Summary
CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.
Abstract
De komst van gerichte CRISPR-Cas-nucleasetechnologieën heeft een revolutie teweeggebracht in het vermogen om nauwkeurige genoombewerking uit te voeren in zowel gevestigde als opkomende modelsystemen. CRISPR-Cas genoombewerkingssystemen gebruiken een synthetisch gids-RNA (sgRNA) om een CRISPR-geassocieerde (Cas) endonuclease te richten op specifieke genomische DNA-loci, waar de Cas-endonuclease een dubbelstrengsbreuk genereert. Het herstel van dubbelstrengsbreuken door intrinsieke foutgevoelige mechanismen leidt tot inserties en/of deleties, waardoor de locus wordt verstoord. Als alternatief kan de opname van dubbelstrengs DNA-donoren of enkelstrengs DNA-oligonucleotiden in dit proces de opname van precieze genoombewerkingen uitlokken, variërend van enkelwandige nucleotidepolymorfismen tot kleine immunologische tags of zelfs grote fluorescerende eiwitconstructen. Een groot knelpunt in deze procedure kan echter het vinden en isoleren van de gewenste bewerking in de kiembaan zijn. Dit protocol schetst een robuuste methode voor het screenen en isoleren van kiembaanmutaties op specifieke loci in Danio rerio (zebravis); Deze principes kunnen echter worden aangepast in elk model waar in vivo spermaverzameling mogelijk is.
Introduction
Het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas-systeem is een krachtig hulpmiddel om loci-specifieke mutagenese en nauwkeurige genoombewerking uit te voeren in het Danio rerio (zebravis) modelsysteem 1,2,3,4. Het Cas-ribonucleoproteïne (RNP) bestaat uit twee hoofdcomponenten: een Cas-endonuclease (gewoonlijk Cas9 of Cas12a) en een locusspecifiek synthetisch gids-RNA (sgRNA)5. Samen genereert de Cas-RNP een dubbelstrengsbreuk (DSB) in de gewenste locus die kan worden gerepareerd door een van de twee intrinsieke reparatiemechanismen. Het niet-homologe end joining (NHEJ) reparatiemechanisme is foutgevoelig en resulteert vaak in een verscheidenheid aan inserties of deleties (indels) rond de DSB. Deze indels kunnen schadelijk zijn als ze een frameshiftmutatie of voortijdige stop in de resulterende eiwitsequentie introduceren. Als alternatief gebruikt het homologie-gerichte reparatiemechanisme (HDR) een donorsjabloon met homologiegebieden rond de DSB-site om de schade te herstellen. Onderzoekers kunnen profiteren van het HDR-systeem om nauwkeurige genomische bewerkingen te genereren. In het bijzonder kunnen ze een dubbelstrengs DNA-donorconstruct co-injecteren dat de gewenste bewerkingen bevat, evenals homologiegebieden die de DSB-site in het genoom flankeren. De toegenomen schaalvoordelen voor deze commercieel geproduceerde CRISPR-componenten hebben de barrières voor het screenen van meerdere loci en voor het opzetten van grootschalige inspanningen voor nauwkeurige genoombewerking aanzienlijk verminderd. In seksueel reproducerende diermodellen is een belangrijk knelpunt echter de identificatie en isolatie van kiembaanstabiele mutante dieren.
Het zebravismodelsysteem vertoont verschillende sleutelkwaliteiten die het gebruik ervan in omgekeerde genetische studies verbeteren. Ze zijn gemakkelijk in grote aantallen groot te brengen met elementaire aquatische huisvestingsapparatuur en vrouwtjes vertonen het hele jaar door een hoge vruchtbaarheid6. Bovendien maken hun externe eileg en bevruchting ze vatbaar voor de micro-injectie van CRISPR / Cas-componenten. De Cas-RNP wordt gewoonlijk geïnjecteerd in eencellige zebravisembryo's om DSB's / reparatie te genereren die in theorie door alle dochtercellen worden geërfd. Dipeloïde genomen vereisen echter twee DSB/reparatiegebeurtenissen om beide homologe chromosomen te mutageneren. Bovendien, hoewel Cas-RNP wordt geïnjecteerd in het eencellige stadium, kan de DSB / reparatie pas op latere punten in de ontwikkeling plaatsvinden. Samen dragen deze factoren bij aan het mozaïekkarakter van F0-geïnjecteerde vissen. Een veel voorkomende praktijk is om F0-geïnjecteerde vissen te oversteken en het F1-nageslacht te screenen op indels / specifieke bewerkingen. Omdat echter niet alle F0-geïnjecteerde vissen kiembaanmutaties bezitten, resulteert deze praktijk in veel onproductieve kruisingen die niet de gewenste bewerking genereren. Het screenen van de F0-kiembaan in plaats van F1-somatisch weefsel verhoogt de kans op het isoleren van de gewenste kiembaanbewerking en vermindert het aantal dieren dat nodig is in dit proces.
