med nålen, da dette resulterer i eliminering av tumorcellesuspensjonen fra kroppen gjennom intestinal peristaltikk.
MERK: Injisering av tumorcellesuspensjonen i musens cecum er det mest utfordrende trinnet i hele prosedyren. Et sterkt lys fokusert på injeksjonsstedet og en forstørrelseslupe bør brukes i denne delen av protokollen. Sett nålen parallelt med cecumoverflaten. Cecum er et svært skjøre vev; Derfor bør immobilisering av cecum utføres ved hjelp av kirurgisk tang og ved å påføre forsiktig trykk for å unngå vevsbrudd som resulterer i blødning. Vellykket implantasjon resulterer i en hvit boble (pellet av celler) i cecumveggen. Hvis boblen ikke kan visualiseres, kan det tyde på at cecum har blitt perforert og cellene har endt i cecum lumen, noe som resulterer i deres clearance av tarmkanalen. - Etter injeksjon, fjern nålen sakte fra cecum og påfør forsiktig trykk på injeksjonsstedet med en bomullstippet applikator for å unngå at tumorceller rømmer og reduserer liten blødning.
- Rengjør cecum med saltoppløsning for å fjerne rusk.
- Sett cecum tilbake i dyrets underliv.
- Lukk bukhinnen med 5/0 suturer.
- Lukk huden på magen ved hjelp av 5/0 suturer.
- Administrer postoperative antibiotika (100 mg/kg amoksicillin eller 20 mg/kg enrofloksacin) og analgetika (5 mg/ml metacam/meloksikam) ved subkutan injeksjon. Plasser musene på en varmepute og hold dem der til de har kommet seg helt. Deretter returnerer du dem til buret med andre dyr.
3. Evaluering av ortotopisk tumorvekst ved bruk av μCT-skanning
MERK: Følgende prosedyre utføres i preklinisk bildebehandlingsplattform (PIP) fra dyreavdelingen.
- Utfør alle dyreprosedyrer i henhold til institusjonelle etiske komiteforskrifter.
- Begynn å overvåke tumorvolumet med μCT 2 uker etter celleinjeksjon, og deretter hver uke.
- Fortynn kontrastmidlet iopamiro (300 mg/ml) i saltoppløsning i forholdet 3:1 for begge doser. Administrer 300 ml iopamiro ved oral gavage.
MERK: På grunn av den dårlige bløtvevskontrasten til μCT, anbefales et kontrastmiddel for å forbedre følsomheten til teknikken. Protokollen inkluderer en oral administrering av et jodbasert middel (iopamiro) for å avgrense den intraluminale tumorbelastningen, og en sekundær intraperitoneal administrering av samme middel for å definere tumorbelastningen i tarmens viscerale ansikt. Pilotforsøk har tidligere blitt utført for å bestemme den nøyaktige tiden kontrastmiddelet trenger for å komme til cecum av mus før eliminering. Når det gjelder iopamiro, er det rundt 2 timer. - Etter 2 timer administreres en intraperitoneal injeksjon på 300 ml tidligere fortynnet iopamiro. Administrasjonen bidrar til å definere tumorgrensene i parietalflaten.
- Bedøv dyrene med 2% isofluran.
- Etter å ha bekreftet at dyret er riktig bedøvet ved å klemme musens fot, plasser dyret i skannesengen til μCT. Den beste posisjonen er liggende (med forsiden opp).
- I kontrollprogramvaren starter du live-modus (fluoroskopimodus) for å plassere bukområdet i skannerens synsfelt (FOV). For å gjøre det, flytt sengen fremover og bakover og sideveis til ønsket posisjon er oppnådd. Roter røntgenrøret og detektoren 90°, og flytt skannesengen i y-aksen for å sentrere dyret helt.
- Bruk følgende parametere for μCT-skannebildene: 30 mm FOV, 26 s innsamlingstid, 90 kV strømspenning og 200 μA strømstyrke ved bruk av et FX μCT-bildesystem.
- Returner dyrene til burene for gjenoppretting når skanningen er ferdig. Gi termisk støtte og overvåke dyrene til de gjenoppretter fra anestesi før de kommer tilbake til boliger.
