Summary
CRISPR-Cas技術は、ゲノム編集の分野に革命をもたらしました。ただし、目的の生殖細胞系列編集を見つけて分離することは、依然として大きなボトルネックです。したがって、このプロトコルは、標準的なPCR、制限消化、およびゲル電気泳動技術を使用して、F0 CRISPR注入ゼブラフィッシュ精子の生殖系列編集を迅速にスクリーニングするための堅牢な方法について説明しています。
Abstract
標的CRISPR-Casヌクレアーゼ技術の出現は、確立されたモデルシステムと新しいモデルシステムの両方で正確なゲノム編集を実行する能力に革命をもたらしました。CRISPR-Casゲノム編集システムは、合成ガイドRNA(sgRNA)を使用して、CRISPR関連(Cas)エンドヌクレアーゼを特定のゲノムDNA遺伝子座に標的化し、そこでCasエンドヌクレアーゼが二本鎖切断を生成します。固有のエラーが発生しやすいメカニズムによる二本鎖切断の修復は、挿入および/または欠失につながり、遺伝子座を破壊します。あるいは、このプロセスに二本鎖DNAドナーまたは一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを含めることで、一塩基多型から小さな免疫学的タグ、さらには大きな蛍光タンパク質構築物に至るまでの正確なゲノム編集を含めることができます。ただし、この手順の主なボトルネックは、生殖細胞系列で目的の編集を見つけて分離することです。このプロトコルは、 ダニオレリオ (ゼブラフィッシュ)の特定の遺伝子座で生殖細胞系列の突然変異をスクリーニングおよび分離するための堅牢な方法を概説しています。しかしながら、これらの原理は、 in vivo 精子採取が可能な任意のモデルにおいて適応可能である可能性がある。
Introduction
CRISPR(クラスター化された規則的間隔の短い回文反復)/Casシステムは、ダニオレリオ(ゼブラフィッシュ)モデルシステム1,2,3,4で遺伝子座特異的突然変異誘発と正確なゲノム編集を行うための強力なツールです。Cas-リボ核タンパク質(RNP)は、Casエンドヌクレアーゼ(一般にCas9またはCas12a)と遺伝子座特異的合成ガイドRNA(sgRNA)5の2つの主要成分で構成されています。一緒に、Cas-RNPは、2つの固有の修復メカニズムのうちの1つによって修復することができる所望の遺伝子座に二本鎖切断(DSB)を生成する。非相同末端結合(NHEJ)修復メカニズムはエラーが発生しやすく、DSBの周囲にさまざまな挿入または欠失(インデル)が生じることがよくあります。これらのインデルは、結果として生じるタンパク質配列にフレームシフト変異または早期停止を導入すると有害になる可能性があります。あるいは、相同性指向修復(HDR)機構は、損傷を修復するためにDSB部位を取り囲む相同性の領域を有するドナーテンプレートを使用する。研究者はHDRシステムを利用して、正確なゲノム編集を生成できます。具体的には、ゲノム中のDSB部位に隣接する相同性領域と同様に、所望の編集を含む二本鎖DNAドナー構築物を共注入することができる。これらの商業的に生産されたCRISPRコンポーネントの規模の経済性の向上により、複数の遺伝子座をスクリーニングし、正確なゲノム編集のためのより大規模な取り組みを設定する際の障壁が大幅に減少しました。しかし、有性生殖動物モデルでは、生殖細胞系列に安定な変異動物の同定と単離が大きなボトルネックとなっています。
ゼブラフィッシュモデルシステムは、逆遺伝学的研究での使用を強化するいくつかの重要な性質を示します。基本的な水生飼育設備で大量飼育が容易で、雌は一年中高い繁殖力を示します6。さらに、それらの外部産卵および受精により、CRISPR / Cas成分のマイクロインジェクションに適しています。Cas-RNPは通常、1細胞期のゼブラフィッシュ胚に注入され、理論的にはすべての娘細胞に受け継がれるDSB /修復を生成します。しかし、二倍体ゲノムは、両方の相同染色体を変異化するために2つのDSB /修復イベントを必要とします。さらに、Cas-RNPは1細胞段階で注入されますが、DSB /修復は発生の後期まで起こらない可能性があります。一緒に、これらの要因はF0注入された魚のモザイクの性質に貢献します。一般的な方法は、F0を注入した魚をアウトクロスし、F1の子孫をインデル/特定の編集のためにスクリーニングすることです。ただし、すべてのF0注入魚が生殖系列の突然変異を持っているわけではないため、この方法では、目的の編集を生成しない多くの非生産的な交配が発生します。F1体細胞組織ではなくF0生殖細胞系列をスクリーニングすると、所望の生殖細胞系列編集を単離する確率が高まり、このプロセスに必要な動物数が減少します。