Sperma kan gemakkelijk worden verzameld van F0-geïnjecteerde zebravissen zonder dat euthanasie nodig is. Deze functie maakt cryopreservatie en rederivatie van ingevroren spermavoorraden7 mogelijk, maar kan ook worden gebruikt om de kiembaandragers van gewenste genomische mutaties 8,9 snel te screenen, identificeren en isoleren. Brocal et al. (2016) beschreven eerder een op sequencing gebaseerde methode voor het screenen van kiembaanbewerkingen in F0-geïnjecteerde mannelijke zebravissen10. Hoewel nuttig voor het identificeren van de gemuteerde allelen in de kiembaan, kan deze aanpak kostbaar worden bij hoge doorvoer en is deze mogelijk niet voor alle laboratoria toegankelijk. Het huidige protocol biedt daarentegen een laagdrempelige en kosteneffectieve op elektroforese gebaseerde strategie voor het identificeren van kiembaanbewerkingen. Concreet schetst dit protocol een robuuste methode voor het screenen en isoleren van kiembaanmutaties bij specifieke loci met behulp van agarosegel-elektroforese met hoge resolutie. Daarnaast beschrijft dit protocol een vergelijkbare strategie voor het identificeren van de succesvolle integratie van een donorconstruct met specifieke bewerkingen. Zoals altijd, als specifieke bewerkingen gewenst zijn, kunnen op sequencing gebaseerde strategieën worden uitgevoerd in combinatie met het hieronder beschreven protocol. Hoewel dit protocol specifiek is voor het zebravismodelsysteem, moeten deze principes kunnen worden aangepast aan elk model waarin het verzamelen van sperma een routineprocedure is. Samen zullen deze strategieën de identificatie mogelijk maken van F0-geïnjecteerde mannetjes met kiembaan-indels / bewerkingen die kunnen worden opgelost op een gel na standaard polymerasekettingreactie (PCR) en / of restrictievertering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de National Institutes of Health. Het protocol is goedgekeurd door de University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee (AUP-2021-00254).
1. Het sgRNA ontwerpen voor CRISPR-mutagenese
- Verkrijg de exonsequentie met de beoogde loci.
- Ontwerp een synthetisch gids-RNA (sgRNA) met een protospacer adjacent motif (PAM) site die specifiek is voor de Cas endonuclease.
- Als u een donorconstruct co-injecteert, ontwerpt u het sgRNA om een voorspelde snijplaats te hebben die zo dicht mogelijk bij de gewenste bewerkingen ligt.
OPMERKING: APE is een gratis software met een tool om Cas9 sgRNA-sites11 te vinden. Als alternatief kunnen tools zoals CHOPCHOP worden gebruikt, die een online interface biedt voor het ontwerpen van sgRNA's die rekening houdt met de verschillende PAM-sites van Cas9 en andere Cas-endonucleasen12.
- Als u een donorconstruct co-injecteert, ontwerpt u het sgRNA om een voorspelde snijplaats te hebben die zo dicht mogelijk bij de gewenste bewerkingen ligt.
- Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers om het gebied rond de ontworpen CRISPR / Cas-snijlocatie te versterken. Het PCR-product moet ongeveer 200-400 baseparen (bp) lang zijn om kleine indels op een gel later in het protocol te kunnen oplossen.
OPMERKING: CHOPCHOP11 ontwerpt automatisch primers voor elke sgRNA die het produceert. - Optioneel: Ontwerp een DNA-donorconstruct met de gewenste bewerking(en).
- Verkrijg de genomische sequentie van het exon dat de loci van de gewenste mutatie bevat.
OPMERKING: Intronische sequenties kunnen variëren tussen individuen, dus het is het beste om de opname van intronische sequenties in het donorconstruct te vermijden, omdat dit de homologie-afhankelijke reparatieroute zou kunnen verstoren. - Als een specifieke aminozuurverandering gewenst is, wijzig dan het specifieke codon dienovereenkomstig.
OPMERKING: Houd bij het aanbrengen van deze wijzigingen rekening met de codonfrequentie. Kies indien mogelijk een codon met een hoog gebruik. - Om CRISPR/Cas-vertering van het donorconstruct te voorkomen, moet u extra synonieme mutaties maken die (i) de PAM verstoren en/of (ii) de sgRNA-sequentie verstoren, waarbij een hogere voorkeur wordt gegeven aan het maken van niet-synonieme veranderingen dichter bij de PAM-site.
- Gebruik een beperkingssitezoeker (APE11 heeft deze functie ook) om unieke beperkingssites te vinden (sites die slechts één keer voorkomen) in het voorspelde PCR-product van de wild-type reeks.
- Herhaal dit proces voor het voorspelde PCR-product dat de succesvolle integratie van de donorconstructie weerspiegelt.
- Vergelijk de lijst met beperkingslocaties tussen de wild-type en donor-geïntegreerde sequenties om een beperkingssite te vinden die alleen aanwezig is in de bewerkte volgorde.
