Summary
As tecnologias CRISPR-Cas revolucionaram o campo da edição do genoma. No entanto, encontrar e isolar a edição de linha germinal desejada continua sendo um grande gargalo. Portanto, este protocolo descreve um método robusto para rastrear rapidamente espermatozoides de peixe-zebra injetados com CRISPR F0 para edições germinativas usando técnicas padrão de PCR, digesto de restrição e eletroforese em gel.
Abstract
O advento de tecnologias nucleases CRISPR-Cas direcionadas revolucionou a capacidade de realizar a edição precisa do genoma em sistemas modelo estabelecidos e emergentes. Os sistemas de edição do genoma CRISPR-Cas usam um RNA guia sintético (sgRNA) para direcionar uma endonuclease associada a CRISPR (Cas) para loci específicos de DNA genômico, onde a endonuclease de Cas gera uma quebra de fita dupla. O reparo de quebras de fita dupla por mecanismos intrínsecos propensos a erros leva a inserções e/ou deleções, interrompendo o locus. Alternativamente, a inclusão de doadores de DNA de fita dupla ou oligonucleotídeos de DNA de fita simples nesse processo pode provocar a inclusão de edições precisas do genoma variando de polimorfismos de nucleotídeo único a pequenas etiquetas imunológicas ou mesmo grandes construções de proteínas fluorescentes. No entanto, um grande gargalo nesse procedimento pode ser encontrar e isolar a edição desejada na linha germinativa. Este protocolo descreve um método robusto para triagem e isolamento de mutações germinativas em loci específicos em Danio rerio (zebrafish); no entanto, esses princípios podem ser adaptáveis em qualquer modelo onde a coleta de espermatozoides in vivo seja possível.
Introduction
O sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas é uma ferramenta poderosa para realizar mutagênese loci-específica e edição precisa do genoma no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) 1,2,3,4. A Cas-ribonucleoproteína (RNP) é composta por dois componentes principais: uma endonuclease Cas (comumente Cas9 ou Cas12a) e um RNA guia sintético locus-específico (sgRNA)5. Juntos, os Cas-RNP geram uma quebra de fita dupla (DSB) no locus desejado que pode ser reparada por um dos dois mecanismos intrínsecos de reparo. O mecanismo de reparo de junção final não homóloga (NHEJ) é propenso a erros e geralmente resulta em uma variedade de inserções ou exclusões (indels) ao redor do DSB. Esses indéis podem ser deletérios se introduzirem uma mutação frameshift ou parada prematura na sequência de proteínas resultante. Alternativamente, o mecanismo de reparo dirigido por homologia (HDR) usa um modelo de doador com regiões de homologia ao redor do local do DSB para reparar o dano. Os pesquisadores podem aproveitar o sistema HDR para gerar edições genômicas precisas. Especificamente, eles podem co-injetar uma construção de doador de DNA de fita dupla que contém as edições desejadas, bem como regiões de homologia flanqueando o sítio DSB no genoma. O aumento da economia de escala para esses componentes CRISPR produzidos comercialmente reduziu muito as barreiras à triagem de múltiplos loci e ao estabelecimento de esforços em maior escala para a edição precisa do genoma. No entanto, em modelos animais sexualmente reprodutores, um grande gargalo é a identificação e o isolamento de animais mutantes estáveis na linha germinativa.
O sistema modelo zebrafish exibe várias qualidades chave que aumentam seu uso em estudos de genética reversa. Eles são fáceis de criar em grande número com equipamentos básicos de alojamento aquático, e as fêmeas exibem alta fecundidade durante todo o ano6. Além disso, sua postura externa de ovos e fertilização os tornam passíveis de microinjeção de componentes CRISPR/Cas. O CAS-RNP é comumente injetado em embriões de peixe-zebra em estágio unicelular para gerar DSBs/reparo que é, em teoria, herdado por todas as células filhas. No entanto, genomas diploides requerem dois eventos DSB/reparo para mutagenizar ambos os cromossomos homólogos. Além disso, embora o Cas-RNP seja injetado no estágio unicelular, o DSB/reparo pode não ocorrer até pontos posteriores do desenvolvimento. Juntos, esses fatores contribuem para a natureza em mosaico dos peixes injetados com F0. Uma prática comum é cruzar peixes injetados com F0 e selecionar a progênie F1 para indels/edições específicas. No entanto, como nem todos os peixes injetados com F0 possuem mutações germinativas, essa prática resulta em muitos cruzamentos improdutivos que não geram a edição desejada. A triagem da linhagem germinativa F0 em vez do tecido somático F1 aumenta a probabilidade de isolar a linha germinativa desejada e reduz o número de animais necessários nesse processo.
