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Biology

माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के साथ माइटोफैगी की कल्पना करना

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64647
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1, 1, 1,2
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 3Department of Pharmacy, Shanghai East Hospital, Tongji University

Summary

माइटोफैगी माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण का प्राथमिक तंत्र है। हालांकि, विवो में माइटोफैगी का मूल्यांकन विश्वसनीय मात्रात्मक परख की कमी से बाधित होता है। यहां प्रस्तुत एक सेल-परगम्य हरे-फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया डाई और एक लाल-फ्लोरोसेंट लाइसोसोम डाई का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में माइटोफैगी के अवलोकन के लिए एक प्रोटोकॉल है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रिया, कोशिका के पावरहाउस होने के नाते, बायोएनर्जेटिक, फ्री रेडिकल उत्पादन, कैल्शियम होमियोस्टेसिस और एपोप्टोसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। माइटोफैगी माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण का प्राथमिक तंत्र है और आमतौर पर सूक्ष्म अवलोकन का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है, हालांकि विवो माइटोफैगी परख में प्रदर्शन करना मुश्किल है। लाइव ऑर्गेनेल इमेजिंग द्वारा माइटोफैगी का मूल्यांकन माइटोकॉन्ड्रियल अनुसंधान के लिए एक वैकल्पिक और आवश्यक तरीका है। यह प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं में सेल-परगम्य ग्रीन-फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया डाई मिटोट्रैकर ग्रीन और रेड-फ्लोरोसेंट लाइसोसोम डाई लाइसोट्रैकर रेड का उपयोग करने की प्रक्रियाओं का वर्णन करता है, जिसमें रंजक की लोडिंग, माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम का विज़ुअलाइज़ेशन और अपेक्षित परिणाम शामिल हैं। लाइव कोशिकाओं में माइटोफैगी के मूल्यांकन के लिए विस्तृत कदम, साथ ही माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर सेटिंग्स के बारे में तकनीकी नोट्स भी प्रदान किए गए हैं। यह विधि शोधकर्ताओं को लाइव-सेल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके माइटोफैगी का निरीक्षण करने में मदद कर सकती है। इसके अलावा, इसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम को मापने और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया लगभग सभी यूकेरियोटिक कोशिकाओं के पावरहाउस हैं 1,2. ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से एटीपी उत्पादन के अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया अन्य प्रक्रियाओं जैसे बायोएनर्जेटिक, कैल्शियम होमियोस्टेसिस, फ्री रेडिकल पीढ़ी, एपोप्टोसिस और सेलुलर होमियोस्टेसिस 3,4,5 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। चूंकि माइटोकॉन्ड्रिया इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में कई परिसरों से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) उत्पन्न करते हैं, इसलिए वे लगातार संभावित ऑक्सीडेटिव तनाव से उत्तेजित होते हैं, जो अंततः संरचनात्मक क्षति और शिथिलता का कारण बन सकता है जब एंटीऑक्सिडेंट रक्षा प्रणाली 6,7 गिर जाती है। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को चयापचय संबंधी विकारों, न्यूरोडीजेनेरेशन और कार्डियोवैस्कुलर बीमारी सहित कई बीमारियों में योगदान करने के लिए पाया गयाहै। इसलिए, स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रियल आबादी और उनके उचित कार्य को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। माइटोकॉन्ड्रिया अत्यधिक प्लास्टिक और गतिशील जीव हैं; उनकी आकृति विज्ञान और कार्य को माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन, माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस, संलयन, विखंडन और माइटोफैगी 9,10 के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) शामिल हैं। डायनेमिन से संबंधित प्रोटीन 1 (डीआरपी 1) द्वारा मध्यस्थ माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन, प्रोटीन के डायनामिन सुपरफैमिली का एक जीटीपेस, छोटे और गोल माइटोकॉन्ड्रिया में परिणाम देता है और निष्क्रिय माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करता है, जिसे माइटोफैगी11,12 द्वारा साफ और अवक्रमित किया जा सकता है।