- Als er geen unieke beperkingslocatie wordt gevonden, ga dan door met het aanbrengen van synonieme wijzigingen binnen de donorconstructie totdat dit is bereikt.
OPMERKING: Ga indien mogelijk door met het maken van synonieme mutaties die de sgRNA-binding aan het donorconstruct zouden verstoren.
- Trim de donorsequentie tot een beheersbare grootte (50-100 bp) met ten minste 20 bp homologie rond de voorspelde CRISPR / Cas-snijplaats en bewerkingen, indien mogelijk.
- Verkrijg de genomische sequentie van het exon dat de loci van de gewenste mutatie bevat.
- Verkrijg de ontworpen sgRNA en/of DNA-donor oligonucleotiden, evenals eventuele primers die nodig zijn voor genotypering.
OPMERKING: Om de vertering van de DNA-donor oligonucleotiden door nucleasen te voorkomen, wordt aanbevolen om de eerste drie fosfaatbindingen aan de 5' en 3' uiteinden van de DNA-oligonucleotiden te wijzigen met fosforothioaat. - Injecteer 1 ml van het injectiemengsel in embryo's in één celstadium. Doorgaans bevat een standaard injectiemix het volgende:
1 μL van 25 μM locus-specifiek sgRNA
1 μL van 25 μM Cas9 endonuclease
Optioneel: 1 μL van 3 μM DNA-donorconstruct- Breng het totale volume op 5 μL met 0,1 M RNase-vrije KCl.
- Laat de F0-geïnjecteerde individuen zich ontwikkelen tot geslachtsrijpe volwassenen. Het resterende protocol richt zich op het screenen van de F0-geïnjecteerde mannetjes op kiembaanbewerkingen.
2. Opzetten van de kweektanks
- Prime F0-mannetjes voor paring door foktanks op te zetten met scheidingswanden tussen de F0-mannetjes en -vrouwtjes.
- Om het aantal benodigde foktanks te minimaliseren, zet u drie mannetjes tegenover twee vrouwtjes in elke tank.
- Stel zoveel mogelijk F0-mannetjes in als effectief kan worden gescreend en gehuisvest als individuen na het verzamelen van sperma. Het genotype van de vrouwtjes is niet belangrijk omdat hun gameten tijdens deze procedure niet worden verzameld.
- Zet één broedbak op met wild-type mannetjes tegenover vrouwtjes. Wild-type sperma zal dienen als een controle voor de interpretatie van de resultaten later in de procedure.
- Om het aantal benodigde foktanks te minimaliseren, zet u drie mannetjes tegenover twee vrouwtjes in elke tank.
- Incubeer de voorbereide kweektanks een nacht.
3. Voorbereiding van de materialen voor de spermaverzamelingsprocedure
- Bereid voldoende verdovingsoplossing (0,016% tricaïne-HCl in viswater) om een kleine glazen kom te vullen.
- Doseer 40 μL 50 mM NaOH in 0,2 ml PCR-buizen. Bereid één buis voor voor elk spermamonster dat zal worden verzameld. Bewaren op ijs.
- Bereid individuele tanks van 0,8 l voor elke vis voor die tijdens de procedure zal worden bemonsterd. Deze tanks zullen de bemonsterde vissen huisvesten totdat de genotypering is voltooid.
OPMERKING: Dit is de belangrijkste factor die het aantal vissen beperkt dat effectief kan worden gescreend in dit protocol. Zorg voor voldoende ruimte voor het huisvesten van de bemonsterde personen totdat de genotypering is voltooid. - Bevochtig een spons van 1 inch x 1 inch (gesneden met een ondiepe, ovaalvormige divot om een mannelijke zebravis tijdens de procedure met de zijkant omhoog te houden) in viswater en knijp overtollige vloeistof uit.
- Plaats de spons in het gezichtsveld van een stereomicroscoop bij lage vergroting (figuur 1A).
- Plaats schuine bovenverlichting voor optimaal zicht.
4. De mannelijke vis verdoven en het sperma verzamelen
- Maak een schone capillaire buis.
- Schud de buiscontainer voorzichtig om een enkele capillaire buis vrij te maken.
- Plaats de capillaire buis in de meegeleverde bol en zet deze opzij.
- Breng een mannelijke vis over in de bereide verdovingsoplossing (0,016% tricaïne-HCl in viswater).
- Roer de oplossing voorzichtig met een lepel om het proces van anesthesie te versnellen.
- Zodra de beweging van het operculum (kieuw) vertraagt (ongeveer 1-2 minuten), gaat u verder met het verzamelen van sperma.
- Gebruik de lepel om de vis over te brengen op een schone stapel keukenpapier.
- Gebruik de lepel om de vis voorzichtig te rollen om overtollig water te verwijderen.
- Dep de vis voorzichtig met schoon, gevouwen tissuepapier om eventueel achtergebleven water te verwijderen.
