Summary
Wir stellen eine Methode zur Quantifizierung der Stentor-Gewöhnung unter Verwendung einer Mikrocontroller-platinengekoppelten Vorrichtung vor, die mechanische Impulse mit einer bestimmten Kraft und Frequenz liefern kann. Wir schließen auch Methoden zum Zusammenbau der Apparatur und zum Aufbau des Experiments so ein, dass externe Störungen minimiert werden.
Abstract
Lernen ist normalerweise mit einem komplexen Nervensystem verbunden, aber es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass das Leben auf allen Ebenen, bis hin zu einzelnen Zellen, intelligente Verhaltensweisen zeigen kann. Sowohl in natürlichen als auch in künstlichen Systemen ist Lernen die adaptive Aktualisierung von Systemparametern auf der Grundlage neuer Informationen, und Intelligenz ist ein Maß für den Rechenprozess, der das Lernen erleichtert. Stentor coeruleus ist ein einzelliger Teichorganismus, der eine Gewöhnung aufweist, eine Form des Lernens, bei der eine Verhaltensreaktion nach einem wiederholten Reiz abnimmt. Stentor kontrahiert sich als Reaktion auf mechanische Stimulation, die eine scheinbare Fluchtreaktion von aquatischen Raubtieren ist. Wiederholte Störungen geringer Kraft induzieren jedoch eine Gewöhnung, was sich in einer fortschreitenden Verringerung der Kontraktionswahrscheinlichkeit zeigt. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Stentor-Gewöhnung unter Verwendung einer Mikrocontroller-platinengebundenen Vorrichtung vor, die mechanische Impulse mit einer bestimmten Kraft und Frequenz liefern kann, einschließlich Methoden zum Bau der Apparatur und zum Aufbau des Experiments in einer Weise, die externe Störungen minimiert. Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Ansätzen zur mechanischen Stimulation von Stentor ermöglicht dieses Gerät die Variation der Stimulationskraft unter Computersteuerung im Verlauf eines einzigen Experiments, wodurch die Vielfalt der anwendbaren Eingabesequenzen stark erhöht wird. Das Verständnis der Gewöhnung auf der Ebene einer einzelnen Zelle wird dazu beitragen, Lernparadigmen zu charakterisieren, die unabhängig von komplexen Schaltkreisen sind.
Introduction
Lernen ist normalerweise mit einem komplexen Nervensystem verbunden, aber es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass das Leben auf allen Ebenen, bis hin zu einzelnen Zellen, intelligente Verhaltensweisen zeigen kann. Sowohl in natürlichen als auch in künstlichen Systemen ist Lernen die adaptive Aktualisierung von Systemparametern auf der Grundlage neuer Informationen1, und Intelligenz ist ein Maß für den Rechenprozess, der das Lernenerleichtert 2.
Stentor coeruleus ist ein einzelliger Teichorganismus, der eine Gewöhnung aufweist, eine Form des Lernens, bei der eine Verhaltensreaktion nach einem wiederholten Reiz abnimmt3. Stentor kontrahiert sich als Reaktion auf mechanische Stimulation3, die eine scheinbare Fluchtreaktion von aquatischen Raubtieren ist. Wiederholte Störungen geringer Kraft induzieren jedoch eine Gewöhnung, was sich in einer fortschreitenden Verringerung der Kontraktionswahrscheinlichkeit zeigt3. Der gewöhnte Stentor zieht sich nach Erhalt einer mechanischen Hochkraftstimulation4 oder einer photischen Stimulation5 noch zusammen. Diese Beobachtungen, die mit den klassischen Kriterien von Thompson und Spencer für die Gewöhnung bei Tieren6 übereinstimmen, deuten stark darauf hin, dass die ursprüngliche kontraktile Reaktionsabnahme eher auf Lernen als auf Müdigkeit oder ATP-Erschöpfung zurückzuführen ist. Als freilebende Zelle kann Stentor ohne große Störungen durch umgebende Zellen untersucht werden, wie es in einem mehrzelligen Gewebe der Fall wäre. Mehrere zusätzliche Merkmale machen Stentor zu einem handhabbaren System für Lernstudien: seine Größe (1 mm), seine quantifizierbare Gewöhnungsreaktion3, die Leichtigkeit der Injektion und Mikromanipulation7, das vollständig sequenzierte Genom8 und die Verfügbarkeit von RNA-Interferenzwerkzeugen (RNAi)9. Um diesen Modellorganismus zur Erforschung des Zelllernens ohne Gehirn oder Nervensystem zu nutzen, ist ein reproduzierbares Verfahren zur Stimulation von Stentorzellen und zur Messung der Reaktion erforderlich.
Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Stentor-Gewöhnung unter Verwendung einer Mikrocontroller-platinengebundenen Vorrichtung vor, die mechanische Impulse mit einer bestimmten Kraft und Frequenz liefern kann, einschließlich Methoden zum Aufbau der Vorrichtung und zum Aufbau des Experiments in einer Weise, die externe Störungen minimiert (Abbildung 1). Das Verständnis der Gewöhnung auf der Ebene einer einzelnen Zelle wird dazu beitragen, Lernparadigmen zu charakterisieren, die unabhängig von komplexen Schaltkreisen sind.
Abbildung 1: Aufbau des Gewöhnungsexperiments. Die Petriplatte mit Stentor wird auf das flexible Metalllineal des Gewöhnungsgeräts gelegt. Der Anker der Gewöhnungsvorrichtung trifft dann mit einer bestimmten Kraft und Frequenz auf das Metalllineal und erzeugt eine Reizwelle über das Zellfeld. Die USB-Mikroskopkamera zeichnet die Reaktionen des Stentor auf die Stimulation auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Zusammenfassung des Arbeitsablaufs des Gewöhnungsexperiments. Die Abbildung zeigt die grundlegenden Schritte bei der Untersuchung von Stentor mit dem Gewöhnungsgerät. Die Figur wurde mit BioRender.com erstellt. Adaptiert von "Process Flowchart", von BioRender.com (2022). Abgerufen von https://app.biorender.com/biorender-templates. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Protocol
HINWEIS: Eine Zusammenfassung des Arbeitsablaufs für Gewöhnungsexperimente ist in Abbildung 2 dargestellt.
1. Zusammenbau der Gewöhnungsvorrichtung
- Schließen Sie den Motortreiber an den Motor an (siehe Abbildung 3).
- Verbinden Sie die beiden Drähte mit der Bezeichnung A von der Treiberplatine mit den blauen und roten Drähten am Motor. Verbinden Sie die beiden Drähte mit der Bezeichnung B von der Treiberplatine mit den grünen und schwarzen Drähten am Motor.
HINWEIS: Wenn man von oben auf die Treiberplatine mit den Motordrähten oben schaut, sollten die vier Eingangsdrähte in dieser Reihenfolge mit den Motorleitungen verbunden sein: blau, rot, schwarz und grün.
- Verbinden Sie die beiden Drähte mit der Bezeichnung A von der Treiberplatine mit den blauen und roten Drähten am Motor. Verbinden Sie die beiden Drähte mit der Bezeichnung B von der Treiberplatine mit den grünen und schwarzen Drähten am Motor.
- Erstellen Sie die in Abbildung 4 gezeigte Steckplatinenschaltung mit besonderer Sorgfalt, um die LEDs in der richtigen Polarität anzuschließen.
- Verbinden Sie den Vcc (+5 V) von der Treiberplatine mit der oberen Schiene des weißen Steckbretts und den Gnd von der Treiberplatine mit der unteren Schiene des Steckbretts.
- Verbinden Sie die Masse der Steckplatine mit dem Erdungsstift der Mikrocontrollerplatine. Verbinden Sie die grüne LED, die rote LED, den Schalter und die Tastendrähte mit den digitalen Pins 8, 9, 10 und 11 der Mikrocontrollerplatine.
- Verbinden Sie die digitalen Pins 2 und 3 des Mikrocontroller-Boards mit den Treiberplatinendrähten Step und Dir.
- Verbinden Sie die digitalen Pins 4, 5, 6 und 7 der Mikrocontrollerplatine mit den Treiberplatinendrähten.
- Verbinden Sie Pin 4 mit MS1, verbinden Sie Pin 5 mit MS2, verbinden Sie Pin 6 mit MS3 und verbinden Sie Pin 7 mit Aktivieren.
- Versorgen Sie die Treiberplatine mit einer 12-V-Stromversorgung. Stecken Sie die 12-V-Versorgung in den schwarz/grünen Adapterstecker, der über zwei rote Drähte an der Motortreiberplatine befestigt ist.
HINWEIS: Stecken Sie die 12-V-Versorgung nicht in den Mikrocontroller-Board-Stecker. - Laden Sie das Steuerungsprogramm (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) auf die Mikrocontrollerplatine herunter.
