Summary
Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen voor het genereren en karakteriseren van muriene orale-oesofageale 3D-organoïden die normale, preneoplastische en plaveiselcelcarcinoomlaesies vertegenwoordigen die worden geïnduceerd via chemische carcinogenese.
Abstract
Oesofageaal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) komt wereldwijd voor, goed voor 90% van alle gevallen van slokdarmkanker per jaar, en is het dodelijkste van alle menselijke plaveiselcelcarcinomen. Ondanks recente vooruitgang bij het definiëren van de moleculaire veranderingen die gepaard gaan met ESCC-initiatie en -ontwikkeling, blijft de prognose van de patiënt slecht. De functionele annotatie van deze moleculaire veranderingen is de noodzakelijke volgende stap en vereist modellen die zowel de moleculaire kenmerken van ESCC vastleggen als gemakkelijk en goedkoop kunnen worden gemanipuleerd voor functionele annotatie. Muizen behandeld met de tabaksrook mimetisch 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) vormen voorspelbaar ESCC en slokdarmpreneoplasie. Van belang is dat 4NQO-laesies ook voorkomen in de mondholte, meestal in de tong, evenals de voormaag, die allemaal het gestratificeerde plaveiselepitheel delen. Deze muizen kunnen echter niet eenvoudig worden gemanipuleerd voor het testen van functionele hypothesen, omdat het genereren van isogene muismodellen tijd- en middelenintensief is. Hierin overwinnen we deze beperking door eencellige driedimensionale (3D) organoïden te genereren van muizen die zijn behandeld met 4NQO om murine ESCC of preneoplastische cellen ex vivo te karakteriseren. Deze organoïden vangen de opvallende kenmerken van ESCC en slokdarmpreneoplasie, kunnen goedkoop en snel worden gebruikt om isogene modellen te vormen en kunnen worden gebruikt voor syngenetische transplantatie-experimenten. We demonstreren hoe 3D-organoïden te genereren uit normaal, preneoplastisch en SCC-muizenslokdarmweefsel en deze organoïden te onderhouden en te cryopreserveren. De toepassingen van deze veelzijdige organoïden zijn breed en omvatten het gebruik van genetisch gemanipuleerde muizen en verdere karakterisering door flowcytometrie of immunohistochemie, het genereren van isogene organoïde lijnen met behulp van CRISPR-technologieën en medicijnscreening of syngenetische transplantatie. Wij zijn van mening dat de wijdverbreide toepassing van de in dit protocol gedemonstreerde technieken de vooruitgang op dit gebied ter bestrijding van de zware last van het ESCC zal versnellen.
Introduction
Oesofageaal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) is het dodelijkste van de menselijke plaveiselcelcarcinomen, vanwege de late diagnose, therapieresistentie en metastase 1,2. ESCC ontstaat uit het gelaagde plaveiselepitheel, dat het luminale oppervlak van de slokdarm bekleedt. Het plaveiselepitheel bestaat uit proliferatieve basale cellen en gedifferentieerde cellen binnen de suprabasale cellaag. Onder fysiologische omstandigheden drukken basale cellen markers uit zoals p63, Sox2 en cytokeratine K5 en K14, terwijl gedifferentieerde cellen K4, K13 en IVL tot expressie brengen. Basale cellen zelf zijn heterogeen en omvatten vermeende stamcellen gedefinieerd door markers zoals K153 en CD734. Bij homeostase ondergaan basale cellen post-mitotische terminale differentiatie binnen de suprabasale cellaag, terwijl gedifferentieerde cellen migreren en desquamateren in het lumen om epitheelvernieuwing te voltooien. ESCC doet denken aan hun cellen van oorsprong en vertoont plaveiselceldifferentiatie in verschillende mate. ESCC gaat vaak gepaard met multifocale histologische voorloperlaesies, bekend als intra-epitheliale neoplasie (IEN) of dysplasie, bestaande uit atypische basaloïde cellen. Naast epitheliale veranderingen vertoont ESCC weefselremodellering binnen het subepitheliale compartiment, waar de activering van kankergeassocieerde fibroblasten (CAF's) en de rekrutering van immuun- / ontstekingscellen plaatsvinden om de tumorbevorderende micro-omgeving te bevorderen.
De pathogenese van ESCC omvat genetische veranderingen en blootstelling aan omgevingsrisicofactoren. Belangrijke genetische laesies omvatten de inactivatie van de tumorsuppressorgenen TP53 en CDKN2A (p16INK4A) en de activering van de CCND1 (cycline D1) en EGFR-oncogenen, die culmineren in een verminderde celcycluscontrolepuntfunctie, afwijkende proliferatie en overleving onder genotoxische stress gerelateerd aan blootstelling aan kankerverwekkende stoffen in het milieu. Inderdaad, genetische veranderingen werken nauw samen met gedrags- en omgevingsrisicofactoren, meestal tabaks- en alcoholgebruik. Tabaksrook bevat kankerverwekkende stoffen voor de mens, zoals aceetaldehyde, dat ook de belangrijkste metaboliet van alcohol is. Aceetaldehyde induceert DNA-adducten en interstreng DNA-crosslinks, wat leidt tot DNA-schade en de accumulatie van DNA-mutaties en chromosomale instabiliteit. Gezien overmatige mitogene stimuli en afwijkende proliferatie door oncogenactivering, wordt de kwaadaardige transformatie van slokdarmepitheelcellen vergemakkelijkt door mechanismen om genotoxische stress het hoofd te bieden, waaronder de activering van antioxidanten, autofagie en epitheliale-mesenchymale overgang (EMT). Interessant is dat deze cytoprotectieve functies vaak worden geactiveerd in ESCC-kankerstamcellen (CSC's) die worden gekenmerkt door hoge CD44 (CD44H) expressie en de mogelijkheden hebben van tumorinitiatie, invasie, metastase en therapieresistentie 5,6,7.
ESCC is gemodelleerd in celkweek en in knaagdiermodellen 8,9. In de afgelopen drie decennia zijn robuuste genetisch gemanipuleerde muismodellen van ESCC ontwikkeld. Deze omvatten CCND1 en EGFR transgene muizen 10,11 en p53 en p120Ctn knock-out muizen 12,13. Enkelvoudige genetische veranderingen resulteren echter meestal niet in een snel optredende ESCC. Deze uitdaging is overwonnen met het gebruik van slokdarmcarcinogenen die de menselijke genetische laesies in ESCC14 goed samenvatten. Bijvoorbeeld, 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) versnelt ESCC ontwikkeling in CCND1 transgene muizen15. In de afgelopen jaren zijn vermeende slokdarmepitheelstamcellen, voorlopercellen en hun respectieve lotgevallen onderzocht in cellijn-traceerbare muismodellen 3,4. Bovendien zijn deze cellijn-traceerbare muizen gebruikt om de cellen van oorsprong van ESCC te onderzoeken en hoe dergelijke cellen aanleiding geven tot CD44H CSC's via conventionele histologie en op omics gebaseerde moleculaire karakterisering7.
