Summary
A mitofagia é o principal mecanismo de controle de qualidade mitocondrial. No entanto, a avaliação da mitofagia in vivo é dificultada pela falta de ensaios quantitativos confiáveis. Apresenta-se aqui um protocolo para a observação da mitofagia em células vivas usando um corante de mitocôndrias verde-fluorescente per-celular e um corante lisossomático vermelho-fluorescente.
Abstract
As mitocôndrias, sendo as potências da célula, desempenham papéis importantes na bioenergética, geração de radicais livres, homeostase do cálcio e apoptose. A mitofagia é o principal mecanismo de controle de qualidade mitocondrial e geralmente é estudada usando observação microscópica, no entanto, ensaios de mitofagia in vivo são difíceis de realizar. A avaliação da mitofagia por imagem de organelas vivas é um método alternativo e necessário para a pesquisa mitocondrial. Este protocolo descreve os procedimentos para o uso do corante de mitocôndrias verde-fluorescentes persignificado por células MitoTracker Green e o corante lisossomo vermelho-fluorescente LysoTracker Red em células vivas, incluindo a carga dos corantes, visualização das mitocôndrias e do lisossomo e resultados esperados. Etapas detalhadas para a avaliação da mitofagia em células vivas, bem como notas técnicas sobre as configurações do software do microscópio, também são fornecidas. Este método pode ajudar os pesquisadores a observar a mitofagia usando microscopia fluorescente de células vivas. Além disso, pode ser usado para quantificar mitocôndrias e lisossomos e avaliar a morfologia mitocondrial.
Introduction
As mitocôndrias são as potências de quase todas as células eucarióticas 1,2. Além da produção de ATP por meio da fosforilação oxidativa, as mitocôndrias desempenham um papel vital em outros processos, como bioenergética, homeostase do cálcio, geração de radicais livres, apoptose e homeostase celular 3,4,5. À medida que as mitocôndrias geram espécies reativas de oxigênio (EROs) a partir de múltiplos complexos na cadeia de transporte de elétrons, elas são constantemente estimuladas pelo potencial estresse oxidativo, o que pode eventualmente levar a danos estruturais e disfunção quando o sistema de defesa antioxidante entra em colapso 6,7. Descobriu-se que a disfunção mitocondrial contribui para muitas doenças, incluindo distúrbios metabólicos, neurodegeneração e doenças cardiovasculares8. Portanto, é crucial manter populações mitocondriais saudáveis e sua função adequada. As mitocôndrias são organelas altamente plásticas e dinâmicas; sua morfologia e função são controladas por mecanismos de controle de qualidade mitocondrial, incluindo modificações pós-translacionais (PTM) de proteínas mitocondriais, biogênese mitocondrial, fusão, fissão e mitofagia 9,10. A fissão mitocondrial mediada pela proteína 1 relacionada à dinamina (DRP1), uma GTPase da superfamília de proteínas dinamina, resulta em mitocôndrias pequenas e redondas e isola as mitocôndrias disfuncionais, que podem ser eliminadas e degradadas pela mitofagia11,12.
A mitofagia é um processo celular que degrada seletivamente as mitocôndrias por autofagia, geralmente ocorrendo em mitocôndrias danificadas após lesão, envelhecimento ou estresse. Posteriormente, essas mitocôndrias são entregues aos lisossomos para degradação10. Assim, a mitofagia é um processo catabólico que ajuda a manter a quantidade e a qualidade das mitocôndrias em um estado saudável em uma ampla gama de tipos de células. Desempenha um papel crucial na restauração da homeostase celular em condições fisiológicas e de estresse normais13,14. As células são caracterizadas por um complexo mecanismo de mitofagia, que é induzido por diferentes sinais de estresse celular e alterações no desenvolvimento. As vias reguladoras da mitofagia são classificadas em dependentes de ubiquitina ou dependentes de receptores15,16; a autofagia dependente de ubiquitina é mediada pela quinase PINK1 e pelo recrutamento da ubiquitina ligase Parkin E3 para as mitocôndrias 17,18, enquanto a autofagia receptor-dependente envolve a ligação dos receptores de autofagia à LC3 da cadeia leve da proteína associada aos microtúbulos que medeia a mitofagia em resposta ao dano mitocondrial19.
