Summary
CRISPR-Cas प्रौद्योगिकियों ने जीनोम संपादन के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। हालांकि, वांछित जर्मलाइन संपादन को ढूंढना और अलग करना एक बड़ी बाधा बनी हुई है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल मानक पीसीआर, प्रतिबंध पाचन और जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीकों का उपयोग करके जर्मलाइन संपादन के लिए एफ 0 सीआरआईएसपीआर-इंजेक्शन जेब्राफिश शुक्राणु की जल्दी से जांच करने के लिए एक मजबूत विधि का वर्णन करता है।
Abstract
लक्षित सीआरआईएसपीआर-कैस न्यूक्लियस प्रौद्योगिकियों के आगमन ने स्थापित और उभरते मॉडल सिस्टम दोनों में सटीक जीनोम संपादन करने की क्षमता में क्रांति ला दी है। CRISPR-Cas जीनोम संपादन प्रणाली विशिष्ट जीनोमिक डीएनए लोकी के लिए CRISPR-संबद्ध (Cas) एंडोन्यूक्लिज़ को लक्षित करने के लिए सिंथेटिक गाइड आरएनए (sgRNA) का उपयोग करती है, जहां Cas एंडोन्यूक्लिज़ एक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक उत्पन्न करता है। आंतरिक त्रुटि-प्रवण तंत्र द्वारा डबल-स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत से सम्मिलन और / या विलोपन होता है, जिससे स्थान बाधित होता है। वैकल्पिक रूप से, इस प्रक्रिया में डबल-फंसे हुए डीएनए दाताओं या एकल-फंसे हुए डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को शामिल करने से एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता से लेकर छोटे इम्यूनोलॉजिकल टैग या यहां तक कि बड़े फ्लोरोसेंट प्रोटीन निर्माण तक सटीक जीनोम संपादन शामिल हो सकते हैं। हालांकि, इस प्रक्रिया में एक बड़ी बाधा जर्मलाइन में वांछित संपादन को ढूंढना और अलग करना हो सकता है। यह प्रोटोकॉल डेनियो रेरियो (ज़ेब्राफिश) में विशिष्ट लोकी पर जर्मलाइन म्यूटेशन की स्क्रीनिंग और आइसोलेटिंग के लिए एक मजबूत विधि की रूपरेखा तैयार करता है; हालाँकि, ये सिद्धांत किसी भी मॉडल में अनुकूलनीय हो सकते हैं जहां विवो शुक्राणु संग्रह संभव है।
Introduction
CRISPR (क्लस्टर्ड नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स)/Cas सिस्टम डैनियो रेरियो (ज़ेब्राफिश) मॉडल सिस्टम 1,2,3,4 में लोकी-विशिष्ट म्यूटेनेसिस और सटीक जीनोम संपादन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। कैस-राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन (आरएनपी) में दो मुख्य घटक शामिल हैं: एक कैस एंडोन्यूक्लिज़ (आमतौर पर कैस 9 या सीएएस 12 ए) और एक टिड्डी-विशिष्ट सिंथेटिक गाइड आरएनए (एसजीआरएनए)5। साथ में, कैस-आरएनपी वांछित स्थान में एक डबल-फंसे हुए ब्रेक (डीएसबी) उत्पन्न करता है जिसे दो आंतरिक मरम्मत तंत्रों में से एक द्वारा मरम्मत की जा सकती है। गैर-समरूप अंत जुड़ने (NHEJ) मरम्मत तंत्र त्रुटि-प्रवण है और अक्सर डीएसबी के आसपास विभिन्न प्रकार के सम्मिलन या विलोपन (इंडेल) का परिणाम होता है। ये इंडेल हानिकारक हो सकते हैं यदि वे परिणामी प्रोटीन अनुक्रम में एक फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन या समय से पहले स्टॉप पेश करते हैं। वैकल्पिक रूप से, होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) तंत्र क्षति की मरम्मत के लिए डीएसबी साइट के आसपास होमोलॉजी के क्षेत्रों के साथ एक दाता टेम्पलेट का उपयोग करता है। शोधकर्ता सटीक जीनोमिक संपादन उत्पन्न करने के लिए एचडीआर प्रणाली का लाभ उठा सकते हैं। विशेष रूप से, वे एक डबल-फंसे हुए डीएनए दाता निर्माण को सह-इंजेक्ट कर सकते हैं जिसमें वांछित संपादन के साथ-साथ जीनोम में डीएसबी साइट के साथ होमोलॉजी के क्षेत्र शामिल हैं। इन व्यावसायिक रूप से उत्पादित सीआरआईएसपीआर घटकों के लिए पैमाने की बढ़ती अर्थव्यवस्था ने कई लोकी की जांच करने और सटीक जीनोम संपादन के लिए बड़े पैमाने पर प्रयासों को स्थापित करने के लिए बाधाओं को बहुत कम कर दिया है। हालांकि, यौन प्रजनन पशु मॉडल में, एक प्रमुख अड़चन जर्मलाइन-स्थिर उत्परिवर्ती जानवरों की पहचान और अलगाव है।
ज़ेबराफिश मॉडल सिस्टम कई प्रमुख गुणों को प्रदर्शित करता है जो रिवर्स आनुवंशिक अध्ययन में इसके उपयोग को बढ़ाते हैं। वे बुनियादी जलीय आवास उपकरणों के साथ बड़ी संख्या में पालन करना आसान है, और महिलाएं पूरे वर्ष6 के आसपास उच्च उर्वरता का प्रदर्शन करती हैं। इसके अलावा, उनके बाहरी अंडे देने और निषेचन उन्हें सीआरआईएसपीआर / सीएएस घटकों के माइक्रोइंजेक्शन के लिए उत्तरदायी बनाते हैं। कैस-आरएनपी को आमतौर पर डीएसबी / मरम्मत उत्पन्न करने के लिए एक-सेल चरण ज़ेब्राफिश भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है, जो सिद्धांत रूप में, सभी बेटी कोशिकाओं द्वारा विरासत में मिला है। हालांकि, द्विगुणित जीनोम को दोनों समरूप गुणसूत्रों को उत्परिवर्तित करने के लिए दो डीएसबी / मरम्मत घटनाओं की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, हालांकि कैस-आरएनपी को एक-सेल चरण में इंजेक्ट किया जाता है, डीएसबी / मरम्मत विकास में बाद के बिंदुओं तक नहीं हो सकती है। साथ में, ये कारक एफ 0-इंजेक्शन मछली की मोज़ेक प्रकृति में योगदान करते हैं। एक आम प्रथा एफ 0-इंजेक्शन वाली मछली को पार करना और एफ 1 संतान को इंडेल / विशिष्ट संपादन के लिए स्क्रीन करना है। हालांकि, चूंकि सभी एफ 0-इंजेक्शन वाली मछलियों में जर्मलाइन म्यूटेशन नहीं होते हैं, इसलिए इस अभ्यास के परिणामस्वरूप कई अनुत्पादक क्रॉस होते हैं जो वांछित संपादन उत्पन्न नहीं करते हैं। एफ 1 दैहिक ऊतक के बजाय एफ 0 जर्मलाइन की जांच वांछित जर्मलाइन संपादन को अलग करने की संभावना को बढ़ाती है और इस प्रक्रिया में आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करती है।
