Summary
CRISPR-Cas-teknologier har revolutionerat området genomredigering. Att hitta och isolera den önskade könsredigeringen är dock fortfarande en stor flaskhals. Därför beskriver detta protokoll en robust metod för att snabbt screena F0 CRISPR-injicerade zebrafiskspermier för könsredigeringar med hjälp av standard PCR, restriktionssmälta och gelelektroforestekniker.
Abstract
Tillkomsten av riktade CRISPR-Cas-nukleasteknologier har revolutionerat förmågan att utföra exakt genomredigering i både etablerade och framväxande modellsystem. CRISPR-Cas genomredigeringssystem använder ett syntetiskt guide-RNA (sgRNA) för att rikta ett CRISPR-associerat (Cas) endonukleas till specifika genomiska DNA-loci, där Cas-endonukleas genererar en dubbelsträngbrytning. Reparation av dubbelsträngade brott genom inneboende felbenägna mekanismer leder till infogningar och / eller borttagningar, vilket stör platsen. Alternativt kan införandet av dubbelsträngade DNA-donatorer eller enkelsträngade DNA-oligonukleotider i denna process framkalla införandet av exakta genomredigeringar som sträcker sig från enkla nukleotidpolymorfismer till små immunologiska taggar eller till och med stora fluorescerande proteinkonstruktioner. En stor flaskhals i denna procedur kan dock vara att hitta och isolera önskad redigering i könslinjen. Detta protokoll beskriver en robust metod för screening och isolering av germlinemutationer vid specifika loci i Danio rerio (zebrafisk); Dessa principer kan dock vara anpassningsbara i alla modeller där spermainsamling in vivo är möjlig.
Introduction
CRISPR-systemet (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas är ett kraftfullt verktyg för att utföra loci-specifik mutagenes och exakt genomredigering i Danio rerio (zebrafisk) modellsystem 1,2,3,4. Cas-ribonukleoproteinet (RNP) består av två huvudkomponenter: ett Cas-endonukleas (vanligtvis Cas9 eller Cas12a) och ett lokusspecifikt syntetiskt guide-RNA (sgRNA)5. Tillsammans genererar Cas-RNP ett dubbelsträngat brott (DSB) i önskad plats som kan repareras med en av två inneboende reparationsmekanismer. Den icke-homologa ändfogningsmekanismen (NHEJ) är felbenägen och resulterar ofta i en mängd olika infogningar eller borttagningar (indels) runt DSB. Dessa indels kan vara skadliga om de introducerar en frameshift-mutation eller för tidigt stopp i den resulterande proteinsekvensen. Alternativt använder den homologiriktade reparationsmekanismen (HDR) en givarmall med homologiregioner som omger DSB-webbplatsen för att reparera skadan. Forskare kan dra nytta av HDR-systemet för att generera exakta genomiska redigeringar. Specifikt kan de saminjicera en dubbelsträngad DNA-donatorkonstruktion som innehåller de önskade redigeringarna såväl som homologiregioner som flankerar DSB-platsen i genomet. Den ökade stordriftsekonomin för dessa kommersiellt producerade CRISPR-komponenter har kraftigt minskat hindren för screening av flera loci och för att inrätta storskaliga insatser för exakt genomredigering. Men i sexuellt reproducerande djurmodeller är en stor flaskhals identifieringen och isoleringen av germline-stabila mutanta djur.
Zebrafiskmodellsystemet uppvisar flera viktiga egenskaper som förbättrar dess användning i omvända genetiska studier. De är lätta att föda upp i stort antal med grundläggande vattenlevande husutrustning, och honor uppvisar hög fecundity året runt6. Dessutom gör deras yttre äggläggning och befruktning dem mottagliga för mikroinjektion av CRISPR / Cas-komponenter. Cas-RNP injiceras vanligen i zebrafiskembryon i encellsstadium för att generera DSB/reparation som i teorin ärvs av alla dotterceller. Diploida genom kräver dock två DSB/reparationshändelser för att mutagenisera båda homologa kromosomerna. Dessutom, även om Cas-RNP injiceras i encellsstadiet, kan DSB/reparation inte ske förrän senare i utvecklingen. Tillsammans bidrar dessa faktorer till mosaikens natur hos F0-injicerad fisk. En vanlig praxis är att korsa F0-injicerad fisk och screena F1-avkomman för indels/specifika redigeringar. Men eftersom inte alla F0-injicerade fiskar har könsmutationer, resulterar denna praxis i många improduktiva korsningar som inte genererar önskad redigering. Screening av F0-könslinjen snarare än F1-somatisk vävnad ökar sannolikheten för att isolera den önskade könscellredigeringen och minskar antalet djur som krävs i denna process.