A microscopia eletrônica de transmissão (MET) é o método mais utilizado, e ainda um dos melhores métodos, para observar e detectar mitofagia20. As características morfológicas da mitofagia são autofagossomos ou autolisossomos formados pela fusão de autofagossomos com lisossomos, que podem ser observados a partir de imagens de microscopia eletrônica21. A fraqueza da microscopia eletrônica (EM), no entanto, é a incapacidade de monitorar os processos dinâmicos da mitofagia, como a despolarização mitocondrial, a fissão mitocondrial e a fusão de autofagossomos e lisossomos, na célula viva20. Assim, avaliar a mitofagia por meio de organelas vivas por imagem é um método alternativo atraente para a pesquisa mitocondrial. A técnica de imagem de células vivas descrita aqui usa dois corantes fluorescentes para manchar mitocôndrias e lisossomos. Quando a mitofagia ocorre, as mitocôndrias danificadas ou supérfluas engolidas por autofagossomos são coradas de verde pelo corante mitocondrial, enquanto o corante vermelho mancha os lisossomos. A fusão desses autofagossomos e lisossomos, denominados autolisossomos, faz com que a fluorescência verde e vermelha se sobreponha e se manifeste como pontos amarelos, indicando a ocorrência de mitofagia22. O corante de mitocôndrias per-celular (MitoTracker Green) contém uma porção clorometil levemente reativa ao tiol para rotular as mitocôndrias23. Para rotular as mitocôndrias, as células são simplesmente incubadas com o corante, que se difunde passivamente através da membrana plasmática e se acumula nas mitocôndrias ativas. Este corante mitocondrial pode facilmente manchar células vivas, e é menos eficaz na coloração de células fixas de aldeído ou mortas. O corante lisossomo (LysoTracker Red) é uma sonda acidotrópica fluorescente usada para marcar e rastrear organelas ácidas em células vivas. Este corante exibe uma alta seletividade para organelas ácidas e pode efetivamente rotular células vivas em concentrações nanomolares24.
Os procedimentos para o uso desses corantes fluorescentes em células vivas, incluindo o carregamento dos corantes e a visualização de mitocôndrias e lisossomos, são apresentados aqui. Este método pode ajudar os pesquisadores a observar a mitofagia usando microscopia fluorescente de células vivas. Também pode ser usado para quantificar mitocôndrias e lisossomos e avaliar a morfologia mitocondrial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultura celular e passaging
NOTA: O protocolo é descrito usando fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) rotineiramente cultivados como exemplo.
- Cultura de células MEF em placas de cultura celular de 10 cm com 10 mL de Meio Águia Modificada (DMEM) da Dulbecco. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 e monitorizar as células ao microscópio a uma ampliação de 100x.
- Realizar a passagem celular de rotina.
- Quando as células atingirem 80%-90% de confluência (a cada 3 dias), lave as células com 2 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Em seguida, adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,05% por 1 min para dissociar as células, seguido por 2 mL de DMEM para interromper a ação da tripsina-EDTA. Centrifugar a suspensão celular a 100 x g durante 3 min e ressuspender o pellet celular em 1 ml de DMEM.
- Conte as células usando um contador de células automatizado e lâminas de câmara de contagem de células (consulte Tabela de Materiais) e, em seguida, inocular 1,5 x 106 células em uma nova placa de cultura celular de 10 cm contendo 10 mL de DMEM.
- Para o ensaio de mitofagia, preparar uma suspensão celular como na etapa 1.2.1. Diluir a suspensão celular para 1 x 105 células/ml em DMEM fresco.
- Adicionar 2 ml da suspensão celular diluída a uma placa confocal de 20 mm (ver Tabela de Materiais) e agitar a placa de cultura numa "cruz". Incubar a placa de cultura celular em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 24 h.
2. Coloração mitocondrial
- Remover as alíquotas da solução-mãe do corante mitocondrial verde-fluorescente e do corante lisossoma vermelho-fluorescente (ver Tabela de Materiais) do congelador -20 °C.
