Summary
Este protocolo descreve o modelo de transposição do neuroma tibial, que envolve uma lesão do nervo tibial com subsequente transposição da extremidade proximal do nervo para uma posição subcutânea pré-tibial ou lateral. O teste comportamental da dor do neuroma e da hiperalgesia plantar é quantificado usando monofilamentos de Von Frey.
Abstract
A transposição do neuroma tibial (TNT) é um modelo de rato no qual a alodínia no sítio do neuroma (nervo tibial) pode ser avaliada independentemente da alodínia na superfície plantar da pata traseira inervada pelo nervo sural intacto. Esse modelo de TNT é adequado para testar terapias para a dor do neuroma, como a potencial superioridade de certas terapias cirúrgicas já utilizadas na clínica, ou para avaliar novos fármacos e seu efeito nas duas modalidades de dor no mesmo animal. Nesse modelo, uma lesão distal (neurotmese) é feita no nervo tibial, e a extremidade proximal do nervo é transposta e fixada subcutânea e pré-tibialmente para permitir a avaliação do sítio do neuroma com um monofilamento de Von Frey de 15 g. Para avaliar a alodínia sobre o nervo sural, os monofilamentos de Von Frey podem ser usados pelo método ascendente-descendente na região lateral plantar da pata traseira. Após o corte do nervo tibial, a hipersensibilidade mecânica se desenvolve no local do neuroma dentro de 1 semana após a cirurgia e persiste pelo menos até 12 semanas após a cirurgia. A alodínia na superfície plantar inervada sural desenvolve-se dentro de 3 semanas após a cirurgia em comparação com o membro contralateral. Com 12 semanas, um neuroma se forma na extremidade proximal do nervo tibial seccionado, indicado por dispersão e turbilhonamento de axônios. Para a cirurgia modelo TNT, múltiplos passos críticos (micro)cirúrgicos precisam ser seguidos, e alguma prática cirúrgica sob anestesia terminal é aconselhada. Em comparação com outros modelos de dor neuropática, como o modelo de lesão nervosa poupada, a alodínia sobre o sítio do neuroma pode ser testada independentemente da hipersensibilidade do nervo sural no modelo TNT. No entanto, o sítio do neuroma pode ser testado apenas em ratos, não em camundongos. As dicas e orientações fornecidas neste protocolo podem ajudar grupos de pesquisa que trabalham com dor a implementar com sucesso o modelo de TNT em seu serviço.
Introduction
Cada ferida, variando de simples lacerações a amputação de membros inteiros, é acompanhada por graus variados de lesão nervosa periférica. Tal lesão nervosa pode resultar na formação de um neuroma, um emaranhamento desorganizado de fibras nervosas brotantes. Os neuromas tornam-se dolorosos em 8%-30% dos pacientes, afetando severamente sua qualidade de vida 1,2,3,4,5. Após a amputação do membro, a dor do neuroma desenvolve-se em 50% dos pacientes 6,7,8. Os sintomas relatados incluem sensibilidade, dor espontânea, alodínia, hiperalgesia e hipersensibilidade mecânica ou térmica na área inervada9. Quando não tratada adequadamente em 1 ano, a dor do neuroma pode evoluir para um estado de dor crônica, resultando em alta carga social e custos médicos associados 10,11,12,13,14. Devido à baixa eficácia das intervenções farmacológicas atuais, a dor do neuroma é tratada preferencialmente pela remoção cirúrgica do neuroma doloroso, e o nervo tratado por várias técnicas cirúrgicas, como descrito na literatura15. É importante ressaltar que o alívio completo da dor é raro, a dor geralmente piora com o tempo e 40% dos pacientes não se beneficiam da cirurgia, indicando que novos tratamentos são necessários 1,16.