Spermier kan enkelt samlas in från F0-injicerade zebrafiskar utan behov av eutanasi. Denna funktion möjliggör kryokonservering och rederivation av frysta spermiestammar7 men kan också utnyttjas för att snabbt screena, identifiera och isolera könscellsbärarna av önskade genomiska mutationer 8,9. Brocal et al. (2016) beskrev tidigare en sekvenseringsbaserad metod för screening av könslinjeredigeringar i F0-injicerade manliga zebrafiskar10. Även om det är användbart för att identifiera de muterade allelerna som finns i könslinjen, kan detta tillvägagångssätt bli kostsamt vid hög genomströmning och kanske inte är tillgängligt för alla laboratorier. Däremot erbjuder det nuvarande protokollet en lättillgänglig och kostnadseffektiv elektroforesbaserad strategi för att identifiera könsredigeringar. Specifikt beskriver detta protokoll en robust metod för screening och isolering av germlinemutationer vid specifika loci med hjälp av högupplöst agarosgelelektrofores. Dessutom beskriver detta protokoll en liknande strategi för att identifiera framgångsrik integration av en givarkonstruktion som innehåller specifika redigeringar. Som alltid, om specifika redigeringar önskas, kan sekvenseringsbaserade strategier utföras tillsammans med protokollet som beskrivs nedan. Även om detta protokoll är specifikt för zebrafiskmodellsystemet, bör dessa principer kunna anpassas till alla modeller där insamling av spermier är ett rutinförfarande. Tillsammans kommer dessa strategier att möjliggöra identifiering av F0-injicerade hanar med germline indels/redigeringar som kan lösas på en gel efter standard polymeraskedjereaktion (PCR) och/eller restriktionssmältning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i enlighet med riktlinjerna i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals från National Institutes of Health. Protokollet godkändes av University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee (AUP-2021-00254).
1. Designa sgRNA för CRISPR-mutagenes
- Hämta exonsekvensen som innehåller målplatsen.
- Designa ett syntetiskt guide-RNA (sgRNA) med ett protospacer intilliggande motiv (PAM) -ställe som är specifikt för Cas-endonukleaset.
- Om du injicerar en donatorkonstruktion, designa sgRNA för att ha ett förutspått snittställe så nära de önskade redigeringarna som möjligt.
OBS: APE är en fri programvara med ett verktyg för att hitta Cas9 sgRNA-platser11. Alternativt kan verktyg som CHOPCHOP användas, vilket erbjuder ett onlinegränssnitt för design av sgRNA som tar hänsyn till de olika PAM-platserna för Cas9 och andra Cas-endonukleaser12.
- Om du injicerar en donatorkonstruktion, designa sgRNA för att ha ett förutspått snittställe så nära de önskade redigeringarna som möjligt.
- Designa framåt- och bakåtprimers för att förstärka området kring den designade CRISPR/Cas-skärplatsen. PCR-produkten bör vara cirka 200-400 baspar (bp) lång för att kunna lösa små indels på en gel senare i protokollet.
OBS: CHOPCHOP11 designar automatiskt primers för varje sgRNA som den matar ut. - Valfritt: Designa en DNA-donatorkonstruktion med önskade redigeringar.
- Erhåll den genomiska sekvensen av exonen innehållande loci för den önskade mutationen.
OBS: Intronic-sekvenser kan variera mellan individer, så det är bäst att undvika att inkludera introniska sekvenser i givarkonstruktionen eftersom detta kan störa den homologiberoende reparationsvägen. - Om en specifik aminosyraförändring önskas, ändra det specifika kodonet i enlighet därmed.
OBS: När du gör dessa ändringar, var medveten om kodonfrekvensen. Om möjligt, välj ett kodon med hög användning. - För att förhindra CRISPR / Cas-nedbrytning av givarkonstruktionen, gör ytterligare synonyma mutationer som (i) stör PAM och / eller (ii) stör sgRNA-sekvensen, med högre preferens på att göra icke-synonyma förändringar närmare PAM-platsen.
- Använd en restriktionsplatssökare (APE11 har också den här funktionen) för att hitta unika restriktionsplatser (de som bara inträffar en gång) i den förutsagda PCR-produkten i vildtypsekvensen.