精子は、安楽死を必要とせずにF0注射ゼブラフィッシュから簡単に収集できます。この特徴は、凍結精子ストック7の凍結保存および再誘導を可能にするが、所望のゲノム変異8,9の生殖細胞系列キャリアを迅速にスクリーニング、同定、および単離するために利用することもできる。Brocalら(2016)は、F0を注入した雄ゼブラフィッシュ10において生殖細胞系列の編集をスクリーニングするためのシーケンシングベースの方法を以前に説明した。生殖細胞系列に存在する変異対立遺伝子を特定するのに有用ですが、このアプローチは高スループットではコストがかかる可能性があり、すべてのラボで利用できるとは限りません。対照的に、現在のプロトコルは、生殖細胞系列の編集を同定するための親しみやすく費用効果の高い電気泳動ベースの戦略を提供します。具体的には、このプロトコルは、高分解能アガロースゲル電気泳動を使用して、特定の遺伝子座で生殖細胞系列変異をスクリーニングおよび分離するための堅牢な方法を概説しています。さらに、このプロトコルは、特定の編集を含むドナーコンストラクトの統合の成功を識別するための同様の戦略を記述します。いつものように、特定の編集が必要な場合は、以下に説明するプロトコルと連携してシーケンスベースの戦略を実行できます。このプロトコルはゼブラフィッシュモデルシステムに固有ですが、これらの原則は、精子の収集が日常的な手順であるすべてのモデルに適応できる必要があります。これらの戦略を組み合わせることで、標準的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および/または制限消化後にゲル上で解決できる生殖細胞系列のインデル/編集を伴うF0注射された男性の同定が可能になります。
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Protocol
この研究は、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用のためのガイドのガイドラインに沿って実施されました。プロトコルは、テキサス大学オースティン校の動物管理および使用委員会(AUP-2021-00254)によって承認されました。
1. CRISPR変異導入のためのsgRNAの設計
- 標的遺伝子座を含むエクソン配列を取得します。
- Casエンドヌクレアーゼに特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)部位を持つ合成ガイドRNA(sgRNA)を設計します。
- ドナーコンストラクトを共注入する場合は、予測される切断部位が目的の編集にできるだけ近いようにsgRNAを設計します。
注:APEは、Cas9 sgRNAサイト11を見つけるためのツールを備えたフリーソフトウェアです。あるいは、Cas9および他のCasエンドヌクレアーゼ12の異なるPAM部位を考慮するsgRNAを設計するためのオンラインインターフェースを提供するCHOPCHOPなどのツールを使用することもできます。
- ドナーコンストラクトを共注入する場合は、予測される切断部位が目的の編集にできるだけ近いようにsgRNAを設計します。
- フォワードプライマーとリバースプライマーを設計して、設計されたCRISPR/Casカット部位の周囲の領域を増幅します。PCR産物は、プロトコルの後半でゲル上の小さなインデルを分解できるように、長さが約200〜400塩基対(bp)である必要があります。
注:CHOPCHOP11 は、出力するすべてのsgRNAのプライマーを自動的に設計します。 - オプション:目的の編集でDNAドナーコンストラクトを設計します。
- 所望の変異の遺伝子座を含むエクソンのゲノム配列を取得する。
注:イントロニック配列は個人間で異なる可能性があるため、ドナー構築物にイントロニック配列を含めることは、相同性依存の修復経路を妨げる可能性があるため、避けるのが最善です。 - 特定のアミノ酸の変更が必要な場合は、それに応じて特定のコドンを変更します。
注:これらの変更を行うときは、コドン頻度に注意してください。可能であれば、使用率の高いコドンを選択してください。 - ドナー構築物のCRISPR/Cas消化を防ぐために、(i)PAMを破壊する、および/または(ii)sgRNA配列を破壊する追加の同義変異を行い、非 同義 的な変化をPAM部位に近づけることが優先されます。