Um modelo padronizado de dor no rato auxilia na compreensão dos mecanismos que conduzem a dor do neuroma e pode ajudar a identificar novos tratamentos ou avaliar os já existentes usados na clínica. O modelo de transposição do neuroma tibial (TNT) foi descrito pela primeira vez por Dorsi e col. em 200817 e tem sido utilizado por diferentes grupos de pesquisa18,19,20. O objetivo geral deste método é ser capaz de testar diferentes técnicas de tratamento para a dor do neuroma. A vantagem do modelo sobre, por exemplo, o modelo de lesão nervosa poupada (SNI)21, é que ele permite testar a alodínia no sítio do neuroma. Isso porque o modelo envolve a transposição da terminação nervosa proximal do nervo tibial para uma posição pré-tibial subcutânea, onde pode ser sondado com monofilamentos de von Frey. Além disso, a alodínia se desenvolve na superfície plantar da pata traseira inervada pelo nervo sural intacto, o que pode ser avaliado independentemente da dor do neuroma no mesmo animal. Isso é semelhante aos sintomas de dor do neuroma em pacientes, onde a dor neuropática persistente após a remoção de um neuroma doloroso às vezes é causada pelos nervos vizinhos22. Além disso, a alodínia sobre um nervo seccionado com neuroma é uma modalidade de dor diferente da alodínia sobre o nervo vizinho intacto. Assim, esse modelo facilita a avaliação do efeito de novas terapias tanto na alodínia presente no sítio do neuroma quanto na dor neuropática mais disseminada testada na superfície plantar da pata traseira. Como a cirurgia realizada para criar o modelo TNT pode ser desafiadora, este artigo elabora o procedimento para apoiar os pesquisadores na implementação do modelo em suas instalações.
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Protocol
Esta pesquisa foi realizada de acordo com o IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) e as diretrizes para pesquisa animal, projeto número AVD1150020198824.
1. Medições basais de Von Frey
- Antes da cirurgia, realizar as medidas basais de acordo com o procedimento de teste de Von Frey, descrito abaixo nas seções 5 e 6.
2. Anestesia e preparo
NOTA: Este estudo foi realizado em 15 ratos machos Sprague Dawley com 12 semanas de idade.
- Anestesiar os animais por indução com isoflurano a 5% e manter a anestesia com isoflurano a 2%-3%.
OBS: A manutenção com isoflurano a 2% geralmente resulta em anestesia suficiente e respiração espontânea, sem a necessidade de intubação traqueal ou ventilação mecânica. - Verifique os reflexos dos animais apertando o pé com uma pinça. Certifique-se de que o animal não responde antes de prosseguir. Faça a barba do campo operatório do joelho ao tornozelo com um barbeador elétrico e aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento. Injetar 0,5 mg/kg de carprofeno analgésico por via subcutânea na região abdominal.
- Coloque o rato anestesiado de costas com a cabeça para a esquerda ou para a direita e a perna a ser operada perto do cirurgião. Exorotar o membro posterior inferior de modo que o maléolo medial fique voltado para cima. Colocar o rato sob um microscópio cirúrgico estéreo com aumento de 6x.
- Desinfetar a área raspada com três rodadas alternadas de esfoliação à base de iodo seguidas de álcool. Coloque uma folha estéril com um orifício operatório sobre a perna, para que apenas o campo operatório seja visível. Certifique-se de manter essas condições estéreis durante a cirurgia.
3. Cirurgia
- Coloque um pequeno cotonete abaixo do tornozelo para manter o campo operatório horizontal. Localize o joelho e faça suavemente uma incisão longitudinal de 1-2 cm usando um bisturi sobre o lado medial da pata traseira do meio da panturrilha até o tornozelo. Se necessário, abra ainda mais a pele e subcutis com micro tesoura até que as camadas musculares fiquem visíveis.
- Identificar o feixe neurovascular superficial como dois ou três brancos e uma linha roxa/vermelha mais espessa, às vezes com ramos menores, que podem mover-se livremente sobre as camadas musculares. Usando um eletrocautério (ver Tabela de Materiais), coagule qualquer sangramento ativo ou exsudação no campo operatório. Tenha cuidado para não danificar o feixe neurovascular.
- Dissecar com firmeza para abrir a fáscia entre os músculos gastrocnêmios, logo posterior ao feixe neurovascular superficial de 3,2. Entre a fáscia dos músculos, encontra-se o nervo tibial. O nervo tibial tem cerca de três vezes o tamanho do nervo superficial no feixe vasculonervoso. Use o osso tibial como um ponto de referência adicional (o nervo tibial fica logo posterior ao osso tibial).
- Identificar o nervo tibial e sua bifurcação.
