Summary
Este protocolo descreve os principais passos para gerar e caracterizar organoides 3D oro-esofágicos murinos que representam lesões normais, pré-neoplásicas e de carcinoma espinocelular induzidas por carcinogênese química.
Abstract
O carcinoma epidermóide de esôfago (CEC) é prevalente em todo o mundo, responsável por 90% de todos os casos de câncer de esôfago a cada ano, e é o mais mortal de todos os carcinomas de células escamosas humanos. Apesar dos recentes progressos na definição das alterações moleculares que acompanham o início e o desenvolvimento do CEC, o prognóstico dos pacientes permanece ruim. A anotação funcional dessas alterações moleculares é o próximo passo necessário e requer modelos que capturam as características moleculares do CEC e podem ser manipulados de forma rápida e barata para anotação funcional. Camundongos tratados com o 4-óxido de nitroquinolina 1-óxido mimético da fumaça do tabaco (4NQO) previsivelmente formam CEC e pré-neoplasia esofágica. Vale ressaltar que as lesões de 4NQO também surgem na cavidade oral, mais comumente na língua, bem como no pré-estômago, que compartilham o epitélio escamoso estratificado. No entanto, esses camundongos não podem ser simplesmente manipulados para testes de hipóteses funcionais, já que a geração de modelos isogênicos em camundongos consome muito tempo e recursos. Neste estudo, superamos essa limitação gerando organoides tridimensionais (3D) derivados de células únicas a partir de camundongos tratados com 4NQO para caracterizar células murinas ESCC ou células pré-neoplásicas ex vivo. Esses organoides capturam as características salientes do CEC e da pré-neoplasia esofágica, podem ser aproveitados de forma barata e rápida para formar modelos isogênicos e podem ser utilizados para experimentos de transplante singênico. Demonstramos como gerar organoides 3D a partir de tecido esofágico murino normal, pré-neoplásico e CEC e manter e criopreservar esses organoides. As aplicações desses organoides versáteis são amplas e incluem o uso de camundongos geneticamente modificados e posterior caracterização por citometria de fluxo ou imunohistoquímica, a geração de linhagens organoides isogênicas usando tecnologias CRISPR e triagem de drogas ou transplante singênico. Acreditamos que a adoção generalizada das técnicas demonstradas neste protocolo acelerará o progresso neste campo para combater a grave carga de CEC.
Introduction
O carcinoma epidermóide de esôfago (CEC) é o mais letal dos carcinomas epidermóides humanos, devido ao seu diagnóstico tardio, resistência à terapia e metástase1,2. O CEC origina-se do epitélio escamoso estratificado, que reveste a superfície luminal do esôfago. O epitélio escamoso é composto por células basais proliferativas e células diferenciadas dentro da camada celular suprabasal. Em condições fisiológicas, as células basais expressam marcadores como p63, Sox2 e citoqueratinas K5 e K14, enquanto as células diferenciadas expressam K4, K13 e IVL. As próprias células basais são heterogêneas e incluem células-tronco putativas definidas por marcadores como K153 e CD734. Na homeostase, as células basais sofrem diferenciação terminal pós-mitótica dentro da camada celular suprabasal, enquanto as células diferenciadas migram e descamam para o lúmen para completa renovação epitelial. Lembrando suas células de origem, o CEC exibe diferenciação celular escamosa em graus variados. O CEC é frequentemente acompanhado por lesões precursoras histológicas multifocais, conhecidas como neoplasia intraepitelial (IEE) ou displasia, compreendendo células basaloides atípicas. Além das alterações epiteliais, o CEC exibe remodelação tecidual dentro do compartimento subepitelial, onde ocorre a ativação de fibroblastos associados ao câncer (CAFs) e o recrutamento de células imunes/inflamatórias para promover o microambiente promotor do tumor.
A patogênese do CEC envolve alterações genéticas e exposição a fatores de risco ambientais. As principais lesões genéticas incluem a inativação dos genes supressores tumorais TP53 e CDKN2A (p16INK4A) e a ativação dos oncogenes CCND1 (ciclina D1) e EGFR, que culminam em comprometimento da função do ponto de verificação do ciclo celular, proliferação aberrante e sobrevivência sob estresse genotóxico relacionado à exposição a carcinógenos ambientais. De fato, as alterações genéticas interagem estreitamente com fatores de risco comportamentais e ambientais, mais comumente o uso de tabaco e álcool. A fumaça do tabaco contém carcinógenos humanos, como o acetaldeído, que também é o principal metabólito do álcool. O acetaldeído induz adutos de DNA e ligações cruzadas de DNA interstrand, levando a danos no DNA e ao acúmulo de mutações no DNA e instabilidade cromossômica. Diante do excesso de estímulos mitogênicos e da proliferação aberrante da ativação de oncogenes, a transformação maligna das células epiteliais esofágicas é facilitada por mecanismos de enfrentamento do estresse genotóxico, incluindo a ativação de antioxidantes, autofagia e transição epitélio-mesenquimal (EMT). Curiosamente, essas funções citoprotetoras são frequentemente ativadas em células-tronco de câncer (CSCs) ESCC, que se caracterizam por alta expressão de CD44 (CD44H) e têm a capacidade de iniciar tumores, invasão, metástase e resistência àterapia5,6,7.
O CEC foi modelado em cultura celular e em modelos deroedores8,9. Nas últimas três décadas, modelos robustos de camundongos geneticamente modificados de CEC foram desenvolvidos. Estes incluem camundongos transgênicos CCND1 e EGFR 10,11 e p53 e camundongos knockout p120Ctn 12,13. No entanto, alterações genéticas isoladas normalmente não resultam em CEC de início rápido. Esse desafio tem sido superado com o uso de carcinógenos esofágicos que recapitulam bem as lesões genéticas humanas noCEC14. Por exemplo, o óxido de 4-nitroquinolina-1 (4NQO) acelera o desenvolvimento de CEC em camundongos transgênicos CCND1 15. Nos últimos anos, células-tronco epiteliais esofágicas putativas, células progenitoras e seus respectivos destinos têm sido investigados em modelos de linhagem celular rastreávelem camundongos3,4. Além disso, esses camundongos rastreáveis por linhagem celular têm sido utilizados para explorar as células de origem do CEC e como tais células dão origem às CSCs CD44H via histologia convencional e caracterização molecular baseada em ômica7.