माइटोफैगी एक सेलुलर प्रक्रिया है जो ऑटोफैगी द्वारा चुनिंदा माइटोकॉन्ड्रिया को नीचा दिखाती है, आमतौर पर चोट, उम्र बढ़ने या तनाव के बाद क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया में होती है। इसके बाद, इन माइटोकॉन्ड्रिया को क्षरण के लिए लाइसोसोम में पहुंचाया जाताहै। इस प्रकार, माइटोफैगी एक कैटाबोलिक प्रक्रिया है जो सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में स्वस्थ अवस्था में माइटोकॉन्ड्रिया की मात्रा और गुणवत्ता को बनाए रखने में मदद करती है। यह सामान्य शारीरिक और तनाव की स्थिति के तहत सेलुलर होमियोस्टैसिस की बहाली में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। कोशिकाओं को एक जटिल माइटोफैगी तंत्र की विशेषता है, जो सेलुलर तनाव और विकासात्मक परिवर्तनों के विभिन्न संकेतों से प्रेरित है। माइटोफैगी नियामक मार्गों को यूबिकिटिन-निर्भर या रिसेप्टर-निर्भर15,16 के रूप में वर्गीकृत किया गया है; यूबिकिटिन-निर्भर ऑटोफैगी की मध्यस्थता काइनेज पिंक 1 द्वारा की जाती है और माइटोकॉन्ड्रिया17,18 में यूबिकिटिन लिगेज पार्किन ई 3 की भर्ती होती है, जबकि रिसेप्टर-निर्भर ऑटोफैगी में ऑटोफैगी रिसेप्टर्स को सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन लाइट चेन एलसी 3 से बांधना शामिल होता है जो माइटोकॉन्ड्रियल क्षति19 के जवाब में माइटोफैगी की मध्यस्थता करता है।

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि है, और अभी भी माइटोफैगी20 का निरीक्षण और पता लगाने के लिए सबसे अच्छे तरीकों में से एक है। माइटोफैगी की रूपात्मक विशेषताएं लाइसोसोम के साथ ऑटोफैगोसोम के संलयन द्वारा गठित ऑटोफैगोसोम या ऑटोलाइसोसोम हैं, जिन्हें इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों21 से देखा जा सकता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) की कमजोरी, हालांकि, जीवित कोशिका20 में माइटोकॉन्ड्रियल विध्रुवण, माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन और ऑटोफैगोसोम और लाइसोसोम के संलयन जैसे माइटोफैगी की गतिशील प्रक्रियाओं की निगरानी करने में असमर्थता है। इस प्रकार, इमेजिंग जीवित जीवों के माध्यम से माइटोफैगी का मूल्यांकन माइटोकॉन्ड्रियल अनुसंधान के लिए एक आकर्षक वैकल्पिक तरीका है। यहां वर्णित लाइव सेल इमेजिंग तकनीक माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम को दागने के लिए दो फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करती है। जब माइटोफैगी होती है, तो ऑटोफैगोसोम द्वारा घिरे क्षतिग्रस्त या अनावश्यक माइटोकॉन्ड्रिया माइटोकॉन्ड्रियल डाई द्वारा हरे रंग के दाग होते हैं, जबकि लाल डाई लाइसोसोम को दाग देता है। इन ऑटोफैगोसोम और लाइसोसोम का संलयन, जिसे ऑटोलाइसोसोम के रूप में जाना जाता है, हरे और लाल प्रतिदीप्ति को पीले बिंदुओं के रूप में ओवरलैप और प्रकट करने का कारण बनता है, इस प्रकार माइटोफैगी22 की घटना का संकेत मिलता है। सेल-परगम्य माइटोकॉन्ड्रिया डाई (मिटोट्रैकर ग्रीन) में माइटोकॉन्ड्रिया23 को लेबल करने के लिए एक हल्का थिओल-प्रतिक्रियाशील क्लोरोमेथिल मोइटी होता है। माइटोकॉन्ड्रिया को लेबल करने के लिए, कोशिकाओं को केवल डाई के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, जो प्लाज्मा झिल्ली में निष्क्रिय रूप से फैलता है और सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होता है। यह माइटोकॉन्ड्रिया डाई आसानी से जीवित कोशिकाओं को दाग सकती है, और एल्डिहाइड-फिक्स्ड या मृत कोशिकाओं को धुंधला करने में कम प्रभावी है। लाइसोसोम डाई (लाइसोट्रैकर रेड) एक फ्लोरोसेंट एसिडोट्रोपिक जांच है जिसका उपयोग जीवित कोशिकाओं में अम्लीय जीवों को लेबल करने और ट्रैक करने के लिए किया जाता है। यह डाई अम्लीय जीवों के लिए एक उच्च चयनात्मकता प्रदर्शित करती है और नैनोमोलर सांद्रता24 पर जीवित कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से लेबल कर सकती है।

