Summary
Detta protokoll beskriver den ortotopiska implantationen av patienthärledda cancerceller i blindtarmsväggen hos möss med immunbrist. Modellen rekapitulerar avancerad metastaserad kolorektalcancer och möjliggör utvärdering av nya terapeutiska läkemedel i ett kliniskt relevant scenario av lung- och levermetastaser.
Abstract
Under det senaste decenniet har mer sofistikerade prekliniska modeller för kolorektal cancer (CRC) etablerats med hjälp av patienthärledda cancerceller och 3D-tumöroider. Eftersom tumörorganoider från patienter kan behålla egenskaperna hos den ursprungliga tumören, möjliggör dessa tillförlitliga prekliniska modeller screening av cancerläkemedel och studier av läkemedelsresistensmekanismer. Dödsfall i tjock- och ändtarmscancer hos patienter är dock främst förknippade med förekomst av metastaserande sjukdom. Det är därför viktigt att utvärdera effekten av anti-cancerterapier i relevanta in vivo-modeller som verkligen rekapitulerar de viktigaste molekylära egenskaperna hos mänsklig cancermetastasering. Vi har etablerat en ortotopisk modell baserad på injektion av cancerceller från patienter med tjock- och ändtarmscancer direkt i blindtarmsväggen hos möss. Dessa tumörceller utvecklar primära tumörer i blindtarmen som metastaserar till lever och lungor, vilket ofta observeras hos patienter med avancerad tjock- och ändtarmscancer. Denna CRC-musmodell kan användas för att utvärdera läkemedelssvar som övervakas med mikrodatortomografi (μCT), en kliniskt relevant småskalig avbildningsmetod som enkelt kan identifiera primära tumörer eller metastaser hos patienter. Här beskriver vi det kirurgiska ingreppet och den metodik som krävs för att implantera patienthärledda cancerceller i blindtarmsväggen hos möss med immunbrist.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) är den näst vanligaste orsaken till cancerdöd i världen1. Förmågan att generera in vitro- eller in vivo-tumörmodeller från enskilda patienters tumörceller har avancerat precisionsmedicin inom onkologi. Under det senaste decenniet har patienthärledda organoider (PDO) eller xenografter (PDX) använts av många forskargrupper runt om i världen2. SUB är flercelliga in vitro-strukturer som liknar egenskaperna hos den ursprungliga tumörvävnaden och kan självorganisera och förnyasig själva 3. Dessa lovande in vitro-modeller kan framgångsrikt användas för läkemedelsscreening och underlätta translationell forskning. Å andra sidan rekapitulerar PDX-modellerna troget den ursprungliga CRC på alla relevanta nivåer, från histologi till molekylära egenskaper och läkemedelsrespons 2,4.
In vivo PDX-modeller odlas mestadels som subkutana tumörer hos möss med immunbrist. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har PDX blivit guldstandarden inom cancerforskning, särskilt för att studera läkemedelskänslighet eller resistens. CRC-relaterade dödsfall är dock oftast förknippade med förekomsten av metastaserande lesioner i levern, lungan eller bukhålan, och ingen av de två metoderna (PDO eller PDX) kan rekapitulera den avancerade kliniska inställningen. Dessutom har det visat sig att det specifika stället för tumörtillväxt bestämmer viktiga biologiska egenskaper som har en inverkan på läkemedelseffekt och sjukdomsprognos2. Det finns därför ett akut behov av att etablera prekliniska modeller som kan användas för att bedöma effekten av cancerläkemedel i en kliniskt relevant metastaserande miljö6.
Mikrodatortomografiskannrar (μCT) kan fungera som nedskalade kliniska CT-skannrar och ge primär tumör- och metastasavbildning hos möss med en skalad bildupplösning som är proportionell mot den för CT-bilder av cancerpatienter7. För att motverka den dåliga mjukdelskontrasten i μCT-tekniken kan radiologiska jodbaserade kontrastmedel användas för att förbättra kontrasten och utvärdera tumörbördan. Med hjälp av en dubbel kontrastmetod administreras oralt och intraperitonealt jod vid olika tidpunkter. Kontrasten som administreras oralt hjälper till att definiera gränserna mellan tumörvävnad och blindtarmsinnehåll i tarmen. Å andra sidan möjliggör kontrasten som administreras intraperitonealt identifieringen av de yttre gränserna för tumörmassan, som ofta växer och invaderar bukhinnan8.