Een opkomend gebied gerelateerd aan deze muismodellen is de nieuwe toepassing van celkweektechnieken om levende ESCC- en voorlopercellen te analyseren in een driedimensionaal (3D) organoïde systeem waarin de architectuur van de oorspronkelijke weefsels ex vivo 7,8,9 wordt samengevat. Deze 3D-organoïden worden snel gekweekt uit een eencellige suspensie geïsoleerd uit muizenweefsels, waaronder primaire en gemetastaseerde tumoren (bijv. Lymfeklier-, long- en leverlaesies). De cellen zijn ingebed in keldermembraanextract (BME) en gevoed met een goed gedefinieerd serumvrij celkweekmedium. De 3D-organoïden groeien binnen 7-10 dagen en de resulterende bolvormige structuren zijn vatbaar voor subcultuur, cryopreservatie en testen voor het analyseren van een verscheidenheid aan cellulaire eigenschappen en functies, waaronder CSC-markers, EMT, autofagie, proliferatie, differentiatie en apoptotische celdood.
Deze methoden kunnen breed worden toegepast op 3D-organoïde culturen die zijn vastgesteld uit elk gestratificeerd plaveiselepitheelweefsel, zoals het hoofd- en nekslijmvlies (mondholte, tong, keelholte en strottenhoofd) en zelfs de voormaag. Het hoofd- en nekslijmvlies zijn aaneengesloten met de slokdarm en de twee weefsels delen een vergelijkbare weefselorganisatie, functie en vatbaarheid voor ziekten. Zowel hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) als ESCC delen genetische laesies en leefstijlgerelateerde omgevingsrisicofactoren zoals blootstelling aan tabak en alcohol. Om deze gelijkenis te onderstrepen, ontwikkelen muizen die zijn behandeld met de tabaksrook mimetische 4NQO gemakkelijk zowel HNSCC als ESCC. Gezien het gemak waarmee de hieronder beschreven protocollen kunnen worden toegepast op het modelleren van HNSCC, nemen we specifieke instructies op voor het vaststellen van 3D-organoïde culturen uit deze laesies.
Hierin bieden we gedetailleerde protocollen voor het genereren van murine oesofageale 3D-organoïden (MEO's) die normale, preneoplastische en ESCC-laesies vertegenwoordigen die zich ontwikkelen bij muizen die zijn behandeld met 4NQO. Verschillende muizenstammen kunnen worden gebruikt, waaronder veel voorkomende laboratoriumstammen zoals C57BL / 6 en cellijn-traceerbare en andere genetisch gemanipuleerde derivaten. We benadrukken de belangrijkste stappen, waaronder de isolatie van normaal of ziek muizenoesofageaal epitheel, de bereiding van eencellige suspensies, de teelt en monitoring van de groeiende 3D-organoïden, subcultuur, cryopreservatie en de verwerking voor latere analyses, inclusief morfologie en andere toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De muizenexperimenten werden gepland en uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften en onder dierprotocol #AABB1502, beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Columbia University. De muizen werden gehuisvest in een goede dierenverzorgingsfaciliteit die de humane behandeling van muizen garandeert en passende veterinaire zorg voor de muizen en laboratoriumveiligheidstraining voor het laboratoriumpersoneel biedt.
1. Behandeling van muizen met 4NQO om slokdarm-IEN- en ESCC-laesies te induceren (tijdsoverweging: tot 28 weken)
OPMERKING: Om MEO's te genereren die neoplastische slokdarmlaesies vertegenwoordigen, worden de muizen onderworpen aan 4NQO-gemedieerde chemische carcinogenese zoals eerder beschreven door Tang et al.14. Normale/niet-neoplastische MEO's worden gegenereerd uit onbehandelde muizen.
- Muizen
- Huisvest vier tot vijf muizen per kooi en laat ze minstens 1 week wennen aan de dierfaciliteit voordat ze aan een experiment beginnen. Om de kans te verkleinen dat leeftijdsgerelateerde aandoeningen resulteren in voortijdige beëindiging van het volledige 28 weken durende experiment, begint u met muizen van 8 weken oud tot 16 weken oud.
OPMERKING: C57BL/6 muizen met een gewicht van ongeveer 20-30 g werden gebruikt in dit protocol. Voor kortere experimenten kunnen oudere muizen worden gebruikt. Mannelijke of vrouwelijke muizen zijn acceptabel. Controlemuizen (geen behandeling, zie rubriek 1.3.1) moeten qua leeftijd en geslacht op elkaar worden afgestemd.
- Huisvest vier tot vijf muizen per kooi en laat ze minstens 1 week wennen aan de dierfaciliteit voordat ze aan een experiment beginnen. Om de kans te verkleinen dat leeftijdsgerelateerde aandoeningen resulteren in voortijdige beëindiging van het volledige 28 weken durende experiment, begint u met muizen van 8 weken oud tot 16 weken oud.
- Bereiding van drinkwater dat 4NQO bevat
- Bereid 1 mg/ml 4NQO stockoplossing in ethyleenpropyleenglycol (materiaaltabel). Los 100 mg 4NQO op in 100 ml 99,9% ethyleenpropyleenglycol in een glazen bekerglas van 500 ml bedekt met afdichtingsfilm. Meng grondig bij kamertemperatuur (RT) met behulp van een magneetroerder bij 800 rpm gedurende 30 min. Bewaren bij 4 °C.
- Voeg 900 ml geautoclaveerd gedeïoniseerd water toe aan 100 ml 1 mg/ml 4NQO-stamoplossing en meng door inversie in een 2 L plastic maatcilinder bedekt met afdichtingsfolie. Een volume van 1 L van 100 μg/ml 4NQO in 10% ethyleenpropyleenglycol zal twee muizenkooien bedienen die zijn uitgerust met een drinkfles van 500 ml.