NOTA: A bifurcação é geralmente visível com uma linha mais clara longitudinalmente sobre o nervo. - Dissecar cuidadosamente o nervo tibial livre dos feixes vasculares circundantes. Realizar a dissecção movendo bruscamente o nervo tibial e cortando o tecido exposto que apresenta algum estiramento durante a movimentação do nervo tibial.
NOTA: Se o nervo tibial estiver ligado às veias de cruzamento após a dissecção, essas veias podem ser coaguladas para expor todo o nervo tibial. Tenha cuidado para não coagular o feixe tibial em si. - Expor proximalmente o nervo tibial até que ele desapareça sob uma camada muscular transversal. Nesse ponto, o nervo tibial parece mergulhar mais profundamente na pata traseira em direção ao joelho. Expor o nervo tibial distalmente até o tornozelo.
NOTA: Quando o nervo tibial é exposto mais distalmente, a quantidade de fibras colágenas cruzadas (ou seja, fibras perpendiculares à direção das fibras nervosas) aumentará. Essas fibras colágenas precisam ser cortadas para permitir comprimento suficiente para transpor o nervo tibial.- Quando todo o nervo tibial estiver exposto, coloque as camadas musculares de volta para evitar a desidratação do nervo. Se o nervo desidratar (ou seja, ficar mais rígido, sem brilho e enrugado), e cobrir com camadas musculares não for suficiente, adicione gotas de soro fisiológico para hidratá-lo.
- Com uma ferramenta de microcirurgia romba, de preferência um porta-microagulhas, disseque a pele pré-tibial da camada muscular subcutânea para fazer um túnel subcutâneo. Para fazer isso, segure a pele e empurre a ponta romba para dentro do tecido, paralelamente à pele. Certifique-se de que a extremidade do túnel esteja localizada pré-tibialmente ou mais lateralmente para garantir fácil acessibilidade da área para teste do neuroma.
- Aumentar o isoflurano para 5%. Retornar ao nervo tibial e expô-lo (ou seja, voltar ao local descrito no passo 3.6). Cortar o nervo tibial (ou seja, ambos os ramos plantares) no nível mais distal próximo ao tornozelo. Diminuir o isoflurano para o nível normal de 2%-3%.
- Mude a ampliação do microscópio para 10x ou 16x. Identificar o epineuro do nervo tibial proximal ao corte realizado no passo 3.8, ou, no caso de uma bifurcação mais proximal do nervo tibial, identificar o epineuro de ambos os ramos plantares medial e lateral proximal ao corte no passo 3.8.
NOTA: O epineuro é mais branco e firme em comparação com as fibras nervosas internas, que são mais amarelas e macias. - Coloque cuidadosamente um 8-0 sutura de náilon (ver Tabela de Materiais) através do epineuro da extremidade proximal do nervo, segurando cuidadosamente o epineuro com uma pinça e colocando a agulha entre o nervo e o epineuro com uma mordida de aproximadamente 0,5 mm. Puxar a sutura e dar uma mordida com a agulha por via subcutânea no final do túnel subcutâneo confeccionado no passo 3.7. Faça um nó, que irá transpor o nervo lateralmente para o túnel subcutâneo.
NOTA: Se ambos os ramos plantares compartilham um epineuro comum, uma sutura deve ser suficiente. Se ambos os ramos plantares tiverem seu próprio epineuro, cada epineuro deve ser fixado individualmente. Evitar colocar a sutura através da pele; apenas consertá-lo subcutaneamente. - Coloque uma sutura mais espessa e de cor escura (de preferência uma sutura azul ou preta 4-0) até a extremidade nervosa fixada, não penetrando na pele. Certifique-se de que a sutura é visível do lado de fora da pele. Verifique se o nervo permanece no lugar depois de mover a pata e os músculos. Corte as extremidades da sutura com uma extremidade de sutura ligeiramente mais longa no 4-0 do que no 8-0 sutura.
- Altere a ampliação do microscópio de volta para 6x. Fechar a pele com suturas intraepidérmicas utilizando o 8-0 sutura e limpeza suave da pele com NaCl 0,9% com um cotonete.