- Upprepa denna process för den förutsagda PCR-produkten som återspeglar den framgångsrika integrationen av givarkonstruktionen.
- Jämför listan över restriktionsplatser mellan vildtyps- och givarintegrerade sekvenser för att hitta en restriktionsplats som endast finns i den redigerade sekvensen.
- Om ingen unik restriktionsplats hittas, fortsätt att göra synonyma förändringar inom givarkonstruktionen tills detta uppnås.
OBS: Om möjligt, fortsätt att göra synonyma mutationer som skulle störa sgRNA-bindningen till givarkonstruktionen.
- Trimma givarsekvensen till en hanterbar storlek (50-100 bp) med minst 20 bp homologi som omger den förutsagda CRISPR / Cas-klippplatsen och redigerar, om möjligt.
- Erhåll den genomiska sekvensen av exonen innehållande loci för den önskade mutationen.
- Skaffa de designade sgRNA- och / eller DNA-donatoroligonukleotiderna, liksom eventuella primers som krävs för genotypning.
OBS: För att förhindra uppslutning av DNA-donatoroligonukleotiderna genom nukleaser rekommenderas att modifiera de tre första fosfatbindningarna på 5'- och 3'-ändarna av DNA-oligonukleotiderna med fosforotiat. - Injicera 1 nL av injektionsblandningen i embryon i encellsstadiet. Vanligtvis innehåller en standardinjektionsblandning följande:
1 μL 25 μM lokusspecifikt sgRNA
1 μl 25 μM Cas9-endonukleas
Valfritt: 1 μL 3 μM DNA-donatorkonstruktion- Öka den totala volymen till 5 μL med 0,1 M RNase-fri KCl.
- Låt de F0-injicerade individerna utvecklas till sexuellt mogna vuxna. Det återstående protokollet fokuserar på screening av F0-injicerade män för könsredigeringar.
2. Ställa in avelstankarna
- Prime F0 hanar för parning genom att sätta upp avelstankar med avdelare mellan F0 hanar och honor.
- För att minimera antalet avelstankar som krävs, sätt upp tre män över två honor i varje tank.
- Ställ in så många F0-män som effektivt kan screenas och inhysas som individer efter spermasamling. Genotypen hos kvinnorna är inte viktig, eftersom deras gameter inte kommer att samlas in under denna procedur.
- Sätt upp en avelstank med vildtyphanar mittemot honor. Vildtypspermier kommer att fungera som en kontroll för tolkningen av resultaten senare i proceduren.
- För att minimera antalet avelstankar som krävs, sätt upp tre män över två honor i varje tank.
- Inkubera de förberedda avelstankarna över natten.
3. Förbereda materialen för spermauppsamlingsproceduren
- Förbered tillräckligt med bedövningslösning (0,016% tricain-HCl i fiskvatten) för att fylla en liten glasskål.
- Fördela 40 μL 50 mM NaOH i 0,2 ml PCR-rör. Förbered ett rör för varje spermaprov som kommer att samlas in. Förvara på is.
- Förbered individuella 0,8 L tankar för varje fisk som kommer att provtas under proceduren. Dessa tankar kommer att hysa den provtagna fisken tills genotypningen är klar.
OBS: Detta är den primära faktorn som begränsar antalet fiskar som effektivt kan screenas i detta protokoll. Se till att det finns tillräckligt med utrymme för att hysa individerna i urvalet tills genotypningen är klar. - Fukta en 1-tums x 1-tums svamp (skär med en grund, ovalformad divot för att hålla en manlig zebrafiskventral sida uppåt under proceduren) i fiskvatten och pressa ut överflödig vätska.
- Placera svampen i synfältet för ett stereomikroskop vid låg förstoring (figur 1A).
- Placera sned takbelysning för optimal visning.
4. Bedöva hanfisken och samla spermierna
- Förbered ett rent kapillärrör.
- Skaka försiktigt rörbehållaren för att frigöra ett enda kapillärrör.
- Placera kapillärröret i den medföljande glödlampan och lägg den åt sidan.
- Överför en manlig fisk till den beredda bedövande lösningen (0,016% tricain-HCl i fiskvatten).
- Rör försiktigt lösningen med en slitssked för att påskynda anestesiprocessen.
- När operculum (gill) rörelsen saktar ner (ca 1-2 min), fortsätt med spermauppsamlingen.
- Använd den hålslev för att överföra fisken till en ren bunt pappershanddukar.