- Verwenden Sie ein USB-Kabel, um die Mikrocontrollerplatine an einen Computer anzuschließen, der auch als Stromquelle für die Mikrocontrollerplatine dient.
- Überprüfen Sie, ob die Benutzersteuerelemente funktionieren.
- Vergewissern Sie sich, dass der Schiebeschalter den Automatikmodus ein- und ausschaltet. Im automatischen Modus führt das System in regelmäßigen, vom Benutzer festgelegten Abständen einen Schritt aus (siehe unten).
- Überprüfen Sie, ob die grüne LED leuchtet, wenn der Automatikmodus eingeschaltet ist.
- Überprüfen Sie, ob die rote LED 1 s blinkt, bevor der Motor einen Impuls ausübt. Die rote LED ist eine Warnleuchte, die anzeigt, wenn das System im Begriff ist, einen mechanischen Impuls abzugeben.
- Testen Sie die rote Taste, die bei jedem Drücken der Taste einen 1/16-Mikroschritt auslöst, unabhängig davon, ob sich das System im Automatikmodus befindet.
Abbildung 3: Komponenten der Gewöhnungsvorrichtung. Die gesamte beschriftete Elektronik wird benötigt, um die Maschine zu montieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Elektronikschema. Dies ist die Schaltung auf dem Steckbrett. Die Drähte, die mit der Mikrocontrollerplatine verbunden sind, sind wie im Protokoll beschrieben nummeriert. D1 und D2 sind die roten bzw. grünen LEDs und sind über 330 Ω Widerstände mit Masse verbunden. Die beiden Schalter werden mit 10 KΩ-Widerständen hochgezogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
2. Aufbau des Gewöhnungsexperiments
- Besorgen Sie sich Stentor.
- Beschichten Sie eine 35 mm dicke Platte mit 0,01% Poly-Ornithin-Lösung.
- 3 ml der 0,01% igen Poly-Ornithin-Lösung auf die Platte geben und über Nacht stehen lassen.
- Waschen Sie den Teller zweimal mit Reinstwasser und einmal mit pasteurisiertem Quellwasser (PSW) (Table of Materials).
- Fügen Sie der 35-mm-Platte 3,5 ml PSW hinzu.
- Waschen Sie den Stentor in einer 6-Well-Platte (Table of Materials).
- Fügen Sie 3 ml PSW in die erste Vertiefung und 5 ml PSW in die zweite und dritte Vertiefung hinzu. Verwenden Sie eine P1.000-Pipette, um 2 ml Stentor aus einer Kulturschale in die erste Vertiefung der 6-Well-Platte zu geben.
- Identifizieren Sie einzelne Stentor mit einem Stereomikroskop (Table of Materials) und verwenden Sie dann eine P20-Pipette, um 100 Stentor von der ersten Vertiefung in die zweite Vertiefung zu übertragen.
- Identifizieren Sie einzelne Stentor mit einem Stereomikroskop und verwenden Sie dann eine P20-Pipette, um 100 Stentor von der zweiten Vertiefung in die dritte Vertiefung zu übertragen.
- Verwenden Sie eine P200-Pipette, um 100 Stentor in einem Gesamtvolumen von 500 μL von der dritten Vertiefung der 6-Well-Platte in die 35-mm-Platte zu übertragen, so dass das Endvolumen in der 35-mm-Platte 4 ml beträgt.
- Kleben Sie ein Stück (7 cm x 7 cm) weißes Papier auf das Metalllineal am Gewöhnungsgerät. Stellen Sie sicher, dass der linke Rand des Papiers 2 cm vom Ende des Lineals entfernt ist, das dem Anker am nächsten ist.
- Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um die Unterseite der 35-mm-Platte in der Mitte des 2 Zoll x 2 Zoll Papiers auf dem Lineal auf der Gewöhnungsvorrichtung zu befestigen.
- Lassen Sie die 35-mm-Platte mindestens 2 h (diese kann bis über Nacht verlängert werden) bei geschlossenem Deckel auf dem Gewöhnungsgerät. Halten Sie die Platte während dieser Akklimatisierungsphase unter Umgebungslichtbedingungen, die den experimentellen Lichtbedingungen entsprechen (d. H. Setzen Sie die Zellen keinen Hell/Dunkel-Schwankungen aus). Stellen Sie außerdem sicher, dass die Platte keine mechanischen Störungen durch versehentliches Stoßen erfährt.