Os espermatozoides podem ser facilmente coletados de peixes-zebra injetados com F0 sem a necessidade de eutanásia. Essa característica permite a criopreservação e a rederivação de espermatozoides congelados7, mas também pode ser explorada para rastrear, identificar e isolar rapidamente os portadores germinativos de mutações genômicas desejadas 8,9. (2016) descreveram anteriormente um método baseado em sequenciamento para triagem de edições germinativas em peixes-zebra machos injetados em F010. Embora útil para identificar os alelos mutados presentes na linha germinativa, essa abordagem pode se tornar dispendiosa em alto rendimento e pode não ser acessível para todos os laboratórios. Em contraste, o protocolo atual oferece uma estratégia baseada em eletroforese acessível e econômica para identificar edições germinativas. Especificamente, este protocolo descreve um método robusto para triagem e isolamento de mutações germinativas em loci específicos usando eletroforese em gel de agarose de alta resolução. Além disso, esse protocolo descreve uma estratégia semelhante para identificar a integração bem-sucedida de um construto doador contendo edições específicas. Como sempre, se edições específicas forem desejadas, estratégias baseadas em sequenciamento podem ser realizadas em conjunto com o protocolo descrito abaixo. Embora este protocolo seja específico para o sistema modelo zebrafish, esses princípios devem ser adaptáveis a qualquer modelo em que a coleta de espermatozoides seja um procedimento de rotina. Juntas, essas estratégias permitirão a identificação de machos injetados com F0 com indels/edições germinativas que podem ser resolvidas em gel após reação em cadeia da polimerase (PCR) padrão e/ou digesto de restrição.
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Protocol
Este estudo foi realizado de acordo com as diretrizes do Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas em Austin (AUP-2021-00254).
1. Projetando o sgRNA para mutagênese CRISPR
- Obtenha a sequência de éxons contendo os loci visados.
- Projetar um RNA guia sintético (sgRNA) com um sítio de motivo adjacente (PAM) do protoespaçador que seja específico para a endonuclease de Cas.
- Se co-injetar uma construção doadora, projete o sgRNA para ter um local de corte previsto o mais próximo possível das edições desejadas.
NOTA: APE é um software livre com uma ferramenta para encontrar Cas9 sgRNA sites11. Alternativamente, ferramentas como o CHOPCHOP podem ser utilizadas, que oferece uma interface on-line para o planejamento de sgRNAs que considera os diferentes sítios PAM de Cas9 e outras endonucleases de Cas912.
- Se co-injetar uma construção doadora, projete o sgRNA para ter um local de corte previsto o mais próximo possível das edições desejadas.
- Projete primers para frente e para trás para amplificar a região ao redor do local de corte CRISPR/Cas projetado. O produto da PCR deve ter aproximadamente 200-400 pares de bases (pb) de comprimento para ser capaz de resolver pequenas indels em um gel mais tarde no protocolo.
NOTA: CHOPCHOP11 projeta automaticamente primers para cada sgRNA que ele produz. - Opcional: Projetar uma construção de doador de DNA com a(s) edição(ões) desejada(s).
- Obter a sequência genômica do éxon contendo os loci da mutação desejada.
NOTA: As sequências intrônicas podem variar entre indivíduos, por isso é melhor evitar a inclusão de sequências intrônicas na construção do doador, pois isso poderia interferir na via de reparo dependente de homologia. - Se uma mudança específica de aminoácidos for desejada, altere o códon específico de acordo.
NOTA: Ao fazer essas alterações, esteja ciente da frequência do códon. Se possível, escolha um códon com alto uso. - Para evitar a digestão CRISPR/Cas da construção do doador, faça mutações sinônimas adicionais que (i) interrompam a PAM e/ou (ii) interrompam a sequência de sgRNA, com maior preferência sendo colocada em fazer alterações não sinônimas mais próximas do local PAM.
- Use um localizador de sites de restrição (o APE11 também tem esse recurso) para encontrar locais de restrição exclusivos (aqueles que ocorrem apenas uma vez) no produto PCR previsto da sequência selvagem.
- Repita esse processo para o produto de PCR previsto que reflete a integração bem-sucedida da construção do doador.
- Compare a lista de locais de restrição entre as sequências curinga e integrada ao doador para localizar um local de restrição que esteja presente apenas na sequência editada.