- 制限部位ファインダー(APE11 にもこの機能があります)を使用して、野生型配列の予測PCR産物内の一意の制限部位(一度だけ発生するもの)を見つけます。
- ドナー構築物の統合の成功を反映する予測されたPCR産物に対して、このプロセスを繰り返します。
- 野生型配列とドナー統合配列の制限部位のリストを比較して、編集された配列 にのみ 存在する制限部位を見つけます。
- 固有の制限部位が見つからない場合は、これが達成されるまで、ドナーコンストラクト内で同義語の変更を続けます。
注:可能であれば、ドナー構築物へのsgRNA結合を破壊する同義の突然変異を作り続けます。
- 可能であれば、ドナー配列を管理可能なサイズ(50〜100 bp)にトリミングし、予測されるCRISPR/Casカット部位と編集を少なくとも20 bpの相同性で行います。
- 所望の変異の遺伝子座を含むエクソンのゲノム配列を取得する。
- 設計したsgRNAおよび/またはDNAドナーオリゴヌクレオチド、およびジェノタイピングに必要なプライマーを入手します。
注:ヌクレアーゼによるDNAドナーオリゴヌクレオチドの消化を防ぐために、DNAオリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端の最初の3つのリン酸結合をホスホロチオエートで修飾することをお勧めします。 - 1 nLの注射用混合物を1細胞期の胚に注入します。通常、標準のインジェクションミックスには次のものが含まれます。
1 μL の 25 μM 遺伝子座特異的 sgRNA
1 μL の 25 μM Cas9 エンドヌクレアーゼ
オプション:1 μLの3 μM DNAドナーコンストラクト- 0.1 M RNaseフリーKClで総容量を5 μLにします。
- F0注射された個人が性的に成熟した成人に成長するのを待ちます。残りのプロトコルは、生殖細胞系列の編集についてF0注射された男性のスクリーニングに焦点を当てています。
2.飼育タンクの設置
- F0オスとメスの間に仕切りを付けた繁殖タンクを設置することにより、交尾するためのF0オスをプライムします。
- 必要な繁殖タンクの数を最小限に抑えるには、各タンクに2人のメスの向かいに3人のオスを設置します。
- 精子採取後に効果的にスクリーニングされ、個人として収容される限り多くのF0男性を設定します。女性の遺伝子型は、この手順中に配偶子が収集されないため、重要ではありません。
- 雌の向かいに野生型の雄の繁殖水槽を1つ設置します。野生型の精子は、手順の後半で結果を解釈するためのコントロールとして機能します。
- 必要な繁殖タンクの数を最小限に抑えるには、各タンクに2人のメスの向かいに3人のオスを設置します。
- 準備した飼育タンクを一晩インキュベートします。
3.精子採取手順のための材料の準備
- 小さなガラスのボウルを満たすのに十分な麻酔溶液(魚水中の0.016%トリカイン-HCl)を準備します。
- 40 μL の 50 mM NaOH を 0.2 mL PCRチューブに分注します。採取する精子サンプルごとに1本のチューブを用意します。氷上に保管してください。
- 手順中にサンプリングされる魚ごとに個別の0.8 Lタンクを準備します。これらのタンクは、ジェノタイピングが完了するまでサンプリングされた魚を収容します。
注:これは、このプロトコルで効果的にスクリーニングできる魚の数を制限する主な要因です。ジェノタイピングが完了するまで、サンプリングされた個人を収容するための十分なスペースを確保してください。 - 1インチx1インチのスポンジ(手順中にオスのゼブラフィッシュの腹側を上にして保持するために浅い楕円形のディボットでカット)を魚の水に湿らせ、余分な液体を絞り出します。
- スポンジを低倍率で実体顕微鏡の視野に配置します(図1A)。
- 最適な表示のために斜めのオーバーヘッド照明を配置します。
4.オスの魚を麻酔し、精子を集める
- きれいな毛細管を準備します。
- チューブ容器を静かに振って、単一のキャピラリーチューブを解放します。
- キャピラリーチューブを付属の電球に入れ、脇に置きます。
- 雄魚を調製した麻酔溶液(魚水中の0.016%トリカイン-HCl)に移す。
- 麻酔のプロセスをスピードアップするためにスロット付きスプーンで溶液を静かにかき混ぜます。
- オペキュラム(えら)の動きが遅くなったら(約1〜2分)、精子の採取に進みます。
- スロット付きスプーンを使用して、魚をペーパータオルのきれいなスタックに移します。