- Zentrieren Sie die USB-Mikroskopkamera (Table of Materials) direkt über der 35 mm Platte von Stentor. Platzieren Sie bei Bedarf eine Stütze, z. B. eine Pipettenspitzenbox, unter der USB-Mikroskopkamera (Universal Serial Bus), um die Höhe einzustellen. Alternativ kann ein Ringständer verwendet werden, um die Höhe zu verstellen.
- Installieren Sie die Webcam-Recorder-Anwendung auf einem Laptop (Table of Materials) und verwenden Sie sie, um die Zellen über den Mikroskopeingang zu visualisieren.
- Öffnen Sie die Webcam-Recorder-App und wählen Sie das USB-Mikroskop aus dem Dropdown-Menü aus. Stellen Sie den Fokus der USB-Mikroskopkamera so ein, dass die Zellen klar sichtbar sind.
- Passen Sie die Position der USB-Mikroskopkamera an, um die Anzahl der Zellen im Sichtfeld zu maximieren.
- Öffnen Sie den seriellen Monitor der Mikrocontrollerplatine: Wählen Sie No Line Ending und stellen Sie ihn auf 9.600 Baud ein.
- Verwenden Sie den Befehl l im Mikrocontroller-Board-Programm, um den Anker abzusenken, bis er das Lineal kaum berührt. Verwenden Sie den Befehl r , um den Arm bei Bedarf anzuheben, um die genaue Position anzupassen.
HINWEIS: Wenn der Anker einen erheblichen Abstand vom Lineal entfernt ist, geben Sie den Befehl d ein, um den Motorspulenstrom zu deaktivieren, damit der Arm manuell in Richtung Lineal bewegt werden kann. Nachdem Sie den Arm manuell bewegt haben, verwenden Sie den Befehl e , um den Motorspulenstrom zu aktivieren und den Arm in Position zu halten. Bei richtiger Absenkung vor Beginn eines Experiments sollte die untere Spitze des Ankers 1 cm vom linken Rand des Lineals entfernt sein. Der Anker liefert den mechanischen Impuls, indem er auf das Lineal trifft. - Verwenden Sie den Befehl i , um den automatischen Modus auf dem Gewöhnungsgerät zu initialisieren.
- Geben Sie die Schrittweite in die Befehlszeile ein. Stufe 5 ist die kleinste Stufe und Stufe 1 ist die größte Stufe. Stufe 4 ist die Schrittgröße, die für Baseline-Gewöhnungsexperimente verwendet wird.
HINWEIS: Ein Stimulus der Stufe 5 führt zu einer Abwärtsverschiebung des Lineals um ~0,5 mm; Stufe 4 führt zu einer Verschiebung nach unten um ~1 mm; Stufe 3 führt zu einer Abwärtsverschiebung um ~2 mm; Stufe 2 führt zu einer Verschiebung nach unten um ~ 3-4 mm; und Level 1 führt zu einer Abwärtsverschiebung um ~8 mm. Ein Stimulus der Stufe 5 führt zu einer nach unten gerichteten Spitzenkraft des Ankers gegen das Lineal von ~0,122 N; Stufe 4 führt zu einer nach unten gerichteten Spitzenkraft von ~0,288 N; und Level 3 führt zu einer Abwärtsspitzenkraft von ~0,557 N. Die von Level 1 und Level 2 erzeugten Abwärtskräfte sind mit einem Dynamometer aufgrund der signifikanten Linealschwingungen, die nach dem Kontakt des Ankers auftreten, empirisch schwieriger zu quantifizieren. - Geben Sie die Zeit zwischen den Impulsen in Minuten ein. Das Intervall, das für Baseline-Gewöhnungsexperimente verwendet wird, beträgt 1 min.
- Starten Sie die Aufnahme eines Videos mit der Webcam-Recorder-App, indem Sie die rote Aufnahmetaste drücken. Schalten Sie dann den Schalter am Gewöhnungsgerät um, um das Experiment mit der ersten automatisierten mechanischen Impulsabgabe zu beginnen.
3. Analyse des Experimentvideos
- Unmittelbar bevor der erste mechanische Impuls auf dem Video erscheint, halten Sie inne und zählen Sie die Anzahl der Stentor , die sowohl an der Unterseite der 35-mm-Platte verankert als auch in einer länglichen, trompetenartigen Form verlängert sind (Abbildung 5A, Video 1).
- Zählen Sie unmittelbar nach dem ersten Impuls die Anzahl der Stentor , die sowohl an der Unterseite der Platte verankert als auch in eine kugelförmige Form zusammengezogen sind (Abbildung 5B, Video 1).