- μCT-innsamlingen gir en fil på 250 Mb for hver skanning. De opprettede datafilene har et VOX-format. For å gjøre dem tilgjengelige for enhver programvare for bildeanalyse, konverter filene til DICOM-format ved hjelp av databaseadministrasjonsprogramvaren til μCT. Lagre bunken med opprettede filer på en bærbar harddisk for å analysere dem ved hjelp av en hvilken som helst datamaskin med tilgjengelig bildebehandlingsprogramvare.
MERK: Under bildeanalyse er cecum lokalisert som en utvidet tarm med et radiotett innhold (iopamiro), ofte i venstre side av caudal abdomen. I den viscerale bøyningen av cecum observeres en veggfortykning, sammenlignet med de tilstøtende tarmområdene. Fortykningen tilsvarer tumorvekst. - Når svulsten er lokalisert, finn den høyeste diameteren i de forskjellige visningene (aksial, koronal og sagittal). Mål disse tre aksene og beregne tumorvolumet etter ellipsoidformelen: volum = 4/3π x (x-semiakse x y-semiakse x z-semiakse)10.
4. Terapeutisk inngrep hos mus som bærer ortotopiske svulster
- Overvåk musene som bærer ortotopiske svulster ukentlig.
- Når et tumor μCT-skanningssignal oppdages i de fleste musene, utfør en ny μCT-skanning uken etter for å bekrefte tilstedeværelsen av svulsten.
MERK: Tiden for å starte behandlingen avhenger av PDX-modellen som brukes, og varierer fra 3-12 uker etter tumorcelleinokulering i cecum. - Randomiser musene i fire grupper: en kjøretøygruppe (n = 10-15 mus), en testmedikamentgruppe (n = 10-15 mus), en standard kjemoterapigruppe (n = 10-15 mus) og en kombinasjonsbehandlingsgruppe (n = 10-15 mus).
- Behandle musene intraperitonealt med saltvann (vehikkelgruppe), testmedikamentet (20 mg/kg) (testlegemiddelgruppe), irinotekan (50 mg/kg) (standardbehandlingsgruppe) eller testmedikamentet (20 mg/kg) med irinotekan (50 mg/kg) (kombinasjonsbehandlingsgruppe). Utfør administrasjonen en gang i uken til slutten av forsøket.
- Overvåk tumorveksten ukentlig ved μCT-skanning i løpet av forsøket.
- På slutten av forsøket, euthanize musene ved cervical dislokasjon og samle lever, lunger og andre mulige lesjoner i andre organer.
- Inkluder vevsprøvene i kassetter og inkuber dem i 4% formalin over natten. Bruk tarmvev fra en mus uten svulst i cecum som en kontroll.
- Fjern kassettene fra formalin og inkuber med 70% etanol i minst 3 timer.
- Legg inn kassettene med parafin, ved hjelp av standardprotokoller for histopatologianlegg.
- Utfør hematoksylin og eosin (H &E) farging fra cecum, lever og lunge, ved hjelp av histopatologi anlegget standardprotokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus ortopisk implantert med pasientavledede kreftceller ble overvåket ukentlig ved μCT-skanning. På slutten av forsøket ble dyrene avlivet. Tarm, ceca (figur 1A,B), lever, lunger og andre mulige lesjoner ble samlet, inkludert i en kassett, og fiksert med 4% formalin over natten. Tarmvev fra mus uten tumor i cecum ble brukt som kontroll (figur 1C). Til slutt ble kassetter endret til 70% etanol i minst 3 timer og parafin innebygd. Hematoksylin- og eosinfarging (H&E) fra ceca, lever og lunger ble utført ved hjelp av standardprotokoller for histopatologianlegg for å identifisere tumorceller (figur 2, figur 3 og figur 4).
I et annet eksperiment ble mus med ortotopiske svulster overvåket ukentlig. Når et tumor μCT-skannesignal ble påvist hos de fleste musene (rundt 2-4 uker, avhengig av PDX-modellen), ble dyrene randomisert i fire grupper og behandlet med enten vehikkel, testmedikamentet (20 mg/kg), standardkjemoterapi irinotekan (50 mg/kg) eller testmedikamentet med irinotekan. Legemidlene ble gitt intraperitonealt en gang i uken frem til forsøkets slutt. Tumorvekst ble overvåket ukentlig ved μCT-skanning i løpet av forsøket. Resultatene indikerte at testmedikamentet induserte en reduksjon av tumorvolumet, beregnet ved μCT-bildene, og som ble forsterket i kombinasjon med irinotekanbehandling (figur 5 og figur 6).