- Gebruik de lepel om de vis over te brengen naar de voorbereide spons (figuur 1B).
- Plaats de ventrale kant van de vis naar boven met zijn kop het dichtst bij de dominante hand van de persoon die de procedure uitvoert.
- Dep het gebied rond de anale vinnen voorzichtig af met schoon, gevouwen vloeipapier.
- Verzamel het sperma.
- Gebruik het uiteinde van de capillaire buis en beweeg de bekkenvinnen voorzichtig zijdelings weg van de middellijn om de cloaca bloot te leggen (figuur 1C).
- Plaats het uiteinde van de capillaire buis in de buurt van de cloaca.
- Knijp met de tang zachtjes in de zijkanten van de vis, beginnend net onder de kieuwen en eindigend bij de cloaca (figuur 1C').
- Verzamel sperma in de capillaire buis door capillaire werking. Ongeveer 1 μL is voldoende voor deze procedure (figuur 1D).
OPMERKING: Sommige laboratoria melden dat ze p10-pipetpunten gebruiken in plaats van capillaire buizen voor het verzamelen van sperma. - Als sperma niet met zachte druk wordt vrijgegeven, breng de vis dan terug naar het systeemwater.
- Monitor voor herstel van de anesthesie.
- Knijp niet hard in de vis om sperma te verdrijven, omdat dit de vis kan verwonden.
- Laat de vis 2 weken rusten voordat je opnieuw sperma probeert te verzamelen.
- Plaats de vis na het verzamelen in een schone isolatietank met systeemwater voor individuele huisvesting.
- Controleer de vis op herstel van de anesthesie.
- Laat de vis 2 weken rusten voordat je opnieuw sperma probeert te verzamelen.
- Plaats de capillaire buis met het verzamelde sperma in de voorbereide PCR-buis (met 40 μL van 50 mM NaOH).
- Knijp in de rubberen bol om het verzamelde monster te verwijderen.
- Gooi de gebruikte capillaire buis weg in een goedgekeurde glasafvalcontainer.
- Incubeer de monsters op ijs totdat alle mannetjes zijn geperst.
- Herhaal stap 4.1-4.5 voor elke individuele man.
- Label de isolatietanks en spermamonsters zodanig dat de uiteindelijke spermagenotyperingsresultaten kunnen worden herleid tot het overeenkomstige individu met vermeende mutaties.
- Bewaak alle personen en zorg ervoor dat ze rechtop staan en hun tanks verkennen voordat u de tanks weer op het systeem plaatst.
- Plaats de vrouwtjes die worden gebruikt voor het primen terug in hun respectieve tanks op het systeem.
- Als een vis na 10 minuten niet herstelt van de anesthesie, volg dan de euthanasieprocedure die is goedgekeurd door de instelling die bij het laboratorium is aangesloten.
- Voorbeeld: Koel het individu snel af in een ijsbad met viswater van 2-4 °C.
- Gooi de geëuthanaseerde vis weg in een geschikte container voor kadaversafval volgens de procedure die is goedgekeurd door de instelling die bij het laboratorium is aangesloten.
5. DNA uit de spermamonsters halen
- Draai kort alle spermamonsters in een minicentrifuge en plaats PCR-buizen in een thermische cycler.
- Sluit het deksel van de thermische cycler.
- Voer de volgende instellingen uit in de thermische cycler:
- Verwarm de monsters gedurende 40 minuten bij 95 °C.
- Koel de monsters af tot 25 °C.
- Verwijder de monsters uit de thermische cycler.
- Met een schone pipetpunt voor elk monster neutraliseert u de pH door 10 μL 1 M Tris-HCl (gebufferd tot pH 8) toe te voegen.
- Meng goed door op en neer te pipetteren.
- Draai de monsters kort af in een minicentrifuge.
- Genomische DNA-monsters kunnen enkele dagen worden bewaard bij 4 °C of worden geplaatst bij −20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
6. PCR-versterking (en/of restrictie-digest) van de gewenste locus
- Versterk de gewenste locus met behulp van een standaard PCR-protocol.
- Verwarm de thermische cycler voor op de initiële denaturatietemperatuur in de onderstaande PCR-reactie.
- Bereid een reactiemengsel van 25 μL voor elk spermamonster in PCR-buizen:
12,5 μL 2x Taq Polymerase Master Mix
1,5 μL van 10 μM voorwaartse primer
1,5 μL van 10 μM omgekeerde primer
4,5 μL nucleasevrij water
5 μL geneutraliseerd sperma-DNA-monster - Meng goed door op en neer te pipetteren.
- Draai de monsters kort af in een minicentrifuge.
- Plaats de monsters in de voorverwarmde thermische cycler met de volgende instellingen:
Initiële denaturatie: 95 °C gedurende 3 min
35 cycli van denaturatie (95 °C gedurende 30 s), gloeien (55 °C gedurende 30 s) en extensie (72 °C gedurende 30 s)
Laatste verlenging: 72 °C gedurende 5 min
OPMERKING: Het kan nodig zijn om de extensietemperatuur en/of -tijd aan te passen, afhankelijk van het specifieke Taq-polymerase en de verwachte lengte van het PCR-versterkingsproduct. - Verwijder de PCR-monsters uit de thermische cycler.