HINWEIS: Kontraktierte Zellen sind leicht von länglichen Zellen zu unterscheiden, da Stentor ihre Körperlänge innerhalb von 10 ms während eines Kontraktionsereignisses um über 50% verkürzt3. - Teilen Sie die zweite Zählung durch die erste Zählung, um den Anteil von Stentor zu bestimmen, der sich als Reaktion auf den mechanischen Reiz zusammengezogen hat.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.3 für alle mechanischen Impulse im Experimentvideo.
Abbildung 5: Stentor zieht sich nach Erhalt eines mechanischen Stimulus zusammen . (A) Die Stentor befinden sich in ihrem länglichen Zustand und sind am Boden der Petriplatte verankert. (B) Die Stentor haben sich nach Erhalt einer mechanischen Stimulation der Stufe 4 durch das Gewöhnungsgerät zusammengezogen. Die Bilder wurden mit einem USB-Mikroskop aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Video von Stentor contracting. Der Stentor erhält jede Minute einen mechanischen Reiz der Stufe 4 vom Gewöhnungsgerät. Diese Zellen haben sich noch nicht daran gewöhnt, so dass sie sich nach Erhalt des Pulses zusammenziehen. Die Zellen befinden sich in der Petriplatte, die auf dem Gewöhnungsgerät platziert ist. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Representative Results
Das oben beschriebene Verfahren, bei dem der mechanische Impuls der Stufe 4 mit einer Frequenz von 1 Tap/min verwendet wird, sollte zu einer progressiven Verringerung der Kontraktionswahrscheinlichkeit des Stentor innerhalb von 1 h führen. Dies deutet auf eine Gewöhnung hin (siehe Abbildung 6, Video 2).
Abbildung 6: Grundgewöhnung. Die Kontraktionswahrscheinlichkeit von Stentor nimmt im Laufe von 1 h progressiv ab, nachdem mechanische Impulse der Stufe 4 mit einer Frequenz von 1 Tap/min (n = 22-27) empfangen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 2. Video des gewöhnten Stentor. Die Zellen erhalten einen mechanischen Stimulus der Stufe 4, nachdem sie 1 h lang mechanische Impulse der gleichen Kraft mit einer Frequenz von 1 Tap/min empfangen haben. Die meisten Zellen haben sich während der Stunde an die Reize gewöhnt und ziehen sich daher nicht zusammen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Die Änderung der Kraft und/oder Frequenz der mechanischen Impulsabgabe kann die Gewöhnungsdynamik von Stentor verändern. Beispielsweise schließt die Verwendung des Pegel-2-Impulses mit einer Frequenz von 1 Tap/min eine Gewöhnung über den Verlauf von 1 h aus (siehe Abbildung 7). Ein Level-5-Impuls sollte bei wenigen bis null Stentor Kontraktionen auslösen.
Abbildung 7: Mangelnde Gewöhnung innerhalb von 1 h für stärkere Kräfte. Die Kontraktionswahrscheinlichkeit von Stentor nimmt im Verlauf von 1 h nach Empfang mechanischer Impulse der Stufe 2 mit einer Frequenz von 1 Tap/min (n = 7-33) nicht merklich ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Die kritischsten Schritte im Protokoll beziehen sich darauf, sicherzustellen, dass der Stentor unter optimalen Bedingungen für Kontraktionen bleibt. Die Kontraktionsreaktion im Gewöhnungstest erfordert, dass Stentors mit ihrem klebrigen Halt an einer Oberfläche verankert werden, da sie sich selten zusammenziehen, wenn sie frei schwimmen. Die Unterseite der 35-mm-Petriplatte, die für Gewöhnungsexperimente verwendet wird, ist jedoch normalerweise nicht förderlich für die Verankerung, es sei denn, sie ist mit Polyornithin beschichtet. Darüber hinaus kann der Stentor mindestens 2 h vor Beginn des Gewöhnungsexperiments keiner mechanischen Störung ausgesetzt werden, da die Stentor-Vergessenszeitskala 2-6 h3 beträgt. Wenn Stentor innerhalb von 2 Stunden nach Beginn des Gewöhnungsexperiments eine mechanische Stimulation erhält, besteht die Möglichkeit, dass diese vorherige Stimulation vor dem Experiment ein leichtes Maß an Gewöhnung induziert, wodurch die Kontraktionswahrscheinlichkeit verringert wird, nachdem die Gewöhnungsvorrichtung den ersten mechanischen Impuls abgegeben hat. Schließlich ist es während der Analysephase wichtig, nur die Anzahl der Stentor zu zählen, die sich nach einem Puls zusammenziehen - und nicht zufällige spontane Kontraktionen, die vor der Pulsabgabe auftreten -, um eine genaue Anzeige des Anteils der Zellen zu erhalten, die sich als Reaktion auf die mechanische Stimulation zusammengezogen haben.