LET OP: Van belang is dat 4NQO een synthetisch chemisch carcinogeen is dat kanker kan veroorzaken. Hanteer met nitrilhandschoenen en een laboratoriumjas met lange mouwen en draag schoenen met gesloten teen. Denk aan goede oogbescherming, gezichtsbescherming en hoofdbedekking. Voor afvalverwijdering moet 4NQO in een geëtiketteerde container worden geplaatst in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor het beheer van gevaarlijk afval door milieugezondheid en -veiligheid.
- Behandeling met 4NQO en monitoring
- Bevestig de drinkfles en dien 4NQO via het drinkwater ad libitum toe aan de muizen gedurende 16 weken. Gebruik 10% (w/v) propyleenglycol als een medium (geen behandeling) controle.
OPMERKING: Kortere duur van 4NQO-behandeling kan worden gebruikt om IEN te induceren. - Vul het water eenmaal per week bij.
- Weeg elke muis wekelijks af door deze in een plastic container op een laboratoriumbalans te plaatsen.
- Begin aan het einde van de 4NQO-behandelingsperiode van 16 weken met het regelmatig geven van drinkwater aan de muizen tijdens de post-4NQO-observatieperiode gedurende maximaal 12 weken (figuur 1).
- Controleer de muizen dagelijks op tekenen van nood (bijv. Verminderde mobiliteit, gebogen habitus en teruggetrokken gedrag), dysfagie en uitdroging. Evalueer de muizen bovendien wekelijks op veranderingen in lichaamsgewicht of voedsel- en vloeistofinname. Als het lichaamsgewicht met meer dan 10% daalt ten opzichte van het oorspronkelijke lichaamsgewicht, voed de muizen dan met een vloeibaar voedingssupplement.
OPMERKING: Een verlies van lichaamsgewicht ongevoelig voor vloeibare voedingssupplementen kan indicatief zijn voor ESCC, en muizen die meer dan 20% van hun lichaamsgewicht verliezen, moeten worden geëuthanaseerd. Belangrijk is dat MEO's kunnen worden gegenereerd uit voortijdig geëuthanaseerde muizen. Merk op dat C57BL/6-muizen zonder genetische modificaties doorgaans geen tekenen van morbiditeit vertonen of zichtbare ESCC-laesies hebben tot het einde van de post-4NQO-observatieperiode.
- Bevestig de drinkfles en dien 4NQO via het drinkwater ad libitum toe aan de muizen gedurende 16 weken. Gebruik 10% (w/v) propyleenglycol als een medium (geen behandeling) controle.
- Voorbereiding van dieren
- Euthanaseer de muizen in een CO 2-kamer gevuld met CO2 met een stroomsnelheid die 30% -70% van het kamervolume per minuut verplaatst. Bevestig de dood door cervicale dislocatie.
- Pin de ledematen en neus van de muis in rugligging vast aan het dissectieplatform met behulp van naalden van 21 G.
- Desinfecteer het ventrale oppervlak van de muis met 70% ethanol.
- Dissectie (tijdsoverweging: 0,5 uur)
- Open de huid door in de midabdominale vacht en huid te knijpen om ervoor te zorgen dat deze wordt bevrijd van de ingewanden eronder. Gebruik de chirurgische schaar om een craniocaudale, ventrale middellijnincisie te maken van de onderbuik naar de kin.
- Begin bij de middellijnincisie en gebruik een chirurgische schaar om radiale sneden te maken die zich uitstrekken tot de ledematen aan beide zijden van de muis. Flay de huid flapt open.
- Om de cervicale luchtpijp bloot te leggen, gebruikt u de ontleedschaar om de speekselklieren op de middellijn te verdelen. De luchtpijp ligt diep in de klieren.
- Om de thoracale luchtpijp bloot te leggen, verwijdert u het borstbeen.
- Knijp en til het peritoneum voorzichtig op met een tang en gebruik een schaar om het peritoneum craniocaudaal en lateraal langs de ribbenkast te verdelen.
- Trek de lever voorzichtig terug van het caudale oppervlak van het diafragma en gebruik een schaar om een kleine incisie in het diafragma te maken bij de sternale inkeping, met name aan het dorsale oppervlak van het xiphoid-proces. Hierdoor komen de long en het hart vrij van het viscerale borstvlies.
- Scheid de ribbenkast van de thoracale inhoud. Steek een schaar in de incisie in het middenrif en ontleed craniaal naar de cervicale gordel. Houd tijdens deze dissectie nauw aan het dorsale oppervlak van het borstbeen om schade aan de organen eronder te voorkomen. Zorg ervoor dat het vlak van dissectie zich buiten de luchtpijp bevindt.
- Knip de ribben aan weerszijden van het borstbeen met een schaar en verwijder het borstbeen. Zorg ervoor dat de thoracale inhoud wordt blootgesteld.
- Stel de buikslokdarm bloot. Til de maag voorzichtig anterieur op door het antrum met een tang vast te houden. Ontleed de milt, alvleesklier en mesenterium van de maag en slokdarm met een schaar.
- Stel de thoracale slokdarm bloot (figuur 2).
- Til de luchtpijp voorzichtig onmiddellijk caudaal op naar het schildklierkraakbeen en ontleed de slokdarm van de dorsale zijde van de luchtpijp met behulp van een irisschaar.
- Verdeel de luchtpijp bij het schildklierkraakbeen met een irisschaar.
- Pel de luchtpijp van de rest van de slokdarm via zorgvuldige dissectie in caudale richting.
- Verwijder de longen, het hart en de thymus massaal met de luchtpijp. Zorg ervoor dat u schade aan de slokdarm voorkomt bij het ontleden en verdelen van de aorta en vena cava.
- Verdeel de maag bij de pylorus met een schaar.
- Scheid de slokdarm van de wervel door het antrum met een tang vast te houden en craniaal te ontleden.
- Verdeel de slokdarm ter hoogte van het schildklierkraakbeen en oogst de slokdarm en maag massaal (figuur 3).
- Scheid de maag en de slokdarm door de slokdarm bij de cardia te verdelen (figuur 4, bovenpaneel, rode lijn).
- Ontleed elke fascia op het buitenoppervlak van de slokdarm. Om een monster te reserveren voor histologie (optioneel), verwijdert u de helft van de slokdarm en splitst u in de lengterichting met een schaar. Plaats de resterende intacte slokdarm in koude PBS op ijs.
- Open de maag langs de grotere kromming en was voldoende met PBS. Scheid de voormaag en was met koude PBS. Plaats de voormaag in koude PBS op ijs.
- Om de tong te oogsten, verwijdert u de naald van 21 G op de neus en trekt u de tong eruit met een pincet. Snijd de tong zo lang mogelijk. Plaats de tong in koude PBS op ijs.