- Optioneel: Voer de donorspecifieke restrictie-digest uit op een klein volume van het PCR-product, waarbij ten minste 5-10 μL onverteerd PCR-product overblijft voor gel-elektroforese.
- Bereid een reactie van 30 μl voor in PCR-buisjes van 0,2 ml:
10 μL ongezuiverd PCR-product
15 μL nucleasevrij water
3 μL 10x restrictie-enzymbuffer
2 μL restrictie-enzym (BstNI wordt gebruikt in de representatieve resultaten voor het analyseren van het dnah10 knock-in allel)
OPMERKING: Veel restrictie-enzymen zijn nog steeds actief in een typische PCR-reactiebuffer; De toevoeging van een restrictiebuffer kan echter helpen de resultaten te verbeteren. Raadpleeg de instructies van de specifieke fabrikant voor het oplossen van problemen als er problemen optreden. - Meng goed door op en neer te pipetteren.
- Draai de monsters kort af in een minicentrifuge.
- Plaats de monsters in een thermische cycler met de volgende instellingen:
- Snijd het PCR-amplicon gedurende 1 uur op 60 °C.
OPMERKING: De snijtemperatuur en incubatietijd moeten mogelijk worden aangepast voor het specifieke restrictie-enzym dat wordt gebruikt. - Inactiveer het restrictie-enzym met de vereiste temperatuur en incubatietijd, indien aangegeven door de fabrikant.
OPMERKING: Het BstNI-enzym vereist geen warmte-inactivatie.
- Snijd het PCR-amplicon gedurende 1 uur op 60 °C.
- Bereid een reactie van 30 μl voor in PCR-buisjes van 0,2 ml:
7. Het uitvoeren van gel-elektroforese om PCR-amplicons van verschillende groottes te scheiden
- Bereid 500 ml 0,5x TBE-loopbuffer voor: voeg 50 ml 10x TBE-bufferconcentraat toe aan 450 ml gedeïoniseerd water.
- Bereid 100 ml 4% agarosegel in 0,5x TBE-loopbuffer: voeg 4 g agarose met 10 μL 10.000x gelvlek toe aan 100 ml 0,5x TBE-loopbuffer. Magnetron tot het agarosepoeder volledig is opgelost.
- Giet de geloplossing in een gelgietframe van de juiste grootte en plaats de kam aan één kant van de gel.
OPMERKING: Een grotere gelmaat (aanbevolen: 15 cm x 15 cm) is voordelig voor deze procedure, omdat het de amplicons meer ruimte biedt om op de gel op te lossen.- Als een restrictieverteringsproduct moet worden geanalyseerd, is het het beste om het op dezelfde gel als het PCR-product te laten lopen, zodat de resultaten kunnen worden vergeleken. Pas de grootte van de kam zo nodig goed aan om alle monsters op de gel te passen.
- Laat de gel op kamertemperatuur staan tot hij gestold is. Verwijder voorzichtig de kam. Verwijder de gel voorzichtig van het gietframe.
- Giet de geloplossing in een gelgietframe van de juiste grootte en plaats de kam aan één kant van de gel.
- Stel de gel-elektroforese-rig in.
- Plaats de gel in de elektroforese-rig zodanig dat de putjes zich het dichtst bij de negatieve elektrode bevinden. Giet 0,5x TBE lopende buffer in de elektroforese-installatie totdat de putten volledig zijn ondergedompeld.
- Laad de gel.
- Laad 5 μL DNA-ladder in de eerste put (kies een DNA-ladder die DNA-fragmenten bevat die qua grootte vergelijkbaar zijn met het PCR-amplicon).
- Gebruik een nieuwe pipetpunt voor elk monster (inclusief het wild-type controlemonster) en laad 5-10 μL van het PCR-product in de resterende putjes.
- Optioneel: Als een restrictieverteringsproduct moet worden geanalyseerd, laadt u deze monsters ook op de gel.
OPMERKING: Het is het beste om gelijke hoeveelheden DNA te laden tussen de PCR en het restrictieverteringsproduct. In het restrictieverteringsreactiemengsel van 30 μL werd bijvoorbeeld 10 μL PCR-product toegevoegd. Daarom was de DNA-concentratie van de 15 μL verteringsproduct vergelijkbaar met de 5 μL van het ongezuiverde PCR-product.
- Laat de gel lopen.
- Sluit de elektroden aan op de gel-elektroforese-installatie en breng 150 V aan gedurende ten minste 1 uur om een adequate scheiding van de amplicons te garanderen.
- Maak een afbeelding van de gel om de DNA-banden te bekijken.