Uma área emergente relacionada a esses modelos murinos é a nova aplicação de técnicas de cultura celular para analisar CEC vivos e células precursoras em um sistema organoide tridimensional (3D) no qual a arquitetura dos tecidos originais é recapitulada exvivo7,8,9. Esses organoides 3D são rapidamente cultivados a partir de uma suspensão unicelular isolada de tecidos murinos, incluindo tumores primários e metastáticos (por exemplo, lesões linfonodais, pulmonares e hepáticas). As células são incluídas em extrato da membrana basal (BME) e alimentadas com um meio de cultura celular livre de soro bem definido. Os organoides 3D crescem dentro de 7-10 dias, e as estruturas esféricas resultantes são passíveis de subcultura, criopreserva e ensaios para analisar uma variedade de propriedades e funções celulares, incluindo marcadores CSC, EMT, autofagia, proliferação, diferenciação e morte celular apoptótica.
Esses métodos podem ser amplamente aplicados a culturas organoides 3D estabelecidas a partir de qualquer tecido epitelial escamoso estratificado, como a mucosa da cabeça e pescoço (cavidade oral, língua, faringe e laringe) e até mesmo o pré-estômago. A mucosa da cabeça e pescoço é contígua ao esôfago, e os dois tecidos compartilham organização, função e suscetibilidade tecidual semelhantes à doença. Tanto o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP) quanto o CEC compartilham lesões genéticas e fatores de risco ambientais relacionados ao estilo de vida, como exposição ao tabaco e ao álcool. Ressaltando essa semelhança, camundongos tratados com o mimético de fumaça de tabaco 4NQO prontamente desenvolvem CEC de cabeça e pescoço. Dada a facilidade com que os protocolos descritos a seguir podem ser aplicados na modelagem do CEC de cabeça e pescoço, incluímos instruções específicas para o estabelecimento de culturas organoides 3D a partir dessas lesões.
Neste artigo, fornecemos protocolos detalhados para a geração de organoides 3D esofágicos murinos (MEOs) representando lesões normais, pré-neoplásicas e CEC que se desenvolvem em camundongos tratados com 4NQO. Várias cepas de camundongos podem ser utilizadas, incluindo cepas comuns de laboratório como C57BL/6 e linhagens celulares rastreáveis e outros derivados geneticamente modificados. Enfatizamos as principais etapas, incluindo o isolamento do epitélio esofágico murino normal ou doente, a preparação de suspensões unicelulares, o cultivo e monitoramento dos organoides 3D em crescimento, a subcultura, a criopreserva e o processamento para análises subsequentes, incluindo morfologia e outras aplicações.
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Protocol
Os experimentos murinos foram planejados e realizados de acordo com os regulamentos e sob protocolo animal #AABB1502, revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Columbia. Os camundongos foram alojados em uma instalação de cuidados com animais adequada que garante o tratamento humano dos camundongos e fornece cuidados veterinários apropriados para os camundongos e treinamento de segurança de laboratório para o pessoal do laboratório.
1. Tratamento de camundongos com 4NQO para induzir lesões de IEN esofágico e CEC (consideração de tempo: até 28 semanas)
NOTA: Para gerar MEOs representando lesões neoplásicas do esôfago, os camundongos são submetidos à carcinogênese química mediada pela 4NQO, conforme descrito anteriormente por Tang et al.14. MEOs normais/não neoplásicas são gerados a partir de camundongos não tratados.
- Mouses
- Acomode de quatro a cinco camundongos por gaiola e aclimate-os ao biotério por pelo menos 1 semana antes de iniciar um experimento. Para reduzir a possibilidade de que distúrbios relacionados à idade resultem no término prematuro do experimento completo de 28 semanas, comece com camundongos de 8 semanas a 16 semanas.
NOTA: Camundongos C57BL/6 pesando aproximadamente 20-30 g foram utilizados neste protocolo. Para experimentos mais curtos, camundongos mais velhos podem ser usados. Camundongos machos ou fêmeas são aceitáveis. Os ratinhos de controlo (sem tratamento, ver secção 1.3.1) devem ser combinados em idade e sexo.
- Acomode de quatro a cinco camundongos por gaiola e aclimate-os ao biotério por pelo menos 1 semana antes de iniciar um experimento. Para reduzir a possibilidade de que distúrbios relacionados à idade resultem no término prematuro do experimento completo de 28 semanas, comece com camundongos de 8 semanas a 16 semanas.
- Preparação de água potável contendo 4NQO
- Preparar 1 mg/mL de solução-mãe de 4NQO em etilenopropilenoglicol (Tabela de Materiais). Dissolver 100 mg de 4NQO em 100 mL de etilenopropilenoglicol a 99,9% em um copo de vidro de 500 mL coberto com filme selante. Misturar cuidadosamente à temperatura ambiente (RT) utilizando um agitador magnético a 800 rpm durante 30 minutos. Conservar a 4 °C.
- Adicionar 900 mL de água deionizada autoclavada a 100 mL de solução-estoque 4NQO 1 mg/mL e misturar por inversão em um cilindro graduado de plástico de 2 L coberto com filme de vedação. Um volume de 1 L de 100 μg/mL de 4NQO em etilenopropilenoglicol a 10% servirá duas gaiolas de camundongos equipadas com um frasco de 500 mL.
CUIDADO: Vale ressaltar que o 4NQO é um carcinógeno químico sintético que pode causar câncer. Manuseie com luvas de nitrilo e jaleco de manga comprida e use sapatos fechados. Considere a proteção adequada dos olhos, proteção facial e cobertura da cabeça. Para o descarte de resíduos, o 4NQO deve ser colocado em um recipiente rotulado de acordo com as diretrizes institucionais para a gestão de resíduos perigosos por meio da saúde e segurança ambiental.