- Preparar soluções de trabalho dos corantes diluindo as soluções-mãe 1:1.000 em DMEM e misturar bem. Por exemplo, adicione 2 μL cada de corante mitocondrial de 1 mM e corante lisossomo a 2 mL de DMEM para obter uma concentração de trabalho de 1 μM para ambos os corantes.
- Retirar o meio da placa de cultura confocal (passo 1.4). Adicionar 1 ml da solução corante (preparada no passo 2.2) para cobrir as células. Colocar a placa de cultura celular numa incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 20-30 min.
3. Imagem confocal
- Preparar 1 L de tampão Krebs-Henseleit (KH) (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4,7H2 O, 15 mM de glicose e 21,85 mM HEPES; pH final 7,4) e armazenar a4 °C (por até 1 mês).
- No dia da imagiologia confocal, retire o tampão KH do frigorífico com antecedência e pré-aqueça-o à temperatura ambiente (20 a 25 °C).
- Defina os parâmetros do software de imagem de microscopia confocal (ver Tabela de Materiais): Para imagens de excitação dupla, use excitação sequencial a 488 nm e 543 nm e colete a emissão a 505-545 nm e >560 nm, respectivamente.
Observação : defina as configurações de imagem da seguinte maneira. Modo de digitalização: quadro; Velocidade: 9; Média: número, 1; Ganho: 450 a 600; Pinhole: 30 a 200; laser: <10%. É melhor iniciar o software de imagem primeiro e, em seguida, ligar completamente o laser de 488 nm. O laser de 543 nm precisa ser ligado e estabilizado por 3-5 min antes do uso (Figura 1A). - Retirar o meio de cultura que contém o corante da incubadora (passo 2.3) e adicionar 1 ml de tampão KH ao prato.
- Para induzir a mitofagia, trate as células com carbonilcianeto-4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) a 1 μM (concentração final) em tampão KH por 10 min à temperatura ambiente, e proceda imediatamente à imagem das células usando o microscópio confocal.
- Aplique uma quantidade apropriada de óleo na parte superior da lente de óleo 63x (consulte Tabela de materiais). Coloque a amostra de célula no estágio de amostra do microscópio confocal e mova-a diretamente acima da lente objetiva.
- Use o software de imagem para encontrar a amostra clicando na guia Localizar no canto superior esquerdo da interface do software (Figura 1B). Selecione um conjunto de filtros verde para o experimento.
- Use o botão de ajuste grosso para focar rapidamente, movendo a lente objetiva para cima e para baixo. Depois que a amostra de célula estiver claramente visível através da ocular, procure e concentre a área de células individuais e mova-a para o centro do campo de visão.
- Clique na guia Aquisição no canto superior esquerdo da interface do software para adquirir imagens. Selecione apenas o canal de 488 nm e a resolução de quadros 1024 x 1024 para visualização.
- Clique na guia Live no canto superior esquerdo para iniciar uma verificação ao vivo. Ajuste o campo de visão para o mais nítido e ajuste a potência do laser movendo o controle deslizante para a esquerda ou para a direita (Figura 1A). Mantenha a configuração de ganho abaixo de 600 para evitar a superexposição.
- Ajuste o valor do orifício para 156, o valor de ganho para 545 e o valor de deslocamento digital para 0.
- Selecione o melhor campo de visão, verifique os dois canais (488 nm e 543 nm) e escolha a resolução do quadro 1024 x 1024. Clique em Ajustar para adquirir imagens 2D. Salve as imagens adquiridas.
NOTA: O corante verde das mitocôndrias tem um pico de excitação a 490 nm e um pico de emissão a 516 nm; ele pode ser excitado usando um laser de 488 nm. O corante lisossomo vermelho tem um pico de excitação a 576 nm e um pico de emissão a 590 nm; ele pode ser excitado usando um laser de 543 nm.
4. Análise de imagem
- Abra a imagem salva com o ImageJ e importe a imagem mesclada para ela.