Manuskriptet beskriver ett protokoll för att utföra ortotopisk implantation av patienthärledda cancerceller i blindtarmsväggen hos möss med immunbrist, och metodiken för att övervaka tarmtumörtillväxt med hjälp av μCT-skanning. Det aktuella manuskriptet visar att modellen rekapitulerar det kliniska scenariot med avancerade tarmtumörer och metastaserande sjukdom hos patienter med tjock- och ändtarmscancer som inte kan studeras med PDO- eller PDXO-modeller. Eftersom ortotopiska PDX-modeller av CRC rekapitulerar det kliniska scenariot för CRC-patienter, drar vi slutsatsen att de är de bästa hittills för att testa effekten av anti-tumörläkemedel i avancerade tarmtumörer och metastaserad sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skriftligt informerat samtycke inhämtades från alla patienter. Projektet godkändes av den forskningsetiska kommittén vid universitetssjukhuset Vall d'Hebron i Barcelona, Spanien (godkännande-ID: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Humana kolonvävnadsprover bestod av biopsier från icke-nekrotiska områden av primära adenokarcinom eller levermetastaser, motsvarande patienter med tjock- och ändtarmscancer som genomgick tumörresektion. Försöken utfördes i enlighet med EU:s djurskyddsdirektiv (86/609/EEG) och godkändes av den etiska kommittén för djurförsök vid VHIR-Vall d'Hebron Research Institute (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA och 12/18 CEEA).
OBS: Hona NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/Ncrcrl) möss från 8 veckors ålder köptes från Charles River Laboratories.
1. Härledning av patientceller
- Extraktion av tumörer
OBS: Följande procedur utförs i ett biologiskt skåp vid rumstemperatur (RT) i djuranläggningen.- Ta tumörprover från patienternas operationer eller biopsier och från PDX:er som växer subkutant i möss.
- För den ortotopiska injektionen, förbered tumörcellerna från etablerade subkutana PDX-tumörmodeller istället för vävnad som erhållits direkt från patienter9.
- Generera PDX-tumörer genom inokulering av en suspension av 1 x 105 tumörceller i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (50 μL) blandad med Matrigel-matris (50 μL) subkutant i flanken av NOD-SCID-möss2.
- Mät tumörtillväxt med ett skjutmått varannan dag.
OBS: Viktigt är att vårt laboratorium har genererat en biobank med mer än 350 PDX-modeller. De CRC-PDX-tumörmodeller som används i protokollet är etablerade PDX-modeller i labbet som har amplifierats mer än tre passager i möss och klarat inklusions-/exklusionskriterierna med ett positivt resultat (Tabell 1).
- Mät tumörtillväxt med ett skjutmått varannan dag.
- Avliva mössen genom cervikal dislokation när subkutana tumörer når den maximala storlek som fastställts av CEEA (1 cm diameter), eller när djuren når endpoint-kriterierna.
- Extrahera tumören och ta försiktigt bort den från huden och omgivande icke-tumörvävnad med hjälp av sax och pincett.
- Förvara de skördade tumörerna i PBS vid 4 °C tills nästa steg.
OBS: Dissociera tumörerna i cellsuspension så snart som möjligt efter avlägsnande från deras ursprungliga plats i patienternas lesioner eller subkutana xenografter hos möss. Cellviabiliteten är signifikant reducerad 24 timmar efter avlägsnande av vävnad, vilket resulterar i en ineffektiv implantation i mottagarmöss.
- Förberedelse av celler
OBS: Följande procedur utförs i ett biologiskt skåp vid rumstemperatur (RT) i vävnadsodlingsrummet.- Dissociera tumörerna med hjälp av ett blad i en 10 cm odlingsplatta med 1 ml komplett CoCSCM 6Ab-medium (tabell 2) (för att underlätta malningen). Placera det homogena dissocierade provet i ett 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt komplett CoCSCM 6Ab medium till en slutlig volym på 5 ml (använd inte mer än 3 ml dissocierad sample i samma rör).