OPMERKING: Sterk gemutagiseerde CRISPR-gerichte loci worden uitgevoerd als meerdere bandgroottes die een combinatie van insertie- / deletie-allelen vertegenwoordigen met de wild-type amplicons.- Als de gelbanden na 1 uur niet zijn verdwenen, breng dan 150 V aan op de gel gedurende intervallen van 15 minuten totdat de banden voldoende gescheiden zijn op de gel.
- Optioneel: Als u screent op het invoegen van een nauwkeurige bewerking zoals een SNP, epitooptag of fluorescerende tag, screent u het sperma-DNA met PCR-methoden die specifiek zijn voor de gewenste bewerking. Bij het identificeren van een donorspecifieke beperkingslocatie zal bijvoorbeeld een extra band aanwezig zijn in het restrictieverteringsproduct in vergelijking met het PCR-product van het spermamonster.
8. Isoleren van kiembaan stabiele allelen
- Na 2 weken rust van de spermaknijpprocedure, oversteek je de F0-individuen van wie het genomische DNA van het sperma de gewenste bewerkingen bevatte.
OPMERKING: Het genereren van sperma van individuele spermatogonia-klonen kan cyclisch zijn bij zebravissen; Het is dus mogelijk dat het gewenste allel geen sperma produceert op het moment van de outcross. Om deze reden moet mogelijk meer dan eens extra kruising worden uitgevoerd om het allel te isoleren dat bij de eerste screening is betrokken. - Zodra de F1-gekruiste vissen geslachtsrijp zijn, gaat u verder met standaard genotyperingsmethoden (bijvoorbeeld vin-clip DNA) met behulp van hetzelfde PCR- en gel-elektroforeseprotocol dat wordt uitgevoerd tijdens de screening van het genomische DNA van het sperma.
- Sanger sequentieert de PCR-producten om de F1-individuen te identificeren met dezelfde gewenste bewerking.
- Optioneel: Als de gewenste bewerking een beperkingssite introduceert of verstoort, wordt een scherm weergegeven met een geschikt protocol voor de beperkingssamenvatting.
- In-cross F1 heterozygoten met dezelfde gewenste edit.
- Screen het F2-nageslacht op het verwachte fenotype en/of genomische bewerkingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experimentele benaderingen die in dit protocol worden beschreven, maken de snellere identificatie van genoombewerkingen of vermeende schadelijke allelen mogelijk door zich te concentreren op de analyse van duizenden genomen die zijn afgeleid van de verzameling F0-geïnjecteerd mannelijk sperma. Figuur 2 laat zien hoe de resultaten die met dit protocol zijn verkregen, moeten worden geïnterpreteerd.
Om mutaties in de p2ry12-locus te genereren, werden eencellige zebravisembryo's geïnjecteerd met Cas9-endonuclease en een p2ry12-specifiek sgRNA (figuur 2B, grijze markering). F0-geïnjecteerde vissen werden in het systeem geplaatst totdat ze geslachtsrijp waren en sperma werd verzameld van zes individuele mannetjes. DNA werd geëxtraheerd uit de spermamonsters met behulp van hoge hitte en basisomstandigheden (HotSHOT DNA-extractie) en geneutraliseerd voorafgaand aan de PCR-amplificatie van de p2ry12-locus. De PCR-producten werden gescheiden op een hoog percentage (4%) agarosegel gedurende 1,5 uur bij een hoge spanning (150 V). In dit voorbeeld liep het wild-type amplicon als een enkele heldere band van ongeveer 250 basenparen lang (Figuur 2C; WT). Daarentegen liepen de F0-geïnjecteerde mannelijke amplicons met indels als meerdere banden op de gel (Figuur 2C; rijstroken #1-2, #5-8). Als alternatief kunnen de gemuteerde F0-geïnjecteerde mannelijke amplicons lopen als een enkele band met veranderde gelmobiliteit (niet weergegeven in het p2ry12-voorbeeld, maar duidelijk in het PCR-product van de dnah10 F0-male # 2; Figuur 2E). Het was minder duidelijk op de p2ry12-voorbeeldgel of monster # 3 en monster # 4 indels bevatten in vergelijking met de wild-type band, dus deze personen zijn misschien niet de beste oprichterskandidaten. De isolatie van allelen van F0-mannetjes met meer onderscheidende ampliconveranderingen is het beste voor het verspreiden van stabiele kiembaandragers, omdat ze gemakkelijk worden gescoord op 4% agarose-gel. Het F0-mannelijke #6 spermamonster bleek bijvoorbeeld een grote deletie te bevatten in een van de allelen (figuur 2C; baan 6; heldere band met verhoogde gelmobiliteit). Als dit grote deletie-allel in de F1-generatie zou worden geselecteerd, zou het gemakkelijk te onderscheiden zijn van het WT-allel op een 4% agarose-gel. Als alternatief, als een verzameling van verschillende allelen gewenst is, zou de F0-male # 7 een effectieve oprichterskandidaat kunnen zijn, omdat het PCR-product verschillende discrete allelen van verschillende mobiliteiten leek te bevatten. Zodra een stichtend mannetje is geselecteerd, kan het gewenste allel worden geïsoleerd door het individu terug te kruisen naar de oorspronkelijke wild-type stam die wordt gebruikt voor injecties.