4. Tratamento pós-cirúrgico
- Coloque o rato em uma gaiola limpa sob um papel toalha em uma posição confortável. Se a sala estiver fria, coloque uma almofada térmica sob uma parte da gaiola (apenas sob uma parte da gaiola, pois o animal deve ser capaz de escapar do calor quando necessário). Garanta fácil acesso a alimentos e água.
- Não deixe o rato pós-cirúrgico sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. O rato pode ser devolvido à companhia de outros animais quando tiver se recuperado totalmente da anestesia após a cirurgia. Isso geralmente ocorre após 1 h e quando o rato exibe seu padrão de marcha e comportamento normais.
- Em 24 h e 48 h após a cirurgia, administrar uma dose de 0,5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea (região abdominal) para tratar a dor pós-cirúrgica.
5. Teste de Von Frey da face plantar das patas traseiras
NOTA: O teste de Von Frey (passos 5 e 6) é realizado antes da cirurgia (para medição basal) e a partir de 3 dias após a cirurgia.
- Coloque os ratos em gaiolas de fundo de arame de malha 1 semana antes da medição basal, ou 2 semanas antes da cirurgia, para garantir a aclimatação ao ambiente de teste.
- Comece com as medidas basais pelo menos 1 semana antes da cirurgia. Certifique-se de que três medições basais independentes sejam realizadas em dias separados.
- Verifique se os ratos estão calmos nas gaiolas de fundo com arame de malha. Aplicar uma série de monofilamentos de Von Frey com escala logarítmica perpendicular à superfície plantar da pata traseira.
- Para estimular o nervo sural (hipersensibilidade), aplique o monofilamento na lateral próxima à borda do cabelo. Evite tocar nas almofadas dos pés, pois estas são mais sensíveis.
- Para estimular o nervo tibial (hipossensibilidade), aplique o monofilamento no meio da superfície plantar da pata traseira. Se o monofilamento for aplicado na área mais medial, isso também pode estimular o nervo safeno, um ramo do nervo femoral (Figura 1). Evite tocar nas almofadas dos pés.
- Comece com o monofilamento de 4 g. Aplique força suficiente no monofilamento para que o pelo fique dobrando e segure por 3 s e, em seguida, verifique as respostas do animal sobre o monofilamento. Uma resposta positiva é a retirada súbita da pata, o vacilo súbito, a lambida súbita da pata ou a vocalização. Em alguns casos, o rato se move e tenta encontrar/atacar o monofilamento.
- Escolha o próximo monofilamento dependendo da resposta ao estímulo pelo método up-down23. Por exemplo, se o rato responder, estimule em seguida com o monofilamento de 2 g; Se o rato não responder, estimule com o monofilamento de 6 g e assim por diante. No total, aplique de 5 a 10 estímulos dependendo da reação.
6. Teste de Von Frey no sítio do neuroma
- Manusear os animais diariamente por um mínimo de 5-7 dias antes das medidas basais ou 2 semanas antes da cirurgia. Certifique-se de que os animais estão detidos como descrito no passo 6.2, para que estejam confortáveis com a posição.
- Segure os ratos com o nariz apontado para a prega do cotovelo. Se o rato for segurado na mão direita, sua pata traseira esquerda deve ficar pendurada livremente entre o polegar direito e o indicador (primeiro espaço na web). Se o rato for segurado na mão esquerda, a pata traseira direita deve ficar pendurada livremente entre o polegar esquerdo e o indicador.
- Comece com as medidas basais pelo menos 1 semana antes da cirurgia. Certifique-se de que três medições basais independentes sejam realizadas em dias separados.
- Verifique se os ratos estão calmos e confortáveis enquanto estão sendo segurados. Na linha de base, coloque o monofilamento de 15 g suavemente sobre a superfície pré-tibial da pata traseira exposta. Após a cirurgia, colocar o monofilamento de 15 g sobre a sutura visível (por exemplo, no local do neuroma). Aplique força suficiente no monofilamento para que o cabelo fique dobrando e segure por 1 s.
- Registre a reação a cada estímulo. As opções de reação incluem nenhuma reação, retirada lenta, retirada rápida e vocalização. Registre a resposta como 0 pontos para nenhuma reação e um ponto para retirada lenta, retirada rápida ou vocalização.