जीवित कोशिकाओं में इन फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करने की प्रक्रियाएं, जिनमें रंजक लोड करना और माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम का विज़ुअलाइज़ेशन शामिल है, यहां प्रस्तुत किए गए हैं। यह विधि शोधकर्ताओं को लाइव-सेल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके माइटोफैगी का निरीक्षण करने में मदद कर सकती है। इसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम को मापने और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है।

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Protocol

1. सेल कल्चर और पासिंग

नोट: प्रोटोकॉल को एक उदाहरण के रूप में नियमित रूप से सुसंस्कृत माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) का उपयोग करके वर्णित किया गया है।

  1. 10 सेमी सेल कल्चर व्यंजनों में 10 एमएल डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम) के साथ एमईएफ कोशिकाओं की संस्कृति। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें और 100x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की निगरानी करें।
  2. नियमित सेल पासिंग करें।
    1. जब कोशिकाएं 80% -90% कंफ्लुएंसी (हर 3 दिनों में) तक पहुंच जाती हैं, तो कोशिकाओं को 2 एमएल डलबेको के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के साथ धो लें। फिर कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल जोड़ें, इसके बाद ट्रिप्सिन-ईडीटीए की कार्रवाई को रोकने के लिए डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें। सेल निलंबन को 3 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और डीएमईएम के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    2. एक स्वचालित सेल काउंटर और सेल काउंटिंग चैंबर स्लाइड्स का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें), और फिर 1.5 x 106 कोशिकाओं को एक नए 10 सेमी सेल कल्चर डिश में टीका लगाएं जिसमें 10 एमएल डीएमईएम हो।
  3. माइटोफैगी परख के लिए, चरण 1.2.1 में एक सेल निलंबन तैयार करें। ताजा डीएमईएम में सेल निलंबन को 1 x 105 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें।
  4. 20 मिमी कॉन्फोकल डिश में पतला सेल निलंबन के 2 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और संस्कृति डिश को "क्रॉस" में हिलाएं। सेल कल्चर डिश को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।

2. माइटोकॉन्ड्रियल धुंधलापन

  1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हरे-फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल डाई और लाल-फ्लोरोसेंट लाइसोसोम डाई ( सामग्री की तालिका देखें) के स्टॉक समाधान एलिकोट को हटा दें।
  2. डीएमईएम में स्टॉक समाधान 1: 1,000 को पतला करके रंगों के कामकाजी समाधान तैयार करें और अच्छी तरह से मिलाएं। उदाहरण के लिए, दोनों रंगों के लिए 1 μM की कार्यशील एकाग्रता प्राप्त करने के लिए DMEM के 2 mL में 1 mM माइटोकॉन्ड्रियल डाई और लाइसोसोम डाई में से प्रत्येक में 2 μL जोड़ें।
  3. कॉन्फोकल कल्चर डिश (चरण 1.4) से माध्यम को हटा दें। कोशिकाओं को कवर करने के लिए धुंधला समाधान (चरण 2.2 में तैयार) का 1 एमएल जोड़ें। सेल कल्चर डिश को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें, 20-30 मिनट के लिए 5% सीओ 2।