OBS: Primär CRC som avlägsnas från patienter är naturligt kontaminerade med bakterier och svamp. Det är viktigt att avlägsna patogener som finns i den ursprungliga patientprovet med hjälp av en cocktail av sex antibiotika (penicillin, streptomycin, fungizone, kanamycin, gentamycin och nystatin). Injektion av tumörceller som är kontaminerade med bakterier hos möss med immunbrist kan leda till att djur dör. - Inkubera med 50 μl DNas I (0,08 kU/ml) och 50 μL kollagenas (1,5 mg/ml) (uppslutningsmedium; Tabell 2) i 1 timme vid 37 °C i en cellodlingsinkubator vid 45 °C. Blanda lösningen väl var 15:e minut med en 5 ml pipett före inkubationen.
OBS: Dissociera tumörvävnaden och smält den genom att pipettera flera gånger för att få en enda celllösning. Detta är viktigt för att räkna cellerna innan de injiceras i mottagarmöss och därmed uppnå en homogen implantation av tumörceller. - Tillsätt 5 ml komplett CoCSCM 6Ab medium och blanda väl med en 5 ml pipett.
- Sortera lösningen med en 100 μm cellsil med ett nytt sterilt 50 ml rör.
- Snurra de sorterade cellerna i 500 x g i 8 minuter vid RT.
- Aspirera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 3 ml 1x RBC-lysbuffertlösning.
- Inkubera i 10 min vid RT.
- Tillsätt 3 ml komplett CoCSCM 6Ab-medium, pipettera provet och snurra med 500 x g i 10 minuter vid RT. Aspirera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten med 5-10 ml komplett CoCSCM 6Ab-medium och använd en cellräknare för att beräkna det totala antalet celler.
- Snurra cellerna vid 500 x g i 10 minuter vid RT och återsuspendera i 10 ml PBS.
- Återsuspendera pelleten för att erhålla en koncentration på 20 x 106 celler/ml, och blanda väl för att erhålla en homogen cellsuspension.
- Förbered 29 G sprutor (0,5 ml U 100 nål, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) för injektion av cecum i vävnadskulturen (en spruta/mus). Fyll på 50 μl av tumörcellssuspensionen (1 x 106 celler/injektion) i sprutan och lägg den på is. Se till att luftbubblor avlägsnas från cellsuspensionen.
OBS: Att eliminera luftbubblor när tumörcellerna laddas i sprutan är viktigt för att undvika injektion av en för stor volym i blindtarmsväggen, vilket kan resultera i vävnadsbristning och provförlust. Det är absolut nödvändigt att blanda cellsuspensionen väl när sprutan laddas för att undvika ojämn tumörstorlek bland möss i samma experiment.
2. Ortotopisk injektion i blindtarm
OBS: Följande procedur utförs på en bänk i ett specifikt patogenfritt (SPF) rum på djuranläggningen. Utrustningen som används är tidigare rengjord och steriliserad. Dessutom steriliseras den igen i en portabel autoklav mellan individer eller zoner i djuranläggningen.
- Rengör operationsområdet genom att spraya med desinficerande rengöringsmedel och torka.
- Depilera mössens buk med hjälp av en hårborttagningsmaskin från möss.
- Placera musen i ryggläge. Använd 2% isofluran för att bedöva djuret. Bekräfta effekten av anestesi genom att försiktigt nypa ihop extremiteten och observera frånvaron av stimulering.
- Placera en 50-100 μL droppe veterinärsalva (3 mg/g Lacryvisc) i ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
- Desinficera musbuken genom att skrubba med klorhexidin eller povidonjod flera gånger i en cirkulär rörelse.
- Gör ett 1 cm längsgående snitt över nedre delen av magen med hjälp av en operationssax. Separera försiktigt huden till varje ställe för att presentera bukhinnan som finns under huden.
- Gör ett 0,5-1 cm snitt i bukhinnan, tillräckligt stort för att exteriorisera blindtarmen.
OBS: Exteriorisera blindtarmen utan att överdrivet manipulera de inre organen, vilket dramatiskt kan öka dödligheten i proceduren. - Isolera försiktigt blindtarmen från musen med en färdigskuren, steril gasbinda.
- Fukta blindtarmen med koksaltlösning under hela proceduren.
- Immobilisera blindtarmen genom att försiktigt ta tag i den med en pincett och för in nålen ytligt i blindtarmsväggen. Undvik kapillärer och kärl på injektionsstället. Ta bort bubblor från cellsuspensionen.