- Repetir cinco clusters de cinco aplicações do monofilamento, com 2-3 s entre cada aplicação e 2-3 min ou mais entre os cinco clusters. No total, cada pata traseira deve ter 25 aplicações do monofilamento com respostas registradas.
7. Recuperação de espécimes para histologia e preparo
NOTA: O exame histológico é realizado 12 semanas após a cirurgia inicial.
- Induzir a anestesia e preparar os animais conforme descrito nos passos 2.2, 2.3 e 2.4.
- Faça suavemente uma incisão de 2-3 cm usando um bisturi sobre a cicatriz que foi feita pela cirurgia inicial, mas tenha cuidado para não cortar muito profundamente, pois o nervo é colocado superficialmente.
- Determinar a posição do neuroma, dissecar cuidadosamente o neuroma e o nervo livre do tecido cicatricial circundante e colocar o neuroma retirado no fixador. Para avaliar a morfologia do neuroma, o tecido é preferencialmente incluído longitudinalmente em parafina ou resina epóxi, como descrito por Tork et al.18.
- Após a retirada do tecido, eutanasiar os ratos sob anestesia terminal (isoflurano a 5%) por punção cardíaca ou decapitação.
NOTA: É aconselhável primeiro colher o neuroma antes de matar os ratos, porque então é mais fácil distinguir o neuroma de seu tecido circundante in vivo.
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Representative Results
A avaliação no sítio do neuroma mostrou aumento da sensibilidade à aplicação do monofilamento de von Frey 15 g. No início do estudo, os ratos tipicamente responderam a 10%-15% (± 13%) das 25 aplicações de um monofilamento de 15 g. A taxa de resposta aumentou para 45%-50% (± 24%) 1 semana após a cirurgia de TNT. No lado contralateral, o número de respostas após a cirurgia foi semelhante ao basal (Figura 2A). Cerca de 20% dos ratos não desenvolveram neuroma doloroso; a taxa de resposta não aumentou em relação à linha de base (Figura 2B). Isso é comparável à situação humana, onde nem todos os pacientes (50% após a amputação) desenvolvem dor após a formação de um neuroma. Todos os ratos desenvolveram neuroma ao final do coto do nervo tibial transeccionado e transposto 12 semanas após a cirurgia (Figura 3). Este neuroma foi caracterizado por axônios e microfascículos giratórios dentro de depósitos de colágeno.
A transecção do nervo tibial reduziu a sensibilidade mecânica no meio da face plantar da pata posterior, inervada pelo nervo tibial (Figura 1). A hipossensibilidade esteve presente em 1 semana após a cirurgia, foi significativamente diferente do lado contralateral e basal a partir de 3 semanas após a cirurgia, e permaneceu até pelo menos 12 semanas após a cirurgia (Figura 4). Na parte lateral da face plantar da pata traseira inervada pelo nervo sural intacto, os ratos desenvolveram hipersensibilidade mecânica significativamente diferente do lado contralateral e basal a partir de 1 semana após a cirurgia (Figura 4). Essa hipersensibilidade persistiu por pelo menos 12 semanas após a cirurgia. Na pata contralateral, a sensibilidade mecânica não foi afetada em relação à basal nas áreas inervadas pelo nervo sural ou tibial (Figura 4).