3. कॉन्फोकल इमेजिंग

  1. क्रेब्स-हेंसेलिट (केएच) बफर (138.2 एमएम एनएसीएल, 3.7 एमएम केसीएल, 0.25 एमएम केसीएल2, 1.2 एमएम केएच2पीओ4, 1.2 एमएम एमजीएसओ4.7 एच 2 ओ, 15 एमएम ग्लूकोज, और 21.85 एमएम एचईपीईएस; अंतिम पीएच 7.4)पर स्टोर करें और 4 डिग्री सेल्सियस (1 महीने तक) पर स्टोर करें।
  2. कॉन्फोकल इमेजिंग के दिन, रेफ्रिजरेटर से केएच बफर को पहले से हटा दें और इसे कमरे के तापमान (20 से 25 डिग्री सेल्सियस) पर पूर्व-गर्म करें।
  3. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सॉफ्टवेयर के मापदंडों को सेट करें ( सामग्री की तालिका देखें): दोहरी उत्तेजना छवियों के लिए, 488 एनएम और 543 एनएम पर अनुक्रमिक उत्तेजना का उपयोग करें, और क्रमशः 505-545 एनएम और >560 एनएम पर उत्सर्जन एकत्र करें।
    नोट: निम्नानुसार इमेजिंग सेटिंग्स सेट करें। स्कैन मोड: फ्रेम; गति: 9; औसत: संख्या, 1; लाभ: 450 से 600; पिनहोल: 30 से 200; लेजर: <10%। पहले इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करना और फिर 488 एनएम लेजर को पूरी तरह से चालू करना सबसे अच्छा है। 543 एनएम लेजर को उपयोग से पहले 3-5 मिनट के लिए चालू और स्थिर करने की आवश्यकता होती है (चित्रा 1 ए)।
  4. इनक्यूबेटर (चरण 2.3) से डाई युक्त संस्कृति माध्यम को हटा दें और पकवान में 1 एमएल केएच बफर जोड़ें।
  5. माइटोफैगी को प्रेरित करने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए केएच बफर में 1 μM (अंतिम एकाग्रता) पर कार्बोनिल साइनाइड -4-(ट्राइफ्लोरोमेथोक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) के साथ कोशिकाओं का इलाज करें, और तुरंत कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की छवि बनाने के लिए आगे बढ़ें।
  6. 63x तेल लेंस के शीर्ष पर उचित मात्रा में तेल लागू करें ( सामग्री की तालिका देखें)। सेल नमूना को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के नमूना चरण पर रखें और इसे सीधे उद्देश्य लेंस के ऊपर ले जाएं।
  7. सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस (चित्रा 1 बी) के ऊपरी बाएं कोने में लोकेट टैब पर क्लिक करके नमूना खोजने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। प्रयोग के लिए किसी हरे रंग के फ़िल्टर सेट का चयन करें.
  8. ऑब्जेक्टिव लेंस को ऊपर और नीचे ले जाकर जल्दी से ध्यान केंद्रित करने के लिए मोटे समायोजन नॉब का उपयोग करें। सेल नमूना आंख के टुकड़े के माध्यम से स्पष्ट रूप से दिखाई देने के बाद, एकल कोशिकाओं के क्षेत्र को खोजें और ध्यान केंद्रित करें और इसे दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में ले जाएं।
  9. छवियों को प्राप्त करने के लिए सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस में ऊपरी बाएं कोने में अधिग्रहण टैब पर क्लिक करें। पूर्वावलोकन के लिए केवल 488 एनएम चैनल और फ्रेम रिज़ॉल्यूशन 1024 x 1024 का चयन करें।
  10. लाइव स्कैन शुरू करने के लिए ऊपरी बाएं कोने में लाइव टैब पर क्लिक करें। दृश्य के क्षेत्र को सबसे तेज में समायोजित करें और स्लाइडर को बाएं या दाएं ले जाकर लेजर शक्ति को समायोजित करें (चित्रा 1 ए)। ओवरएक्सपोजर से बचने के लिए गेन सेटिंग को 600 से नीचे रखें।
  11. पिनहोल मान को 156 पर समायोजित करें, मान को 545 पर प्राप्त करें, और डिजिटल ऑफसेट मान को 0 पर समायोजित करें।
  12. दृश्य के सर्वश्रेष्ठ क्षेत्र का चयन करें, दो चैनलों (488 एनएम और 543 एनएम) की जांच करें, और फ्रेम रिज़ॉल्यूशन 1024 x 1024 चुनें। 2D छवियाँ प्राप्त करने के लिए स्नैप क्लिक करें. अधिग्रहित छवियों को सहेजें।
    नोट: हरे माइटोकॉन्ड्रिया डाई में 490 एनएम पर उत्तेजना शिखर और 516 एनएम पर उत्सर्जन शिखर होता है; यह 488 एनएम लेजर का उपयोग करके उत्तेजित किया जा सकता है। लाल लाइसोसोम डाई में 576 एनएम पर उत्तेजना शिखर और 590 एनएम पर उत्सर्जन शिखर होता है; यह 543 एनएम लेजर का उपयोग करके उत्तेजित किया जा सकता है।

4. छवि विश्लेषण

  1. ImageJ के साथ सहेजी गई छवि खोलें और मर्ज की गई छवि को इसमें आयात करें।
  2. मैन्युअल रूप से प्रत्येक कोशिका में पीले बिंदुओं की संख्या की गणना करें, जो इंगित करते हैं कि लाइसोसोम माइटोकॉन्ड्रिया को घेर रहा है।