- Se nenhum local de restrição exclusivo for encontrado, continue fazendo alterações sinônimas dentro da construção do doador até que isso seja alcançado.
NOTA: Se possível, continue fazendo mutações sinônimas que interromperiam a ligação do sgRNA à construção do doador.
- Corte a sequência doadora para um tamanho gerenciável (50-100 pb) com pelo menos 20 pb de homologia em torno do local de corte CRISPR/Cas previsto e edições, se possível.
- Obter a sequência genômica do éxon contendo os loci da mutação desejada.
- Obter os oligonucleotídeos doadores de sgRNA e/ou DNA projetados, bem como quaisquer primers necessários para a genotipagem.
NOTA: Para evitar a digestão dos oligonucleotídeos doadores de DNA por nucleases, recomenda-se modificar as três primeiras ligações fosfato nas extremidades 5' e 3' dos oligonucleotídeos de DNA com fosforotioato. - Injetar 1 nL da mistura injetável em embriões de uma célula. Normalmente, uma mistura de injeção padrão contém o seguinte:
1 μL de sgRNA locus-específico de 25 μM
1 μL de 25 μM de endonuclease Cas9
Opcional: 1 μL de 3 μM de construção de doador de DNA- Elevar o volume total para 5 μL com KCl 0,1 M livre de RNase.
- Permitir que os indivíduos injetados com F0 se desenvolvam em adultos sexualmente maduros. O protocolo restante se concentra na triagem dos machos injetados com F0 para edições germinativas.
2. Montagem dos tanques de reprodução
- Machos F0 primos para acasalamento através da montagem de tanques de reprodução com divisórias entre os machos e fêmeas F0.
- Para minimizar o número de tanques de reprodução necessários, configure três machos em frente a duas fêmeas em cada tanque.
- Configure tantos machos F0 quantos puderem efetivamente ser rastreados e alojados como indivíduos após a coleta de espermatozoides. O genótipo das fêmeas não é importante, uma vez que seus gametas não serão coletados durante este procedimento.
- Monte um tanque de reprodução de machos selvagens em frente às fêmeas. Os espermatozoides selvagens servirão como um controle para a interpretação dos resultados mais tarde no procedimento.
- Para minimizar o número de tanques de reprodução necessários, configure três machos em frente a duas fêmeas em cada tanque.
- Incube os tanques de reprodução preparados durante a noite.
3. Preparação dos materiais para o procedimento de coleta de espermatozoides
- Prepare solução anestesiante suficiente (0,016% de tricaína-HCl em água de peixe) para encher uma pequena tigela de vidro.
- Distribuir 40 μL de NaOH 50 mM em tubos de PCR de 0,2 mL. Prepare um tubo para cada amostra de esperma que será coletada. Armazenar no gelo.
- Preparar tanques individuais de 0,8 L para cada peixe que será amostrado durante o procedimento. Esses tanques abrigarão os peixes amostrados até que a genotipagem seja concluída.
NOTA: Este é o principal fator que limita o número de peixes que podem ser efetivamente rastreados neste protocolo. Garantir espaço adequado para alojar os indivíduos amostrados até que a genotipagem esteja completa. - Umedeça uma esponja de 1 polegada x 1 polegada (cortada com um divot raso em forma oval para segurar um macho do lado ventral do peixe-zebra durante o procedimento) na água dos peixes e esprema o excesso de líquido.
- Posicionar a esponja no campo de visão de um estereomicroscópio em baixa magnificação (Figura 1A).
- Posicione a iluminação aérea oblíqua para uma visualização ideal.
4. Anestesiar os peixes machos e coletar os espermatozoides
- Prepare um tubo capilar limpo.
- Agite suavemente o recipiente do tubo para liberar um único tubo capilar.
- Coloque o tubo capilar no bulbo fornecido e reserve-o.
- Transferir um peixe macho para a solução anestesiante preparada (0,016% de tricaína-HCl em água de peixe).
- Mexa suavemente a solução com uma colher de fenda para acelerar o processo de anestesia.
- Uma vez que o movimento do opérculo (guelra) diminui (aproximadamente 1-2 min), prossiga com a coleta de espermatozoides.
- Use a colher de fenda para transferir o peixe para uma pilha limpa de toalhas de papel.
- Use a colher de fenda para enrolar suavemente o peixe para remover o excesso de água.
- Limpe suavemente o peixe com papel de seda limpo e dobrado para remover qualquer água restante.
- Utilizar a colher com fenda para transferir o peixe para a esponja preparada (Figura 1B).