- Tratamento com 4NQO e monitoramento
- Anexe a garrafa de beber e administre 4NQO através da água potável ad libitum aos ratos durante 16 semanas. Use 10% (p/v) de propilenoglicol como veículo (sem tratamento) de controle.
NOTA: Durações mais curtas do tratamento com 4NQO podem ser usadas para induzir o IEN. - Reabasteça a água uma vez por semana.
- Pese cada rato semanalmente, colocando-o num recipiente de plástico numa balança de laboratório.
- No final do período de tratamento de 16 semanas com 4NQO, comece a administrar água potável regular aos camundongos durante o período de observação pós-4NQO por até 12 semanas (Figura 1).
- Monitore os camundongos diariamente em busca de sinais de sofrimento (por exemplo, mobilidade prejudicada, habitus curvado e comportamento retraído), disfagia e desidratação. Além disso, avalie os camundongos semanalmente quanto a mudanças no peso corporal ou na ingestão de alimentos e líquidos. Se o peso corporal cair mais de 10% do peso corporal inicial, alimente os ratos com um suplemento dietético líquido.
NOTA: Uma perda de peso corporal refratária a suplementos dietéticos líquidos pode ser indicativa de CEC, e ratos que perdem mais de 20% de seu peso corporal devem ser eutanasiados. É importante ressaltar que os MEOs podem ser gerados a partir de camundongos eutanasiados prematuramente. Observe que camundongos C57BL/6 sem modificações genéticas normalmente não apresentam sinais de morbidade ou apresentam lesões visíveis de CEC até o final do período de observação pós-4NQO.
- Anexe a garrafa de beber e administre 4NQO através da água potável ad libitum aos ratos durante 16 semanas. Use 10% (p/v) de propilenoglicol como veículo (sem tratamento) de controle.
- Preparo animal
- Eutanasiar os camundongos em uma câmara de CO 2 preenchida com CO2 a uma taxa de fluxo que desloca 30%-70% do volume da câmara por minuto. Confirmar óbito por luxação cervical.
- Fixar os membros e o nariz do camundongo na posição supina à plataforma de dissecção com agulhas 21G.
- Desinfetar a superfície ventral do rato com etanol a 70%.
- Dissecção (consideração de tempo: 0,5 h)
- Abra a pele beliscando o pelo e a pele do abdômen médio para garantir que ela seja liberada das vísceras abaixo. Use a tesoura cirúrgica para fazer uma incisão craniocaudal, ventral da linha média do abdome inferior até o queixo.
- A partir da incisão mediana, use uma tesoura cirúrgica para fazer cortes radiais que se estendem até os membros de ambos os lados do rato. Abrir os retalhos cutâneos.
- Para expor a traqueia cervical, use a tesoura dissecante para dividir as glândulas salivares na linha média. A traqueia fica profundamente nas glândulas.
- Para expor a traqueia torácica, remova o esterno.
- Aperte e levante suavemente o peritônio com pinça e use tesoura para dividir o peritônio craniocaudal e lateralmente ao longo da caixa torácica.
- Retrair suavemente o fígado da superfície caudal do diafragma e usar tesoura para fazer uma pequena incisão no diafragma na fúrcula esternal, especificamente na superfície dorsal do processo xifoide. Isso libera o pulmão e o coração da pleura visceral.
- Separe a caixa torácica do conteúdo torácico. Inserir tesoura na incisão no diafragma e dissecar cranialmente a cintura cervical. Durante esta dissecção, aderir firmemente à superfície dorsal do esterno para evitar danos aos órgãos abaixo. Certifique-se de que o plano de dissecção é anterior à traqueia.
- Corte as costelas de cada lado do esterno usando uma tesoura e retire o esterno. Certifique-se de que o conteúdo torácico esteja exposto.
- Expor o esôfago abdominal. Levante suavemente o estômago anteriormente segurando o antro com pinças. Disseque o baço, pâncreas e mesentério do estômago e esôfago com tesoura.
- Expor o esôfago torácico (Figura 2).
- Levante suavemente a traqueia imediatamente caudal à cartilagem tireóidea e disseque o esôfago do lado dorsal da traqueia usando tesoura de íris.
- Divida a traqueia na cartilagem tireoide com uma tesoura de íris.
- Descascar a traqueia do restante do esôfago através de dissecção cuidadosa no sentido caudal.
- Remova o pulmão, o coração e o timo em massa com a traqueia. Tome cuidado para evitar danos ao esôfago ao dissecar e dividir a aorta e a veia cava.
- Divida o estômago no piloro com uma tesoura.
- Separe o esôfago da vértebra segurando o antro com pinça e dissecando cranialmente.
- Divida o esôfago ao nível da cartilagem tireoide e retire o esôfago e o estômago em massa (Figura 3).
- Separe o estômago e o esôfago dividindo o esôfago na cárdia (Figura 4, painel superior, linha vermelha).
- Disseque qualquer fáscia na superfície externa do esôfago. Para reservar uma amostra para histologia (opcional), remova metade do esôfago e divida longitudinalmente com tesoura. Coloque o esôfago intacto restante em PBS frio sobre gelo.
- Abra o estômago ao longo da curvatura maior e lave com PBS suficientemente. Separe o pré-estômago e lave com PBS frio. Coloque o estômago anterior em PBS frio sobre gelo.
- Para colher a língua, retire a agulha 21 G no nariz e puxe a língua com uma pinça. Corte a língua o maior tempo possível. Coloque a língua em PBS fria sobre gelo.
2. Estabelecimento da cultura organoide esofágica murina (MEO)
NOTA: Este protocolo também pode ser usado para estabelecer uma cultura organoide de língua murina com a adição de uma etapa na qual o tecido da língua é picado antes da tripsinização. Veja a nota na etapa 2.2.3.