Figura 1: Distribuição nervosa na face plantar da pata traseira. Vermelho = distribuição do nervo sural (lateral); roxo = distribuição do nervo tibial (médio); verde = distribuição do nervo safeno (medial). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Von Frey do sítio do neuroma. O nervo tibial foi transeccionado e o curso da sensibilidade mecânica sobre o sítio do neuroma foi avaliado com um monofilamento de 15 g aplicado em cinco agrupamentos de cinco aplicações cada, totalizando 25 aplicações. Uma resposta é pontuada como um ponto. (A) O sítio do neuroma apresentou resposta significativamente maior 1 semana após a cirurgia em relação ao basal e ao lado contralateral. N = 15; barras de erro: erro padrão da média (EPM); análise de modelos mistos com comparações múltiplas e teste de Tukey. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (B) Os valores individuais do sítio ipsilateral mostram diversidade na reação. Três ratos (20%) apresentaram escore basal relativamente alto e três ratos (20%) não apresentaram alterações na sensibilidade pré-tibial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Morfologia do neuroma. Imagens histológicas de neuroma de 12 semanas. (A) Coloração Hematoxilina-Eosina, (B) Coloração Tricrômico de Masson e (C) Coloração de Neurofilamento. Seta verde = nervo tibial proximal ao neuroma. Seta alaranjada = neuroma, identificado por turbilhonamento dos axônios e difusão dos fascículos. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Von Frey da pata posterior plantar (nervo tibial e sural). O nervo tibial foi transeccionado e o curso da sensibilidade mecânica foi avaliado pelo teste de Von Frey na superfície plantar da pata traseira. A parte média da pata traseira operada ipsilateralmente inervada pelo nervo tibial mostrou hiposensibilidade. A parte lateral da pata traseira operada ipsilateralmente inervada pelo nervo sural mostrou hipersensibilidade. As partes média e lateral da pata posterior plantar contralateral não apresentaram alterações na sensibilidade em relação à linha de base. N = 15; barras de erro: erro padrão da média (EPM); análise de modelos mistos com comparações múltiplas e teste de Tukey. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Etapas críticas do protocolo
O modelo TNT envolve cortar o nervo tibial e transpô-lo lateral e subcutaneamente para um local pré-tibial para permitir o teste de sensibilidade do neuroma, além de hiperalgesia plantar sobre o nervo sural. No modelo TNT, é fundamental que o local do neuroma seja visível para os pesquisadores. Portanto, uma cepa de rato albino é preferida porque as suturas subcutâneas são facilmente visíveis através da pele e a cor da sutura deve ser preferencialmente azul escuro ou preto.
Quando a cirurgia é realizada e o nervo tibial é exposto, há variação no local (por exemplo, proximal ou distal) da bifurcação do nervo tibial. Se os ratos apresentarem uma bifurcação proximal, é possível que dois nervos (o nervo plantar medial e lateral) proximal ao tornozelo (Figura 5A), em vez de apenas um nervo tibial (Figura 5B). É importante que ambos os ramos sejam cortados e transpostos para induzir hiperalgesia plantar sobre o nervo sural. Optou-se por transpor apenas um nervo plantar; entretanto, a distinção entre o nervo plantar lateral e medial não é facilmente feita neste nível e poderia influenciar os resultados. Portanto, é aconselhável transpor ambos os nervos. Além disso, alguns ratos podem ter uma bifurcação mais distal do nervo tibial, e transpor apenas um nervo plantar pode ser impossível.
Figura 5: Bifurcação proximal e distal do nervo tibial. Variação anatômica do nível de bifurcação (*) do nervo tibial. (A) Bifurcação proximal do nervo tibial; (B) bifurcação distal do nervo tibial. Abreviações: NMP = nervo plantar medial, NPL = nervo plantar lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No artigo original de Dorsi et al.17, uma ligadura é colocada ao redor da extremidade proximal do nervo tibial e o nervo é transposto e fixado através dessa sutura de ligadura. Como a ligadura ao redor do nervo pode induzir dor por constrição24, uma alternativa descrita nesse método é a fixação do nervo por meio de suturas epineurinais. Se o nervo tibial for cortado e transposto, é importante que a sutura para fixação subcutânea do nervo seja colocada através do epineuro e não dos próprios fascículos nervosos, pois isso também poderia influenciar as medidas de dor. Além disso, deve-se evitar a colocação da sutura através da pele, pois os ratos tendem a roer quaisquer suturas visíveis, resultando em deslocamento do neuroma e, portanto, resultados não confiáveis das medidas de dor.
Quando a pele está fechada, também é importante usar suturas intraepidérmicas para evitar roer que resultará em uma ferida aberta. Além disso, após a transposição do nervo tibial, ele ficará situado em uma camada mais superficial logo abaixo da pele. Uma ferida aberta em combinação com um nervo colocado superficialmente é indesejável.
As medidas de von Frey podem ser realizadas para testar a dor do neuroma no local do neuroma e para testar a hiperalgesia plantar sobre o nervo sural, na face lateral da pata traseira. O sítio do neuroma é visível após a cirurgia devido à cor escura da sutura. Para o teste de hipersensibilidade do nervo sural, deve-se escolher um local onde o monofilamento de Von Frey é aplicado. Este pode ser proximal ou distal ao coxim alimentar lateral, mas deve ser aproximadamente o mesmo local durante as medidas basais e medidas nas semanas após a cirurgia.