- Använd den slitsade skeden för att försiktigt rulla fisken för att ta bort överflödigt vatten.
- Torka försiktigt fisken med rent, vikt silkespapper för att ta bort eventuellt kvarvarande vatten.
- Använd den hålslev för att överföra fisken till den förberedda svampen (figur 1B).
- Placera fiskens ventrala sida uppåt med huvudet närmast den dominerande handen hos den person som utför proceduren.
- Torka försiktigt området runt analfenorna med rent, vikt silkespapper.
- Samla spermierna.
- Använd änden av kapillärröret, flytta försiktigt bäckenfenorna i sidled bort från mittlinjen för att exponera cloaca (figur 1C).
- Placera änden av kapillärröret nära cloaca.
- Pressa försiktigt fiskens sidor med hjälp av pincetten, med början strax under gälarna och slutar vid cloaca (figur 1C').
- Samla spermier i kapillärröret genom kapillärverkan. Ungefär 1 μl är tillräckligt för denna procedur (figur 1D).
OBS: Vissa laboratorier rapporterar att de använder p10-pipettspetsar istället för kapillärrör för spermauppsamling. - Om spermier inte släpps med försiktigt tryck, återför fisken till systemvattnet.
- Övervaka för återhämtning från anestesi.
- Pressa inte fisken hårt för att utvisa spermier, eftersom det kan skada fisken.
- Vila fisken i 2 veckor innan du försöker samla spermier igen.
- Efter insamling, placera fisken i en ren isoleringstank med systemvatten för individuellt hus.
- Övervaka fisken för återhämtning från anestesi.
- Vila fisken i 2 veckor innan du försöker samla spermier igen.
- Placera kapillärröret med den uppsamlade sperman i det beredda PCR-röret (med 40 μL 50 mM NaOH).
- Pressa gummilampan för att driva ut det uppsamlade provet.
- Kassera det använda kapillärröret i en godkänd glasavfallsbehållare.
- Inkubera proverna på is tills alla hanar har pressats.
- Upprepa steg 4.1-4.5 för varje enskild hane.
- Märk isoleringstankarna och spermaproverna så att de slutliga spermiegenotypresultaten kan spåras tillbaka till motsvarande individ med förmodade mutationer.
- Övervaka alla individer och se till att de är upprätt och utforskar sina tankar innan du sätter tillbaka tankarna på systemet.
- Sätt tillbaka honorna som används för grundning i sina respektive tankar på systemet.
- Om någon fisk inte återhämtar sig från anestesin efter 10 minuter, följ den avlivningsprocedur som godkänts av den institution som är associerad med laboratoriet.
- Exempel: Kyl individen snabbt i ett isbad med fiskvatten som är 2-4 °C.
- Kassera den avlivade fisken i en lämplig behållare för djurkadaveravfall enligt det förfarande som godkänts av den institution som är associerad med laboratoriet.
5. Extrahera DNA från spermaproverna
- Snurra kort ner alla spermaprover i en minicentrifug och placera PCR-rör i en termisk cykler.
- Stäng locket på den termiska cyklern.
- Kör följande inställningar i termocyklern:
- Värm proverna i 40 min vid 95 °C.
- Kyl proverna till 25 °C.
- Ta bort proverna från termocyklern.
- Neutralisera pH-värdet med en ren pipettspets för varje prov genom att tillsätta 10 μL 1 M Tris-HCl (buffrat till pH 8).
- Blanda väl genom att pipettera upp och ner.
- Snurra kortfattat ner proverna i en minicentrifug.
- Genomiska DNA-prover kan lagras i flera dagar vid 4 °C eller placeras vid −20 °C i upp till 6 månader.
6. PCR-amplifiering (och/eller restriktionssammanfattning) av önskad plats
- Förstärk önskad plats med ett standard PCR-protokoll.
- Förvärm värmecykeln till den ursprungliga denatureringstemperaturen i PCR-reaktionen nedan.
- Bered en 25 μL reaktionsblandning för varje spermaprov i PCR-rör:
12,5 μL 2x Taq Polymerase Master Mix
1,5 μL 10 μM framåtriktad primer
1,5 μL 10 μM omvänd primer
4,5 μl nukleasfritt vatten
5 μL neutraliserat spermie-DNA-prov - Blanda väl genom att pipettera upp och ner.
- Snurra kortfattat ner proverna i en minicentrifug.