- Conte manualmente o número de pontos amarelos em cada célula, que indicam que o lisossomo está engolindo mitocôndrias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MitoTracker Green é uma mancha mitocondrial verde-fluorescente que é capaz de localizar com precisão as mitocôndrias. O corante pode facilmente corar células vivas e é menos eficaz na coloração de células fixas ou mortas com aldeído (Figura 2). O corante lisossomo vermelho-fluorescente LysoTracker Red é capaz de marcar e rastrear organelas lisossômicas ácidas e só pode manchar células vivas (Figura 2). A imagem em microscópio confocal permite a visualização de mitocôndrias e lisossomos corados com os corantes apropriados (Figura 1 e Figura 2).
A mitofagia é um processo celular catabólico que degrada seletivamente as mitocôndrias por autofagia, que geralmente ocorre em mitocôndrias danificadas após lesão, envelhecimento ou estresse20. Posteriormente, essas mitocôndrias são entregues aos lisossomos para degradação. A mitofagia ajuda a manter a quantidade e a qualidade das mitocôndrias em um estado saudável em uma ampla gama de tipos de células. Em células de mamíferos saudáveis, a mitofagia ocorre com pouca frequência e, portanto, outros estímulos são necessários para induzir esse processo25. A fenilhidrazona (FCCP) carbonilcianeto-4 (trifluorometoxi), um desacoplador mitocondrial, é um ionóforo inespecífico que causa uma grave perda do potencial de membrana mitocondrial em minutos, alteração do pH intracelular e subsequente mitofagia26,27. Neste estudo, o FCCP foi utilizado para desencadear mitofagia em células MEF para imagens confocais. Quando as mitocôndrias manchadas de verde danificadas são engolidas por lisossomos corados de vermelho, a fluorescência verde e vermelha se sobrepõe para revelar lisossomos mitocondriais amarelos co-localizados (Figura 3). Os pontos amarelos da Figura 3D e da Figura 4B correspondem a essas mitocôndrias-lisossomos colocalizadas, representando a mitofagia em curso, podendo, portanto, ser contados para avaliar a extensão da mitofagia (Figura 4).
Figura 1: Parâmetros de imagem do software de imagem de microscopia confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ilustração esquemática da imagem confocal de células vivas. As células vivas são co-coradas com o corante mitocondrial verde-fluorescente e o corante lisossômico vermelho-fluorescente e, em seguida, as células vivas são fotografadas usando microscopia confocal. O processamento de imagens e a análise dos dados foram realizados usando o software de imagem associado ao microscópio ou a Imagem J. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem confocal de células vivas . (A) Imagens representativas de células coradas com o corante mitocôndrias verde-fluorescentes mostram as mitocôndrias. (B) Imagens representativas de células coradas com o corante lisossomo vermelho-fluorescente mostrando o lisossomo. (C) Imagem mesclada de ambos os corantes fluorescentes. (D) Área expandida mostrando mitofagia. A seta branca indica mitocôndrias verdes engolidas por lisossomos vermelhos. Abreviação: Ex = comprimento de onda de excitação. O corante mitocondrial verde-fluorescente é excitado a 488 nm com emissão coletada a 505-545 nm. O corante lisossomo vermelho-fluorescente é excitado a 543 nm com emissão coletada a >560 nm. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mitofagia desencadeada pela estimulação FCCP . (A) Imagens representativas de células co-coradas com o corante mitocôndria verde-fluorescente e o corante lisossomo vermelho-fluorescente. (B) Imagens representativas de células tratadas com FCCP de 1 μM por 10 min. A seta branca indica mitocôndrias verdes engolidas por lisossomos vermelhos. (C) Dados quantitativos de mitofagia indicada pela sobreposição lisossômica-mitocondria. Os dados são médios ± MEV, n = 8 células. *p < 0,05 versus controle. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo aqui descrito fornece um método para avaliar e monitorar o processo dinâmico de mitofagia em células vivas, envolvendo autofagossomos, lisossomos e fissão mitocondrial, através da co-coloração com mitocôndrias e corantes lisossômicos permeant por células. O método também pode ser usado para identificar mitocôndrias e avaliar a morfologia mitocondrial. Ambos os corantes utilizados neste estudo devem ser protegidos da luz, múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento devem ser evitados e os corantes devem ser armazenados em alíquotas de uso único, tanto quanto possível. Recomenda-se preparar soluções de trabalho dos corantes para evitar adicioná-los diretamente ao meio de cultura celular, o que pode resultar em altas concentrações locais e mistura inadequada dos corantes. Para evitar a coloração de outras estruturas celulares, as células MEF devem ser coradas por 30 minutos antes da imagem com o microscópio confocal. Recomenda-se realizar o procedimento de coloração imediatamente antes da imagem. Nas células MEF, tanto as mitocôndrias quanto os corantes lisossomos a 1 μM estão bem localizados nas mitocôndrias e lisossomos, respectivamente, com concentrações mais altas de corantes, resultando em citotoxicidade, bem como coloração inespecífica de outras estruturas celulares. Esta concentração também é ideal para colorir mitocôndrias e lisossomos em células H9C2. Para outras linhagens celulares, a concentração de corante e o tempo de coloração que permitem que o corante se localize bem nas organelas precisam ser otimizados. Para obter imagens claras de mitocôndrias e lisossomos, os parâmetros de coleta de imagens (ver a nota na etapa 3.3) devem ser ajustados conscientemente. A confluência celular a 50%-60% é crucial para obter imagens individuais de células vivas e, portanto, as células devem ser contadas antes da semeadura. Se o laboratório não tiver placas confocais, as coberturas circulares podem ser usadas como alternativa. Em alguns estudos com animais, especialmente em exames clínicos, é difícil detectar mitofagia em amostras de tecido vivo animal devido à falta de experimentos quantitativos confiáveis e convenientes para estudar a mitofagia. No entanto, a mitofagia em células isoladas de tecidos animais pode ser avaliada usando o protocolo descrito aqui. Uma limitação deste método é que, embora ambos os corantes possam facilmente manchar células vivas, eles são menos eficazes na coloração de células mortas ou fixas em aldeído.
Além dos corantes utilizados neste estudo, outros marcadores de mitocôndrias e lisossomos, como MitoMM1/2 e LysoKK, respectivamente, estão atualmente à disposição dos pesquisadores para avaliação da mitofagia28,29. Embora o MitoMM1/2 possa manchar mitocôndrias em células ou tecidos fixos em paraformaldeído, ele não pode avaliar diretamente a mitofagia e requer dupla coloração com um anticorpo específico, como o anti-LC3B, para detectar mitofagia. Como o LysoKK só pode corar células vivas, a combinação desses corantes também só pode detectar autofagia mitocondrial em células vivas28,29. No entanto, o MitoMM1/2 é fácil de usar e permite o uso do filtro TRITC (pois não mostra excitação ao usar um laser azul e não produz emissão verde). O LysoKK pode corar organelas em até 5 min, facilitando o rápido monitoramento e avaliação de inúmeros estímulos28,29.
A mitofagia ocorre nas células através de um mecanismo complexo, que é induzido por diferentes sinais de estresse celular e alterações no desenvolvimento. O FCCP, um potente desacoplador da fosforilação oxidativa mitocondrial, é um ionóforoinespecífico 26 que foi utilizado para induzir a mitofagia neste estudo. O FCCP (1 μM) interfere no gradiente de prótons transportando prótons através da membrana mitocondrial interna, um processo que causa uma mudança no pH intracelular. Assim, o FCCP pode causar uma perda grave do potencial de membrana mitocondrial em poucos minutos e, em seguida, induzir a autofagia mitocondrial recrutando Parkin e cadeia leve de proteína associada a microtúbulos 3 (CL3) para as mitocôndrias26,27,30. As vias reguladoras da mitofagia são classificadas em dependentes de ubiquitina (mediadas por PINK1-parkin) ou dependentes de receptores (mediadas por CL3 e outros receptores)15,16. A mitofagia tem sido estudada utilizando anticorpos específicos que se ligam a moléculas-chave na via autofágica receptor-dependente, como a CL3B, seguida de cocoloração com corante lisossomo fluorescente vermelho31,32. Embora seja difícil diferenciar essas duas vias usando os corantes empregados neste protocolo, eles oferecem um método simples para avaliar a extensão da mitofagia em células vivas e avaliar a morfologia mitocondrial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves da China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81970333,31901044) e pelo Programa de Professor de Nomeação Especial nas Instituições de Ensino Superior de Xangai (GZ2020008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