- Posicione o peixe ventral de lado para cima com a cabeça mais próxima da mão dominante da pessoa que realiza o procedimento.
- Limpe suavemente a área ao redor das nadadeiras anais com papel de seda limpo e dobrado.
- Colete os espermatozoides.
- Com a extremidade do tubo capilar, mova suavemente as nadadeiras pélvicas lateralmente para longe da linha média para expor a cloaca (Figura 1C).
- Posicione a extremidade do tubo capilar próximo à cloaca.
- Com a pinça, aperte suavemente as laterais do peixe começando logo abaixo das brânquias e terminando na cloaca (Figura 1C').
- Coletar espermatozoides no tubo capilar por ação capilar. Aproximadamente 1 μL é suficiente para esse procedimento (Figura 1D).
NOTA: Alguns laboratórios relatam usar pontas de pipeta p10 em vez de tubos capilares para coleta de espermatozoides. - Se os espermatozoides não forem liberados com pressão suave, devolva os peixes à água do sistema.
- Monitor para recuperação da anestesia.
- Não aperte o peixe com força para expelir espermatozoides, pois isso pode machucar o peixe.
- Descanse o peixe por 2 semanas antes de tentar coletar espermatozoides novamente.
- Após a coleta, coloque os peixes em um tanque de isolamento limpo com sistema de água para alojamento individual.
- Monitorar os peixes para recuperação da anestesia.
- Descanse o peixe por 2 semanas antes de tentar coletar espermatozoides novamente.
- Colocar o tubo capilar com os espermatozoides coletados no tubo de PCR preparado (com 40 μL de NaOH 50 mM).
- Esprema o bulbo de borracha para expelir a amostra coletada.
- Descarte o tubo capilar usado em um recipiente de resíduos de vidro aprovado.
- Incubar as amostras no gelo até que todos os machos tenham sido espremidos.
- Repita os passos 4.1-4.5 para cada indivíduo do sexo masculino.
- Rotular os tanques de isolamento e as amostras de esperma de modo que os resultados finais da genotipagem do esperma possam ser rastreados até o indivíduo correspondente com mutações putativas.
- Monitore todos os indivíduos e certifique-se de que eles estejam eretos e explorando seus tanques antes de colocá-los de volta no sistema.
- Coloque as fêmeas usadas para priming de volta em seus respectivos tanques no sistema.
- Se algum peixe não se recuperar da anestesia após 10 min, siga o procedimento de eutanásia aprovado pela instituição associada ao laboratório.
- Exemplo: Resfriar rapidamente o indivíduo em um banho de gelo com água de peixe que é 2-4 °C.
- Descarte os peixes eutanasiados em recipiente apropriado para resíduos de carcaça de animais, de acordo com o procedimento aprovado pela instituição associada ao laboratório.
5. Extração de DNA das amostras de esperma
- Gire brevemente todas as amostras de esperma em uma minicentrífuga e coloque os tubos de PCR em um termociclador.
- Feche a tampa do termociclador.
- Execute as seguintes configurações no termociclador:
- Aquecer as amostras durante 40 min a 95 °C.
- Arrefecer as amostras a 25 °C.
- Retire as amostras do termociclador.
- Com uma ponta de pipeta limpa para cada amostra, neutralize o pH adicionando 10 μL de Tris-HCl 1 M (tamponada a pH 8).
- Misture bem pipetando para cima e para baixo.
- Gire brevemente as amostras em uma minicentrífuga.
- As amostras de DNA genômico podem ser armazenadas por vários dias a 4 °C ou colocadas a -20 °C por até 6 meses.
6. PCR, amplificação (e/ou digesto de restrição) do locus desejado
- Amplificar o locus desejado usando um protocolo de PCR padrão.
- Pré-aqueça o termociclador à temperatura inicial de desnaturação na reação de PCR abaixo.
- Preparar uma mistura de reacção de 25 μL para cada amostra de esperma em tubos de PCR:
12,5 μL de 2x Taq Polymerase Master Mix
1,5 μL de primer para frente de 10 μM
1,5 μL de primer reverso de 10 μM
4,5 μL de água livre de nucleases
5 μL de amostra de DNA de espermatozoides neutralizados - Misture bem pipetando para cima e para baixo.
- Gire brevemente as amostras em uma minicentrífuga.