2. Oprichting van muriene oesofageale organoïde (MEO) cultuur
OPMERKING: Dit protocol kan ook worden gebruikt om een murine tong organoïde cultuur vast te stellen met de toevoeging van een stap waarin het tongweefsel wordt gehakt vóór trypsinisatie. Zie de opmerking in stap 2.2.3.
- Bereiding van reagentia
OPMERKING: Een lijst van reagentia is te vinden in de materiaaltabel. Bereid en bewaar de voorraadoplossingen volgens de instructies van de fabrikant, tenzij anders aangegeven.- Zorg ervoor dat de aliquots voor eenmalig gebruik van de keldermembraanmatrix (BME) die in dit protocol worden gebruikt, worden opgeslagen bij −20 °C tot de dag van gebruik, vervolgens worden ontdooid op ijs of bij 2-8 °C en te allen tijde op ijs worden bewaard wanneer ze niet in gebruik zijn.
- Los 250 mg soja-trypsineremmer (soa) op in 1.000 ml PBS (250 mg / ml voorraadconcentratie) en filtersteriliseer het (0,22 μm). Doseer 50 ml aliquots in conische buizen en bewaar gedurende maximaal 6 maanden bij 4 °C.
- Bereid het muis organoïde medium (MOM): Supplement geavanceerde DMEM / F12 met 1 mM N-acetyl-L-cysteïne (NAC), 2% R-Spondin en Noggin geconditioneerd medium (RN CM), 1x N-2 supplement, 1x B-27 supplement, 10 mM HEPES, 1x antibioticum-antimycoticum, 1x GlutaMAX supplement en 100 ng / ml muis epidermale groeifactor (mEGF). Bereid de MOM 500 ml per keer, verdeel het in aliquots van 50 ml en bewaar bij 2-8 °C totdat het klaar is voor gebruik. Voeg vlak voor gebruik 0,5 μg/ml amfotericine B en 10 μM Y-27632 toe.
- Verwarm de MOM, 0,25% trypsine en soja-trypsineremmer (soa) voor gebruik voor op 37 °C in een water- of kralenbad.
- Isolatie van keratinocyten uit het ontleedde muizenweefsel (tijdsoverweging: 2 uur)
- Breng het slokdarmweefsel over in 500 μL dispase in PBS (2,5-5 eenheden totaal) en incubeer in een thermomixer gedurende 10 minuten bij 37 °C en 800 tpm.
- Breng het weefsel over in een kweekschaal en verwijder voorzichtig de spierlaag uit het epitheel met een tang (figuur 4).
OPMERKING: Deze stap kan ook worden uitgevoerd door een ervaren onderzoekervoorafgaand aan incubatie met dispase. - Breng het epitheel over in een microcentrifugebuis met 500 μL 0,25% trypsine en incubeer gedurende 10 minuten in een thermomixer bij 37 °C en 800 tpm.
OPMERKING: Als het uitgangsmateriaal tongweefsel is, gehakt het weefsel dan met een steriel scalpel in kleinere stukjes, ongeveer 1-2 mm2 groot, voordat u de trypsine toevoegt. - Centrifugeer kort gedurende 5-10 s op 2.000 x g om het weefsel te pelleteren. Bereid een conische buis van 50 ml voor met een celzeef van 100 μm. Breng de weefsel/celsuspensie met een brede boringspunt met cirkelvormige bewegingen door de zeef.
- Voeg 3 ml soa toe door de zeef, gebruik cirkelvormige bewegingen om te wassen.
- Schrob de zeef met de basis van een 1 ml tuberculinspuitzuiger om de cellen erdoorheen te duwen.
- Was de zeef 3-5 keer met 3 ml PBS en schrob de zeef met de basis van de spuit tussen de wasbeurten door.
- Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
- Verwijder het supernatant en laat 1 ml oplossing in de buis achter.
- Resuspendeer de pellet in de resterende 1 ml en breng de celsuspensie door een 70 μm celzeef over in een nieuwe conische buis van 50 ml.
- Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
- Resuspendeerde de pellet in 100 μL MOM; Pas het volume indien nodig aan. Voer een geautomatiseerd celgetal uit door trypan blue uit te sluiten.
- Zaaien van de initiële celsuspensie (tijdsoverweging: <1 uur)
- Verwarm een celkweekplaat met 24 putten in een incubator van 37 °C.
- Plaat 5.000 levensvatbare cellen in 75% (v/v) BME/MOM met 50 μL totaal volume per put. Maximaliseer het aantal putjes en bereid voldoende cellen voor in BME voor één extra put volgens de onderstaande voorbeeldberekeningen.
OPMERKING: Cryopreserveer overtollige cellen in het cryopreservatiemedium (10% DMSO in FBS) bij een maximale concentratie van 1 x 106 cellen / ml. Bewaar de cryovialen een nacht in een vriesbak bij −80 °C. Breng ze over naar vloeibare stikstof in de dampfase voor langdurige opslag. - Bereid in een microcentrifugebuis eerst een geschikte celverdunning in MOM voor en voeg vervolgens BME toe met behulp van een brede boringspunt vlak voor het plateren.
- Voeg met behulp van een 200 μL brede boringstip langzaam een druppel van 50 μL toe aan het midden van de put, waarbij contact tussen de punt en de bodem of zijkanten van de put wordt vermeden (figuur 5). Zorg ervoor dat u niet te veel kracht gebruikt om de vloeistof uit de punt te verdrijven, anders zal de koepel plat worden.
- Laat de BME 30 minuten stollen in een 37 °C, 5% CO2, 95% relatieve vochtigheid (RH) incubator.
- Voeg voorzichtig 500 μL MOM per put toe, aangevuld met 0,5 μg/ml amfotericine B en 10 μM Y-27632.
OPMERKING: Voeg amfotericine toe aan alle MOM gedurende de initiële primaire cultuur. Voeg Y-27632 alleen toe op de dag van passeren (dag 0) voor alle passages. - Verander de MOM op dag 3-4 en daarna elke 2-3 dagen totdat ze klaar zijn om over te gaan.
- Op dag 7-10, beeld de organoïden en meet de organoïde vormingssnelheid (OFR) door het aantal gevormde organoïden te delen door het aantal cellen dat aanvankelijk is gezaaid.