- スロット付きスプーンを使用して魚をそっと転がし、余分な水分を取り除きます。
- きれいな折りたたんだティッシュペーパーで魚をそっと拭き取り、残っている水分を取り除きます。
- スロット付きスプーンを使用して、準備したスポンジに魚を移します(図1B)。
- 魚の腹側を上にして、手順を実行する人の利き手に頭を近づけます。
- 肛門鰭の周囲を清潔で折りたたんだティッシュペーパーでそっと拭きます。
- 精子を集めます。
- 毛細管の端を使用して、骨盤フィンを正中線から横方向にゆっくりと離して、クロアカを露出させます(図1C)。
- 毛細管の端をクロアカの近くに配置します。
- 鉗子を使用して、えらのすぐ下からクロアカで終わる魚の側面をそっと絞ります(図1C ')。
- 毛細管作用によって精子を毛細管に集める。この手順には約1 μLで十分です(図1D)。
注:一部のラボでは、精子の収集に毛細管の代わりにp10ピペットチップを使用していると報告されています。 - 精子が穏やかな圧力で放出されない場合は、魚をシステムの水に戻します。
- 麻酔からの回復を監視します。
- これは魚を傷つける可能性があるので、精子を排出するために魚を強く絞らないでください。
- 精子を再び収集しようとする前に、魚を2週間休ませてください。
- 収集後、魚を個々の住居用のシステム水の入ったきれいな隔離タンクに入れます。
- 麻酔からの回復について魚を監視します。
- 精子を再び収集しようとする前に、魚を2週間休ませてください。
- 採取した精子を入れたキャピラリーチューブを、準備したPCRチューブ(40 μLの50 mM NaOH)に入れます。
- ゴム球を絞って、収集したサンプルを排出します。
- 使用済みの毛細管は、承認されたガラス廃棄物容器に廃棄してください。
- すべての男性が絞られるまで氷上でサンプルをインキュベートします。
- 個々の男性ごとに手順4.1〜4.5を繰り返します。
- 最終的な精子ジェノタイピングの結果が推定変異を持つ対応する個体にまでさかのぼることができるように、分離タンクと精子サンプルにラベルを付けます。
- すべての個人を監視し、タンクをシステムに戻す前に、直立してタンクを探索していることを確認してください。
- プライミングに使用したメスをシステム上のそれぞれのタンクに戻します。
- 10分経っても魚が麻酔から回復しない場合は、ラボに関連する機関によって承認された安楽死手順に従ってください。
- 例:2〜4°Cの魚水を入れた氷浴で個体を急速に冷やします。
- 安楽死させた魚は、研究所に関連する機関によって承認された手順に従って、適切な動物の死骸廃棄物容器に廃棄してください。
5.精子サンプルからのDNA抽出
- ミニ遠心分離機ですべての精子サンプルを簡単にスピンダウンし、PCRチューブをサーマルサイクラーに入れます。
- サーマルサイクラーの蓋を閉めます。
- サーマルサイクラーで次の設定を実行します。
- サンプルを95°Cで40分間加熱します。
- サンプルを25°Cに冷却します。
- サーマルサイクラーからサンプルを取り出します。
- 各サンプルの清潔なピペットチップを使用して、1 μLの1 M Tris-HCl(pH 8に緩衝)を加えてpHを中和します。
- 上下にピペッティングしてよく混ぜます。
- ミニ遠心分離機でサンプルを簡単にスピンダウンします。
- ゲノムDNAサンプルは、4°Cで数日間保存することも、-20°Cで最大6か月間保存することもできます。
6.目的の遺伝子座のPCR増幅(および/または制限消化)
- 標準PCRプロトコルを使用して目的の遺伝子座を増幅します。
- 下記のPCR反応においてサーマルサイクラーを初期変性温度に予熱する。
- PCRチューブ内の精子サンプルごとに25 μLの反応混合物を調製します。
12.5 μL 2x Taq ポリメラーゼマスターミックス
1.5 μL の 10 μM フォワードプライマー
1.5 μL の 10 μM リバースプライマー
4.5 μLのヌクレアーゼフリー水
5 μL の中和精子 DNA サンプル - 上下にピペッティングしてよく混ぜます。
- ミニ遠心分離機でサンプルを簡単にスピンダウンします。
- 次の設定で予熱されたサーマルサイクラーにサンプルを置きます。
初期変性:95°Cで3分間
変性(95°Cで30秒間)、アニーリング(55°Cで30秒間)、伸長(72°Cで30秒間)の35サイクル
最終延長:72°Cで5分間
注:特定のTaqポリメラーゼおよびPCR増幅産物の予想される長さに応じて、伸長温度および/または時間を調整する必要がある場合があります。 - サーマルサイクラーからPCRサンプルを取り出します。