- Coloque as amostras no termociclador pré-aquecido com as seguintes configurações:
Desnaturação inicial: 95 °C por 3 min
35 ciclos de desnaturação (95 °C por 30 s), recozimento (55 °C por 30 s) e extensão (72 °C por 30 s)
Extensão final: 72 °C por 5 min
NOTA: Pode ser necessário ajustar a temperatura e/ou o tempo de extensão dependendo da Taq polimerase específica e do comprimento esperado do produto de amplificação por PCR. - Remova as amostras de PCR do termociclador.
- Opcional: Realizar a digestão de restrição específica do doador em um pequeno volume do produto de PCR, deixando pelo menos 5-10 μL do produto de PCR não digerido para eletroforese em gel.
- Preparar uma reação de 30 μL em tubos de PCR de 0,2 mL:
10 μL de produto PCR não purificado
15 μL de água livre de nucleases
3 μL de tampão de enzima de restrição 10x
2 μL de enzima de restrição (BstNI é usado nos resultados representativos para analisar o alelo knock-in dnah10 )
NOTA: Muitas enzimas de restrição ainda estão ativas em um tampão de reação de PCR típico; no entanto, a adição de buffer digest de restrição pode ajudar a melhorar os resultados. Consulte as instruções específicas do fabricante para solução de problemas se ocorrerem problemas. - Misture bem pipetando para cima e para baixo.
- Gire brevemente as amostras em uma minicentrífuga.
- Coloque as amostras em um termociclador com as seguintes configurações:
- Cortar o amplicon de PCR a 60 °C durante 1 h.
NOTA: A temperatura de corte e o tempo de incubação podem ter de ser ajustados para a enzima de restrição específica que está a ser utilizada. - Inative a enzima de restrição com a temperatura e o tempo de incubação necessários, se indicado pelo fabricante.
NOTA: A enzima BstNI não requer inativação de calor.
- Cortar o amplicon de PCR a 60 °C durante 1 h.
- Preparar uma reação de 30 μL em tubos de PCR de 0,2 mL:
7. Realização de eletroforese em gel para separar amplicons de PCR de tamanhos variados
- Preparar 500 mL de tampão de corrida 0,5x TBE: adicionar 50 mL de concentrado de tampão 10x TBE a 450 mL de água deionizada.
- Preparar 100 mL de gel de agarose a 4% em tampão de corrida 0,5x TBE: adicionar 4 g de agarose com 10 μL de coloração de gel de 10.000x a 100 mL de tampão de corrida de 0,5x TBE. Leve ao micro-ondas até que o pó de agarose esteja totalmente dissolvido.
- Despeje a solução de gel em uma estrutura de fundição de gel de tamanho adequado e insira o pente em um lado do gel.
OBS: Um gel maior (recomendado: 15 cm x 15 cm) é vantajoso para este procedimento, pois proporciona aos amplicons mais espaço para resolver no gel.- Se um produto de digestão de restrição deve ser analisado, é melhor executá-lo no mesmo gel que o produto de PCR para que os resultados possam ser comparados. Ajuste o tamanho do pente conforme necessário para encaixar todas as amostras no gel.
- Deixe o gel à temperatura ambiente até solidificar. Retire cuidadosamente o pente. Retire cuidadosamente o gel da estrutura de fundição.
- Despeje a solução de gel em uma estrutura de fundição de gel de tamanho adequado e insira o pente em um lado do gel.
- Configure o equipamento de eletroforese em gel.
- Posicione o gel na plataforma de eletroforese de forma que os poços estejam mais próximos do eletrodo negativo. Despeje 0,5x TBE de tampão de corrida na plataforma de eletroforese até que os poços estejam totalmente submersos.
- Carregue o gel.
- Coloque 5 μL de escada de DNA no primeiro poço (escolha uma escada de DNA que contenha fragmentos de DNA que sejam semelhantes em tamanho ao amplicon de PCR).
- Usando uma nova ponta de pipeta para cada amostra (incluindo a amostra de controle selvagem), carregue 5-10 μL do produto de PCR nos poços restantes.
- Opcional: Se um produto de digestão de restrição for analisado, carregue essas amostras no gel também.
NOTA: É melhor carregar quantidades iguais de DNA entre o PCR e o produto de digestão de restrição. Por exemplo, na mistura de 30 μL de reação digestiva de restrição, foram adicionados 10 μL do produto da PCR. Portanto, a concentração de DNA dos 15 μL do produto digesto foi comparável aos 5 μL do produto da PCR não purificado.
- Execute o gel.
- Conecte os eletrodos ao equipamento de eletroforese em gel e aplique 150 V por pelo menos 1 h para garantir a separação adequada dos amplicons.