- Preparação de reagentes
NOTA: Uma lista de reagentes pode ser encontrada na Tabela de materiais. Preparar e armazenar as soluções-mãe de acordo com as instruções do fabricante, salvo indicação em contrário.- Certifique-se de que as alíquotas de uso único da matriz de membrana basal (EMB) utilizadas neste protocolo sejam armazenadas a -20 °C até o dia do uso, sejam posteriormente descongeladas no gelo ou a 2-8 °C e mantidas no gelo o tempo todo quando não estiverem em uso.
- Dissolver 250 mg de inibidor de tripsina (IST) de soja em 1.000 mL de PBS (concentração estoque de 250 mg/mL) e filtrar-esterilizar (0,22 μm). Dispensar alíquotas de 50 mL em tubos cônicos e armazenar por até 6 meses a 4 °C.
- Prepare o meio organoide de camundongo (MOM): Suplemento avançado DMEM/F12 com 1 mM N-acetil-L-cisteína (NAC), 2% R-Spondin e meio condicionado Noggin (RN CM), 1x suplemento N-2, 1x suplemento B-27, 10 mM HEPES, 1x antibiótico-antimicótico, 1x suplemento GlutaMAX e 100 ng/mL de fator de crescimento epidérmico de camundongo (mEGF). Prepare o MOM 500 mL de cada vez, divida em alíquotas de 50 mL e armazene a 2-8 °C até ficar pronto para uso. Adicionar 0,5 μg/mL de anfotericina B e 10 μM Y-27632 imediatamente antes do uso.
- Pré-aquecer o MOM, tripsina a 0,25% e inibidor de tripsina de soja (IST) a 37 °C em água ou banho de contas antes do uso.
- Isolamento de queratinócitos do tecido dissecado de camundongos (consideração de tempo: 2 h)
- Transferir o tecido esofágico para 500 μL de dispase em PBS (2,5-5 unidades no total) e incubar em um termomisturador por 10 min a 37 °C e 800 rpm.
- Transfira o tecido para uma placa de cultura e remova cuidadosamente a camada muscular do epitélio com pinça (Figura 4).
NOTA: Esta etapa também pode ser realizada por um pesquisador experiente antes da incubação com dispase. - Transferir o epitélio para um tubo de microcentrífuga contendo 500 μL de tripsina a 0,25% e incubar em um termomisturador por 10 min a 37 °C e 800 rpm.
NOTA: Se o material de partida for tecido lingual, pice o tecido com um bisturi estéril em pedaços menores, aproximadamente 1-2 mm2 de tamanho, antes de adicionar a tripsina. - Centrifugar brevemente por 5-10 s a 2.000 x g para pellet o tecido. Preparar um tubo cônico de 50 mL com um filtro de células de 100 μm. Transfira a suspensão tecido/célula através do filtro com uma ponta de furo larga usando movimentos circulares.
- Adicionar 3 mL de IST através do filtro, usando movimentos circulares para lavar.
- Esfregue o filtro com a base de um êmbolo de seringa tuberculínica de 1 mL para empurrar as células.
- Lave o filtro com 3 mL de PBS 3-5 vezes, esfregando o filtro com a base da seringa entre as lavagens.
- Centrifugar o tubo a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C para pellet das células.
- Retire o sobrenadante, deixando 1 mL de solução no tubo.
- Ressuspender o pellet no 1 mL restante e transferir a suspensão celular através de um filtro celular de 70 μm para um novo tubo cônico de 50 mL.
- Centrifugar o tubo a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C para pellet das células.
- Ressuspender o pellet em 100 μL de MOM; Ajuste o volume conforme necessário. Execute uma contagem de células automatizada por exclusão azul de tripano.
- Semeadura da suspensão celular inicial (consideração de tempo: <1 h)
- Pré-aquecer uma placa de cultura celular de 24 poços em uma incubadora de 37 °C.
- Placa de 5.000 células viáveis em 75% (v/v) de BME/MOM com 50 μL de volume total por poço. Maximize o número de poços banhados e prepare células suficientes no BME para um poço extra de acordo com os cálculos de exemplo abaixo.
NOTA: Criopreservar qualquer excesso de células no meio de criopreservação (10% DMSO em FBS) a uma concentração máxima de 1 x 106 células/mL. Conservar os crióscimos num recipiente de congelação durante a noite a -80 °C. Transfira-os para nitrogênio líquido em fase vapor para armazenamento a longo prazo. - Em um tubo de microcentrífuga, prepare uma diluição celular apropriada em MOM primeiro e, em seguida, adicione BME usando uma ponta de furo largo imediatamente antes de revestir.
- Com uma ponta de 200 μL de largura, adicione lentamente uma gota de 50 μL ao centro do poço, evitando o contato entre a ponta e o fundo ou as laterais do poço (Figura 5). Tenha cuidado para não usar muita força para expelir o líquido da ponta, ou a cúpula vai achatar.
- Permitir que o BME se solidifique por 30 min em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2, 95% de umidade relativa (UR).
- Adicionar cuidadosamente 500 μL de MOM por poço suplementado com 0,5 μg/mL de anfotericina B e 10 μM Y-27632.
NOTA: Adicione anfotericina a todo o MOM durante toda a cultura primária inicial. Adicione Y-27632 apenas no dia da passagem (dia 0) para todas as passagens. - Mude a MOM nos dias 3-4 e, em seguida, a cada 2-3 dias depois disso até estar pronto para a passagem.
- Nos dias 7-10, faça imagens dos organoides e meça a taxa de formação de organoides (RLO) dividindo o número de organoides formados pelo número de células inicialmente semeadas.
Exemplos de cálculos:
- Passaging e criopreservação de organoides esofágicos murinos (MEOs) (consideração de tempo: <1,5 h)
- Descongele e mantenha o BME no gelo. Pré-aquecer MOM, tripsina a 0,05% e IST a 37 °C em banho de água ou miçanga antes do uso. Pré-aquecer uma placa de cultura celular de 24 poços em uma incubadora de 37 °C.