- オプション:少量のPCR産物に対してドナー特異的制限消化を行い、ゲル電気泳動用に少なくとも5〜10μLの未消化PCR産物を残します。
- 0.2 mL PCRチューブで30 μLの反応液を調製します。
10 μLの未精製PCR産物
15 μLのヌクレアーゼフリー水
3 μL の 10x 制限酵素バッファー
2 μLの制限酵素(BstNIは dnah10 ノックイン対立遺伝子を分析するための代表的な結果に使用されます)
注:多くの制限酵素は、典型的なPCR反応バッファーでまだ活性があります。ただし、制限ダイジェストバッファを追加すると、結果の改善に役立ちます。問題が発生した場合のトラブルシューティングについては、製造元の特定の手順を参照してください。 - 上下にピペッティングしてよく混ぜます。
- ミニ遠心分離機でサンプルを簡単にスピンダウンします。
- サンプルを次の設定のサーマルサイクラーに入れます。
- PCRアンプリコンを60°Cで1時間カットします。
注:カット温度とインキュベーション時間は、使用する特定の制限酵素に合わせて調整する必要がある場合があります。 - 製造元から指示がある場合は、必要な温度とインキュベーション時間で制限酵素を不活性化します。
注:BstNI酵素は熱失活を必要としません。
- PCRアンプリコンを60°Cで1時間カットします。
- 0.2 mL PCRチューブで30 μLの反応液を調製します。
7. ゲル電気泳動を実行して、さまざまなサイズのPCRアンプリコンを分離する
- 500 mLの0.5x TBEランニングバッファーを調製する:50 mLの10x TBEバッファー濃縮液を450 mLの脱イオン水に加えます。
- 0.5x TBEランニングバッファーで100 mLの4%アガロースゲルを調製:10 μLの10,000xゲル染色剤を含む4 gのアガロースを100 mLの0.5x TBEランニングバッファーに加えます。アガロース粉末が完全に溶解するまでマイクロ波で加熱する。
- 適切なサイズのゲルキャストフレームにゲル溶液を注ぎ、ゲルの片側にコームを挿入します。
注:より大きなゲルサイズ(推奨:15 cm x 15 cm)は、アンプリコンにゲル上で解決するためのより多くのスペースを提供するため、この手順に有利です。- 制限ダイジェスト産物を分析する場合は、結果を比較できるように、PCR産物と同じゲル上で分析するのが最善です。必要に応じてコームウェルのサイズを調整して、ゲル上のすべてのサンプルを合わせます。
- 固まるまでゲルを室温で放置します。櫛を慎重に取り外します。キャスティングフレームからゲルを慎重に取り除きます。
- 適切なサイズのゲルキャストフレームにゲル溶液を注ぎ、ゲルの片側にコームを挿入します。
- ゲル電気泳動装置をセットアップします。
- ウェルが負極に最も近いように電気泳動リグにゲルを配置します。ウェルが完全に水没するまで、0.5x TBEランニングバッファーを電気泳動リグに注ぎます。
- ゲルをロードします。
- 5 μLのDNAラダーを最初のウェルにロードします(PCRアンプリコンと同様のサイズのDNAフラグメントを含むDNAラダーを選択します)。
- 各サンプル(野生型対照サンプルを含む)に新しいピペットチップを使用して、5〜10 μLのPCR産物を残りのウェルにロードします。
- オプション:制限ダイジェスト製品を分析する場合は、これらのサンプルもゲルにロードします。
注:PCRと制限ダイジェスト産物の間に等量のDNAをロードするのが最善です。例えば、30 μLの制限消化反応混合物に、10 μLのPCR産物を添加した。したがって、15 μLの消化産物のDNA濃度は、5 μLの未精製PCR産物と同等でした。
- ゲルを実行します。
- 電極をゲル電気泳動リグに接続し、アンプリコンを適切に分離するために、150 Vを少なくとも1時間印加します。
- ゲルを画像化してDNAバンドを表示します。
注:強く変異誘発されたCRISPR標的遺伝子座は、挿入/欠失対立遺伝子と野生型アンプリコンの組み合わせを表す複数のバンドサイズとして実行されます。- 1時間経ってもゲルバンドが分解されない場合は、バンドがゲル上で十分に分離されるまで、150Vをゲルに15分間隔で印加します。
- オプション:SNP、エピトープタグ、蛍光タグなどの正確な編集の挿入をスクリーニングする場合は、目的の編集に特異的なPCR法で精子DNAをスクリーニングします。例えば、ドナー特異的な制限部位を同定する場合、精子サンプルのPCR産物と比較して、制限消化産物に追加のバンドが存在するであろう。