Tidligere studier i vårt laboratorium har vist at det metastatiske potensialet (karsinomatose, lunge- og levermetastaser) til de ortotopiske CRC-PDX-modellene avhenger av PDX-modellen som brukes (tabell 3)2. I denne studien ble også den terapeutiske effekten på metastasedannelse evaluert. Resultatene indikerte at testmedisinen, irinotekan, og kombinasjonen utryddet dannelsen av lunge- og levermetastaser hos behandlede mus (tabell 4)11.
Figur 1 Makroskopiske tarmbilder av mus med ortotopiske CRC-PDX-svulster. Makroskopiske tarmbilder fra to mus som bærer en ortotopisk PDX-tumor (A,B) på slutten av forsøket. Cecum svulster er definert i rødt på bildene. (C) Et tarmbilde av en mus uten svulst i cecum som kontroll. Skalastenger = 5 mm (A,B); 1 cm (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Histologiske bilder av ortotopiske CRC-PDX-svulster. H&E-farging av en PDX-tumormodell i cecum ved slutten av forsøket ved lav (A) og høy (a) forstørrelse. Cecum svulster er definert i rødt på bildene. Skalastenger = 2,5 mm (A); 100 mm (a). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Histologiske bilder av lungemetastaser fra ortotopisk CRC-PDX-tumor H&E-farging av lunge fra mus med ortotopisk PDX-tumor. Lungemetastase kan observeres ved lav (A) og høy (a) forstørrelse. Lungemetastaser er definert i rødt på bildene. Skalastenger = 250 mm (A); 100 mm (a). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Histologiske bilder av levermetastaser fra ortotopiske CRC-PDX-svulster. H&E-farging av en lever fra en mus som bærer en ortotopisk PDX-tumor. Levermetastaser kan observeres ved lav (A) og høy (a) forstørrelse. Levermetastaser er definert i rødt på bildene. Skalastenger er angitt på bildene. Skalastenger = 500 mm (A); 50 mm (a). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Terapeutisk effekt av et testmedikament i en ortotopisk CRC-PDX-modell. Eksempel på et eksperiment med fire grupper (vehikkel, utprøvingsmiddel, irinotekan og testing av legemiddel med irinotekan)11. Tumorvolum oppnådd fra μCT-skanningsbildene er representert over tid (A) og ved slutten av forsøket (dag 42) (B). Barer, ± SE (n = 15-30) og *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 versus kjøretøy (t-test, tosidig). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: μCT-bilder fra mus med ortotopiske CRC-PDX-svulster under behandling. Representative μCT-bilder av mus som bærer ortotopiske svulster behandlet med et terapeutisk legemiddel. Cecum (rød) og tumormasse (blå) er definert i bildene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Etablering av subkutan PDX. Eksempel på tre PDX-modeller etablert i laboratoriet (P1, P2 og P3) fra vår biobank2 av mer enn 350 PDX-modeller med antall inokulerte celler, forekomsten av PDX-etablering og passasjer i mus. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Reagenser for å forberede vekstfaktorene (GF) MIX 10X, CoCSCM 6Ab uten EGF, FGF2 og vekstfaktorer, CoCSCM 6Ab komplett medium og fordøyelsesmediet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Metastatisk potensial for ortotopiske CRC-PDX-modeller. Eksempel på tre ortotopiske CRC-PDX-modeller etablert i lab (P1, P2 og P3) fra vår biobank2. Her indikeres antall inokulerte celler, forekomsten av cecum-tumordannelse og forekomsten for å generere karsinomatose, lungemetastase eller levermetastase. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: Terapeutisk metastatisk effekt av et testmedikament i en ortotopisk CRC-PDX-modell. Eksempel på et eksperiment med fire grupper (vehikkel, utprøvingsmiddel, irinotekan og testing av legemiddel med irinotekan)11. Her angis antall mus i hver gruppe og hvilken av dem som utviklet karsinomatose, lungemetastase eller levermetastase ved slutten av forsøket. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løpet av de siste tiårene har mange nye anti-kreftbehandlinger blitt utviklet og testet hos pasienter med forskjellige svulsttyper, inkludert kolorektal kreft (CRC). Selv om lovende resultater i prekliniske modeller har blitt observert i mange tilfeller, har den terapeutiske effekten hos pasienter med avansert metastatisk CRC ofte vært begrenset. Derfor er det et presserende behov for prekliniske modeller som gjør det mulig å teste effekten av nye terapeutiske legemidler i et klinisk relevant metastatisk scenario.