Das Protokoll kann leicht modifiziert werden, um verschiedene Arten von Gewöhnungsdynamik zu untersuchen, indem die Kraft und Frequenz der mechanischen Impulse geändert werden, die von der Gewöhnungsvorrichtung abgegeben werden. Dies bietet auch die Möglichkeit, andere Arten des Lernens, wie z.B. Sensibilisierung, zu erforschen, die in Stentor auftreten könnten. Der Programmcode der Mikrocontroller-Platine selbst kann ebenfalls angepasst werden, um verschiedene Muster mechanischer Taps an den Stentor zu liefern.
Ein potenzielles Problem, das mit diesem Protokoll behoben werden muss, ist die geringe Frequenz der Stentor-Verankerung, die die Anzahl der Stentor, die im Gewöhnungsexperiment beobachtet werden kann, einschränken könnte. Die Verankerungsfrequenz ist manchmal in Stentor Kulturen reduziert, die nicht kürzlich gefüttert wurden oder kontaminiert sind. Um dieses Problem anzugehen, sollte man eine frische Charge Stentor waschen, um eine neue Kultur zu beginnen, und sie regelmäßig gemäß dem in Lin et al.10 beschriebenen Protokoll füttern.
Dieses Protokoll ist insofern eingeschränkt, als nur eine einzige Platte Stentor gleichzeitig getestet werden kann, was zu Messungen mit relativ niedrigem Durchsatz führt. Darüber hinaus erlaubt die aktuelle Software keine Automatisierung der Einzelzellbildanalyse. Die meisten erhobenen Daten beziehen sich daher auf Bevölkerungsebene. Zukünftige Modelle des Gewöhnungsgeräts und der Bildanalysewerkzeuge könnten Einzelzellexperimente mit hohem Durchsatz erleichtern.
Die Gewöhnung in Stentor wurde zuvor mit Methoden untersucht, die von Wood3 beschrieben wurden, aber dieses neue Protokoll ermöglicht die Automatisierung von Experimenten. Die Automatisierung ermöglicht es dem Forscher nicht nur, mechanische Impulse mit einer bestimmten Kraft und Frequenz reproduzierbar zu liefern, sondern erleichtert auch langfristige Gewöhnungsexperimente, da das Gerät tagelang unbeaufsichtigt laufen kann. Darüber hinaus verringert die Verwendung eines Schrittmotors anstelle des in Woods Experimenten3 verwendeten Magneten das Risiko einer Entmagnetisierung im Laufe der Zeit und ermöglicht es auch, die Stärke des Stimulus im Laufe eines einzelnen Experiments zu variieren.
Die Untersuchung der zellulären Gewöhnung kann klinische Erkenntnisse für Erkrankungen wie Aufmerksamkeitsdefizit- / Hyperaktivitätsstörung (ADHS) und Tourette-Syndrom liefern, bei denen die Gewöhnung beeinträchtigt ist11. Stentor Gewöhnungsmechanismen können auch neue nicht-synaptische Lernparadigmen unabhängig von komplexen zellulären Schaltkreisen enthüllen. Schließlich könnten Erkenntnisse über das Einzelzelllernen zu Methoden zur Reprogrammierung von Zellen in mehrzelligen Geweben inspirieren - ein weiterer potenzieller Weg zur Bekämpfung von Krankheiten.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Tatyana Makushok für unzählige Diskussionen über das Lernen von Stentor . Diese Arbeit wurde durch den NSF-Zuschuss MCB-2012647 und durch den NIH-Zuschuss R35 GM130327 sowie durch den I2CELL-Preis der Stiftung Fourmentin-Guilbert finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
| 35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
| 6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
| Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
| Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
| Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
| Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
| Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
| Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
| Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
| Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
| Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
| Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
| USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
| Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |
References
- Dussutour, A. Learning in single cell organisms. Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).
- Sternberg, R. J. Intelligence. Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).
- Wood, D. C. Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus. Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Cell learning. Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).
- Wood, D. C. Stimulus specific habituation in a protozoan. Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).
- Thompson, R. F., Spencer, W. A. Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior. Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).
- Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. Stentor coeruleus. Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).
- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).
- McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).