Om een specifieke knock-in mutatie in het dnah10-gen te genereren, werden eencellige zebravisembryo's geïnjecteerd met Cas9-endonuclease, een dnah10-specifiek sgRNA (figuur 2D; grijze markering) en een DNA-donor oligonucleotide met de gewenste bewerking (figuur 2D; rood) en een donorspecifieke BstNI-restrictieplaats (figuur 2D) , haakjes). Dit ontwerp maakt de eenvoudige identificatie van donorintegratie met een restrictie-digest na PCR mogelijk. Bovendien voorkomt dit ontwerp, door basenparen binnen de sgRNA-herkenningsplaats te veranderen (figuur 2D; grijze markering), de Cas9-vertering van de donorsequentie. Zodra de F0-geïnjecteerde vis geslachtsrijp was, werd sperma verzameld en DNA geëxtraheerd met behulp van de hot shot-methode. Uit deze monsters werd de dnah10-locus versterkt met behulp van PCR en de producten werden gescheiden op een hoog percentage (4%) agarose-gel gedurende 1 uur bij een hoge spanning (150 V). In dit voorbeeld liep het wild-type amplicon als een enkele heldere band van ongeveer 400 basenparen lang (Figuur 2E; bovenpaneel: WT). Daarentegen liepen de F0-geïnjecteerde mannelijke amplicons met indels als meerdere banden (figuur 2E; bovenpaneel: rijstroken # 1, # 4 en # 5) of als een enkele band met verminderde gelmobiliteit (figuur 2E; bovenpaneel: rijstrook # 2). Om te bepalen of een van de spermamonsters donorgeïntegreerde allelen bevatte, werden de PCR-producten gedurende 1 uur verteerd met het BstNI-restrictie-enzym en werd het product gedurende 1 uur bij hoogspanning (150 V) op een agarosegel van 4% uitgevoerd. Vergelijking van het onverteerde PCR-product (figuur 2D; bovenpaneel) met het verteerde product (figuur 2D; onderste panelen) onthult monsters met waarschijnlijke integratie van de donorconstructie. In dit voorbeeld had de F0-geïnjecteerde man #1 een extra band in het verteerde product die niet aanwezig was in het PCR-product (Figuur 2D; onderste paneel: baan #1, omcirkeld). Daarom vertegenwoordigt dit mannetje de beste oprichterskandidaat voor het opzetten van een mutantenlijn met de gewenste knock-in.
Zodra het vermeende F0-dragermannetje is overkruist, moet het allel worden geverifieerd in het F1-nageslacht. Er wordt voorgesteld om de amplicons afgeleid van de F1 heterozygote vis direct te sequencen, gevolgd door het uitvoeren van heterozygote allelanalysemethoden zoals Poly Peak Parser13 of met behulp van een verscheidenheid aan op sequencing gebaseerde methoden van de volgende generatie, zoals MiSeq14 of Hi-Tom 15-sequencing. Dit is een noodzakelijke en complementaire benadering om ervoor te zorgen dat de precieze bewerking of schadelijke indelmutatie daadwerkelijk kiembaan krijgt en niet alleen een artefact is van de gel-elektroforese-analyse. Inderdaad, het gebruik van next-generation sequencing-benaderingen om sperma-DNA van F0-dragers te sequencen, kan gemakkelijk worden gebruikt in plaats van de gel-elektroforese-analyse die in dit protocol wordt beschreven. Het hebben van een gemakkelijk verschroeibare agarosegel genotyperingsmethode is echter een meer economische en egalitaire benadering voor de wereldwijde gemeenschap van zebravisonderzoekers.