Solução de problemas do método
Se os ratos reagirem a todos os estímulos aplicados na área pré-tibial já durante as medições basais, certifique-se de que estão calmos e relaxados e de que estão devidamente aclimatados à área de teste. Repetir a medição basal até que os ratos reajam menos aos estímulos. Além disso, é preferível não usar nenhum perfume durante a realização das medições. Idealmente, os ratos não reagem ao estímulo pré-tibial quando um monofilamento de 15 g é aplicado antes da cirurgia. No entanto, se os ratos estiverem calmos e 50%-100% dos ratos ainda reagirem ao monofilamento de 15 g, mude-o para um monofilamento que tenha uma taxa de resposta de 10%-20% durante a linha de base. No entanto, se o monofilamento for alterado, recomenda-se primeiro realizar um experimento piloto para testar se os ratos TNT reagem a essa menor força do monofilamento. No trabalho inicial do modelo TNT, o sítio do neuroma foi medido aplicando-se o monofilamento através de uma abertura no fundo de uma caixa de Perspex17. Em experimentos piloto, os ratos reagiram a cada estímulo quando aplicado através do fundo da gaiola e tenderam a atacar o monofilamento. Quando mantidos de perto pelo pesquisador, os ratos estavam em um estado calmo, resultando em uma menor taxa de resposta no monofilamento durante a medição basal.
Se a extremidade proximal do nervo tibial não puder alcançar o suficiente no túnel subcutâneo, siga o curso do nervo tibial mais proximal e remova qualquer tecido colágeno e gorduroso ao redor do nervo. Corte quaisquer ramos nervosos menores ou vasos que mantenham o nervo fixo ao seu entorno. Isso dará ao nervo uma amplitude de movimento maior para ser transposto mais lateralmente. Vale ressaltar que no trabalho original de Dorsi et al.17, o nervo foi transposto mais lateralmente. Em experimentos piloto, verificou-se a impossibilidade de alcançar a posição lateral. Portanto, este método descreve uma posição pré-tibial do sítio do neuroma.
Limitações do método
Uma limitação do modelo TNT é que a cirurgia envolve múltiplos passos (micro)cirúrgicos a serem seguidos. Outra limitação é que o modelo TNT não é facilmente traduzido para camundongos. Por experiência, camundongos tendem a ser bastante sensíveis a estímulos aplicados em uma área pré-tibial, mesmo com a aplicação de um monofilamento de 0,008 g.
Importância do método em relação aos métodos existentes/alternativos
No modelo TNT, a dor do neuroma pode ser testada independentemente da hiperalgesia plantar sobre o nervo sural. Esta última também é induzida em outros modelos de dor neuropática, como o modelo SNI, mas aqui a dor do neuroma não pode ser testada de forma independente21. Além disso, tanto o nervo tibial quanto o fibular são cortados no modelo SNI, resultando em maior perda da função motora, o que resulta em paralisação dos músculos intrínsecos da pata21. Como apenas o nervo tibial é cortado em nível distal no modelo TNT, os músculos intrínsecos dos pés apresentam apenas uma perda desprezível da função motora.
Aplicações potenciais do método
Pesquisas anteriores já mostraram que o modelo de TNT pode ser usado para testar vários medicamentos para dor, capas nervosas ou outras ferramentas cirúrgicas para o tratamento do neuroma18,19,20. No entanto, todos os grupos de pesquisa interessados em dor poderiam ter potencial benefício com o uso do modelo TNT, uma vez que duas modalidades diferentes de dor podem ser testadas no mesmo animal.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse. Embora este trabalho de pesquisa tenha sido parcialmente financiado pela Axogen, a empresa não teve influência na execução do estudo e nos resultados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Sabine Versteeg pela assistência durante a microcirurgia e a Anja van der Sar e Trudy Oosterveld-Romijn do Common Animal Laboratory (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) por sua ajuda na preparação do microscópio e sala cirúrgica e no cuidado com os animais.
Esta pesquisa foi financiada por Axogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
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