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Representative Results

मिटोट्रैकर ग्रीन एक हरे-फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग है जो माइटोकॉन्ड्रिया को सटीक रूप से स्थानीयकृत करने में सक्षम है। डाई आसानी से जीवित कोशिकाओं को दाग सकती है और एल्डिहाइड-फिक्स्ड या मृत कोशिकाओं को धुंधला करने में कम प्रभावी है (चित्रा 2)। लाल फ्लोरोसेंट लाइसोसोम डाई लाइसोट्रैकर रेड अम्लीय लाइसोसोमल ऑर्गेनेल को लेबल करने और ट्रैक करने में सक्षम है और केवल जीवित कोशिकाओं को दाग सकता है (चित्रा 2)। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम के विज़ुअलाइज़ेशन को उपयुक्त रंगों (चित्रा 1 और चित्रा 2) के साथ दाग की अनुमति देता है।

माइटोफैगी एक कैटाबोलिक सेलुलर प्रक्रिया है जो ऑटोफैगी द्वारा चुनिंदा माइटोकॉन्ड्रिया को नीचा दिखाती है, जो आमतौर पर चोट, उम्र बढ़ने या तनाव20 के बाद क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया में होती है। इसके बाद, इन माइटोकॉन्ड्रिया को क्षरण के लिए लाइसोसोम में पहुंचाया जाता है। माइटोफैगी कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में स्वस्थ अवस्था में माइटोकॉन्ड्रिया की मात्रा और गुणवत्ता को बनाए रखने में मदद करता है। स्वस्थ स्तनधारी कोशिकाओं में, माइटोफैगी अक्सर होती है, और इसलिए इस प्रक्रिया को प्रेरित करने के लिए अन्य उत्तेजनाओं की आवश्यकता होतीहै। कार्बोनिल साइनाइड -4 (ट्राइफ्लोरोमेथोक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी), एक माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर, एक गैर-विशिष्ट आयोनोफोर है जो मिनटों के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता के गंभीर नुकसान, इंट्रासेल्युलर पीएच में परिवर्तन और बाद में माइटोफैगी 26,27 का कारण बनता है। इस अध्ययन में, एफसीसीपी का उपयोग कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए एमईएफ कोशिकाओं में माइटोफैगी को ट्रिगर करने के लिए किया गया था। जब क्षतिग्रस्त हरे रंग के दाग वाले माइटोकॉन्ड्रिया लाल दाग वाले लाइसोसोम से घिरे होते हैं, तो हरे और लाल प्रतिदीप्ति पीले सह-स्थानीयकृत माइटोकॉन्ड्रिया-लाइसोसोम को प्रकट करने के लिए ओवरलैप होते हैं (चित्रा 3)। चित्रा 3 डी और चित्रा 4 बी में पीले बिंदु इन सह-स्थानीयकृत माइटोकॉन्ड्रिया-लाइसोसोम के अनुरूप हैं, जो चल रहे माइटोफैगी का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इस प्रकार माइटोफैगी की सीमा का मूल्यांकन करने के लिए गिना जा सकता है (चित्रा 4)।

Figure 1
चित्र 1: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सॉफ्टवेयर के इमेजिंग पैरामीटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: जीवित कोशिकाओं के कॉन्फोकल इमेजिंग का योजनाबद्ध चित्रण। जीवित कोशिकाओं को हरे-फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल डाई और लाल-फ्लोरोसेंट लाइसोसोमल डाई के साथ सह-दाग दिया जाता है, और फिर जीवित कोशिकाओं को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया जाता है। छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण माइक्रोस्कोप से जुड़े इमेजिंग सॉफ्टवेयर या छवि जे का उपयोग करके किया गया था ।