8.生殖細胞系列の安定対立遺伝子の分離
- 精子圧搾手順から2週間休んだ後、精子ゲノムDNAに目的の編集が含まれているF0個体をアウトクロスします。
注:個々の精原細胞クローンからの精子生成は、ゼブラフィッシュでは周期的である可能性があります。したがって、所望の対立遺伝子は、アウトクロスの時点で精子を産生していない可能性がある。このため、最初のスクリーニングによって関与する対立遺伝子を単離するために、追加の交差を複数回実行しなければならない場合があります。 - F1アウトクロスフィッシュが性的に成熟したら、精子ゲノムDNAのスクリーニング中に実行されるのと同じPCRおよびゲル電気泳動プロトコルを使用して、標準的なジェノタイピング法(フィンクリップDNAなど)に進みます。
- サンガーはPCR産物を配列決定し、同じ所望の編集を有するF1個体を同定する。
- オプション: 目的の編集によって制限サイトが導入または中断される場合は、適切な制限ダイジェストプロトコルを使用して画面を表示します。
- 同じ所望の編集を有するインクロスF1ヘテロ接合体。
- 予想される表現型および/またはゲノム編集についてF2子孫をスクリーニングします。
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Representative Results
このプロトコルに記載されている実験的アプローチは、F0注入された男性精子の収集に由来する数千のゲノムの分析に焦点を当てることにより、ゲノム編集または推定有害対立遺伝子のより迅速な同定を可能にする。 図2 は、このプロトコルを使用して得られた結果を解釈する方法を示しています。
p2ry12遺伝子座に変異を発生させるために、1細胞期のゼブラフィッシュ胚にCas9エンドヌクレアーゼとp2ry12特異的sgRNAを注射した(図2B、灰色のハイライト)。F0を注入した魚を性成熟までシステムに入れ、6匹のオスから精子を採取した。高熱および塩基性条件(HotSHOT DNA抽出)を使用して精子サンプルからDNAを抽出し、p2ry12遺伝子座のPCR増幅の前に中和しました。PCR産物は、高パーセンテージ(4%)アガロースゲル上で高電圧(150 V)で1.5時間分離されました。この例では、野生型アンプリコンは、長さ約250塩基対の単一の明るいバンドとして実行されました(図2C;WT)。対照的に、インデルを含むF0注入オスアンプリコンは、複数のバンドとしてゲル上を走行しました(図2C;レーン#1-2、#5-8)。あるいは、変異したF0を注入した雄アンプリコンは、ゲル移動度が変化した単一バンドとして実行することができます(p2ry12の例には示されていませんが、dnah10 F0-雄#2のPCR産物で明らかです。図2E)。p2ry12サンプルゲルでは、サンプル#3とサンプル#4に野生型バンドと比較してインデルが含まれているかどうかはあまり明確ではなかったため、これらの個人は最良の創設者候補ではない可能性があります。より特徴的なアンプリコン変化を有するF0雄からの対立遺伝子の単離は、4%アガロースゲルで容易にスコアリングされるため、安定した生殖細胞系列キャリアの増殖に最適です。例えば、F0-男性#6精子サンプルは、対立遺伝子の1つに大きな欠失を含むように見えた(図2C;レーン6;ゲル移動度が増加した明バンド)。この大きな欠失対立遺伝子がF1世代で選択された場合、4%アガロースゲル上のWT対立遺伝子と容易に区別できるであろう。あるいは、異なる対立遺伝子のコレクションが必要な場合、F0-男性#7は、そのPCR産物がさまざまな可動性のいくつかの個別の対立遺伝子を含むように見えるため、効果的な創設者候補になる可能性があります。創始者の雄が選択されると、注射に使用される元の野生型株に個体を交配することによって、所望の対立遺伝子を単離することができる。