- Usando uma ponta de micropipeta de furo largo, colete os organoides na cúpula da BME junto com o sobrenadante. Interrompa o BME pipetando para cima e para baixo.
NOTA: Combinar os poços contendo amostras idênticas em um único tubo de microcentrífuga. - Centrifugar brevemente por 10-15 s a 2.000 x g para pellet os organoides. Retire e descarte o sobrenadante.
- Deslocar suavemente o pellet e ressuspendê-lo em 500 μL de tripsina a 0,05%.
- Incubar o(s) tubo(s) num termomisturador a 37 °C e 800 rpm durante 10 min.
- Inativar a tripsina com 600 μL de IST.
- Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C para pellet das células.
- Retire e descarte o sobrenadante. Ressuspender a pastilha celular em 100 μL de MOM. Execute uma contagem de células automatizada por exclusão azul de tripano.
NOTA: O volume pode ser ajustado conforme necessário. - Placa 2.000-5.000 células viáveis em 75% (v/v) de BME/MOM com 50 μL de volume total por poço. Maximize o número de poços banhados e prepare células suficientes no BME para um poço extra de acordo com os cálculos de exemplo mencionados anteriormente.
NOTA: Criopreservar qualquer excesso de células no meio de criopreservação (10% DMSO em FBS) a uma concentração máxima de 1 x 106 células/mL. Conservar os crióscimos num recipiente de congelação durante a noite a -80 °C. Transfira-os para nitrogênio líquido em fase vapor para armazenamento a longo prazo. - Em um tubo de microcentrífuga, prepare uma diluição celular apropriada em MOM primeiro e, em seguida, adicione BME usando uma ponta de furo largo imediatamente antes de revestir.
- Usando uma ponta de furo de 200 μL de largura, adicione lentamente uma gota de 50 μL ao centro do poço, evitando o contato entre a ponta e o fundo ou as laterais do poço. Tenha cuidado para não usar muita força para expelir o líquido da ponta, ou a cúpula vai achatar.
- Incubar a placa por 30 min em uma incubadora a 37 °C, 5% CO 2,95% RH.
- Adicione cuidadosamente 500 μL de MOM por poço suplementado com 10 μM Y-27632.
NOTA: Adicione Y-27632 somente no dia da passagem (dia 0). É desnecessário adicioná-lo durante as alterações de mídia. A adição de anfotericina B não é mais necessária. - Mude a MOM nos dias 3-4 e, em seguida, a cada 2-3 dias depois disso até estar pronto para a passagem.
- Nos dias 7-10, faça a imagem dos organoides e meça o RLO.
- Descongelamento e recuperação dos organoides murinos do esôfago (MEOs) (consideração de tempo: <1 h)
- Descongele e mantenha o BME no gelo. Pré-aquecer uma placa de cultura celular de 24 poços em uma incubadora de 37 °C.
- Preparar 10 mL de frio ou RT MOM ou PBS em um tubo cônico de 15 mL.
- Descongelar um criovial em banho-maria ou banho de contas a 37 °C por aproximadamente 30 s a 1 min ou até que reste uma pequena pelota de gelo.
- Com uma ponta de pipeta pré-molhada, transfira lentamente a suspensão da célula para o tubo contendo MOM ou PBS de forma gota a gota.
- Centrifugar o tubo para 300 x g e 4 °C por 5 min para pellet as células.
- Retire e descarte o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em 100 μL de MOM; Ajuste o volume conforme necessário. Execute uma contagem de células automatizada por exclusão azul de tripano.
- Placa 5.000-10.000 células viáveis em 75% (v/v) BME/MOM com 50 μL de volume total por poço. Maximize o número de poços banhados e prepare células suficientes na BME para um poço extra de acordo com cálculos de exemplo mencionados anteriormente.
- Continuar com as restantes etapas do protocolo de passagem e criopreservação de organoides esofágicos murinos (MEO) (ver passo 2.4.11).
3. Preparação de organoides para inclusão em parafina (consideração de tempo: <1 h [mais 1,5 h para preparação de reagentes])
- Usando uma ponta de micropipeta de furo largo, colete três poços por tubo de microcentrífuga. Coletar os organoides na cúpula BME juntamente com o sobrenadante. Interrompa o BME pipetando para cima e para baixo.
- Centrifugar brevemente por 10-15 s a 2.000 x g para pellet os organoides. Retire e descarte o sobrenadante.
- Deslocar suavemente o pellet e ressuspendê-lo em 300 μL de paraformaldeído (PFA) a 4%.
- Fixar os organoides durante a noite a 4 °C.
- Centrifugar brevemente por 10-15 s a 2.000 x g para pellet os organoides. Remova e descarte o máximo de PFA possível.
- Deslocar suavemente o pellet e ressuspendê-lo em 500 μL de PBS.
NOTA: Os organoides fixos podem ser armazenados a 4 °C por até 2 semanas antes de prosseguir para a próxima etapa. - Preparar um caldo de 50 mL de gel de ágar (2% de ágar mais 2,5% de gelatina).
OBS: Preparar o estoque de gel de ágar com antecedência, devido ao tempo de incubação, seguido da realização do ciclo de autoclave.- Ressuspender 1 g de Bacto-ágar e 1,25 g de gelatina em 50 mL de água em copo de vidro autoclavável de 150 mL.
- Gire a suspensão e deixe-a descansar por 30-60 min no RT.
- Autoclave por 20 min a 121 °C.
- Arrefecer ligeiramente e distribuir alíquotas de 5 ml em tubos cónicos de 15 ml.
- Armazene por até 6 meses na RT.
- Prepare uma superfície de incorporação invertendo um rack de tubo de microcentrífuga e cobrindo a superfície com uma folha de filme de vedação. Etiqueta com o(s) ID(s) organoide(s) correspondente(s).
- Centrifugar o tubo a 300 x g por 5 min para pellet os organoides. Retire e descarte o sobrenadante.