Figure 3
चित्र 3: जीवित कोशिकाओं की कॉन्फोकल इमेजिंग। (ए) हरे-फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया डाई से सना कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां माइटोकॉन्ड्रिया को दिखाती हैं। (बी) लाल फ्लोरोसेंट लाइसोसोम डाई से सनी कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां लाइसोसोम दिखाती हैं। (सी) दोनों फ्लोरोसेंट रंगों की मर्ज छवि। (डी) माइटोफैगी दिखाने वाला विस्तारित क्षेत्र। सफेद तीर लाल लाइसोसोम द्वारा घिरे हरे माइटोकॉन्ड्रिया को इंगित करता है। संक्षिप्त नाम: एक्स = उत्तेजना तरंग दैर्ध्य। ग्रीन-फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया डाई 505-545 एनएम पर एकत्र किए गए उत्सर्जन के साथ 488 एनएम पर उत्तेजित होती है। लाल फ्लोरोसेंट लाइसोसोम डाई >560 एनएम पर एकत्र किए गए उत्सर्जन के साथ 543 एनएम पर उत्तेजित होती है। स्केल पट्टियाँ = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एफसीसीपी उत्तेजना द्वारा ट्रिगर माइटोफैगी। (ए) हरे-फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया डाई और लाल-फ्लोरोसेंट लाइसोसोम डाई के साथ सह-दाग वाली कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। (बी) 10 मिनट के लिए 1 μM FCCP के साथ इलाज की गई कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। सफेद तीर लाल लाइसोसोम द्वारा घिरे हरे माइटोकॉन्ड्रिया को इंगित करता है। (सी) लाइसोसोमल-माइटोकॉन्ड्रिया ओवरले द्वारा इंगित माइटोफैगी का मात्रात्मक डेटा। डेटा एसईएम, एन = 8 कोशिकाओं ± माध्य हैं। * पी < 0.05 बनाम नियंत्रण। स्केल पट्टियाँ = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं में माइटोफैगी की गतिशील प्रक्रिया का मूल्यांकन और निगरानी करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, जिसमें ऑटोफागोसोम, लाइसोसोम और माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन शामिल हैं, सेल-परगम्य माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम रंगों के साथ सह-धुंधलापन के माध्यम से। विधि का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया की पहचान करने और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले दोनों रंगों को प्रकाश से बचाया जाना चाहिए, कई फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचा जाना चाहिए, और रंगों को जितना संभव हो सके एकल-उपयोग एलिकोट में संग्रहीत किया जाना चाहिए। उन्हें सीधे सेल कल्चर माध्यम में जोड़ने से बचने के लिए रंगों के कामकाजी समाधान तैयार करने की सिफारिश की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च स्थानीय सांद्रता और रंगों का अपर्याप्त मिश्रण हो सकता है। अन्य सेलुलर संरचनाओं को धुंधला करने से बचने के लिए, एमईएफ कोशिकाओं को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग करने से पहले 30 मिनट के लिए दाग दिया जाना चाहिए। इमेजिंग से तुरंत पहले धुंधला प्रक्रिया करने की सिफारिश की जाती है। एमईएफ कोशिकाओं में, माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम रंगों दोनों को क्रमशः माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम में अच्छी तरह से स्थानीयकृत किया जाता है, जिसमें उच्च डाई सांद्रता होती है जिसके परिणामस्वरूप साइटोटॉक्सिसिटी के साथ-साथ अन्य सेलुलर संरचनाओं का गैर-विशिष्ट धुंधलापन होता है। यह एकाग्रता एच 9 सी 2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम को धुंधला करने के लिए भी इष्टतम है। अन्य सेल लाइनों के लिए, डाई एकाग्रता और धुंधला समय जो डाई को ऑर्गेनेल के लिए अच्छी तरह से स्थानीयकृत करने की अनुमति देता है, को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम की स्पष्ट छवियां प्राप्त करने के लिए, छवि संग्रह पैरामीटर (चरण 3.3 में नोट देखें) को ईमानदारी से समायोजित किया जाना चाहिए। 50% -60% पर सेल संगम व्यक्तिगत लाइव सेल छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, और इसलिए बीज बोने से पहले कोशिकाओं की गणना की जानी चाहिए। यदि प्रयोगशाला में कॉन्फोकल व्यंजन नहीं हैं, तो परिपत्र कवरलिप्स का उपयोग विकल्प के रूप में किया जा सकता है। कुछ जानवरों के अध्ययनों में, विशेष रूप से नैदानिक परीक्षाओं में, माइटोफैगी का अध्ययन करने के लिए विश्वसनीय और सुविधाजनक मात्रात्मक प्रयोगों की कमी के कारण पशु जीवित ऊतक नमूनों में माइटोफैगी का पता लगाना मुश्किल है। फिर भी, जानवरों के ऊतकों से अलग कोशिकाओं में माइटोफैगी का मूल्यांकन यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया जा सकता है। इस विधि की एक सीमा यह है कि हालांकि दोनों रंजक आसानी से जीवित कोशिकाओं को दाग सकते हैं, वे मृत या एल्डिहाइड-निश्चित कोशिकाओं को धुंधला करने में कम प्रभावी हैं।