- Placera proverna i den förvärmda termiska cykeln med följande inställningar:
Ursprunglig denaturering: 95 °C i 3 min
35 cykler med denaturering (95 °C för 30 s), glödgning (55 °C för 30 s) och förlängning (72 °C för 30 s)
Slutlig förlängning: 72 °C i 5 min
OBS: Det kan vara nödvändigt att justera förlängningstemperaturen och/eller tiden beroende på det specifika Taq-polymeraset och den förväntade längden på PCR-amplifieringsprodukten. - Ta bort PCR-proverna från termocyklern.
- Valfritt: Utför den givarspecifika restriktionssmältningen på en liten volym av PCR-produkten och lämna minst 5-10 μL osmält PCR-produkt för gelelektrofores.
- Bered en 30 μL-reaktion i 0,2 ml PCR-rör:
10 μl orenad PCR-produkt
15 μl nukleasfritt vatten
3 μL 10x restriktionsenzymbuffert
2 μL restriktionsenzym (BstNI används i de representativa resultaten för analys av dnah10-knock-in-allelen)
OBS: Många restriktionsenzymer är fortfarande aktiva i en typisk PCR-reaktionsbuffert; Tillägget av restriktionsdigestbuffert kan dock bidra till att förbättra resultaten. Se tillverkarens specifika instruktioner för felsökning om några problem uppstår. - Blanda väl genom att pipettera upp och ner.
- Snurra kortfattat ner proverna i en minicentrifug.
- Placera proverna i en termisk cykler med följande inställningar:
- Skär PCR-amplikonen vid 60 °C i 1 timme.
OBS: Skärtemperaturen och inkubationstiden kan behöva justeras för det specifika restriktionsenzym som används. - Inaktivera restriktionsenzymet med önskad temperatur och inkubationstid, om tillverkaren anger detta.
OBS: BstNI-enzymet kräver inte värmeinaktivering.
- Skär PCR-amplikonen vid 60 °C i 1 timme.
- Bered en 30 μL-reaktion i 0,2 ml PCR-rör:
7. Utför gelelektrofores för att separera PCR-amplicons i varierande storlekar
- Förbered 500 ml 0,5x TBE löpande buffert: tillsätt 50 ml 10x TBE-buffertkoncentrat till 450 ml avjoniserat vatten.
- Bered 100 ml 4% agarosgel i 0,5x TBE löpande buffert: tillsätt 4 g agaros med 10 μL 10 000x gelfläck till 100 ml 0,5x TBE löpande buffert. Mikrovågsugn tills agarospulvret är helt upplöst.
- Häll gellösningen i en gelgjutningsram av lämplig storlek och sätt in kammen på ena sidan av gelén.
OBS: En större gelstorlek (rekommenderas: 15 cm x 15 cm) är fördelaktig för denna procedur, eftersom det ger amplicons mer utrymme att lösa på gelén.- Om en restriktionsprodukt ska analyseras är det bäst att köra den på samma gel som PCR-produkten så att resultaten kan jämföras. Justera kambrunnens storlek efter behov för att passa alla prover på gelén.
- Låt gelen stå i rumstemperatur tills den stelnat. Ta försiktigt bort kammen. Ta försiktigt bort gelén från gjutramen.
- Häll gellösningen i en gelgjutningsram av lämplig storlek och sätt in kammen på ena sidan av gelén.
- Ställ in gelelektroforesriggen.
- Placera gelen i elektroforesriggen så att brunnarna är närmast den negativa elektroden. Häll 0,5x TBE löpande buffert i elektroforesriggen tills brunnarna är helt nedsänkta.
- Ladda gelén.
- Ladda 5 μL DNA-stege i den första brunnen (välj en DNA-stege som innehåller DNA-fragment som är lika stora som PCR-ampliconen).
- Använd en ny pipettspets för varje prov (inklusive vildtypskontrollprovet) och fyll på 5–10 μl av PCR-produkten i de återstående brunnarna.
- Valfritt: Om en restriktionsprodukt ska analyseras, ladda även dessa prover på gelén.
OBS: Det är bäst att ladda lika stora mängder DNA mellan PCR och restriktionssmältprodukten. Till exempel tillsattes i 30 μL restriktionssmältreaktionsblandningen 10 μL PCR-produkt. Därför var DNA-koncentrationen av 15 μL spjälk jämförbar med 5 μL orenad PCR-produkt.
- Kör gelén.
- Anslut elektroderna till gelelektroforesriggen och applicera 150 V i minst 1 timme för att säkerställa adekvat separation av amplikonerna.