इच्छामृत्यु की आवश्यकता के बिना एफ 0-इंजेक्शन जेब्राफिश से शुक्राणु आसानी से एकत्र किए जा सकते हैं। यह सुविधा जमे हुए शुक्राणु स्टॉक7 के क्रायोप्रिजर्वेशन और पुन: व्युत्पन्न के लिए अनुमति देती है, लेकिन वांछित जीनोमिक उत्परिवर्तन 8,9 के जर्मलाइन वाहक को तेजी से स्क्रीन, पहचान और अलग करने के लिए भी इसका उपयोग किया जा सकता है। ब्रोकल एट अल (2016) ने पहले एफ 0-इंजेक्शन वाले नर जेब्राफिश10 में जर्मलाइन संपादन की स्क्रीनिंग के लिए एक अनुक्रमण-आधारित विधि का वर्णन किया था। हालांकि जर्मलाइन में मौजूद उत्परिवर्तित एलील्स की पहचान करने के लिए उपयोगी है, यह दृष्टिकोण उच्च थ्रूपुट में महंगा हो सकता है और सभी प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ नहीं हो सकता है। इसके विपरीत, वर्तमान प्रोटोकॉल जर्मलाइन संपादन की पहचान करने के लिए एक सुलभ और लागत प्रभावी वैद्युतकणसंचलन-आधारित रणनीति प्रदान करता है। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल उच्च-रिज़ॉल्यूशन एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके विशिष्ट लोकी पर जर्मलाइन म्यूटेशन की स्क्रीनिंग और आइसोलेटिंग के लिए एक मजबूत विधि की रूपरेखा तैयार करता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल विशिष्ट संपादन वाले दाता निर्माण के सफल एकीकरण की पहचान करने के लिए एक समान रणनीति का वर्णन करता है। हमेशा की तरह, यदि विशिष्ट संपादन वांछित हैं, तो अनुक्रमण-आधारित रणनीतियों को नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के साथ मिलकर किया जा सकता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल ज़ेबराफिश मॉडल सिस्टम के लिए विशिष्ट है, इन सिद्धांतों को किसी भी मॉडल के लिए अनुकूल होना चाहिए जिसमें शुक्राणु का संग्रह एक नियमित प्रक्रिया है। साथ में, ये रणनीतियां जर्मलाइन इंडेल / एडिट के साथ एफ 0-इंजेक्शन वाले पुरुषों की पहचान करने की अनुमति देंगी, जिन्हें मानक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और / या प्रतिबंध पाचन के बाद जेल पर हल किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
यह अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में दिशानिर्देशों के अनुरूप किया गया था। प्रोटोकॉल ऑस्टिन पशु देखभाल और उपयोग समिति (एयूपी-2021-00254) में टेक्सास विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. सीआरआईएसपीआर म्यूटेनेसिस के लिए एसजीआरएनए डिजाइन करना
- लक्षित लोकी युक्त एक्सॉन अनुक्रम प्राप्त करें।
- प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) साइट के साथ एक सिंथेटिक गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) डिजाइन करें जो कैस एंडोन्यूक्लिज़ के लिए विशिष्ट है।
- यदि दाता निर्माण को सह-इंजेक्शन दिया जाता है, तो एसजीआरएनए को वांछित संपादन के करीब अनुमानित कट साइट के लिए डिज़ाइन करें।
नोट: एपीई कैस 9 एसजीआरएनए साइटों11 को खोजने के लिए एक उपकरण के साथ एक मुफ्त सॉफ्टवेयर है। वैकल्पिक रूप से, चॉपचॉप जैसे उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है, जो एसजीआरएनए को डिजाइन करने के लिए एक ऑनलाइन इंटरफ़ेस प्रदान करता है जो कैस 9 और अन्य सीएएस एंडोन्यूक्लिज़12 की विभिन्न पीएएम साइटों पर विचार करता है।
- यदि दाता निर्माण को सह-इंजेक्शन दिया जाता है, तो एसजीआरएनए को वांछित संपादन के करीब अनुमानित कट साइट के लिए डिज़ाइन करें।
- डिज़ाइन किए गए CRISPR / Cas कट साइट के आसपास के क्षेत्र को बढ़ाने के लिए फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर डिजाइन करें। पीसीआर उत्पाद की लंबाई लगभग 200-400 बेस जोड़े (बीपी) होनी चाहिए ताकि प्रोटोकॉल में बाद में जेल पर छोटे इंडेल को हल करने में सक्षम हो सके।
नोट: CHOPCHOP11 स्वचालित रूप से प्रत्येक SgRNA आउटपुट के लिए प्राइमर डिज़ाइन करता है। - वैकल्पिक: वांछित संपादन के साथ एक डीएनए दाता निर्माण डिजाइन करें।
- वांछित उत्परिवर्तन के लोकी वाले एक्सॉन का जीनोमिक अनुक्रम प्राप्त करें।
नोट: इनट्रोनिक अनुक्रम व्यक्तियों के बीच भिन्न हो सकते हैं, इसलिए दाता निर्माण में इनट्रोनिक अनुक्रमों को शामिल करने से बचना सबसे अच्छा है क्योंकि यह होमोलॉजी-निर्भर मरम्मत मार्ग में हस्तक्षेप कर सकता है। - यदि एक विशिष्ट अमीनो एसिड परिवर्तन वांछित है, तो तदनुसार विशिष्ट कोडन को बदलें।
नोट: इन परिवर्तनों को करते समय, कोडन आवृत्ति से अवगत रहें। यदि संभव हो, तो उच्च उपयोग के साथ एक कोडन चुनें। - दाता निर्माण के CRISPR / Cas पाचन को रोकने के लिए, अतिरिक्त पर्यायवाची उत्परिवर्तन करें जो (i) PAM को बाधित करते हैं और / या (ii) SGRNA अनुक्रम को बाधित करते हैं, जिसमें PAM साइट के करीब गैर-पर्यायवाची परिवर्तन करने पर उच्च प्राथमिकता दी जाती है।