Figuur 1: Opstelling voor de spermaknijpprocedure. (A) De spons bevindt zich onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting met bovenlicht. (B) De bevochtigde 1 op x 1 in spons, gesneden met een ovale divot (stippellijn), wordt gebruikt om de verdoofde mannelijke vis ventrale kant omhoog te houden tijdens de procedure. (C) Anatomie van de ventrale zijde van de verdoofde mannelijke vis met de anale vinnen (af, roze), bekkenvinnen (pf, blauw) en cloaca (pijl), waar sperma tijdens de procedure zal worden verdreven. C') Filtertangen worden gebruikt om de verdoofde mannelijke vis voorzichtig van de kieuwen naar de cloaca te persen, terwijl het uitgestoten sperma door capillaire werking (witte pijl) in een glazen pipet wordt getrokken. D) Een capillaire buis met voldoende uitgestoten sperma (ondoorzichtige vloeistof; zwarte beugel) voor downstream DNA-extractie en -analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Workflow en representatieve resultaten . (A) Algemene workflow van het protocol. (B) Representatief ontwerp van de p2ry12 sgRNA-site (grijze markering) met een Cas9-specifieke PAM-site (onderstreept). (C) Representatieve resultaten van de 4% gelelektroforese na 1,5 uur bij 150 V. Wild-type (WT) controle en F0-p2ry12 CRISPR-geïnjecteerde mannelijke spermamonsters (1-8) na PCR-amplificatie. (D) Representatief ontwerp van de dnah10 sgRNA-site (grijze markering) met een Cas9-specifieke PAM-site (onderstreept) in de buurt van het beoogde codon (vet). DNA-donorsequentie met de gewenste codonbewerking (rood vetgedrukt) en BstNI-restrictieplaats (haakjes met apostrof die de snijplaats markeren). (E) Representatieve resultaten van de 4% gelelektroforese na 1 uur bij 150 V. Top: PCR-product van het wild-type (WT) en F0 dnah10 CRISPR-geïnjecteerde mannelijke spermamonsters (1-5). Onder: BstNI restrictie digest product van de bovenstaande monsters. Monster 1 toont de succesvolle integratie van het donorconstruct op basis van de extra band na vertering (rode cirkel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor het snel karakteriseren van vermeende genoombewerkingen of gerichte mutaties met behulp van CRISPR-Cas-technologie door gerichte analyse op F0 mannelijke spermagenomen. Dit protocol moet vatbaar zijn voor andere diermodellen waarbij sperma gemakkelijk beschikbaar is voor bemonstering zonder euthanasie. Deze methode verhoogt de doorvoer van screening voor gewenste bewerkingen en is vooral handig voor het identificeren van zeldzame HDR-gemedieerde knock-in-gebeurtenissen. Deze aanpak dient ook om het aantal proefdieren te verminderen dat wordt gebruikt om een stabiele kiembaanbewerking te vinden door de snelle screening van mogelijk duizenden genomen in één spermamonster van een vermeende F0-drager te vergemakkelijken, wat in tegenstelling is tot meer traditionele benaderingen die de screening van honderden embryo's kunnen vereisen die zijn afgeleid van kruisingen van vermeende F0-dragers.
Dit protocol bouwt voort op gevestigde protocollen voor spermaverzameling bij zebravissen 7,10,14,16,17,18 door een reproduceerbare techniek op te nemen voor het identificeren van kiembaanbewerkingen met behulp van gelelektroforese met hoge resolutie. Deze aanpak kan eenvoudig worden geïntegreerd in elke standaard CRISPR / Cas-workflow om de doorvoer voor de screening en isolatie van doelgenoombewerkingen te verhogen. Bovendien is dit protocol geschikt voor laboratoria die bemand zijn met personeel met een scala aan training en ervaring, evenals onderwijslaboratoria. Onze methode van spermaverzameling is echter niet voldoende voor cryopreservatie, die vakkundig is beschreven in eerdere publicaties10,17.
Dit protocol maakt gebruik van een hoge resolutie agarose gel elektroforese om vermeende mannelijke dragers van gewenste indel en precieze genomische mutaties te identificeren. Sperma genomisch DNA is echter vatbaar voor een groot aantal andere benaderingen, waaronder fluorescerende fragmentanalyse of barcode-sequencing14, smeltanalyse met hoge resolutie18 of eenvoudige amplicondetectie van fluorescerende tags of epitopen met behulp van standaard gel-elektroforesebenaderingen. De downstream validatie van alle allelen met behulp van benaderingen zoals sanger-gebaseerde of next-generation sequencing moet worden gedaan voordat experimenteel werk aan vermeende allelen wordt gestart. Bestaande methoden voor screening op mutaties in embryo's met behulp van de next-generation sequencing-benadering14 zouden de noodzaak van analyse op agarosegels, die in dit protocol wordt beschreven, kunnen omzeilen. Het hebben van een gel-scorable genotyperingsmethode is echter een meer kosteneffectieve en egalitaire benadering om te overwegen, aangezien niet alle laboratoria gemakkelijk toegang hebben tot goedkope sequencingmethoden van de volgende generatie tijdens de isolatie- en experimentele fasen van het werken met elke mutante stam.
Samenvattend biedt dit protocol stapsgewijze aanwijzingen voor het reproduceerbaar screenen van spermagenomen van CRISPR / Cas-bewerkte mannetjes, zodat er minder kruisingen en minder PCR-screening van embryo's nodig zijn om te screenen op gewenste bewerkingen. De toepassing van deze methode vermindert het aantal vissen dat moet worden gemaakt en geanalyseerd om de bewerkte allelen van belang met succes te identificeren, wat ook de tijd en kosten van personeel voor het genereren van stabiele lijnen vermindert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
We willen Anna Hindes van de Washington University School of Medicine bedanken voor haar eerste inspanningen om sperma-genomisch DNA van goede kwaliteit te verkrijgen met behulp van de hot shot-methode. Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health under Award (R01AR072009 to R.S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