- Avbilda gelén för att se DNA-banden.
OBS: Starkt mutageniserade CRISPR-riktade loci kommer att köras som flera bandstorlekar som representerar en kombination av insättnings-/deletionsalleler med vildtypsamplikonerna.- Om gelbanden inte är upplösta efter 1 timme, applicera 150 V på gelen i 15 minuters intervall tills banden är tillräckligt separerade på gelén.
- Valfritt: Om screening för införande av en exakt redigering, till exempel en SNP, epitoptagg eller fluorescerande tagg, screena spermie-DNA med PCR-metoder som är specifika för önskad redigering. Till exempel, när man identifierar ett donatorspecifikt restriktionsställe, kommer ett ytterligare band att finnas i restriktionsmatsmältningsprodukten jämfört med PCR-produkten i spermaprovet.
8. Isolera könsstabila alleler
- Efter 2 veckors vila från spermieklämningsproceduren, korsa F0-individerna vars spermgenomiska DNA innehöll de önskade redigeringarna.
OBS: Spermiegenerering från enskilda spermatogoniakloner kan vara cyklisk i zebrafisk; Således kan den önskade allelen inte producera spermier vid tidpunkten för utkorsningen. Av denna anledning kan ytterligare korsningar behöva utföras mer än en gång för att isolera allelen som impliceras av den första screeningen. - När den utkorsade F1-fisken är könsmogen, fortsätt med vanliga genotypningsmetoder (till exempel fin-clip-DNA) med samma PCR- och gelelektroforesprotokoll som utfördes under screeningen av spermiernas genomiska DNA.
- Sanger sekvenserar PCR-produkterna för att identifiera F1-individerna med samma önskade redigering.
- Valfritt: Om önskad redigering introducerar eller stör en begränsningsplats skärmar du med ett lämpligt protokoll för restriktionssammanfattning.
- In-cross F1 heterozygoter med samma önskade redigering.
- Screena F2-avkomman för den förväntade fenotypen och/eller genomiska redigeringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experimentella tillvägagångssätten som beskrivs i detta protokoll möjliggör snabbare identifiering av genomredigeringar eller förmodade skadliga alleler genom att fokusera på analys av tusentals genom som härrör från insamling av F0-injicerade manliga spermier. Figur 2 belyser hur man tolkar de resultat som erhållits med hjälp av detta protokoll.
För att generera mutationer i p2ry12-lokus injicerades zebrafiskembryon i encellsstadium med Cas9-endonukleas och ett p2ry12-specifikt sgRNA (figur 2B, grå höjdpunkt). F0-injicerad fisk sattes i systemet tills könsmognad, och spermier samlades in från sex enskilda män. DNA extraherades från spermaproverna med hög värme och grundläggande förhållanden (HotSHOT DNA-extraktion) och neutraliserades före PCR-amplifieringen av p2ry12-lokusen. PCR-produkterna separerades på en högprocentig (4%) agarosgel i 1,5 timmar vid högspänning (150 V). I detta exempel sprang den vilda amplikonen som ett enda ljust band med cirka 250 baspar i längd (figur 2C; WT). Däremot sprang de F0-injicerade manliga amplicons innehållande indels på gelén som flera band (figur 2C; banor # 1-2, # 5-8). Alternativt kan de muterade F0-injicerade manliga amplicons köras som ett enda band med förändrad gelrörlighet (visas inte i p2ry12-exemplet, men tydligt i PCR-produkten av dnah10 F0-hane #2; Figur 2E). Det var mindre tydligt på p2ry12-exempelgelen om prov #3 och prov #4 innehöll indels i jämförelse med vildtypsbandet, så dessa individer kanske inte är de bästa grundarkandidaterna. Isoleringen av alleler från F0-hanar med mer distinkta amplikonförändringar är bäst för att föröka stabila könscellsbärare eftersom de lätt får poäng på 4% agarosgel. Till exempel verkade F0-hane #6 spermaprovet innehålla en stor deletion i en av allelerna (Figur 2C; lane 6; ljust band med ökad gelrörlighet). Om denna stora deletionsallel valdes för i F1-generationen skulle den lätt kunna skiljas från WT-allelen på en 4% agarosgel. Alternativt, om en samling av olika alleler önskas, kan F0-hane #7 vara en effektiv grundarkandidat eftersom dess PCR-produkt tycktes innehålla flera diskreta alleler av olika mobiliteter. När en grundande hane har valts kan den önskade allelen isoleras genom att korsa individen tillbaka till den ursprungliga vildtypstammen som används för injektioner.