- Injicera hela 50 μL av tumörcellssuspensionen långsamt. Det tar vanligtvis cirka 10 sekunder att administrera. Undvik att perforera cecum lumen med nålen, eftersom detta resulterar i eliminering av tumörcellssuspensionen från kroppen genom tarmperistaltik.
OBS: Att injicera tumörcellssuspensionen i blindtarmen på mössen är det mest utmanande steget i hela proceduren. Ett starkt ljus fokuserat på injektionsstället och en förstoringslupp bör användas i denna del av protokollet. För in nålen parallellt med blindtarmens yta. Blindtarmen är en mycket ömtålig vävnad; Därför bör immobilisering av blindtarmen utföras med hjälp av kirurgisk pincett och genom att applicera ett lätt tryck för att undvika vävnadsruptur som resulterar i blödning. Lyckad implantation resulterar i en vit bubbla (pellet av celler) i blindtarmsväggen. Om bubblan inte kan visualiseras kan det tyda på att blindtarmen har perforerats och att cellerna har hamnat i blindtarmslumen, vilket resulterar i att de rensas av tarmkanalen. - Efter injektionen tar du långsamt bort nålen från blindtarmen och trycker försiktigt på injektionsstället med en applikator med bomullsspets för att undvika att tumörceller flyr och minska lätt blödning.
- Rengör blindtarmen med koksaltlösning för att ta bort eventuellt skräp.
- Sätt tillbaka blindtarmen i djurets buk.
- Stäng bukhinnan med 5/0 suturer.
- Stäng huden på buken med 5/0 suturer.
- Administrera postoperativa antibiotika (100 mg/kg amoxicillin eller 20 mg/kg enrofloxacin) och analgetika (5 mg/ml metakam/meloxikam) genom subkutan injektion. Placera mössen på en värmedyna och håll dem där tills de har återhämtat sig helt. Sätt sedan tillbaka dem i buren tillsammans med andra djur.
3. Utvärdering av ortotopisk tumörtillväxt med hjälp av μCT-skanning
OBS: Följande procedur utförs i den prekliniska bildplattformen (PIP) från djuranläggningen.
- Utföra alla djurförsök i enlighet med institutionella etiska kommittéers föreskrifter.
- Börja övervaka tumörvolymen med μCT 2 veckor efter cellinjektion och därefter varje vecka.
- Späd kontrastmedlet iopamiro (300 mg/ml) i koksaltlösning i förhållandet 3:1 för båda doserna. Administrera 300 ml iopamiro genom oral sondmatning.
OBS: På grund av μCT:s dåliga mjukvävnadskontrast rekommenderas ett kontrastmedel för att förbättra teknikens känslighet. Protokollet inkluderar en oral administrering av ett jodbaserat medel (iopamiro) för att avgränsa den intraluminala tumörbördan, och en sekundär intraperitoneal administrering av samma medel för att definiera tumörbördan i tarmens viscerala yta. Pilotförsök har tidigare utförts för att bestämma den exakta tiden som kontrastmedlet behöver anlända till blindtarmen hos möss innan det elimineras. När det gäller iopamiro är det cirka 2 timmar. - Efter 2 timmar ges en intraperitoneal injektion av 300 ml tidigare utspädd iopamiro. Administreringen hjälper till att definiera tumörgränserna i parietalansiktet.
- Bedöva djuren med 2% isofluran.
- Efter att ha bekräftat att djuret är korrekt bedövat genom att nypa musfoten, placera djuret i μCT:s skanningsbädd. Den bästa positionen är på rygg (med ansiktet uppåt).
- I kontrollprogramvaran startar du live-läget (fluoroskopiläge) för att placera bukområdet i skannerns synfält (FOV). För att göra det, flytta sängen framåt och bakåt och i sidled tills önskad position uppnås. Vrid röntgenröret och detektorn 90° och flytta skanningsbädden i y-axeln för att centrera djuret helt.
- Använd följande parametrar för μCT-skanningsbilderna: 30 mm synfält, 26 s exponeringstid, 90 kV strömspänning och 200 μA strömstyrka, med hjälp av ett FX μCT-bildsystem.