- जंगली प्रकार के अनुक्रम के अनुमानित पीसीआर उत्पाद में अद्वितीय प्रतिबंध साइटों (जो केवल एक बार होती हैं) को खोजने के लिए प्रतिबंध साइट खोजक (एपीई11 में यह सुविधा भी है) का उपयोग करें।
- अनुमानित पीसीआर उत्पाद के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं जो दाता निर्माण के सफल एकीकरण को दर्शाता है।
- केवल संपादित अनुक्रम में मौजूद प्रतिबंध साइट खोजने के लिए जंगली-प्रकार और दाता-एकीकृत अनुक्रमों के बीच प्रतिबंध साइटों की सूची की तुलना करें।
- यदि कोई अद्वितीय प्रतिबंध साइट नहीं मिलती है, तो दाता निर्माण के भीतर पर्यायवाची परिवर्तन करना जारी रखें जब तक कि यह हासिल न हो जाए।
नोट: यदि संभव हो, तो समानार्थी उत्परिवर्तन करना जारी रखें जो दाता निर्माण के लिए एसजीआरएनए बाइंडिंग को बाधित करेगा।
- दाता अनुक्रम को एक प्रबंधनीय आकार (50-100 बीपी) में ट्रिम करें, जिसमें अनुमानित सीआरआईएसपीआर / सीएएस कट साइट के आसपास कम से कम 20 बीपी होमोलॉजी हो और यदि संभव हो तो संपादन करें।
- वांछित उत्परिवर्तन के लोकी वाले एक्सॉन का जीनोमिक अनुक्रम प्राप्त करें।
- डिज़ाइन किए गए एसजीआरएनए और / या डीएनए दाता ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स प्राप्त करें, साथ ही जीनोटाइपिंग के लिए आवश्यक कोई भी प्राइमर।
नोट: न्यूक्लियस द्वारा डीएनए दाता ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के पाचन को रोकने के लिए, फॉस्फोरोथियोएट के साथ डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के 5 ' और 3 ' सिरों पर पहले तीन फॉस्फेट बांड को संशोधित करने की सिफारिश की जाती है। - इंजेक्शन मिश्रण के 1 एनएल को एक-सेल चरण भ्रूण में इंजेक्ट करें। आमतौर पर, एक मानक इंजेक्शन मिश्रण में निम्नलिखित होते हैं:
25 μM टिड्डी-विशिष्ट sgRNA का 1 μL
25 μM Cas9 एंडोन्यूक्लिज़ का 1 μL
वैकल्पिक: 3 μM डीएनए दाता निर्माण का 1 μL- 0.1 M RNase-मुक्त KCl के साथ कुल मात्रा को 5 μL तक लाएं।
- एफ 0-इंजेक्शन वाले व्यक्तियों को यौन परिपक्व वयस्कों में विकसित होने की अनुमति दें। शेष प्रोटोकॉल जर्मलाइन संपादन के लिए एफ 0-इंजेक्शन वाले पुरुषों की स्क्रीनिंग पर केंद्रित है।
2. प्रजनन टैंक ों की स्थापना
- एफ0 नर और मादा के बीच विभाजक के साथ प्रजनन टैंक स्थापित करके संभोग के लिए प्राइम एफ 0 नर।
- आवश्यक प्रजनन टैंकों की संख्या को कम करने के लिए, प्रत्येक टैंक में दो मादाओं में से तीन नर स्थापित करें।
- शुक्राणु संग्रह के बाद प्रभावी रूप से जांच किए जा सकने वाले एफ0 पुरुषों को व्यक्तियों के रूप में रखा जा सकता है। मादाओं का जीनोटाइप महत्वपूर्ण नहीं है क्योंकि इस प्रक्रिया के दौरान उनके युग्मकों को एकत्र नहीं किया जाएगा।
- मादाओं से जंगली प्रकार के पुरुषों का एक प्रजनन टैंक स्थापित करें। जंगली प्रकार के शुक्राणु प्रक्रिया में बाद में परिणामों की व्याख्या के लिए एक नियंत्रण के रूप में काम करेंगे।
- आवश्यक प्रजनन टैंकों की संख्या को कम करने के लिए, प्रत्येक टैंक में दो मादाओं में से तीन नर स्थापित करें।
- तैयार प्रजनन टैंकों को रात भर इनक्यूबेट करें।
3. शुक्राणु संग्रह प्रक्रिया के लिए सामग्री तैयार करना
- एक छोटे से कांच के कटोरे को भरने के लिए पर्याप्त एनेस्थेटाइजिंग समाधान (मछली के पानी में 0.016% ट्राइकेन-एचसीएल) तैयार करें।
- 50 mM NaOH के 40 μL को 0.2 mL PCR ट्यूबों में वितरित करें। प्रत्येक शुक्राणु नमूने के लिए एक ट्यूब तैयार करें जिसे एकत्र किया जाएगा। बर्फ पर स्टोर करें।
- प्रत्येक मछली के लिए अलग-अलग 0.8 एल टैंक तैयार करें जिन्हें प्रक्रिया के दौरान नमूना लिया जाएगा। जीनोटाइपिंग पूरी होने तक ये टैंक नमूना मछली को घर देंगे।
नोट: यह प्राथमिक कारक है जो मछली की संख्या को सीमित करता है जिसे इस प्रोटोकॉल में प्रभावी ढंग से जांच की जा सकती है। जीनोटाइपिंग पूरी होने तक नमूना व्यक्तियों के आवास के लिए पर्याप्त स्थान सुनिश्चित करें। - मछली के पानी में 1 इंच x 1 इंच स्पंज को नम करें (प्रक्रिया के दौरान एक नर ज़ेबराफिश वेंट्रल साइड को पकड़ने के लिए उथले, अंडाकार आकार के डिवोट के साथ काटा गया) और अतिरिक्त तरल निचोड़ें।
- स्पंज को कम आवर्धन पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र में रखें (चित्रा 1 ए)।
- इष्टतम देखने के लिए तिरछी ओवरहेड लाइटिंग रखें।
4. नर मछली को एनेस्थेटाइज करना और शुक्राणु एकत्र करना
- एक साफ केशिका ट्यूब तैयार करें।
- एक केशिका ट्यूब छोड़ने के लिए ट्यूब कंटेनर को धीरे से हिलाएं।
- केशिका ट्यूब को प्रदान किए गए बल्ब में रखें, और इसे एक तरफ सेट करें।
- तैयार एनेस्थेटाइजिंग समाधान (मछली के पानी में 0.016% ट्राइकेन-एचसीएल) में एक नर मछली को स्थानांतरित करें।
- संज्ञाहरण की प्रक्रिया को तेज करने के लिए घोल को एक स्लॉट चम्मच के साथ धीरे से हिलाएं।
- एक बार जब ऑपरकुलम (गिल) आंदोलन धीमा हो जाता है (लगभग 1-2 मिनट), शुक्राणु संग्रह के साथ आगे बढ़ें।
- पेपर तौलिए के एक साफ ढेर पर मछली को स्थानांतरित करने के लिए स्लॉट किए गए चम्मच का उपयोग करें।
- अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए मछली को धीरे से रोल करने के लिए स्लॉट किए गए चम्मच का उपयोग करें।