- Enquanto isso, liquefaça o gel de ágar colocando um tubo cônico de 15 mL contendo o gel de ágar em um copo de vidro de 150 mL contendo 100 mL de água e microondulando na configuração de maior potência por 1-2 min ou até que a água comece a ferver e o gel de ágar esteja em estado líquido.
CUIDADO: Solte a tampa do tubo cônico contendo o gel de ágar antes de fazer micro-ondas. - Submergir parcialmente o tubo de microcentrífuga contendo o pellet organoide na água morna sem introduzir água no tubo de microcentrífuga.
- Sobreponha cuidadosamente o pellet organoide adicionando 50 μL de ágar na lateral do tubo.
- Sem perturbar o pellet (não ressuspenda, mantenha o pellet intacto), transfira o pellet na gota de gel de ágar para a película de vedação na superfície de incorporação.
- Repetir os passos 3.12 e 3.13 com mais 50 μL de gel de ágar líquido para recolher qualquer pastilha organoide restante e adicionar cuidadosamente à mesma gota de gel.
- Incubar a gota contendo o pellet organoide durante 45 min a 4 °C.
- Usando pinças, transfira cuidadosamente a gota que contém a pastilha organoide para um de patologia marcado.
- Conservar a em etanol a 70% a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.
- Proceder à incorporação de parafina através de processamento histológico de rotina para preparar blocos de parafina.
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Representative Results
Este protocolo descreve o processo de geração de organoides esofágicos murinos (MEOs) a partir de tecido esofágico normal ou tecido tumoral ESCC de camundongos tratados com 4NQO de acordo com um regime de tratamento específico que consiste em 16 semanas de 4NQO administradas em água potável, seguidas por um período de observação de 10 semanas a 12 semanas (Figura 1). Os camundongos são então eutanasiados para a dissecção da língua ou tecido esofágico (Figura 2 e Figura 3). Descrevemos um método de isolamento da camada epitelial do esôfago íntegro (Figura 4) a ser utilizado para posterior isolamento unicelular. As células epiteliais derivadas do esôfago são inicialmente plaqueadas a 5.000 células por poço em gotículas de 50 μL contendo células em uma matriz de membrana basal e meio de cultura celular livre de soro bem caracterizado (Figura 5) e permitem formar organoides ao longo de 7-10 dias, em média. Os organoides murinos do esôfago, língua e anteestômago podem ser caracterizados pela análise morfológica por contraste de fase/campo claro e histopatologia (Figura 6). A capacidade de auto-renovação dos organoides pode ser avaliada pela determinação do RLO no subcultivo (Figura 7). O RLO é amplamente influenciado pelo conteúdo das células basaloides proliferativas, como revelado pela análise da cinética de crescimento aliada à sua morfologia (Figura 8). Finalmente, esses organoides, incluindo estruturas normais de camundongos 4NQO não tratados, crescem continuamente e podem ser mantidos por um longo tempo (Figura 9).
Figura 1: Esquema de tratamento da 4NQO. Os camundongos são tratados com 4NQO em água potável por 16 semanas, seguidas por um período de observação de 10 semanas a 12 semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exposição do esôfago torácico. A traqueia (linhas azuis) é descascada para longe do esôfago (linhas brancas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esôfago (linhas brancas) conectado ao estômago (linhas amarelas) na junção escamosa colunar (linha azul). Abreviações: FS = pré-estômago, DS = estômago distal, L = fígado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Separar o estômago e o esôfago e isolar o epitélio. Superior: O estômago é separado do esôfago. A linha vermelha indica onde o esôfago deve ser destacado durante a dissecção. Meio: O epitélio (linha branca) é descascado para longe da camada muscular. Inferior: Esôfago com tumores seguindo o esquema de tratamento descrito na Figura 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Plaqueamento da gota de EMB contendo células únicas com ponta larga. Os organoides começam a se formar em torno dos dias 4-7 e estão prontos para serem passados após 7-10 dias, em média. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Caracterização dos organoides por análise morfológica. (A) Imagens representativas de MEOs normais e ESCC. Canto superior esquerdo: Imagem de campo brilhante de um MEO normal. Canto inferior esquerdo: coloração H&E de um MEO normal. Canto superior direito: Imagem de campo brilhante de um ESCC MEO de um rato tratado com 4NQO. Canto inferior direito: coloração H&E de um CEC MEO de um camundongo tratado com 4NQO exibindo atipia nuclear e queratinização abrupta, sendo esta última reminiscente de uma pérola de queratina, representando um compartimento bem diferenciado dentro de um tumor de CEC. (B) Imagens representativas de organoides normais da língua e do pré-estômago de camundongos (MTO e MFO, respectivamente). Canto superior esquerdo: imagem de campo brilhante de um MTO normal. Canto inferior esquerdo: coloração H&E de um MTO normal. Canto superior direito: imagem de campo brilhante de uma MFO normal. Canto inferior direito: coloração H&E de uma MFO normal. Todas as barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Determinação da capacidade de renovação organoide. (A) Planejamento experimental para determinação da capacidade de renovação organoide por subcultivo. Os organoides primários em crescimento (P0) são dissociados em vários momentos e transformados em suspensões unicelulares. Essas células são passadas para determinar o RLO no dia 7 na subcultura (P1). (B) Dados representativos de OFR de MEOs passados gerados a partir de camundongos não tratados com 4NQO. Note-se que o RLO diminui em função do tempo, refletindo a diminuição das células basaloides proliferativas nos organoides maturados, que contêm mais células que sofreram diferenciação terminal pós-mitótica (ver Figura 8). p < 0,001 (n = 6) RLO no dia 7, dia 11 e dia 21 versus RLO no dia 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Cinética de crescimento dos organoides revelada por sua morfologia em vários momentos. São mostradas imagens representativas de campo claro e coloração