Voorbeeld berekeningen:
- Passaging en cryopreservatie van muriene oesofageale organoïden (MEO's) (tijdsoverweging: <1,5 uur)
- Ontdooi en houd de BME op ijs. Verwarm MOM, 0,05% trypsine en soa voor gebruik tot 37 °C in een water- of kralenbad. Verwarm een celkweekplaat met 24 putten in een incubator van 37 °C.
- Gebruik een micropipetpunt met brede boring en verzamel de organoïden in de BME-koepel samen met het supernatant. Verstoor de BME door op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Combineer de putjes met identieke monsters in een enkele microcentrifugebuis. - Centrifugeer kort gedurende 10-15 s op 2.000 x g om de organoïden te pelleteren. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Maak de pellet voorzichtig los en resuspensie van de pellet in 500 μL van 0,05% trypsine.
- Incubeer de buis(sen) in een thermomixer bij 37 °C en 800 tpm gedurende 10 min.
- Inactiveer de trypsine met 600 μL soa.
- Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
- Verwijder het supernatant en gooi het weg. Resuspendeerde de celkorrel in 100 μL MOM. Voer een geautomatiseerd celgetal uit door trypan blue uit te sluiten.
OPMERKING: Het volume kan indien nodig worden aangepast. - Plaat 2.000-5.000 levensvatbare cellen in 75% (v/v) BME/MOM met 50 μL totaal volume per put. Maximaliseer het aantal putjes dat is verguld en bereid voldoende cellen voor in BME voor één extra put volgens de eerder genoemde voorbeeldberekeningen.
OPMERKING: Cryopreserveer overtollige cellen in het cryopreservatiemedium (10% DMSO in FBS) bij een maximale concentratie van 1 x 106 cellen / ml. Bewaar de cryovialen een nacht in een vriesbak bij −80 °C. Breng ze over naar vloeibare stikstof in de dampfase voor langdurige opslag. - Bereid in een microcentrifugebuis eerst een geschikte celverdunning in MOM voor en voeg vervolgens BME toe met behulp van een brede boringspunt vlak voor het plateren.
- Voeg met behulp van een 200 μL brede boringstip langzaam een druppel van 50 μL toe aan het midden van de put, waarbij contact tussen de punt en de bodem of zijkanten van de put wordt vermeden. Zorg ervoor dat u niet te veel kracht gebruikt om de vloeistof uit de punt te verdrijven, anders zal de koepel plat worden.
- Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in een 37 °C, 5% CO 2,95% RH incubator.
- Voeg voorzichtig 500 μL MOM per put toe, aangevuld met 10 μM Y-27632.
OPMERKING: Voeg Y-27632 alleen toe op de dag van overlijden (dag 0). Het is niet nodig om het toe te voegen tijdens de mediawijzigingen. Het toevoegen van amfotericine B is niet langer nodig. - Verander de MOM op dag 3-4 en daarna elke 2-3 dagen totdat ze klaar zijn om over te gaan.
- Op dag 7-10, beeld de organoïden en meet de OFR.
- Ontdooien en herstel van de muriene oesofageale organoïden (MEO's) (tijdsoverweging: <1 uur)
- Ontdooi en houd de BME op ijs. Verwarm een celkweekplaat met 24 putten in een incubator van 37 °C.
- Bereid 10 ml koude of RT MOM of PBS in een conische buis van 15 ml.
- Ontdooi een cryoviaal in een waterbad of kralenbad van 37 °C gedurende ongeveer 30 s tot 1 minuut of totdat er een kleine ijskorrel overblijft.
- Breng met een voorbevochtigde pipetpunt de celsuspensie langzaam druppelsgewijs over naar de buis met MOM of PBS.
- Centrifugeer de buis gedurende 300 x g en 4 °C gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
- Verwijder het supernatant en gooi het weg. Resuspendeerde de celkorrel in 100 μL MOM; Pas het volume indien nodig aan. Voer een geautomatiseerd celgetal uit door trypan blue uit te sluiten.
- Plaat 5.000-10.000 levensvatbare cellen in 75% (v/v) BME/MOM met 50 μL totaal volume per put. Maximaliseer het aantal putjes en bereid voldoende cellen in BME voor op één extra put volgens eerder genoemde voorbeeldberekeningen.
- Ga verder met de resterende stappen van het protocol voor het passeren en cryopreservatie van muizenoesofageale organoïden (MEO) (zie stap 2.4.11).
3. Bereiding van organoïden voor paraffine-inbedding (tijdsoverweging: <1 uur [plus 1,5 uur voor reagensbereiding])
- Verzamel met behulp van een micropipetpunt met brede boring drie putjes per microcentrifugebuis. Verzamel de organoïden in de BME-koepel samen met het supernatant. Verstoor de BME door op en neer te pipetteren.
- Centrifugeer kort gedurende 10-15 s op 2.000 x g om de organoïden te pelleteren. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Maak de pellet voorzichtig los en resuspensie van de pellet in 300 μL 4% paraformaldehyde (PFA).
- Fixeer de organoïden een nacht op 4 °C.
- Centrifugeer kort gedurende 10-15 s op 2.000 x g om de organoïden te pelleteren. Verwijder en gooi zoveel mogelijk PFA weg.
- Maak de pellet voorzichtig los en resuspensie de pellet in 500 μL PBS.
OPMERKING: Vaste organoïden kunnen tot 2 weken bij 4 °C worden bewaard voordat u doorgaat naar de volgende stap. - Bereid een voorraad agargel van 50 ml (2% agar plus 2,5% gelatine).
OPMERKING: Bereid de agargelbouillon van tevoren voor, vanwege de incubatietijd, gevolgd door het uitvoeren van de autoclaafcyclus.- Resuspendeer 1 g Bacto-agar en 1,25 g gelatine in 50 ml water in een autoclaveerbaar glazen bekerglas van 150 ml.
- Draai de suspensie en laat hem 30-60 minuten zitten bij RT.
- Autoclaaf gedurende 20 min bij 121 °C.
- Laat iets afkoelen en doseer 5 ml aliquots in conische buisjes van 15 ml.
- Maximaal 6 maanden bewaren bij RT.
- Bereid een inbeddingsoppervlak voor door een microcentrifugebuisrek om te keren en het oppervlak te bedekken met een vel afdichtingsfolie. Etiket met de bijbehorende organoïde ID('s).
- Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten om de organoïden te pelleteren. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Maak ondertussen de agargel vloeibaar door een conische buis van 15 ml met de agargel in een glazen bekerglas van 150 ml met 100 ml water te plaatsen en gedurende 1-2 minuten op de hoogste vermogensstand te microwaving of totdat het water begint te koken en de agargel zich in een vloeibare toestand bevindt.