- किसी भी शेष पानी को हटाने के लिए मछली को साफ, मुड़े हुए टिशू पेपर के साथ धीरे से धब्बा दें।
- मछली को तैयार स्पंज में स्थानांतरित करने के लिए स्लॉट किए गए चम्मच का उपयोग करें (चित्रा 1 बी)।
- प्रक्रिया करने वाले व्यक्ति के प्रमुख हाथ के निकट अपने सिर के साथ मछली उदर पक्ष को रखें।
- कोमलता से गुदा पंख के आसपास के क्षेत्र को साफ, मुड़े हुए टिशू पेपर के साथ धब्बा दें।
- शुक्राणु एकत्र करें।
- केशिका ट्यूब के अंत का उपयोग करके, धीरे से क्लोका को उजागर करने के लिए पेल्विक फिन को मध्य रेखा से दूर ले जाएं (चित्रा 1 सी)।
- क्लोआका के पास केशिका ट्यूब के अंत को रखें।
- बल का उपयोग करके, धीरे से गलफड़ों के ठीक नीचे शुरू होने वाली मछली के किनारों को निचोड़ें और क्लोआका पर समाप्त करें (चित्रा 1 सी')।
- केशिका क्रिया द्वारा केशिका ट्यूब में शुक्राणु एकत्र करें। इस प्रक्रिया के लिए लगभग 1 μL पर्याप्त है (चित्रा 1 डी)।
नोट: कुछ प्रयोगशालाएं शुक्राणु संग्रह के लिए केशिका ट्यूबों के बजाय पी 10 पिपेट युक्तियों का उपयोग करने की रिपोर्ट करती हैं। - यदि शुक्राणु कोमल दबाव के साथ जारी नहीं किया जाता है, तो मछली को सिस्टम के पानी में वापस कर दें।
- संज्ञाहरण से वसूली के लिए निगरानी करें।
- शुक्राणु को बाहर निकालने के लिए मछली को कठोर न निचोड़ें, क्योंकि इससे मछली घायल हो सकती है।
- शुक्राणु को फिर से इकट्ठा करने का प्रयास करने से पहले मछली को 2 सप्ताह तक आराम दें।
- संग्रह के बाद, मछली को व्यक्तिगत आवास के लिए सिस्टम पानी के साथ एक साफ अलगाव टैंक में रखें।
- संज्ञाहरण से वसूली के लिए मछली की निगरानी करें।
- शुक्राणु को फिर से इकट्ठा करने का प्रयास करने से पहले मछली को 2 सप्ताह तक आराम दें।
- एकत्रित शुक्राणु के साथ केशिका ट्यूब को तैयार पीसीआर ट्यूब में रखें (50 एमएम एनएओएच के 40 μL के साथ)।
- एकत्र किए गए नमूने को निष्कासित करने के लिए रबर बल्ब निचोड़ें।
- इस्तेमाल किए गए केशिका ट्यूब को एक अनुमोदित ग्लास अपशिष्ट कंटेनर में निपटाएं।
- बर्फ पर नमूने को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि सभी पुरुषों को निचोड़ा न जाए।
- प्रत्येक व्यक्तिगत पुरुष के लिए चरण 4.1-4.5 दोहराएं।
- अलगाव टैंक और शुक्राणु के नमूनों को लेबल करें ताकि अंतिम शुक्राणु जीनोटाइपिंग परिणामों को कथित उत्परिवर्तन के साथ संबंधित व्यक्ति में वापस पाया जा सके।
- सभी व्यक्तियों की निगरानी करें, और सुनिश्चित करें कि वे सीधे हैं और टैंकों को सिस्टम पर वापस रखने से पहले अपने टैंकों की खोज कर रहे हैं।
- प्राइमिंग के लिए इस्तेमाल की जाने वाली महिलाओं को सिस्टम पर अपने संबंधित टैंकों में वापस रखें।
- यदि कोई मछली 10 मिनट के बाद संज्ञाहरण से ठीक नहीं होती है, तो प्रयोगशाला से जुड़ी संस्था द्वारा अनुमोदित इच्छामृत्यु प्रक्रिया का पालन करें।
- उदाहरण: मछली के पानी के साथ बर्फ स्नान में व्यक्ति को तेजी से ठंडा करें जो 2-4 डिग्री सेल्सियस है।
- प्रयोगशाला से जुड़ी संस्था द्वारा अनुमोदित प्रक्रिया के अनुसार एक उपयुक्त पशु शव अपशिष्ट कंटेनर में इच्छामृत्यु मछली का निपटान करें।
5. शुक्राणु के नमूनों से डीएनए निकालना
- संक्षेप में एक मिनीसेंट्रीफ्यूज में सभी शुक्राणु नमूनों को घुमाएं, और पीसीआर ट्यूबों को थर्मल साइक्लर में रखें।
- थर्मल साइक्लर के ढक्कन को बंद करें।
- थर्मल साइक्लर में निम्न सेटिंग्स चलाएँ:
- नमूने को 95 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए गर्म करें।
- नमूने को 25 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
- थर्मल साइकलर से नमूने निकालें।
- प्रत्येक नमूने के लिए एक साफ पिपेट टिप के साथ, 1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8 में बफर) के 10 μL जोड़कर पीएच को बेअसर करें।
- ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
- संक्षेप में नमूनों को एक मिनीसेंट्रीफ्यूज में घुमाएं।
- जीनोमिक डीएनए नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है या 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
6. वांछित टिड्डी का पीसीआर प्रवर्धन (और / या प्रतिबंध पाचन)
- एक मानक पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करके वांछित स्थान को बढ़ाएं।
- थर्मल साइक्लर को नीचे पीसीआर प्रतिक्रिया में प्रारंभिक विकृतीकरण तापमान पर प्रीहीट करें।
- पीसीआर ट्यूबों में प्रत्येक शुक्राणु नमूने के लिए 25 μL प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें:
2x Taq पोलीमरेज़ मास्टर मिक्स का 12.5 μL
1.5 μL का 10 μM फॉरवर्ड प्राइमर
1.5 μL का 10 μM रिवर्स प्राइमर
4.5 μL न्यूक्लियस मुक्त पानी
बेअसर शुक्राणु डीएनए नमूने का 5 μL - ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
- संक्षेप में नमूनों को एक मिनीसेंट्रीफ्यूज में घुमाएं।
- नमूने को निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ पूर्व-गर्म थर्मल साइकिलर में रखें:
प्रारंभिक विकृतीकरण: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस
विकृतीकरण के 35 चक्र (30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस), एनीलिंग (30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस), और विस्तार (30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस)