För att generera en specifik knock-in-mutation i dnah10-genen injicerades zebrafiskembryon i encellsstadium med Cas9-endonukleas, ett dnah10-specifikt sgRNA (figur 2D; grå höjdpunkt) och en DNA-donatoroligonukleotid innehållande önskad redigering (figur 2D; röd) och ett donatorspecifikt BstNI-restriktionsställe (figur 2D , parenteser). Denna design möjliggör enkel identifiering av givarintegration med en restriktionssammandrag efter PCR. Dessutom, genom att ändra baspar inom sgRNA-igenkänningsstället (figur 2D; grå markering), förhindrar denna design Cas9-digestionen av givarsekvensen. När den F0-injicerade fisken nådde könsmognad samlades spermier och DNA extraherades med hjälp av hot shot-metoden. Från dessa prover amplifierades dnah10-lokus med PCR, och produkterna separerades på en högprocentig (4%) agarosgel i 1 h vid en högspänning (150 V). I det här exemplet sprang den vilda amplikonen som ett enda ljust band med cirka 400 baspar i längd (figur 2E; övre panel: WT). Däremot sprang de F0-injicerade manliga amplikonerna innehållande indels som flera band (figur 2E; övre panelen: banor # 1, # 4 och # 5) eller som ett enda band med minskad gelrörlighet (figur 2E; övre panelen: körfält # 2). För att avgöra om något av spermaproverna innehöll donatorintegrerade alleler spjälkades PCR-produkterna med BstNI-restriktionsenzymet i 1 timme och produkten kördes på en 4% agarosgel i 1 timme vid högspänning (150 V). Jämförelse av den osmälta PCR-produkten (figur 2D; övre panelen) med den smälta produkten (figur 2D; bottenpaneler) avslöjar prover med sannolik integration av givarkonstruktionen. I det här exemplet hade den F0-injicerade hanen #1 ett ytterligare band i den smälta produkten som inte fanns i PCR-produkten (figur 2D; nedre panelen: körfält #1, inringad). Därför representerar denna hane den bästa grundarkandidaten för att etablera en mutantlinje med önskad knock-in.
När den förmodade F0-bärarhanen är utkorsad måste allelen sekvensverifieras i F1-avkomman. Det föreslås att direkt Sanger sekvenserar amplikonerna härledda från den heterozygota F1-fisken följt av att utföra heterozygota allelanalysmetoder såsom Poly Peak Parser 13 eller använda en mängd olika nästa generations sekvenseringsbaserade metoder såsom MiSeq14 eller Hi-Tom15-sekvensering. Detta är ett nödvändigt och kompletterande tillvägagångssätt för att säkerställa att den exakta redigeringen eller skadliga indelmutationen faktiskt går i könslinjen och inte bara är en artefakt av gelelektroforesanalysen. Faktum är att användningen av nästa generations sekvenseringsmetoder för att sekvensera spermie-DNA från F0-bärare lätt kan användas i stället för gelelektroforesanalysen som beskrivs i detta protokoll. Att ha en lätt scorable agarosgel genotypningsmetod är dock ett mer ekonomiskt och jämlikt tillvägagångssätt för det globala samhället av zebrafiskforskare.