dnah10遺伝子に特異的なノックイン変異を発生させるために、1細胞期のゼブラフィッシュ胚にCas9エンドヌクレアーゼ、dnah10特異的sgRNA(図2D、灰色のハイライト)、および目的の編集を含むDNAドナーオリゴヌクレオチド(図2D;赤色)およびドナー特異的BstNI制限部位(図2D、括弧)。この設計により、PCR後の制限ダイジェストとのドナー統合を簡単に識別できます。さらに、sgRNA認識部位内の塩基対を変化させることによって(図2D;灰色のハイライト)、この設計はドナー配列のCas9消化を防止する。F0を注入した魚が性成熟に達すると、精子を採取し、ホットショット法を使用してDNAを抽出しました。これらのサンプルから、DNA10遺伝子座をPCRを用いて増幅し、生成物を高パーセンテージ(4%)アガロースゲル上で高電圧(150V)で1時間分離した。この例では、野生型アンプリコンは長さ約400塩基対の単一の明るいバンドとして走っていました(図2E、トップパネル:WT)。対照的に、インデルを含むF0注入オスアンプリコンは、複数のバンド(図2E、トップパネル:レーン#1、#4、および#5)またはゲル移動度が低下した単一のバンド(図2E、トップパネル:レーン#2)として実行されました。精子サンプルのいずれかにドナー組み込み対立遺伝子が含まれているかどうかを判断するために、PCR産物をBstNI制限酵素で1時間消化し、生成物を4%アガロースゲル上で高電圧(150 V)で1時間実行しました。未消化PCR産物(図2D、上のパネル)と消化された産物(図2D、下のパネル)を比較すると、ドナー構築物が統合されている可能性のあるサンプルが明らかになります。この例では、F0を注入したオス#1は、PCR産物には存在しない追加のバンドを消化産物に持っていました(図2D;下のパネル:レーン#1、丸で囲んだ部分)。したがって、この男性は、望ましいノックインで突然変異株を確立するための最良の創設者候補を表しています。
推定F0キャリアオスが交配したら、対立遺伝子はF1子孫で配列検証されなければなりません。F1ヘテロ接合魚由来のアンプリコンを直接サンガー配列決定した後、Poly Peak Parser 13などのヘテロ接合対立遺伝子解析方法を実行するか、MiSeq14やHi-Tom15シーケンシングなどのさまざまな次世代シーケンシングベースの方法を使用することが推奨されます。これは、正確な編集または有害なインデル変異が実際に生殖細胞系列になり、ゲル電気泳動分析の単なるアーティファクトではないことを保証するために必要かつ補完的なアプローチです。実際、F0キャリアからの精子DNAを配列決定するための次世代シーケンシングアプローチの使用は、このプロトコルに記載されているゲル電気泳動分析の代わりに容易に使用することができる。しかし、簡単に採点できるアガロースゲルジェノタイピング法を持つことは、ゼブラフィッシュ研究者のグローバルコミュニティにとってより経済的で平等主義的なアプローチです。
図1:精子搾り取り手順のセットアップ 。 (A)スポンジは、頭上の照明で低倍率で実体顕微鏡の下に配置されます。(B)湿らせた1インチ×1のスポンジを楕円形のくぼみ(破線)でカットし、麻酔をかけたオスの魚の腹側を上にして手順中に保持するために使用されます。(C)麻酔をかけたオスの腹側の解剖学的構造で、肛門鰭(af、ピンク)、骨盤鰭(pf、青)、およびクロアカ(矢印)が描かれており、手順中に精子が排出されます。(C')フィルター鉗子は、麻酔をかけた雄魚をえらからクロアカまで優しく絞るために使用され、排出された精子は毛細管現象によってガラスピペットに引き込まれます(白い矢印)。(D)下流のDNA抽出と分析のために十分な排出精子(不透明な液体;黒い括弧)を含む毛細管。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ワークフローと代表的な結果 。 (A)プロトコルの一般的なワークフロー。(B) p2ry12 sgRNAサイト(灰色のハイライト)とCas9特異的PAMサイト(下線部)の代表的なデザイン。(C)PCR増幅後の150V.野生型(WT)対照およびF0-p2ry12 CRISPR注入雄精子サンプル(1-8)で1.5時間後の4%ゲル電気泳動の代表的な結果。 (D) dnah10 sgRNAサイト(灰色のハイライト)の代表的なデザインで、標的コドン(太字)の近くにCas9特異的PAMサイト(下線付き)。目的のコドン編集(赤太字)およびBstNI制限部位(切断部位を示すアポストロフィ付きの括弧)を有するDNAドナー配列。(E)150Vで1時間後の4%ゲル電気泳動の代表的な 結果:野生型(WT)およびF0 dnah10 CRISPR注入雄性精子サンプルのPCR産物(1〜5)。 下:上記サンプルのBstNI制限ダイジェスト産物。サンプル1は、消化後の追加バンド(赤丸)に基づくドナー構築物の正常な統合を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、F0雄精子ゲノムに焦点を当てた分析により、CRISPR-Cas技術を使用して推定ゲノム編集または標的変異を迅速に特徴付ける方法を説明しています。