Manuskriptet beskriver i detalj en avansert CRC ortotopisk PDX-modell basert på implantasjon av pasienttumorceller i cecumveggen hos immundefekte mus12.
Metodikken er tidkrevende og konsentrasjonskrevende. I gjennomsnitt kan injeksjonen av et eksperiment med 30 mus ta rundt 11 timer totalt, inkludert: 1) PDX-tumorsamling (1 time); tumorbehandling (4 timer); og cecum implantasjon (6 timer). Prosedyren må utføres under sterile forhold, minimere tiden for tumorbehandling og injeksjon, mens manipulere indre organer svært nøye for å unngå kirurgi-relatert dødelighet. Det anbefales derfor sterkt at flere piloteksperimenter utføres med tumorcellelinjer eller PDX-celler, for å trene etterforskerne og gjøre dem kjent med prosedyren. I tillegg må to forskere være involvert i prosedyren, en for å samle inn og behandle svulsten, samt hjelpe til med suturene til dyrene, og den andre for å utføre selve operasjonen.
Det er også viktig å vurdere at cecumtumorer kan vokse inn i tarmens lumen eller inne i cecum, avhengig av PDX-modellen og injeksjonsstedet. Utfallet av tumorveksten er vanskelig å kontrollere og kan dramatisk påvirke musens overlevelse, noe som resulterer i mindre svulster og alvorlig tarmobstruksjon når svulstene vokser inne i lumen. Musene må derfor overvåkes ukentlig, fra og med uken etter celleimplantasjon. Når de fleste musene presenterer et tumorsignal ved μCT-skanningen, bør dyr uten signal utelukkes, og resten randomiseres til eksperimentelle grupper basert på tumorvolum. For å oppnå statistisk signifikante resultater, bør hver eksperimentell gruppe inkludere 12-15 mus.
Overvåking av tumorbærende mus er avgjørende for å bestemme effekten av nye terapeutiske midler i klinisk relevante ortotopiske modeller. μCT-skanning muliggjør identifisering og kvantifisering av primærtumorvolum hos mus. Bruken av en dobbel kontrast øker følsomheten til μCT-teknikken betydelig, og forbedrer kvaliteten på bildene8. Veksten av tumorceller i cecum kan føre til intraluminale svulster hvis de vokser mot tarmens lumen, eller ekstraluminale svulster hvis de vokser ut av tarmens lumen. Begge scenariene er observert med forrige metodikk, og avhenger av PDX-modellen som brukes og injeksjonsstedet. Musene kom seg helt fra skanningen, uten kliniske tegn på nyreskade eller andre forekomster. Resultatene viser at μCT-avbildning kan være et nyttig verktøy for å overvåke utvikling og langsgående vekst av CRC.
Ortotopiske modeller rekapitulerer nøyaktig klinisk CRC12 og er svært nyttige for å teste effekten av nye terapeutiske legemidler på primær tumorvekst og lever- og lungemetastaser 2,11. Det er imidlertid ikke sikkert at en detaljert skriftlig protokoll er tilstrekkelig for at en ny forskergruppe skal kunne etablere slike komplekse modeller. Som svar har denne videoen som mål å veilede forskningsgrupper til å implementere denne prosedyren i sin forskning. Det viser implantasjonsprosedyren for celler i cecumveggen av immundefekte mus og metoden for å overvåke tarmtumorvekst ved hjelp av μCT-skanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Cellex Foundation, CIBERONC-nettverket og Instituto de Salud Carlos III for deres støtte. Videre takker vi også den prekliniske bildebehandlingsplattformen ved Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), hvor eksperimentene ble utført.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B.
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