- Imagem do gel para visualizar as bandas de DNA.
NOTA: Os loci fortemente mutagenizados direcionados a CRISPR serão executados como vários tamanhos de banda representando uma combinação de alelos de inserção/exclusão com os amplicons do tipo selvagem.- Se as bandas de gel não forem resolvidas após 1 h, aplique 150 V no gel por intervalos de 15 min até que as bandas estejam suficientemente separadas no gel.
- Opcional: Se a triagem para a inserção de uma edição precisa, como um SNP, etiqueta de epítopo ou etiqueta fluorescente, examine o DNA do esperma com métodos de PCR específicos para a edição desejada. Por exemplo, ao identificar um local de restrição específico do doador, uma banda adicional estará presente no produto de digestão de restrição em comparação com o produto de PCR da amostra de esperma.
8. Isolamento de alelos estáveis germinativos
- Após 2 semanas de repouso do procedimento de compressão de espermatozoides, cruze os indivíduos F0 cujo DNA genômico espermático continha as edições desejadas.
NOTA: A geração de espermatozoides a partir de clones individuais de espermatogônias pode ser cíclica em peixes-zebra; assim, o alelo desejado pode não estar produzindo espermatozoides no momento do cruzamento. Por essa razão, cruzamentos adicionais podem ter que ser realizados mais de uma vez para isolar o alelo implicado pela triagem inicial. - Uma vez que os peixes cruzados com F1 estejam sexualmente maduros, prossiga com os métodos de genotipagem padrão (por exemplo, DNA de clipe de barbatana) usando o mesmo protocolo de PCR e eletroforese em gel realizado durante a triagem do DNA genômico do esperma.
- Sanger sequencia os produtos de PCR para identificar os indivíduos F1 com a mesma edição desejada.
- Opcional: se a edição desejada introduzir ou interromper um site de restrição, tela com um protocolo de resumo de restrição apropriado.
- Heterozigotos F1 cruzados com a mesma edição desejada.
- Rastrear a progênie F2 para o fenótipo esperado e/ou edições genômicas.
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Representative Results
As abordagens experimentais descritas neste protocolo permitem a identificação mais rápida de edições do genoma ou alelos deletérios putativos, concentrando-se na análise de milhares de genomas derivados da coleção de espermatozoides masculinos injetados com F0. A Figura 2 destaca como interpretar os resultados obtidos com esse protocolo.
Para gerar mutações no locus p2ry12, embriões de zebrafish em estágio unicelular foram injetados com endonuclease Cas9 e um sgRNA específico para p2ry12 (Figura 2B, grifo cinza). Os peixes injetados com F0 foram colocados no sistema até a maturidade sexual, e os espermatozoides foram coletados de seis machos individuais. O DNA foi extraído das amostras de esperma usando alto calor e condições básicas (extração de DNA HotSHOT) e neutralizado antes da amplificação por PCR do locus p2ry12. Os produtos da PCR foram separados em gel de agarose de alta porcentagem (4%) por 1,5 h em alta voltagem (150 V). Neste exemplo, o amplicon do tipo selvagem funcionou como uma única banda brilhante de cerca de 250 pares de base de comprimento (Figura 2C; WT). Em contraste, os amplificadores machos injetados em F0 contendo indels corriam sobre o gel como bandas múltiplas (Figura 2C; pistas #1-2, #5-8). Alternativamente, os amplificadores machos injetados em F0 mutados poderiam funcionar como uma única banda com mobilidade alterada do gel (não mostrado no exemplo p2ry12, mas evidente no produto da PCR do dnah10 F0-macho #2; Figura 2E). Foi menos claro no gel de exemplo p2ry12 se a amostra #3 e a amostra #4 continham indels em comparação com a banda selvagem, então esses indivíduos podem não ser os melhores candidatos fundadores. O isolamento de alelos de machos F0 com alterações amplicon mais distintas é melhor para a propagação de portadores estáveis da linha germinativa, pois eles são facilmente pontuados em gel de agarose a 4%. Por exemplo, a amostra de espermatozoides F0-macho #6 pareceu conter uma grande deleção em um dos alelos (Figura 2C; raia 6; faixa brilhante com mobilidade aumentada do gel). Se esse alelo de deleção grande fosse selecionado na geração F1, ele seria facilmente distinguível do alelo WT em gel de agarose a 4%. Alternativamente, se uma coleção de alelos diferentes é desejada, o macho F0 #7 poderia ser um candidato fundador eficaz, uma vez que seu produto de PCR parecia conter vários alelos discretos de várias mobilidades. Uma vez que um macho fundador é selecionado, o alelo desejado pode ser isolado cruzando o indivíduo de volta para a cepa selvagem original usada para injeções.