このプロトコルは、安楽死なしで精子をサンプリングするために容易に利用できる他の動物モデルに適しているはずです。この方法は、目的の編集のスクリーニングのスループットを向上させ、まれなHDRを介したノックインイベントを特定するのに特に役立ちます。このアプローチはまた、推定F0キャリアからの1つの精子サンプル中の潜在的に数千のゲノムの迅速なスクリーニングを容易にすることにより、安定した生殖系列編集を見つけるために使用される実験動物の数を減らすのに役立ち、これは、推定F0キャリアの交配に由来する数百の胚のスクリーニングを必要とする可能性のあるより伝統的なアプローチとは対照的です。
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ7、10、14、16、17、18における精子採取のための確立されたプロトコルに基づいており、高分解能ゲル電気泳動を使用して生殖細胞系列の編集を同定するための再現可能な技術が含まれています。このアプローチは、標準的なCRISPR/Casワークフローに簡単に組み込むことができ、ターゲットゲノム編集のスクリーニングと分離のスループットを向上させることができます。さらに、このプロトコルは、さまざまなトレーニングと経験を持つ担当者が配置されたラボや、教育ラボに適しています。しかし、我々の精子採取方法は凍結保存には十分ではなく、これは以前の文献10,17に専門的に記載されている。
このプロトコルは、高分解能アガロースゲル電気泳動を使用して、目的のインデルおよび正確なゲノム変異の推定オスキャリアを特定します。しかしながら、精子ゲノムDNAは、蛍光フラグメント解析またはバーコードシーケンシング14、高分解能メルト解析18、または標準的なゲル電気泳動アプローチを用いた蛍光タグまたはエピトープの単純なアンプリコン検出を含む、無数の他のアプローチに適している。サンガーベースまたは次世代シーケンシングなどのアプローチを使用したすべての対立遺伝子の下流検証は、推定対立遺伝子の実験作業を開始する前に行う必要があります。実際、次世代シーケンシングアプローチ14 を使用して胚の突然変異をスクリーニングするための既存の方法は、このプロトコルに記載されているアガロースゲルの分析の必要性を回避する可能性があります。ただし、ゲルスコア可能なジェノタイピング法を持つことは、各変異株を扱う分離および実験段階ですべてのラボが安価な次世代シーケンシング法に簡単にアクセスできるわけではないことを考えると、より費用効果が高く平等主義的なアプローチです。
要約すると、このプロトコルは、CRISPR/Cas編集された男性から精子ゲノムを再現性よくスクリーニングするための段階的な指示を提供し、目的の編集をスクリーニングするために必要な胚の交配とPCRスクリーニングを減らします。この方法を適用すると、編集された目的の対立遺伝子を正常に特定するために作成および分析する必要のある魚の数が減り、安定した系統を生成するための人員の時間とコストも削減されます。
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Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
ワシントン大学医学部のアンナ・ヒンデスがホットショット法を使用して高品質の精子ゲノムDNAを取得するための最初の努力に感謝します。この研究は、国立衛生研究所の国立関節炎および筋骨格および皮膚疾患研究所から助成金を受けました(R01AR072009からR.S.G.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
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| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
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| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
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| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
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