Figur 1: Inställning för spermieklämningsproceduren . (A) Svampen placeras under ett stereomikroskop vid låg förstoring med takbelysning. (B) Den fuktade 1:e x 1 i svampen, skuren med en oval divot (streckad linje), används för att hålla den bedövade hanfiskens ventrala sida uppåt under proceduren. (C) Anatomi på den ventrala sidan av den bedövade hanfisken som visar analfenorna (af, rosa), bäckenfenorna (pf, blå) och cloaca (pil), där spermier kommer att utvisas under proceduren. (C') Filterpincett används för att försiktigt pressa den bedövade manliga fisken från gallen till cloaca, medan den utvisade spermien dras in i en glaspipett genom kapillärverkan (vit pil). d) Ett kapillärrör som innehåller tillräckligt med utvisade spermier (ogenomskinlig vätska, svart fäste) för DNA-extraktion och analys nedströms. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Arbetsflöde och representativa resultat . (A) Protokollets allmänna arbetsflöde. (B) Representativ design av p2ry12 sgRNA-stället (grå markering) med ett Cas9-specifikt PAM-ställe (understruket). (C) Representativa resultat av 4% gelelektrofores efter 1,5 timmar vid 150 V. Wild-type (WT) kontroll och F0-p2ry12 CRISPR-injicerade manliga spermaprover (1-8) efter PCR-amplifiering. (D) Representativ utformning av sgRNA-stället dnah10 (grå markering) med ett Cas9-specifikt PAM-ställe (understruket) nära målkodonet (fetstil). DNA-donatorsekvens med önskad kodonredigering (röd fetstil) och BstNI-restriktionsställe (parenteser med apostrof som markerar skärplatsen). (E) Representativa resultat av 4% gelelektrofores efter 1 h vid 150 V. Överst: PCR-produkt av vildtyp (WT) och F0 dnah10 CRISPR-injicerade manliga spermaprover (1-5). Nederst: BstNI-restriktionsprodukt av ovanstående prover. Prov 1 visar den framgångsrika integrationen av givarkonstruktionen baserat på det extra bandet efter matsmältningen (röd cirkel). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att snabbt karakterisera förmodade genomredigeringar eller riktade mutationer med hjälp av CRISPR-Cas-teknik genom fokuserad analys på F0 manliga spermiegenom. Detta protokoll bör vara mottagligt för andra djurmodeller där spermier är lätt tillgängliga för provtagning utan avlivning. Den här metoden ökar genomströmningen för screening av önskade redigeringar och är särskilt användbar för att identifiera sällsynta HDR-medierade dominoningshändelser. Detta tillvägagångssätt tjänar också till att minska antalet försöksdjur som används för att hitta en stabil könsredigering genom att underlätta snabb screening av potentiellt tusentals genom i ett spermaprov från en förmodad F0-bärare, vilket står i kontrast till mer traditionella tillvägagångssätt som kan kräva screening av hundratals embryon som härrör från korsningar av förmodade F0-bärare.
Detta protokoll bygger på etablerade protokoll för spermainsamling i zebrafisk 7,10,14,16,17,18 genom att inkludera en reproducerbar teknik för att identifiera könsredigeringar med högupplöst gelelektrofores. Detta tillvägagångssätt kan enkelt införlivas i alla vanliga CRISPR / Cas-arbetsflöden för att öka genomströmningen för screening och isolering av målgenomredigeringar. Dessutom är detta protokoll lämpligt för laboratorier som är bemannade med personal med en rad utbildning och erfarenhet, samt undervisningslaboratorier. Vår metod för spermainsamling är dock inte tillräcklig för kryokonservering, vilket har beskrivits sakkunnigt i tidigare publikationer10,17.
Detta protokoll använder en högupplöst agarosgelelektrofores för att identifiera förmodade manliga bärare av önskade indel och exakta genomiska mutationer. Spermiegenomiskt DNA är emellertid mottagligt för en myriad av andra metoder, inklusive fluorescerande fragmentanalys eller streckkodad sekvensering14, högupplöst smältanalys18 eller enkel amplikondetektering av fluorescerande taggar eller epitoper med hjälp av standardgelelektroforesmetoder. Valideringen nedströms av alla alleler med hjälp av metoder som Sanger-baserad eller nästa generations sekvensering måste göras innan experimentellt arbete påbörjas på förmodade alleler. Befintliga metoder för screening för mutationer i embryon med hjälp av nästa generations sekvenseringsmetod14 skulle kunna kringgå behovet av analys av agarosgeler, som beskrivs i detta protokoll. Att ha en gel-scorable genotypningsmetod är dock ett mer kostnadseffektivt och jämlikt tillvägagångssätt att överväga med tanke på att inte alla laboratorier har enkel tillgång till billiga nästa generations sekvenseringsmetoder under isolerings- och experimentfaserna för att arbeta med varje mutantstam.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll steg-för-steg-anvisningar för reproducerbar screening av spermiegenom från CRISPR / Cas-redigerade män så att färre korsningar och mindre PCR-screening av embryon behövs för att screena för önskade redigeringar. Tillämpningen av denna metod kommer att minska antalet fiskar som behöver skapas och analyseras för att framgångsrikt identifiera de redigerade allelerna av intresse, vilket också minskar tid och kostnad för personal för att generera stabila linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Anna Hindes vid Washington University School of Medicine för hennes första ansträngningar för att erhålla spermiegenomiskt DNA av god kvalitet med hjälp av hot shot-metoden. Detta arbete finansierades av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award (R01AR072009 till RSG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