de H&E de um MEO normal de camundongos não tratados com 4NQO. Note que a queratinização do núcleo interno dos organoides torna-se proeminente no dia 10. As células basaloides proliferativas permanecem na camada celular mais externa mesmo nos momentos do dia 14 e do dia 21. Para imunohistoquímica/imunofluorescência, a queratina acumulada pode causar coloração inespecífica, como é o caso dos tecidos epiteliais escamosos originais, garantindo uma otimização cuidadosa das condições de coloração, controles (por exemplo, apenas anticorpos secundários) e interpretação dos dados. Todas as barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Curva de duplicação populacional de uma MTO normal representativa gerada a partir de camundongos não tratados com 4NQO. Esses organoides foram previamente gerados, criopreservados e descongelados para demonstrar seu crescimento constante ao longo de múltiplas passagens e cultura de longo prazo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem várias etapas e considerações críticas para a geração e análise de MEOs nos protocolos aqui descritos. Para garantir a reprodutibilidade e o rigor nas experiências MEO, as réplicas biológicas e técnicas são importantes. Para réplicas biológicas, dois a três camundongos independentes portadores de CEC são geralmente suficientes por condição experimental. No entanto, o número adequado de réplicas biológicas pode variar dependendo dos parâmetros a serem testados em estudos individuais. Por exemplo, atualmente não se sabe quão precocemente e com que frequência organoides neoplásicos podem ser detectados em camundongos tratados com 4NQO sem lesões macroscopicamente visíveis ou lesões histológicas de IEN e CEC. Embora o 4NQO induza lesões esofágicas em várias linhagens de camundongos14, MEOs foram gerados apenas a partir de camundongos C57BL/6. O desenvolvimento e a progressão do CEC são acelerados em camundongos com lesões genéticas geneticamente modificadas, como a perda de Trp53 e a superexpressão da ciclina D17,14,15. Em tais camundongos, MEOs neoplásicas podem surgir mais frequentemente e mais cedo do que em camundongos selvagens C57BL/6 durante ou após o tratamento com 4NQO. Se necessário, devem ser realizados estudos-piloto para estimar o tamanho adequado da amostra de ratinhos nas experiências planeadas. Com placas de cultura celular de poços múltiplos, réplicas técnicas (n = 3-6) são facilmente criadas. No entanto, a pipetagem cuidadosa e a prática são necessárias para minimizar a variabilidade do poço ao poço, pois as células são dispensadas em um meio viscoso contendo EMB.
Uma taxa de sucesso próxima de 100% pode ser esperada para o estabelecimento da MEO nos protocolos descritos. No entanto, o sucesso da cultura MEO depende da viabilidade das células epiteliais esofágicas isoladas inicialmente, o que está amplamente relacionado à qualidade do material de partida. Quando os camundongos não podem ser imediatamente dissecados após a eutanásia, as carcaças podem ser mantidas a 4 °C durante a noite para isolar o esôfago no dia seguinte. No entanto, as carcaças não devem ser congeladas, pois o tecido congelado não produzirá células viáveis. As células epiteliais dissociadas do esôfago podem ser criopreservadas como suspensão unicelular em meio de congelamento (SFB 90% e DMSO 10%) e armazenadas em nitrogênio líquido para gerar organoides posteriormente. O esôfago (lençol epitelial) pode ser criopreservado de maneira semelhante, embora menos ideal. Enquanto os MEOs podem ser iniciados com células purificadas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e outros métodos para purificar subconjuntos únicos de células epiteliais esofágicas, a viabilidade celular pode ser diminuída após a purificação. Deve-se notar que ensaios de viabilidade celular, como o teste de exclusão do azul de tripano, podem distinguir células vivas de células mortas, mas não células moribundas, subestimando assim a viabilidade celular antes do início da cultura de organoides. Após o estabelecimento, os MEOs de camundongos tratados com 4NQO e não tratados podem ser passados indefinidamente (>20 passagens), com viabilidade esperada de >80% em cada passagem no meio especificado. Vale ressaltar que existem componentes do meio organoide cujas exigências permanecem obscuras. Zheng e col. demonstraram recentemente que um suplemento composto por Wnt3A, RSpondin-1 e Noggin é necessário para o crescimento de organoides murinos do esôfago16. Entretanto, não utilizamos o Wnt3A nesse protocolo, pois organoides da língua, esôfago e pré-estômago crescem e podem ser passados várias vezes (>10 passagens) sem ele 7,3,17. Deve-se notar que os requisitos desses fatores não foram testados individualmente.
As lâminas epiteliais são utilizadas para gerar MEOs a partir do esôfago normal ou da mucosa esofágica sem lesões macroscopicamente visíveis, como tumores. O uso de lâminas epiteliais permite o enriquecimento de células epiteliais como material de partida. No entanto, o isolamento das lâminas epiteliais da mucosa esofágica portadora de tumor é difícil devido à invasão do CEC nos compartimentos subepiteliais. Todo o esôfago pode ser usado para iniciar a cultura MEO, embora a presença de populações de células não epiteliais possa diminuir a taxa de formação de organoides (RLO) na cultura inicial. Espera-se que o RLO aumente nas passagens subsequentes, uma vez que as atuais condições de cultura MEO permitem que as células epiteliais cresçam dentro do BME. Vale ressaltar que os protocolos aqui descritos também podem ser aplicados a outros órgãos, especialmente a língua oral e o pré-estômago, ambos suscetíveis à carcinogênese de células escamosas induzida por 4NQO. Vale ressaltar que geramos organoides de língua de camundongo (MTOs) e organoides de estômago anterior de camundongo (MFOs) de todo o tecido sem isolar as células epiteliais. Se necessário, esses organoides podem ser feitos a partir de uma subpopulação de células epiteliais purificadas por classificação de células ativadas por fluorescência (por exemplo, células-tronco cancerosas caracterizadas por alta expressão de CD44, células-tronco esofágicas putativas CD73+).