अंतिम विस्तार: 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
नोट: विशिष्ट टैक पोलीमरेज़ और पीसीआर प्रवर्धन उत्पाद की अपेक्षित लंबाई के आधार पर विस्तार तापमान और / या समय को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है। - थर्मल साइकलर से पीसीआर नमूने निकालें।
- वैकल्पिक: पीसीआर उत्पाद की एक छोटी मात्रा पर दाता-विशिष्ट प्रतिबंध पाचन करें, जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए कम से कम 5-10 μL बिना पचे पीसीआर उत्पाद छोड़ दें।
- 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में 30 μL प्रतिक्रिया तैयार करें:
10 μL अनप्योरिफाइड पीसीआर उत्पाद
न्यूक्लियस मुक्त पानी का 15 μL
10x प्रतिबंध एंजाइम बफर का 3 μL
प्रतिबंध एंजाइम का 2 μL ( DNAH10 नॉक-इन एलील का विश्लेषण करने के लिए प्रतिनिधि परिणामों में BSTNI का उपयोग किया जाता है)
नोट: कई प्रतिबंध एंजाइम अभी भी एक विशिष्ट पीसीआर प्रतिक्रिया बफर में सक्रिय हैं; हालांकि, प्रतिबंध डाइजेस्ट बफर के अतिरिक्त परिणामों को बेहतर बनाने में मदद मिल सकती है। यदि कोई समस्या उत्पन्न होती है तो समस्या निवारण के लिए विशिष्ट निर्माता निर्देशों का संदर्भ लें। - ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
- संक्षेप में नमूनों को एक मिनीसेंट्रीफ्यूज में घुमाएं।
- नमूने को निम्न सेटिंग्स के साथ थर्मल साइकिलर में रखें:
- पीसीआर एम्प्लिकॉन को 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर काटें।
नोट: उपयोग किए जा रहे विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइम के लिए कटे हुए तापमान और इनक्यूबेशन समय को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। - यदि निर्माता द्वारा इंगित किया जाता है, तो आवश्यक तापमान और इनक्यूबेशन समय के साथ प्रतिबंध एंजाइम को निष्क्रिय करें।
नोट: बीएसटीएनआई एंजाइम को गर्मी निष्क्रियता की आवश्यकता नहीं होती है।
- पीसीआर एम्प्लिकॉन को 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर काटें।
- 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में 30 μL प्रतिक्रिया तैयार करें:
7. अलग-अलग आकार के पीसीआर एम्प्लिकॉन को अलग करने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन करना
- 500 एमएल 0.5 एक्स टीबीई रनिंग बफर तैयार करें: 450 एमएल विआयनीकृत पानी में 50 एमएल 10एक्स टीबीई बफर कंसंट्रेट जोड़ें।
- 0.5x TBE रनिंग बफर में 4% अगारोस जेल का 100 mL तैयार करें: 0.5x TBE रनिंग बफर के 100 mL में 10,000x जेल दाग के 10 μL के साथ 4 ग्राम Agarose जोड़ें। अगारोस पाउडर पूरी तरह से घुलने तक माइक्रोवेव करें।
- जेल समाधान को उचित आकार के जेल कास्टिंग फ्रेम में डालें, और जेल के एक तरफ कंघी डालें।
नोट: एक बड़ा जेल आकार (अनुशंसित: 15 सेमी x 15 सेमी) इस प्रक्रिया के लिए फायदेमंद है, क्योंकि यह एम्प्लिकॉन को जेल पर हल करने के लिए अधिक स्थान प्रदान करता है।- यदि एक प्रतिबंध डाइजेस्ट उत्पाद का विश्लेषण किया जाना है, तो इसे पीसीआर उत्पाद के समान जेल पर चलाना सबसे अच्छा है ताकि परिणामों की तुलना की जा सके। जेल पर सभी नमूनों को फिट करने के लिए आवश्यक रूप से कंघी को अच्छी तरह से आकार समायोजित करें।
- जेल को कमरे के तापमान पर जमने तक छोड़ दें। कंघी को सावधानी से हटा दें। कास्टिंग फ्रेम से जेल को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- जेल समाधान को उचित आकार के जेल कास्टिंग फ्रेम में डालें, और जेल के एक तरफ कंघी डालें।
- जेल वैद्युतकणसंचलन रिग सेट करें।
- वैद्युतकणसंचलन रिग में जेल को इस तरह रखें कि कुएं नकारात्मक इलेक्ट्रोड के निकटतम हों। वैद्युतकणसंचलन रिग में 0.5x TBE रनिंग बफर डालें जब तक कि कुएं पूरी तरह से जलमग्न न हो जाएं।
- जेल लोड करें।
- डीएनए सीढ़ी के 5 μL को पहले कुएं में लोड करें (एक डीएनए सीढ़ी चुनें जिसमें डीएनए टुकड़े होते हैं जो पीसीआर एम्प्लिकॉन के आकार के समान होते हैं)।
- प्रत्येक नमूने (जंगली प्रकार के नियंत्रण नमूने सहित) के लिए एक नई पिपेट टिप का उपयोग करके, शेष कुओं में पीसीआर उत्पाद के 5-10 μL लोड करें।
- वैकल्पिक: यदि एक प्रतिबंध डाइजेस्ट उत्पाद का विश्लेषण किया जाना है, तो इन नमूनों को जेल पर भी लोड करें।
नोट: पीसीआर और प्रतिबंध पाचन उत्पाद के बीच डीएनए की समान मात्रा को लोड करना सबसे अच्छा है। उदाहरण के लिए, 30 μL प्रतिबंध पाचन प्रतिक्रिया मिश्रण में, पीसीआर उत्पाद के 10 μL जोड़ा गया था। इसलिए, डाइजेस्ट उत्पाद के 15 μL की डीएनए एकाग्रता अशुद्ध पीसीआर उत्पाद के 5 μL के बराबर थी।
- जेल चलाएं।
- इलेक्ट्रोड को जेल वैद्युतकणसंचलन रिग से कनेक्ट करें, और एम्प्लिकॉन के पर्याप्त पृथक्करण को सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए 150 वी लागू करें।
- डीएनए बैंड देखने के लिए जेल की छवि बनाएं।
नोट: दृढ़ता से उत्परिवर्तित सीआरआईएसपीआर-लक्षित लोकी कई बैंड आकारों के रूप में चलेगा जो जंगली-प्रकार के एम्प्लिकॉन के साथ सम्मिलन / विलोपन एलील के संयोजन का प्रतिनिधित्व करते हैं।- यदि जेल बैंड 1 घंटे के बाद हल नहीं होते हैं, तो 15 मिनट के अंतराल के लिए जेल में 150 वी लागू करें जब तक कि बैंड जेल पर पर्याप्त रूप से अलग न हो जाएं।