Para gerar uma mutação knock-in específica no gene dnah10, embriões de peixe-zebra em estágio de uma célula foram injetados com endonuclease Cas9, um sgRNA específico para dnah10 (Figura 2D; destaque cinza) e um oligonucleotídeo doador de DNA contendo a edição desejada (Figura 2D; vermelho) e um sítio de restrição BstNI específico do doador (Figura 2D , parênteses). Este desenho permite a fácil identificação da integração do doador com um digestor de restrição após a PCR. Além disso, alterando pares de bases dentro do sítio de reconhecimento do sgRNA (Figura 2D; destaque cinza), esse desenho impede a digestão Cas9 da sequência doadora. Uma vez que os peixes injetados com F0 atingiram a maturidade sexual, os espermatozoides foram coletados e o DNA foi extraído usando o método hot shot. A partir dessas amostras, o locus dnah10 foi amplificado por PCR, e os produtos foram separados em gel de agarose de alta porcentagem (4%) por 1 h em alta voltagem (150 V). Neste exemplo, o amplicon do tipo selvagem era executado como uma única banda brilhante de cerca de 400 pares de base de comprimento (Figura 2E; painel superior: WT). Em contraste, os amplificadores machos injetados em F0 contendo indels funcionaram como múltiplas bandas (Figura 2E; painel superior: pistas #1, #4 e #5) ou como uma única banda com mobilidade de gel diminuída (Figura 2E; painel superior: raia #2). Para determinar se alguma das amostras de esperma continha alelos integrados ao doador, os produtos da PCR foram digeridos com a enzima de restrição BstNI por 1 h, e o produto foi executado em gel de agarose a 4% por 1 h em alta voltagem (150 V). A comparação do produto da PCR não digerido (Figura 2D; painel superior) com o produto digerido (Figura 2D; painéis inferiores) revela amostras com provável integração da construção doadora. Neste exemplo, o macho F0-injetado #1 tinha uma banda adicional no produto digerido que não estava presente no produto da PCR (Figura 2D; painel inferior: faixa #1, circulada). Portanto, esse macho representa o melhor candidato fundador para estabelecer uma linha mutante com o knock-in desejado.
Uma vez que o suposto macho portador de F0 é ultrapassado, o alelo deve ser verificado em sequência na progênie F1. Sugere-se sequenciar diretamente Sanger os amplicons derivados dos peixes heterozigotos F1 seguido pela realização de métodos de análise de alelos heterozigotos como Poly Peak Parser13 ou usando uma variedade de métodos baseados em sequenciamento de próxima geração como MiSeq 14 ou Hi-Tom15 sequenciamento. Esta é uma abordagem necessária e complementar para garantir que a mutação indel precisa ou deletéria esteja realmente indo para a linha germinativa e não seja apenas um artefato da análise de eletroforese em gel. De fato, o uso de abordagens de sequenciamento de próxima geração para sequenciar o DNA espermático de portadores F0 pode ser facilmente usado no lugar da análise por eletroforese em gel descrita neste protocolo. No entanto, ter um método de genotipagem em gel de agarose facilmente escorável é uma abordagem mais econômica e igualitária para a comunidade global de pesquisadores de peixes-zebra.