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले रंगों के अलावा, अन्य माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम ट्रेसर, जैसे कि क्रमशः मिटोएमएम 1/2 और लाइसोके, वर्तमान में माइटोफैगी28,29 का मूल्यांकन करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं। जबकि मिटोएमएम 1/2 पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड कोशिकाओं या ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रिया को दाग सकता है, यह सीधे माइटोफैगी का आकलन नहीं कर सकता है और माइटोफैगी का पता लगाने के लिए एंटी-एलसी 3 बी जैसे विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ डबल स्टेनिंग की आवश्यकता होती है। चूंकि लाइसोकेके केवल जीवित कोशिकाओं को दाग सकता है, इसलिए इन रंगों का संयोजन केवल जीवित कोशिकाओं28,29 में माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी का पता लगा सकता है। फिर भी, MitoMM1/2 का उपयोग करना आसान है और TRITC फ़िल्टर के उपयोग की अनुमति देता है (क्योंकि यह नीले लेजर का उपयोग करते समय उत्तेजना नहीं दिखाता है और हरे उत्सर्जन का उत्पादन नहीं करता है)। लाइसोकेके 5 मिनट के भीतर ऑर्गेनेल को दाग सकता है,जिससे कई उत्तेजनाओं की तेजी से निगरानी और मूल्यांकन की सुविधा मिलती है।

माइटोफैगी कोशिकाओं में एक जटिल तंत्र के माध्यम से होता है, जो विभिन्न सेलुलर तनाव संकेतों और विकासात्मक परिवर्तनों से प्रेरित होता है। एफसीसीपी, माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन का एक शक्तिशाली अनकपलर, एक गैर-विशिष्ट आयोनोफोर26 है जिसका उपयोग इस अध्ययन में माइटोफैगी को प्रेरित करने के लिए किया गया था। एफसीसीपी (1 μM) आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में प्रोटॉन परिवहन करके प्रोटॉन ढाल में हस्तक्षेप करता है, एक प्रक्रिया जो इंट्रासेल्युलर पीएच में परिवर्तन का कारण बनती है। इस प्रकार, एफसीसीपी मिनटों के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का गंभीर नुकसान पैदा कर सकता है और फिर माइटोकॉन्ड्रिया 26,27,30 में पार्किन और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन लाइट चेन 3 (एलसी 3) की भर्ती करके माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी को प्रेरित कर सकता है। माइटोफैगी नियामक मार्गों को यूबिकिटिन-निर्भर (पिंक 1-पार्किन-मध्यस्थता) या रिसेप्टर-निर्भर (एलसी 3 और अन्य रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता) 15,16 के रूप में वर्गीकृत किया गया है। माइटोफैगी का अध्ययन विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके किया गया है जो रिसेप्टर-निर्भर ऑटोफैजिक मार्ग में प्रमुख अणुओं को बांधते हैं, जैसे कि एलसी 3 बी, इसके बाद लाल फ्लोरोसेंट लाइसोसोम डाई31,32 के साथ सह-धुंधलापन। यद्यपि इस प्रोटोकॉल में नियोजित रंगों का उपयोग करके इन दो मार्गों के बीच अंतर करना मुश्किल है, वे जीवित कोशिकाओं में माइटोफैगी की सीमा का मूल्यांकन करने और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017वाईएफए 0105601, 2018वाईएफए0107102), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81970333,31901044), और शंघाई इंस्टीट्यूट ऑफ हायर लर्निंग (जीजेड 2020008) में विशेष नियुक्ति के प्रोफेसर के लिए कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated cell counter Countstar IC1000
Cell counting chamber slides Countstar 12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Corning 21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish) NEST 801002
Image J (Rasband, NIH) NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer Self-prepared
LysoTracker Red Invitrogen 1818430 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green Invitrogen 1842298 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts Self-prepared
Objective (63x oil lens) ZEISS ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25% Gibico Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) ZEISS ZEN 2.1

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References

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जीव विज्ञान अंक 189
माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के साथ माइटोफैगी की कल्पना करना
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Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L.,… More

Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L., Gao, M., Gong, G. Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome. J. Vis. Exp. (189), e64647, doi:10.3791/64647 (2022).

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