- वैकल्पिक: यदि एसएनपी, एपिटोप टैग, या फ्लोरोसेंट टैग जैसे सटीक संपादन के सम्मिलन के लिए स्क्रीनिंग की जाती है, तो शुक्राणु डीएनए को पीसीआर विधियों के साथ स्क्रीन करें जो वांछित संपादन के लिए विशिष्ट हैं। उदाहरण के लिए, दाता-विशिष्ट प्रतिबंध साइट की पहचान करते समय, शुक्राणु नमूने के पीसीआर उत्पाद की तुलना में प्रतिबंध पाचन उत्पाद में एक अतिरिक्त बैंड मौजूद होगा।
8. जर्मलाइन स्थिर एलील्स को अलग करना
- शुक्राणु निचोड़ने की प्रक्रिया से 2 सप्ताह के आराम के बाद, उन एफ 0 व्यक्तियों को पीछे छोड़ दें जिनके शुक्राणु जीनोमिक डीएनए में वांछित संपादन शामिल थे।
नोट: व्यक्तिगत शुक्राणुगोनिया क्लोन से शुक्राणु उत्पादन जेब्राफिश में चक्रीय हो सकता है; इस प्रकार, वांछित एलील आउटक्रॉस के समय शुक्राणु का उत्पादन नहीं कर सकता है। इस कारण से, प्रारंभिक स्क्रीनिंग द्वारा फंसे एलील को अलग करने के लिए अतिरिक्त क्रॉसिंग को एक से अधिक बार करना पड़ सकता है। - एक बार जब एफ 1 आउटक्रॉस्ड मछली यौन रूप से परिपक्व हो जाती है, तो शुक्राणु जीनोमिक डीएनए की स्क्रीनिंग के दौरान किए गए एक ही पीसीआर और जेल वैद्युतकणसंचलन प्रोटोकॉल का उपयोग करके मानक जीनोटाइपिंग विधियों (उदाहरण के लिए, फिन-क्लिप डीएनए) के साथ आगे बढ़ें।
- सेंगर एक ही वांछित संपादन के साथ एफ 1 व्यक्तियों की पहचान करने के लिए पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमित करता है।
- वैकल्पिक: यदि वांछित संपादन एक प्रतिबंध साइट का परिचय देता है या बाधित करता है, तो उचित प्रतिबंध डाइजेस्ट प्रोटोकॉल के साथ स्क्रीन करें।
- एक ही वांछित संपादन के साथ इन-क्रॉस एफ 1 हेटरोजाइगोट।
- अपेक्षित फेनोटाइप और / या जीनोमिक संपादन के लिए एफ 2 संतान को स्क्रीन करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एफ 0-इंजेक्शन पुरुष शुक्राणु के संग्रह से प्राप्त हजारों जीनोम के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करके जीनोम संपादन या कथित हानिकारक एलील्स की अधिक तेजी से पहचान करने की अनुमति देते हैं। चित्रा 2 इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त परिणामों की व्याख्या करने के तरीके पर प्रकाश डालता है।
पी 2 आर 12 लोकस में उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए, एक-सेल चरण ज़ेबराफिश भ्रूण को कैस 9 एंडोन्यूक्लिज़ और पी 2 आरवाई 12-विशिष्ट एसजीआरएनए (चित्रा 2 बी, ग्रे हाइलाइट) के साथ इंजेक्ट किया गया था। यौन परिपक्वता तक एफ 0-इंजेक्शन वाली मछली को सिस्टम में रखा गया था, और शुक्राणु छह अलग-अलग पुरुषों से एकत्र किए गए थे। उच्च गर्मी और बुनियादी स्थितियों (हॉटशॉट डीएनए निष्कर्षण) का उपयोग करके शुक्राणु के नमूनों से डीएनए निकाला गया था और पी 2 आर 12 लोकस के पीसीआर प्रवर्धन से पहले बेअसर कर दिया गया था। पीसीआर उत्पादों को उच्च वोल्टेज (150 वी) पर 1.5 घंटे के लिए उच्च प्रतिशत (4%) एगारोस जेल पर अलग किया गया था। इस उदाहरण में, जंगली प्रकार के एम्प्लिकॉन लंबाई में लगभग 250 बेस जोड़े के एकल उज्ज्वल बैंड के रूप में चलते थे (चित्रा 2 सी; डब्ल्यूटी)। इसके विपरीत, एफ 0-इंजेक्टेड पुरुष एम्प्लिकॉन जिसमें इंडेल होते हैं, जेल पर कई बैंड (चित्रा 2 सी; लेन # 1-2, # 5-8) के रूप में चलते हैं। वैकल्पिक रूप से, उत्परिवर्तित एफ 0-इंजेक्शन वाले पुरुष एम्प्लिकॉन बदले हुए जेल गतिशीलता के साथ एकल बैंड के रूप में चल सकते हैं (पी 2 आरवाई 12 उदाहरण में नहीं दिखाया गया है, लेकिन डीएनएएच 10 एफ 0-पुरुष # 2 के पीसीआर उत्पाद में स्पष्ट है; चित्र 2E)। यह p2ry12 उदाहरण जेल पर कम स्पष्ट था कि नमूना # 3 और नमूना # 4 में जंगली प्रकार के बैंड की तुलना में इंडेल शामिल थे, इसलिए ये व्यक्ति सबसे अच्छे संस्थापक उम्मीदवार नहीं हो सकते हैं। अधिक विशिष्ट एम्प्लिकॉन परिवर्तनों के साथ एफ 0 पुरुषों से एलील्स का अलगाव स्थिर जर्मलाइन वाहक के प्रचार के लिए सबसे अच्छा है क्योंकि वे आसानी से 4% एगारोस जेल पर स्कोर किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, एफ 0-पुरुष # 6 शुक्राणु के नमूने में एलील्स में से एक में एक बड़ा विलोपन दिखाई दिया (चित्रा 2 सी; लेन 6; बढ़ी हुई जेल गतिशीलता के साथ उज्ज्वल बैंड)। यदि इस बड़े विलोपन एलील को एफ 1 पीढ़ी में चुना गया था, तो यह 4% अगारोस जेल पर डब्ल्यूटी एलील से आसानी से अलग हो जाएगा। वैकल्पिक रूप से, यदि विभिन्न एलील्स का संग्रह वांछित है, तो एफ 0-पुरुष # 7 एक प्रभावी संस्थापक उम्मीदवार हो सकता है क्योंकि इसके पीसीआर उत्पाद में विभिन्न मोबिलिटीज के कई असतत एलील्स होते हैं। एक बार एक संस्थापक पुरुष का चयन हो जाने के बाद, वांछित एलील को इंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले मूल जंगली-प्रकार के तनाव में व्यक्ति को वापस पार करके अलग किया जा सकता है।