Figura 1: Configuração para o procedimento de compressão de espermatozoides . (A) A esponja é posicionada embaixo de um estereomicroscópio em baixa magnificação com iluminação aérea. (B) A esponja umedecida 1 em x 1, cortada com uma divot oval (linha tracejada), é usada para segurar o peixe macho anestesiado ventralmente durante o procedimento. (C) Anatomia da face ventral do peixe macho anestesiado representando as nadadeiras anais (af, rósea), pélvicas (pf, azul) e cloaca (seta), onde os espermatozoides serão expelidos durante o procedimento. (C') Pinças de filtro são usadas para espremer suavemente os peixes machos anestesiados das brânquias para a cloaca, enquanto o esperma expelido é puxado para uma pipeta de vidro por ação capilar (seta branca). (D) Um tubo capilar contendo espermatozoides expelidos suficientes (líquido opaco; suporte preto) para extração e análise de DNA a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho e resultados representativos . (A) Fluxo de trabalho geral do protocolo. (B) Desenho representativo do sítio sgRNA p2ry12 (realce cinza) com um sítio PAM específico para Cas9 (sublinhado). (C) Resultados representativos da eletroforese em gel a 4% após 1,5 h a 150 V. Controle do tipo selvagem (WT) e amostras de espermatozoides machos injetados em F0-p2ry12 CRISPR (1-8) após amplificação por PCR. (D) Projeto representativo do sítio sgRNA dnah10 (realce cinza) com um sítio PAM específico para Cas9 (sublinhado) próximo ao códon alvo (negrito). Sequência de DNA doador com a edição desejada do códon (negrito vermelho) e sítio de restrição BstNI (parênteses com apóstrofo marcando o local de corte). (E) Resultados representativos da eletroforese em gel a 4% após 1 h a 150 V. Topo: Produto de PCR das amostras de espermatozoides machos injetados em CRISPR do tipo selvagem (WT) e F0 dnah10 CRISPR (1-5). Parte inferior: BstNI produto digestor de restrição das amostras acima. A amostra 1 demonstra a integração bem-sucedida do construto doador com base na banda adicional após a digestão (círculo vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um método para caracterizar rapidamente edições do genoma putativo ou mutações direcionadas usando a tecnologia CRISPR-Cas por análise focada em genomas de espermatozoides masculinos F0. Este protocolo deve ser acessível a outros modelos animais em que os espermatozoides estejam prontamente disponíveis para amostragem sem eutanásia. Esse método aumentará a taxa de transferência de triagem para edições desejadas e é especialmente útil para identificar eventos raros mediados por HDR. Essa abordagem também serve para reduzir o número de animais experimentais usados para encontrar uma linha germinativa estável, facilitando a triagem rápida de potencialmente milhares de genomas em uma amostra de espermatozoides de um suposto portador F0, o que contrasta com abordagens mais tradicionais que podem exigir a triagem de centenas de embriões derivados de cruzamentos de portadores putativos de F0.
Este protocolo baseia-se em protocolos estabelecidos para a coleta de espermatozoides em zebrafish 7,10,14,16,17,18, incluindo uma técnica reprodutível para identificar edições germinativas usando eletroforese em gel de alta resolução. Essa abordagem pode ser facilmente incorporada a qualquer fluxo de trabalho CRISPR/Cas padrão para aumentar a taxa de transferência para a triagem e isolamento de edições do genoma alvo. Além disso, esse protocolo é apropriado para laboratórios com pessoal com uma variedade de treinamento e experiência, bem como laboratórios de ensino. Entretanto, nosso método de coleta de espermatozoides não é suficiente para a criopreservação, o que já foi habilmente descrito em publicações anteriores10,17.
Este protocolo utiliza uma eletroforese em gel de agarose de alta resolução para identificar possíveis portadores masculinos de mutações genômicas indel desejadas e precisas. No entanto, o DNA genômico do esperma é passível de uma miríade de outras abordagens, incluindo análise de fragmentos fluorescentes ou sequenciamento com código de barras14, análise de fusão de alta resolução18 ou detecção simples de amplificação de etiquetas fluorescentes ou epítopos usando abordagens padrão de eletroforese em gel. A validação a jusante de todos os alelos usando abordagens como o sequenciamento baseado em Sanger ou de próxima geração deve ser feita antes de iniciar o trabalho experimental em alelos putativos. De fato, os métodos existentes para triagem de mutações em embriões usando a abordagem de sequenciamento de próxima geração14 poderiam contornar a necessidade de análise em géis de agarose, que é descrita neste protocolo. No entanto, ter um método de genotipagem com pontuação em gel é uma abordagem mais econômica e igualitária a ser considerada, uma vez que nem todos os laboratórios têm acesso fácil a métodos baratos de sequenciamento de próxima geração durante as fases de isolamento e experimentação de trabalho com cada cepa mutante.
Em resumo, este protocolo fornece instruções passo a passo para a triagem reprodutível de genomas de espermatozoides de machos editados por CRISPR/Cas, de modo que menos cruzamentos e menos triagem por PCR de embriões são necessários para rastrear as edições desejadas. A aplicação deste método diminuirá o número de peixes que precisam ser criados e analisados para identificar com sucesso os alelos editados de interesse, o que também reduz o tempo e o custo de pessoal para gerar linhas estáveis.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Anna Hindes, da Escola de Medicina da Universidade de Washington, por seus esforços iniciais na obtenção de DNA genômico de espermatozoides de boa qualidade usando o método hot shot. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde sob Prêmio (R01AR072009 a R.S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
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