- Sätt tillbaka djuren i sina burar för återhämtning när undersökningen är klar. Ge termiskt stöd och övervaka djuren tills de återhämtar sig från narkosen innan de återvänder till stallet.
- μCT-insamlingen ger en fil på 250 Mb för varje skanning. De skapade datafilerna har ett VOX-format. För att göra dem tillgängliga för alla bildanalysprogram, konvertera filerna till DICOM-format med hjälp av databashanteringsprogramvaran för μCT. Lagra batchen med skapade filer på en bärbar hårddisk för att analysera dem med vilken dator som helst med tillgänglig bildbehandlingsprogramvara.
OBS: Under bildanalys är blindtarmen lokaliserad som en dilaterad tarm med ett radiotätt innehåll (iopamiro), ofta i vänster sida av svansbuken. I blindtarmens viscerala böjning observeras en väggförtjockning jämfört med de intilliggande tarmregionerna. Förtjockningen motsvarar tumörtillväxt. - När tumören är lokaliserad, hitta den högsta diametern i de olika vyerna (axiell, koronal och sagittal). Mät dessa tre axlar och beräkna tumörvolymen enligt ellipsoidformeln: volym = 4/3π x (x-halvaxel x y-halvaxel x z-halvaxel)10.
4. Terapeutisk intervention hos möss som bär ortotopiska tumörer
- Övervaka möss som bär på ortotopiska tumörer varje vecka.
- När en μCT-skanningssignal upptäcks hos de flesta möss, utför ytterligare en μCT-skanning följande vecka för att bekräfta förekomsten av tumören.
OBS: Tiden för att påbörja behandlingen beror på vilken PDX-modell som används, och varierar från 3-12 veckor efter tumörcellsinokulering i blindtarmen. - Randomisera mössen i fyra grupper: en vehikelgrupp (n = 10-15 möss), en testläkemedelsgrupp (n = 10-15 möss), en standardgrupp med kemoterapi (n = 10-15 möss) och en kombinationsbehandlingsgrupp (n = 10-15 möss).
- Behandla mössen intraperitonealt med koksaltlösning (vehikelgrupp), testläkemedlet (20 mg/kg) (testläkemedelsgruppen), irinotekan (50 mg/kg) (standardbehandlingsgruppen) eller testläkemedlet (20 mg/kg) med irinotekan (50 mg/kg) (kombinationsbehandlingsgruppen). Utför administreringen en gång i veckan fram till slutet av experimentet.
- Övervaka tumörtillväxten varje vecka genom μCT-skanning under hela experimentets gång.
- I slutet av experimentet avlivas mössen genom livmoderhalsluxation och lever, lungor och andra möjliga skador i andra organ samlas in.
- Inkludera vävnadsproverna i kassetter och inkubera dem i 4 % formalin över natten. Använd tarmvävnad från mus utan tumör i blindtarmen som kontroll.
- Ta bort kassetterna från formalin och inkubera med 70 % etanol i minst 3 timmar.
- Bädda in kassetterna med paraffin med hjälp av standardprotokoll för histopatologi.
- Utför hematoxylin och eosin (H&E) färgning från blindtarmen, levern och lungan med hjälp av histopatologianläggningens standardprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Möss ortopiskt implanterade med cancerceller från patienter följdes varje vecka med μCT-skanning. I slutet av försöket avlivades djuren. Tarmar, ceca (Figur 1A,B), lever, lungor och alla andra möjliga lesioner samlades in, inkluderades i en kassett och fixerades med 4 % formalin över natten. Tarmvävnad från en mus utan tumör i blindtarmen användes som kontroll (Figur 1C). Slutligen byttes kassetterna till 70 % etanol i minst 3 timmar och paraffininbäddades. Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) från ceca, lever och lungor utfördes med hjälp av histopatologiska standardprotokoll för att identifiera tumörceller (Figur 2, Figur 3 och Figur 4).
I ett annat experiment övervakades möss med ortotopiska tumörer varje vecka. När en μCT-skanningssignal detekterades hos de flesta mössen (cirka 2-4 veckor, beroende på PDX-modellen) randomiserades djuren i fyra grupper och behandlades med antingen vehikeln, testläkemedlet (20 mg/kg), standardbehandlingen med kemoterapi irinotekan (50 mg/kg) eller testläkemedlet med irinotekan. Läkemedlen administrerades intraperitonealt en gång i veckan fram till slutet av experimentet. Tumörtillväxten övervakades varje vecka med μCT-skanning under hela experimentet. Resultaten indikerade att testläkemedlet inducerade en minskning av tumörvolymen, beräknad med μCT-skanningsbilderna, och att den förstärktes i kombination med irinotekanbehandling (Figur 5 och Figur 6).