Além disso, células não epiteliais, fibroblastos em particular, podem migrar para fora da EMB para crescer em uma monocamada na superfície plástica, permitindo assim o estabelecimento concomitante de fibroblastos murinos esofágicos, incluindo fibroblastos associados ao câncer. A seletividade para o crescimento de células epiteliais na BME 3D pode limitar a co-cultura de MEOs com células imunes e outros tipos celulares nas condições atuais aqui descritas. A otimização para experimentos de co-cultura está em andamento. Além disso, a frente invasiva tumoral pode ser melhor recapitulada na interface epitélio-estromal modelada por métodos alternativos de cultura 3D, como a cultura organotípica3D8,18. Além disso, as MEOs podem não ser uma plataforma adequada para medir a função de barreira epitelial, que pode ser melhor avaliada utilizando cultura de interface ar-líquido para avaliar a resistência elétrica transepitelial 19,20,21.
A principal vantagem dos MEOs, e de fato dos MTOs e MFOs, é o rápido crescimento de estruturas derivadas de uma única célula que recapitulam as estruturas epiteliais originais, tanto benignas quanto malignas. O tempo de duplicação (TD) desses organoides é tipicamente estimado em <20 h. A cinética de crescimento de MTOs normais de camundongos 4NQO não tratados ilustra tanto a capacidade de cultura a longo prazo de organoides normais, bem como o nível esperado de duplicação populacional (PD) e DT (Figura 9). Neste exemplo, cerca de 10 duplicações populacionais ocorreram durante cada passagem, com um TD calculado de 18,5 h e 18,3 h, em média. Após a cultura primária inicial, um RLO de 15%-25% é tipicamente esperado, independentemente da densidade de semeadura, e os MEOs podem surgir já no 4º dia (Figura 8), embora possam ser menores em tamanho. Sob microscopia de contraste de fase, organoides da mucosa esofágica normal exibem estruturas esféricas com superfícies lisas. Em função do tempo, organoides normais exibem uma estrutura concêntrica à medida que a massa celular interna sofre diferenciação terminal pós-mitótica, gerando um gradiente de diferenciação que mimetiza o epitélio escamoso estratificado. Os organoides neoplásicos apresentam superfícies irregulares, refletindo a alta atividade proliferativa das células basalóides, que podem se expandir externamente. A capacidade das MEOs de exibir um gradiente proliferação-diferenciação pode ser utilizada para estudar como os queratinócitos basais proliferativos do esôfago podem se propagar e sofrer diferenciação terminal pós-mitótica. Por meio da subcultura de células MEO dissociadas, pode-se avaliar a auto-renovação das células epiteliais (Figura 7), bem como a regeneração ou transformação sob estresse genotóxico induzido pela 4NQO. Estudos semelhantes também podem ser realizados utilizando o modelo MTO no contexto do câncer oral, ampliando a aplicação do modelo organoide de camundongo 4NQO descrito para CEC de cabeça e pescoço. Embora a renovação epitelial possa implicar células estaminais, uma fraqueza potencial do sistema MEO é que pode não detetar células estaminais quiescentes ou raramente em divisão, uma vez que a formação de MEO depende da proliferação celular. Um estudo recente de análise de célula única em MEOs forneceu informações substanciais sobre a heterogeneidade das células epiteliais esofágicas22.
A transformação maligna pode ser avaliada pela avaliação morfológica cuidadosa das estruturas individuais da MEO e da atipia nuclear das células que compõem as MEOs. O perfil molecular de MEOs por sequenciamento do exoma total e sequenciamento de RNA pode revelar a natureza distinta das lesões pré-neoplásicas e CEC. No entanto, o teste final para transformação maligna pode exigir o transplante de MEOs em camundongos imunodeficientes ou imunocompetentes para documentar a tumorigenicidade das células ESCC. Os MEOs ESCC transplantados em camundongos imunocompetentes singênicos também podem fornecer uma excelente plataforma para investigar o microambiente imune tumoral.
As aplicações dos MEOs são amplas. Além das abordagens morfológica, bioquímica e multi-ômica, a citometria de fluxo pode ser utilizada não apenas para analisar processos celulares como síntese de DNA, apoptose, autofagia e respiração mitocondrial, mas também marcadores de superfície celular que definem subconjuntos únicos de células dentro de MEOs correspondentes a modificações genéticas e farmacológicas ex vivo 7,23 . Além disso, organoides podem ser utilizados em experimentos de co-cultura para avaliar as interações entre as células epiteliais e o estroma, as células imunes ou mesmo o microbioma24. Finalmente, as MEOs podem ser geradas a partir de camundongos portadores de modificações genéticas rastreáveis por linhagem celular, como a proteína repórter fluorescente expressa sob um promotor regulador gênico específico do tipo celular (por exemplo, Sox2, citoqueratinas Krt5 e Krt15)3,4,7,25.
Em resumo, os MEOs são uma ferramenta inestimável para o estudo da ESCC. Os protocolos aqui descritos visam mostrar que os MEOs representam um modelo versátil, relativamente fácil de gerar, manter e caracterizar e com a capacidade de recapitular as características do CEC e da neoplasia esofágica.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos aos Recursos Compartilhados (Citometria de Fluxo, Patologia Molecular e Microscopia Confocal e Especializada) do Herbert Irving Comprehensive Cancer Center da Columbia University pelo suporte técnico. Agradecemos aos Drs. Alan Diehl, Adam J. Bass e Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) e aos membros dos laboratórios Rustgi e Nakagawa pelas discussões úteis. Este estudo foi apoiado pelos seguintes NIH Grants: P01CA098101 (H.N. e A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. e H.N.) e P30CA013696 (A.K.R.). H.N. e C.L. receberam o Prêmio Piloto Multi-PI do Centro Abrangente de Câncer Herbert Irving da Universidade de Columbia. H.N. recebeu o Prêmio Fanconi Anemia Research Fund. F.M.H. recebeu o Prêmio da Fundação Mark para Pesquisa do Câncer (20-60-51-MOME) e um Prêmio da Associação Americana para Pesquisa do Câncer. J.G. recebeu o prêmio da American Gastroenterological Association (AGA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
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