LET OP: Maak de dop van de conische buis met de agargel los voordat u deze in de magnetron zet. - Dompel de microcentrifugebuis met de organoïde pellet gedeeltelijk onder in het warme water zonder water in de microcentrifugebuis te brengen.
- Bedek de organoïde pellet voorzichtig door 50 μL agar aan de zijkant van de buis toe te voegen.
- Zonder de pellet te verstoren (niet resuspend, houd de pellet intact), breng de pellet in de agargeldruppel over naar de afdichtingsfilm op het inbeddingsoppervlak.
- Herhaal stap 3.12 en stap 3.13 met nog eens 50 μL vloeibare agargel om eventuele resterende organoïde pellets te verzamelen en voorzichtig toe te voegen aan dezelfde geldruppel.
- Incubeer de druppel met de organoïde pellet gedurende 45 minuten bij 4 °C.
- Breng met behulp van een tang de druppel met de organoïde pellet voorzichtig over naar een gelabelde pathologiecassette.
- Bewaar de cassette in 70% ethanol bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
- Ga verder met het inbedden van paraffine via routinematige histologische verwerking om paraffineblokken te bereiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft het proces van het genereren van murine oesofageale organoïden (MEO's) uit normaal slokdarmweefsel of ESCC-tumorweefsel van 4NQO-behandelde muizen volgens een specifiek behandelingsregime bestaande uit 16 weken 4NQO toegediend in drinkwater, gevolgd door een observatieperiode van 10 weken tot 12 weken (figuur 1). De muizen worden vervolgens geëuthanaseerd voor de dissectie van de tong of het slokdarmweefsel (figuur 2 en figuur 3). We beschrijven een methode voor de isolatie van de epitheellaag van de intacte slokdarm (figuur 4) die moet worden gebruikt voor daaropvolgende eencellige isolatie. Van slokdarm afgeleide epitheelcellen worden aanvankelijk geplateerd op 5.000 cellen per put in druppeltjes van 50 μL die cellen bevatten in een keldermembraanmatrix en een goed gekarakteriseerd serumvrij celkweekmedium (figuur 5) en mogen organoïden vormen in de loop van gemiddeld 7-10 dagen. Murine slokdarm-, tong- en voormaagorganoïden kunnen verder worden gekarakteriseerd door morfologische analyse door fasecontrast/brightfield beeldvorming en histopathologie (figuur 6). Het zelfvernieuwingsvermogen van organoïden kan worden beoordeeld door de OFR bij subcultuur te bepalen (figuur 7). De OFR wordt grotendeels beïnvloed door de inhoud van de proliferatieve basaloïde cellen, zoals blijkt uit de groeikinetische analyse in combinatie met hun morfologie (figuur 8). Ten slotte groeien deze organoïden, inclusief normale structuren van 4NQO-onbehandelde muizen, continu en kunnen ze lange tijd worden gehandhaafd (figuur 9).
Figuur 1: Het 4NQO-behandelingsregime. De muizen worden behandeld met 4NQO in drinkwater gedurende 16 weken, gevolgd door een observatieperiode van 10 weken tot 12 weken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Blootstellen van de thoracale slokdarm. De luchtpijp (blauwe lijnen) wordt afgepeld van de slokdarm (witte lijnen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Slokdarm (witte lijnen) verbonden met de maag (gele lijnen) op de plaveiselvormige kruising (blauwe lijn). Afkortingen: FS = voormaag, DS = distale maag, L = lever. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het scheiden van maag en slokdarm en het isoleren van het epitheel. Boven: De maag is gescheiden van de slokdarm. De rode lijn geeft aan waar de slokdarm moet worden losgemaakt tijdens de dissectie. Midden: Het epitheel (witte lijn) wordt afgepeld van de spierlaag. Lager: De slokdarm met tumoren volgens het behandelschema beschreven in figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Beplating van de BME-druppel met enkele cellen met behulp van een brede boringstip. De organoïden beginnen zich te vormen rond dag 4-7 en zijn klaar om gemiddeld na 7-10 dagen te worden gepasseerd. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Karakterisering van de organoïden door morfologische analyse. (A) Representatieve beelden van normale en ESCC-MEO's. Linksboven: Brightfield afbeelding van een normale MEO. Linksonder: H&E kleuring van een normale MEO. Rechtsboven: Brightfield-afbeelding van een ESCC MEO van een 4NQO-behandelde muis. Rechtsonder: H&E-kleuring van een ESCC MEO van een 4NQO-behandelde muis met nucleaire atypie en abrupte keratinisatie, waarbij de laatste doet denken aan een keratineparel, die een goed gedifferentieerd compartiment binnen een SCC-tumor vertegenwoordigt. (B) Representatieve beelden van normale muizentong en voormaagorganoïden (respectievelijk MTD en MFO). Linksboven: Brightfield-afbeelding van een normale MTO. Linksonder: H&E kleuring van een normale MTO. Rechtsboven: Brightfield afbeelding van een normale MFO. Rechtsonder: H&E kleuring van een normale MFO. Alle schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Bepalen van de vernieuwingscapaciteit van organoïden. (A) Experimenteel ontwerp om het organoïde vernieuwingsvermogen per subcultuur te bepalen. De groeiende primaire organoïden (P0) worden op verschillende tijdstippen gedissocieerd en tot eencellige suspensies gemaakt. Deze cellen worden gepasseerd om de OFR op dag 7 in de subcultuur (P1) te bepalen. (B) Representatieve OFR-gegevens van gepasseerde MEO's gegenereerd uit 4NQO-onbehandelde muizen. Merk op dat de OFR afneemt als functie van de tijd, als gevolg van verminderde proliferatieve basaloïde cellen in de gerijpte organoïden, die meer cellen bevatten die post-mitotische terminale differentiatie hebben ondergaan (zie figuur 8). p < 0,001 (n = 6) OFR op dag 7, dag 11 en dag 21 versus OFR op dag 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Groeikinetiek van organoïden zoals onthuld door hun morfologie op verschillende tijdstippen. Representatieve bright-field en H&E kleuringsbeelden van een normale MEO van 4NQO-onbehandelde muizen worden getoond. Merk op dat de keratinisatie van de binnenkern van organoïden prominent wordt op dag 10. De proliferatieve