Tidigare studier i vårt laboratorium har visat att den metastaserande potentialen (karcinomatos, lung- och levermetastaser) hos de ortotopiska CRC-PDX-modellerna beror på vilken PDX-modell som används (Tabell 3)2. I den aktuella studien utvärderades även den terapeutiska effekten på metastasbildning. Resultaten indikerade att testläkemedlet irinotekan och kombinationen utrotade bildandet av lung- och levermetastaser hos behandlade möss (tabell 4)11.
Figur 1: Makroskopiska bilder av tarmen hos möss med ortotopiska CRC-PDX-tumörer. Makroskopiska tarmbilder från två möss som bar på en ortotopisk PDX-tumör (A,B) i slutet av experimentet. Blindtarmstumörer är markerade med rött på bilderna. (C) En tarmbild av en mus utan tumör i blindtarmen som kontroll. Skalstreck = 5 mm (A,B); 1 cm (C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Histologiska bilder av ortotopiska CRC-PDX-tumörer. H&E-färgning av en PDX-tumörmodell i blindtarmen i slutet av experimentet vid låg (A) och hög (a) förstoring. Blindtarmstumörer är markerade med rött på bilderna. Skalstreck = 2,5 mm (A); 100 mm (a). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Histologiska bilder av lungmetastaser härledda från ortotopisk CRC-PDX-tumör H&E-färgning av en lunga från en mus som bär på en ortotopisk PDX-tumör. Lungmetastaser kan observeras vid låg (A) och hög (a) förstoring. Lungmetastaser är markerade med rött på bilderna. Skalstreck = 250 mm (A); 100 mm (a). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Histologiska bilder av levermetastaser härledda från ortotopiska CRC-PDX-tumörer. H&E-färgning av en lever från en mus som bär på en ortotopisk PDX-tumör. Levermetastaser kan observeras vid låg (A) och hög (a) förstoring. Levermetastaser är markerade med rött på bilderna. Skalstreck anges i bilderna. Skalstreck = 500 mm (A); 50 mm (a). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Terapeutisk effekt av ett testläkemedel i en ortotopisk CRC-PDX-modell. Exempel på ett experiment med fyra grupper (vehikel, testläkemedel, irinotekan och testläkemedel med irinotekan)11. Tumörvolymen som erhålls från μCT-skanningsbilderna representeras över tid (A) och i slutet av experimentet (dag 42) (B). Staplar, ± SE (n = 15-30) och *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 jämfört med fordon (t-test, dubbelsidigt). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: μCT-bilder från möss med ortotopiska CRC-PDX-tumörer under behandling. Representativa μCT-bilder av möss med ortotopiska tumörer som behandlats med ett terapeutiskt läkemedel. Blindtarmen (röd) och tumörmassan (blå) definieras i bilderna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Etablering av subkutan PDX. Exempel på tre PDX-modeller etablerade i labbet (P1, P2 och P3) från vår biobank2 av mer än 350 PDX-modeller med antalet inokulerade celler, förekomsten av PDX-etablering och passagerna i möss. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Reagenser för att bereda tillväxtfaktorer (GF) MIX 10X, CoCSCM 6Ab utan EGF, FGF2 och tillväxtfaktorer, CoCSCM 6Ab komplett medium och digestionsmedium. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Metastatisk potential för ortotopiska CRC-PDX-modeller. Exempel på tre ortotopiska CRC-PDX-modeller etablerade i labbet (P1, P2 och P3) från vår biobank2. Här anges antalet celler som inokulerats, förekomsten av cecumtumörbildning och incidensen för att generera karcinomatos, lungmetastaser eller levermetastaser. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 4: Terapeutisk metastaserande effekt av ett testläkemedel i en ortotopisk CRC-PDX-modell. Exempel på ett experiment med fyra grupper (vehikel, testläkemedel, irinotekan och testläkemedel med irinotekan)11. Här anges antalet möss i varje grupp och vilka av dem som utvecklade karcinomatos, lungmetastaser eller levermetastaser i slutet av försöket. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste decennierna har många nya behandlingar mot cancer utvecklats och testats på patienter med olika tumörtyper, inklusive kolorektal cancer (CRC). Även om lovande resultat i prekliniska modeller har observerats i många fall, har den terapeutiska effekten hos patienter med avancerad metastaserad kolorektalcancer ofta varit begränsad. Det finns därför ett akut behov av prekliniska modeller som gör det möjligt att testa effekten av nya terapeutiska läkemedel i ett kliniskt relevant metastatiskt scenario.