डीएनएएच 10 जीन में एक विशिष्ट नॉक-इन उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए, एक-सेल चरण जेब्राफिश भ्रूण को कैस 9 एंडोन्यूक्लिज़, एक डीएनएएच 10-विशिष्ट एसजीआरएनए (चित्रा 2 डी; ग्रे हाइलाइट), और वांछित संपादन (चित्रा 2 डी; लाल) और एक दाता-विशिष्ट बीएसटीएनआई प्रतिबंध साइट (चित्रा 2 डी) वाले डीएनए दाता ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ इंजेक्ट किया गया था। , कोष्ठक)। यह डिजाइन पीसीआर के बाद प्रतिबंध पाचन के साथ दाता एकीकरण की आसान पहचान के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, एसजीआरएनए मान्यता साइट (चित्रा 2 डी; ग्रे हाइलाइट) के भीतर आधार जोड़े को बदलकर, यह डिज़ाइन दाता अनुक्रम के सीएएस 9 पाचन को रोकता है। एक बार जब एफ 0-इंजेक्शन मछली यौन परिपक्वता तक पहुंच गई, तो शुक्राणु एकत्र किए गए, और डीएनए को गर्म शॉट विधि का उपयोग करके निकाला गया। इन नमूनों से, डीएनएएच 10 लोकस को पीसीआर का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था, और उत्पादों को उच्च वोल्टेज (150 वी) पर 1 घंटे के लिए उच्च प्रतिशत (4%) एगारोस जेल पर अलग किया गया था। इस उदाहरण में, वाइल्ड-टाइप एम्पलीकॉन लंबाई में लगभग 400 बेस जोड़े के एकल उज्ज्वल बैंड के रूप में चला (चित्रा 2 ई; शीर्ष पैनल: डब्ल्यूटी)। इसके विपरीत, एफ0-इंजेक्टेड पुरुष एम्प्लिकॉन जिसमें इंडेल होते हैं, कई बैंड (चित्रा 2 ई; शीर्ष पैनल: लेन # 1, # 4, और # 5) के रूप में या कम जेल गतिशीलता के साथ एकल बैंड के रूप में चलते थे (चित्रा 2 ई; शीर्ष पैनल: लेन # 2)। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या शुक्राणु के नमूनों में से किसी में दाता-एकीकृत एलील शामिल हैं, पीसीआर उत्पादों को 1 घंटे के लिए बीएसटीएनआई प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचाया गया था, और उत्पाद को उच्च वोल्टेज (150 वी) पर 1 घंटे के लिए 4% अगारोस जेल पर चलाया गया था। पचे हुए पीसीआर उत्पाद (चित्रा 2 डी; शीर्ष पैनल) की तुलना पचे हुए उत्पाद (चित्रा 2 डी; निचले पैनल) से करने से दाता निर्माण के संभावित एकीकरण के साथ नमूने का पता चलता है। इस उदाहरण में, एफ 0-इंजेक्शन वाले पुरुष # 1 में पचे हुए उत्पाद में एक अतिरिक्त बैंड था जो पीसीआर उत्पाद में मौजूद नहीं था (चित्रा 2 डी; निचला पैनल: लेन # 1, सर्कल)। इसलिए, यह पुरुष वांछित नॉक-इन के साथ उत्परिवर्ती रेखा स्थापित करने के लिए सबसे अच्छे संस्थापक उम्मीदवार का प्रतिनिधित्व करता है।
एक बार जब कथित एफ 0 वाहक पुरुष को पार कर लिया जाता है, तो एलील को एफ 1 संतान में अनुक्रम-सत्यापित किया जाना चाहिए। यह सुझाव दिया जाता है कि एफ 1 विषमयुग्मी मछली से प्राप्त एम्प्लिकॉन को सीधे अनुक्रमित किया जाए, जिसके बाद पॉली पीक पार्सर13 जैसे विषम एलील विश्लेषण विधियों का प्रदर्शन किया जाए या विभिन्न प्रकार के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण-आधारित तरीकों जैसे कि मिसेक14 या हाय-टॉम15 अनुक्रमण का उपयोग किया जाए। यह सुनिश्चित करने के लिए एक आवश्यक और पूरक दृष्टिकोण है कि सटीक संपादन या हानिकारक इंडेल उत्परिवर्तन वास्तव में जर्मलाइन हो रहा है और यह केवल जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण का एक विरूपण साक्ष्य नहीं है। दरअसल, एफ 0 वाहक से शुक्राणु डीएनए अनुक्रमित करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण का उपयोग आसानी से इस प्रोटोकॉल में वर्णित जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण के स्थान पर किया जा सकता है। हालांकि, जेब्राफिश शोधकर्ताओं के वैश्विक समुदाय के लिए एक आसानी से स्कोर करने योग्य अगारोस जेल जीनोटाइपिंग विधि होना एक अधिक किफायती और समतावादी दृष्टिकोण है।
चित्र 1: शुक्राणु निचोड़ने की प्रक्रिया के लिए सेटअप। (A) स्पंज को ओवरहेड प्रकाश व्यवस्था के साथ कम आवर्धन पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे स्थित किया जाता है। (बी) स्पंज में एक्स 1 में नम 1, एक अंडाकार डिवोट (डैश्ड लाइन) के साथ काटा जाता है, प्रक्रिया के दौरान एनेस्थेटाइज्ड नर मछली उदर पक्ष को पकड़ने के लिए उपयोग किया जाता है। (सी) एनेस्थेटाइज्ड नर मछली के उदर पक्ष की शारीरिक रचना गुदा पंख (एएफ, गुलाबी), श्रोणि पंख (पीएफ, नीला), और क्लोआका (तीर) को दर्शाती है, जहां प्रक्रिया के दौरान शुक्राणु को निष्कासित किया जाएगा। (C') फिल्टर फोर्स का उपयोग धीरे-धीरे एनेस्थेटाइज्ड नर मछली को गलफड़ों से क्लोआका तक निचोड़ने के लिए किया जाता है, जबकि निष्कासित शुक्राणु को केशिका क्रिया (सफेद तीर) द्वारा ग्लास पिपेट में खींचा जाता है। (डी) डाउनस्ट्रीम डीएनए निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए पर्याप्त निष्कासित शुक्राणु (अपारदर्शी तरल; काला ब्रैकेट) युक्त एक केशिका ट्यूब। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: वर्कफ़्लो और प्रतिनिधि परिणाम. (A) प्रोटोकॉल का सामान्य वर्कफ़्लो. (बी) सीएएस 9-विशिष्ट पीएएम साइट (रेखांकित) के साथ पी 2 आरवाई 12 एसजीआरएनए साइट (ग्रे हाइलाइट) का प्रतिनिधि डिजाइन। वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) नियंत्रण और पीसीआर प्रवर्धन के बाद एफ0-पी2आरवाई12 सीआरआईएसपीआर-इंजेक्शन वाले पुरुष शुक्राणु नमूने (1-8) पर 1.5 घंटे के बाद 4% जेल वैद्युतकणसंचलन के प्रतिनिधि परिणाम। (डी) लक्षित कोडन (बोल्ड) के पास कैस 9-विशिष्ट पीएएम साइट (रेखांकित) के साथ डीएनएएच 10 एसजीआरएनए साइट (ग्रे हाइलाइट) का प्रतिनिधि डिजाइन। वांछित कोडन संपादन (लाल बोल्ड) और बीएसटीएनआई प्रतिबंध साइट (कट साइट को चिह्नित करने वाले एपोस्ट्रोफ के साथ कोष्ठक) के साथ डीएनए दाता अनुक्रम। शीर्ष: जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और एफ 0 डीएनएएच 10 सीआरआईएसपीआर-इंजेक्शन पुरुष शुक्राणु नमूने (1-5) के पीसीआर उत्पाद। नीचे: उपरोक्त नमूनों के बीएसटीएनआई प्रतिबंध पाचन उत्पाद। नमूना 1 पाचन (लाल सर्कल) के बाद अतिरिक्त बैंड के आधार पर दाता निर्माण के सफल एकीकरण को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यह प्रोटोकॉल एफ0 पुरुष शुक्राणु जीनोम पर केंद्रित विश्लेषण द्वारा सीआरआईएसपीआर-सीएएस तकनीक का उपयोग करके कथित जीनोम संपादन या लक्षित उत्परिवर्तन को तेजी से चिह्नित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल अन्य पशु मॉडल के लिए उत्तरदायी होना चाहिए जहां शुक्राणु इच्छामृत्यु के बिना नमूने के लिए आसानी से उपलब्ध हैं। यह विधि वांछित संपादन के लिए स्क्रीनिंग के थ्रूपुट को बढ़ाएगी और दुर्लभ एचडीआर-मध्यस्थता नॉक-इन घटनाओं की पहचान करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। यह दृष्टिकोण एक कथित एफ 0 वाहक से एक शुक्राणु नमूने में संभावित हजारों जीनोम की तेजी से जांच की सुविधा प्रदान करके एक स्थिर जर्मलाइन संपादन खोजने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक जानवरों की संख्या को कम करने का भी कार्य करता है, जो अधिक पारंपरिक दृष्टिकोणों के विपरीत है जिनके लिए कथित एफ 0 वाहक के क्रॉस से प्राप्त सैकड़ों भ्रूणों की स्क्रीनिंग की आवश्यकता हो सकती है।
यह प्रोटोकॉल उच्च-रिज़ॉल्यूशन जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके जर्मलाइन संपादन की पहचान करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक को शामिल करके ज़ेबराफिश 7,10,14,16,17,18 में शुक्राणु संग्रह के लिए स्थापित प्रोटोकॉल पर बनाता है। लक्ष्य जीनोम संपादन की स्क्रीनिंग और अलगाव के लिए थ्रूपुट बढ़ाने के लिए इस दृष्टिकोण को आसानी से किसी भी मानक CRISPR / Cas वर्कफ़्लो में शामिल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल प्रशिक्षण और अनुभव की एक श्रृंखला के साथ-साथ शिक्षण प्रयोगशालाओं के साथ कर्मचारियों के साथ प्रयोगशालाओं के लिए उपयुक्त है। हालांकि, शुक्राणु संग्रह की हमारी विधि क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए पर्याप्त नहीं है, जिसे पिछलेप्रकाशनों 10,17 में विशेषज्ञ रूप से वर्णित किया गया है।
यह प्रोटोकॉल वांछित इंडेल और सटीक जीनोमिक उत्परिवर्तन के कथित पुरुष वाहक की पहचान करने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करता है। हालांकि, शुक्राणु जीनोमिक डीएनए अन्य दृष्टिकोणों के असंख्य के लिए उत्तरदायी है, जिसमें फ्लोरोसेंट टुकड़ा विश्लेषण या बारकोडेड अनुक्रमण14, उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघल विश्लेषण18, या मानक जेल वैद्युतकणसंचलन दृष्टिकोण का उपयोग करके फ्लोरोसेंट टैग या एपिटोप्स का सरल एम्प्लिकॉन पता लगाना शामिल है। सेंगर-आधारित या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जैसे दृष्टिकोणों का उपयोग करके सभी एलील्स का डाउनस्ट्रीम सत्यापन कथित एलील्स पर प्रयोगात्मक कार्य शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए। दरअसल, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण14 का उपयोग करके भ्रूण में उत्परिवर्तन के लिए स्क्रीनिंग के लिए मौजूदा तरीके अगारोस जैल पर विश्लेषण की आवश्यकता को दरकिनार कर सकते हैं, जिसे इस प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है। हालांकि, एक जेल-स्कोरेबल जीनोटाइपिंग विधि होना विचार करने के लिए एक अधिक लागत प्रभावी और समतावादी दृष्टिकोण है, यह देखते हुए कि सभी प्रयोगशालाओं के पास प्रत्येक उत्परिवर्ती तनाव के साथ काम करने के अलगाव और प्रयोगात्मक चरणों के दौरान सस्ती अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधियों तक आसान पहुंच नहीं है।
सारांश में, यह प्रोटोकॉल सीआरआईएसपीआर / सीएएस-संपादित पुरुषों से शुक्राणु जीनोम की पुन: जांच के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है जैसे कि वांछित संपादन के लिए स्क्रीन करने के लिए कम क्रॉस और भ्रूण की कम पीसीआर स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है। इस पद्धति के आवेदन से मछली की संख्या कम हो जाएगी जिसे रुचि के संपादित एलील्स की सफलतापूर्वक पहचान करने के लिए बनाने और विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है, जो स्थिर लाइनों को उत्पन्न करने के लिए कर्मियों के समय और लागत को भी कम करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
हम हॉट शॉट विधि का उपयोग करके अच्छी गुणवत्ता वाले शुक्राणु जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने में अपने प्रारंभिक प्रयासों के लिए वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में अन्ना हिंड्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के गठिया और मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोग संस्थान द्वारा पुरस्कार के तहत वित्त पोषित किया गया था (आर01एआर072009 आरएसजी को)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