basaloïde cellen blijven in de buitenste cellaag, zelfs op de dag 14 en dag 21 tijdstippen. Voor immunohistochemie/immunofluorescentie kan geaccumuleerde keratine niet-specifieke kleuring veroorzaken, zoals het geval is voor originele plaveiselepitheelweefsels, wat een zorgvuldige optimalisatie van de kleuringsomstandigheden, controles (bijv. alleen secundair antilichaam) en gegevensinterpretatie rechtvaardigt. Alle schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Een populatieverdubbelingscurve van een representatieve normale MTD gegenereerd uit 4NQO-onbehandelde muizen. Deze organoïden werden eerder gegenereerd, gecryopreserveerd en ontdooid om hun gestage groei over meerdere passages en langdurige cultuur aan te tonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende kritieke stappen en overwegingen voor het genereren en analyseren van MEO's in de hier beschreven protocollen. Om reproduceerbaarheid en striktheid in MEO-experimenten te garanderen, zijn biologische en technische replicaties beide belangrijk. Voor biologische replicaties zijn twee tot drie onafhankelijke muizen met ESCC over het algemeen voldoende per experimentele conditie. Het juiste aantal biologische replicaties kan echter variëren, afhankelijk van de parameters die in individuele onderzoeken moeten worden getest. Het is momenteel bijvoorbeeld onbekend hoe vroeg en hoe vaak neoplastische organoïden kunnen worden gedetecteerd van 4NQO-behandelde muizen zonder macroscopisch zichtbare laesies of histologische IEN- en ESCC-laesies. Hoewel 4NQO slokdarmlaesies induceert in verschillende muizenstammen14, zijn MEO's alleen gegenereerd uit C57BL / 6-muizen. De ontwikkeling en progressie van ESCC worden versneld bij muizen met genetisch gemanipuleerde genetische laesies zoals Trp53-verlies en cycline D1-overexpressie 7,14,15. Bij dergelijke muizen kunnen neoplastische MEO's vaker en eerder opduiken dan bij wildtype C57BL/6-muizen tijdens of na 4NQO-behandeling. Indien nodig moeten pilotstudies worden uitgevoerd om de juiste steekproefgrootte van muizen in geplande experimenten te schatten. Met multi-well celkweekplaten worden technische replicaties (n = 3-6) eenvoudig gemaakt. Zorgvuldig pipetteren en oefenen zijn echter gerechtvaardigd om de variabiliteit van goed tot goed te minimaliseren, omdat de cellen worden afgegeven in een viskeus medium dat BME bevat.
Een succespercentage van bijna 100% kan worden verwacht voor de oprichting van MEO in de beschreven protocollen. Een succesvolle MEO-cultuur hangt echter af van de levensvatbaarheid van de initiële geïsoleerde slokdarmepitheelcellen, die grotendeels verband houden met de kwaliteit van het uitgangsmateriaal. Wanneer de muizen bij euthanasie niet onmiddellijk kunnen worden ontleed, mogen de karkassen 's nachts op 4 °C worden gehouden om de slokdarm de volgende dag te isoleren. De karkassen mogen echter niet worden ingevroren, omdat bevroren weefsel geen levensvatbare cellen oplevert. De gedissocieerde slokdarmepitheelcellen kunnen worden gecryopreserveerd als een eencellige suspensie in een vriesmedium (90% FBS en 10% DMSO) en opgeslagen in vloeibare stikstof om op een later tijdstip organoïden te genereren. De slokdarm (epitheelbladen) kan op een vergelijkbare manier worden gecryopreserveerd, zij het minder optimaal. Hoewel MEO's kunnen worden geïnitieerd met cellen die zijn gezuiverd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en andere methoden om unieke subsets van slokdarmepitheelcellen te zuiveren, kan de levensvatbaarheid van de cel na zuivering worden verminderd. Opgemerkt moet worden dat cel levensvatbaarheidstests zoals de trypan blauwe uitsluitingstest levende cellen kunnen onderscheiden van dode cellen, maar geen stervende cellen, waardoor de levensvatbaarheid van de cel voorafgaand aan de start van de organoïde cultuur wordt onderschat. Na oprichting kunnen MEO's van zowel 4NQO-behandelde als onbehandelde muizen voor onbepaalde tijd worden gepasseerd (>20 passages), met >80% levensvatbaarheid verwacht bij elke passage in het gespecificeerde medium. Het is opmerkelijk dat er organoïde mediumcomponenten zijn waarvan de vereisten onduidelijk blijven. Zheng et al. hebben onlangs aangetoond dat een supplement bestaande uit Wnt3A, RSpondin-1 en Noggin nodig is om murine slokdarmorganoïden te laten groeien16. We gebruiken Wnt3A echter niet in dit protocol omdat organoïden van de tong, slokdarm en voormaag groeien en meerdere keren (>10 passages) kunnen worden gepasseerd zonder dit 7,3,17. Opgemerkt moet worden dat de vereisten van deze factoren niet individueel zijn getest.
Epitheelbladen worden gebruikt om MEO's te genereren uit de normale slokdarm of het slokdarmslijmvlies zonder macroscopisch zichtbare laesies zoals tumoren. Het gebruik van epitheelbladen maakt de verrijking van epitheelcellen als uitgangsmateriaal mogelijk. De isolatie van de epitheelbladen van het tumordragende slokdarmslijmvlies is echter moeilijk vanwege ESCC-invasie in de subepitheliale compartimenten. De hele slokdarm kan worden gebruikt om MEO-cultuur te initiëren, hoewel de aanwezigheid van niet-epitheliale celpopulaties de organoïdevormingssnelheid (OFR) in de initiële cultuur kan verminderen. De OFR zal naar verwachting stijgen in de volgende passages, omdat de huidige MEO-kweekomstandigheden epitheelcellen in staat stellen om binnen de BME te groeien. Van belang is dat de hier beschreven protocollen ook kunnen worden toegepast op andere organen, met name de mondtong en de voormaag, die beide gevoelig zijn voor 4NQO-geïnduceerde plaveiselcelcarcinogenese. Van belang is dat we muizentongorganoïden (MTO's) en muisvoormaagorganoïden (MFO's) uit de hele weefsels hebben gegenereerd zonder de epitheelcellen te isoleren. Indien nodig kunnen deze organoïden worden gemaakt van een subpopulatie van epitheelcellen gezuiverd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (bijv. Kankerstamcellen gekenmerkt door hoge CD44-expressie, CD73 + vermeende slokdarmstamcellen).