Manuskriptet beskriver i detalj en avancerad ortopisk PDX-modell baserad på implantation av tumörceller hos patienter i blindtarmsväggen hos möss med immunbrist12.
Metodiken är tidskrävande och koncentrationskrävande. I genomsnitt kan injektionen av ett experiment med 30 möss ta cirka 11 timmar totalt, inklusive: 1) PDX-tumörsamling (1 timme); tumörbehandling (4 timmar); och cecumimplantation (6 timmar). Ingreppet måste utföras under sterila förhållanden, vilket minimerar tiden för tumörbearbetning och injektion, samtidigt som de inre organen manipuleras mycket noggrant för att undvika kirurgirelaterad dödlighet. Det rekommenderas därför starkt att flera pilotexperiment utförs med tumörcellinjer eller PDX-celler, för att utbilda utredarna och bekanta dem med proceduren. Dessutom måste två forskare vara involverade i ingreppet, en för att samla in och bearbeta tumören, samt hjälpa till med suturerna på djuren, och den andra för att utföra själva operationen.
Det är också viktigt att tänka på att blindtarmstumörer kan växa in i tarmens lumen eller inuti blindtarmen, beroende på PDX-modellen och det specifika injektionsstället. Utfallet av tumörtillväxten är svårt att kontrollera och kan dramatiskt påverka mössens överlevnad, vilket resulterar i mindre tumörer och en allvarlig tarmobstruktion när tumörerna växer inuti lumen. Mössen måste därför följas upp varje vecka, med start veckan efter cellimplantationen. När de flesta av mössen uppvisar en tumörsignal vid μCT-skanningen bör djur utan signal uteslutas och resten randomiseras till experimentella grupper baserat på tumörvolym. För att få statistiskt signifikanta resultat bör varje försöksgrupp inkludera 12-15 möss.
Övervakning av tumörbärande möss är avgörande för att fastställa effekten av nya läkemedel i kliniskt relevanta ortotopiska modeller. μCT-skanningar gör det möjligt att identifiera och kvantifiera primär tumörvolym hos möss. Användningen av dubbel kontrast ökar avsevärt μCT-teknikens känslighet, vilket förbättrar bildkvaliteten8. Tillväxten av tumörceller i blindtarmen kan leda till intraluminala tumörer om de växer mot tarmens lumen, eller extraluminala tumörer om de växer ut ur tarmens lumen. Båda scenarierna har observerats med den tidigare metoden och beror på vilken PDX-modell som används och vilket injektionsställe som används. Mössen återhämtade sig helt från skanningen, utan några kliniska tecken på njurskador eller andra incidenser. Resultaten visar att μCT-avbildning kan vara ett användbart verktyg för att övervaka utveckling och longitudinell tillväxt av CRC.
Ortotopiska modeller rekapitulerar kliniskt CRC12 och är mycket användbara för att testa effekten av nya terapeutiska läkemedel på primär tumörtillväxt och lever- och lungmetastaser 2,11. Det är dock inte säkert att ett detaljerat skriftligt protokoll räcker för att en ny forskargrupp ska kunna etablera så komplexa modeller. Som svar på detta syftar den här videon till att vägleda forskargrupper att implementera denna procedur i sin forskning. Den visar implantationsproceduren för celler i blindtarmsväggen hos möss med immunbrist och metodiken för att övervaka tarmtumörtillväxt med hjälp av μCT-skanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi tackar Cellex Foundation, CIBERONC-nätverket och Instituto de Salud Carlos III för deras stöd. Dessutom tackar vi också den prekliniska bildplattformen vid Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), där experimenten utfördes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B.
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