Bovendien kunnen niet-epitheelcellen, met name fibroblasten, uit de BME migreren om in een monolaag op het plastic oppervlak te groeien, waardoor de gelijktijdige vestiging van muizenoesofageale fibroblasten, waaronder kankergeassocieerde fibroblasten, mogelijk wordt. De selectiviteit voor epitheelcelgroei in de 3D BME kan de co-kweek van MEO's met immuuncellen en andere celtypen beperken onder de huidige omstandigheden die hier worden beschreven. Optimalisatie voor co-cultuur experimenten is aan de gang. Bovendien kan het invasieve front van de tumor beter worden samengevat in de epitheliale-stromale interface gemodelleerd door alternatieve 3D-kweekmethoden zoals organotypische 3D-cultuur 8,18. Bovendien zijn MEO's mogelijk geen geschikt platform om de epitheliale barrièrefunctie te meten, die beter kan worden geëvalueerd door gebruik te maken van lucht-vloeistofinterfacecultuur om de transepitheliale elektrische weerstand te beoordelen 19,20,21.
Het belangrijkste voordeel van MEO's, en inderdaad MTO's en MFO's, is de snelle groei van van één cel afgeleide structuren die de oorspronkelijke epitheelstructuren recapituleren, zowel goedaardig als kwaadaardig. De verdubbelingstijd (DT) van deze organoïden wordt meestal geschat op <20 uur. De groeikinetiek van normale MTO's van 4NQO-onbehandelde muizen illustreert zowel het vermogen voor langdurige kweek van normale organoïden, als het verwachte populatieverdubbelingsniveau (PD) en DT (figuur 9). In dit voorbeeld traden ongeveer 10 populatieverdubbelingen op tijdens elke passage, met een berekende DT van gemiddeld 18,5 uur en 18,3 uur. Na de eerste primaire cultuur wordt meestal een OFR van 15% -25% verwacht, ongeacht de zaaidichtheid, en MEO's kunnen al op dag 4 verschijnen (figuur 8), hoewel ze kleiner kunnen zijn. Onder fasecontrastmicroscopie vertonen organoïden uit het normale slokdarmslijmvlies bolvormige structuren met gladde oppervlakken. Als functie van de tijd vertonen normale organoïden een concentrische structuur terwijl de binnenste celmassa post-mitotische terminale differentiatie ondergaat, waardoor een differentiatiegradiënt wordt gegenereerd die het gestratificeerde plaveiselepitheel nabootst. Neoplastische organoïden vertonen onregelmatige oppervlakken, die de hoge proliferatieve activiteit van de basaloïde cellen weerspiegelen, die zich op een uiterlijke manier kunnen uitbreiden. Het vermogen van MEO's om een proliferatie-differentiatiegradiënt weer te geven, kan worden gebruikt om te bestuderen hoe proliferatieve oesofageale basale keratinocyten zich kunnen voortplanten en post-mitotische terminale differentiatie kunnen ondergaan. Door gedissocieerde MEO-cellen te subcultureren, kan men de zelfvernieuwing van epitheelcellen evalueren (figuur 7), evenals regeneratie of transformatie onder genotoxische stress geïnduceerd door 4NQO. Soortgelijke studies kunnen ook worden uitgevoerd met behulp van het MTO-model in de context van mondkanker, waardoor de toepassing van het beschreven 4NQO-muisorganoïdemodel op hoofd-hals-SCC wordt verbreed. Hoewel epitheelvernieuwing stamcellen kan impliceren, is een mogelijke zwakte van het MEO-systeem dat het mogelijk geen rustige of zelden delende stamcellen detecteert, omdat MEO-vorming afhankelijk is van celproliferatie. Een recente eencellige analysestudie op MEO's gaf substantieel inzicht in heterogeniteit van slokdarmepitheelcellen22.
Maligne transformatie kan worden beoordeeld door de zorgvuldige morfologische beoordeling van individuele MEO-structuren en de nucleaire atypie van cellen die MEO's bevatten. De moleculaire profilering van MEO's door whole-exome sequencing en RNA-sequencing kan de verschillende aard van preneoplastische en ESCC-laesies onthullen. De ultieme test voor kwaadaardige transformatie kan echter de transplantatie van MEO's in immunodeficiënte of immunocompetente muizen vereisen om de tumorigeniciteit van de ESCC-cellen te documenteren. ESCC MEO's getransplanteerd in syngeneïne immunocompetente muizen kunnen ook een uitstekend platform bieden om de tumorimmuunmicro-omgeving te onderzoeken.
De toepassingen van MEO's zijn breed. Naast morfologie, biochemie en multi-omics-benaderingen, kan flowcytometrie niet alleen worden gebruikt om cellulaire processen zoals DNA-synthese, apoptose, autofagie en mitochondriale ademhaling te analyseren, maar ook celoppervlakmarkers die unieke subsets van cellen binnen MEO's definiëren die overeenkomen met genetische en farmacologische modificaties ex vivo 7,23 . Bovendien kunnen organoïden worden gebruikt voor co-cultuurexperimenten om de interacties tussen de epitheelcellen en het stroma, de immuuncellen of zelfs het microbioomte evalueren 24. Ten slotte kunnen MEO's worden gegenereerd uit muizen die cellijn-traceerbare genetische modificaties dragen, zoals fluorescerend reporter-eiwit dat tot expressie komt onder een celtypespecifieke genregulerende promotor (bijv. Sox2, cytokeratines Krt5 en Krt15) 3,4,7,25.
Kortom, MEO's zijn van onschatbare waarde voor de studie van ESCC. De hier beschreven protocollen zijn bedoeld om aan te tonen dat MEO's een veelzijdig model vertegenwoordigen dat relatief eenvoudig te genereren, te onderhouden en te karakteriseren is en de mogelijkheid heeft om de kenmerken van ESCC en oesofageale neoplasie samen te vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We danken de Shared Resources (Flow Cytometry, Molecular Pathology, and Confocal &Specialized Microscopy) van het Herbert Irving Comprehensive Cancer Center aan de Columbia University voor technische ondersteuning. We danken Drs. Alan Diehl, Adam J. Bass en Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) en leden van de Rustgi en Nakagawa laboratoria voor nuttige discussies. Deze studie werd ondersteund door de volgende NIH-beurzen: P01CA098101 (H.N. en A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. en H.N.), en P30CA013696 (A.K.R.). H.N. en C.L. zijn ontvangers van de Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. is een ontvanger van de Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. is de ontvanger van de Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) en een American Association for Cancer Research Award. J.G. is de ontvanger van de American Gastroenterological Association (AGA) award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B.
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
- Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
- Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
- Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
- Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
- Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
- Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
- Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
- Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
- Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
- Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
- Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
- Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).
