Studera tillvänjning i Stentor coeruleus

Summary

Vi introducerar en metod för att kvantifiera Stentor-tillvänjning med hjälp av en mikrokontroller-kortlänkad apparat som kan leverera mekaniska pulser vid en viss kraft och frekvens. Vi inkluderar också metoder för att montera apparaten och ställa in experimentet på ett sätt som minimerar yttre störningar.

Abstract

Lärande är vanligtvis förknippat med ett komplext nervsystem, men det finns ökande bevis för att livet på alla nivåer, ner till enskilda celler, kan visa intelligenta beteenden. I både naturliga och artificiella system är lärande den adaptiva uppdateringen av systemparametrar baserat på ny information, och intelligens är ett mått på beräkningsprocessen som underlättar lärandet. Stentor coeruleus är en encellig dammboende organism som uppvisar tillvänjning, en form av inlärning där ett beteendemässigt svar minskar efter en upprepad stimulans. Stentor kontraherar som svar på mekanisk stimulering, vilket är ett uppenbart flyktsvar från vattenlevande rovdjur. Upprepade störningar med låg kraft inducerar emellertid tillvänjning, vilket demonstreras av en progressiv minskning av kontraktionssannolikheten. Här introducerar vi en metod för att kvantifiera Stentor-tillvänjning med hjälp av en mikrokontroller-kortlänkad apparat som kan leverera mekaniska pulser vid en viss kraft och frekvens, inklusive metoder för att bygga apparaten och ställa in experimentet på ett sätt som minimerar yttre störningar. I motsats till de tidigare beskrivna tillvägagångssätten för mekaniskt stimulerande Stentor, tillåter denna anordning att stimuleringskraften varieras under datorkontroll under ett enda experiment, vilket kraftigt ökar de olika ingångssekvenserna som kan appliceras. Att förstå tillvänjning på nivå med en enda cell hjälper till att karakterisera inlärningsparadigmer som är oberoende av komplexa kretsar.

Introduction

Lärande är vanligtvis förknippat med ett komplext nervsystem, men det finns ökande bevis för att livet på alla nivåer, ner till enskilda celler, kan visa intelligenta beteenden. I både naturliga och artificiella system är lärande den adaptiva uppdateringen av systemparametrar baserat på ny information¹, och intelligens är ett mått på beräkningsprocessen som underlättar inlärning².

Stentor coeruleus är en encellig dammboende organism som uppvisar tillvänjning, en form av inlärning där ett beteendemässigt svar minskar efter en upprepad stimulans³. Stentor kontraherar som svar på mekanisk stimulering³, vilket är ett uppenbart flyktsvar från vattenlevande rovdjur. Upprepade störningar med låg kraft inducerar emellertid tillvänjning, vilket demonstreras av en progressiv minskning av sammandragningssannolikheten³. Den vana Stentor drar sig fortfarande samman efter att ha fått mekanisk stimulering med hög kraft⁴ eller fotisk stimulering⁵. Dessa observationer, som överensstämmer med Thompson och Spencers klassiska kriterier för tillvänjning hos djur⁶, tyder starkt på att den ursprungliga kontraktila svarsminskningen beror på inlärning snarare än trötthet eller ATP-utarmning. Som en fritt levande cell kan Stentor studeras utan mycket störningar från omgivande celler, vilket skulle vara fallet i en multicellulär vävnad. Flera ytterligare funktioner gör Stentor till ett lätthanterligt system för att studera inlärning: dess stora storlek (1 mm), dess kvantifierbara tillvänjningssvar³, enkel injektion och mikromanipulering⁷, det helt sekvenserade genomet⁸ och tillgängligheten av RNA-interferens (RNAi) verktyg⁹. Att använda denna modellorganism för att utforska cellinlärning utan hjärna eller nervsystem kräver en reproducerbar procedur för att stimulera Stantor-celler och mäta svaret.

Här introducerar vi en metod för att kvantifiera Stentor-tillvänjning med hjälp av en mikrokontroller-kortlänkad apparat som kan leverera mekaniska pulser vid en viss kraft och frekvens, inklusive metoder för att bygga apparaten och ställa in experimentet på ett sätt som minimerar yttre störningar (figur 1). Att förstå tillvänjning på nivå med en enda cell hjälper till att karakterisera inlärningsparadigmer som är oberoende av komplexa kretsar.

Bild 1: Inställning av tillvänjningsexperiment. Petriplattan som innehåller Stentor placeras ovanpå den flexibla metalllinjalen på tillvänjningsanordningen. Ankaret på tillvänjningsanordningen träffar sedan metalllinjalen vid en viss kraft och frekvens, vilket ger en stimulansvåg över cellfältet. USB-mikroskopkameran registrerar Stentors svar på stimuleringen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 2: Sammanfattning av arbetsflödet för tillvänjningsexperimentet. Figuren visar de grundläggande stegen som är involverade i att studera Stentor med hjälp av tillvänjningsanordningen. Figuren skapades med BioRender.com. Anpassad från "Process Flowchart", av BioRender.com (2022). Hämtad från https://app.biorender.com/biorender-templates. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

OBS: En sammanfattning av arbetsflödet för tillvänjningsexperiment visas i figur 2.

1. Montering av tillvänjningsanordningen

1. Haka fast motordrivrutinen i motorn (se figur 3).
   1. Anslut de två ledningarna märkta A från förarkortet till de blå och röda ledningarna på motorn. Anslut de två ledningarna märkta B från förarkortet till de gröna och svarta ledningarna på motorn.
      OBS: När man tittar ner på förarkortet ovanifrån med motorkablarna högst upp bör de fyra ingångskablarna anslutas till motorkablarna i denna ordning: blå, röd, svart och grön.
2. Bygg brödbrädekretsen som visas i figur 4, med särskild försiktighet för att ansluta lysdioderna i rätt polaritet.
3. Anslut Vcc (+5 V) från förarkortet till den övre skenan på den vita brödbrädan och Gnd från förarkortet till brödbrädans nedre skena.
4. Anslut brödbrädans mark till mikrokontrollkortets jordstift. Anslut den gröna lysdioden, den röda lysdioden, omkopplaren respektive knappkablarna till mikrokontrollerkortets digitala stift 8, 9, 10 och 11.
5. Anslut mikrokontrollerkortets digitala stift 2 och 3 till förarkortets ledningar Step och Dir.
6. Anslut mikrokontrollerkortets digitala stift 4, 5, 6 och 7 till förarkortets ledningar.
   1. Anslut stift 4 till MS1, anslut stift 5 till MS2, anslut stift 6 till MS3 och anslut stift 7 till aktivera.
7. Strömförarkortet med en 12 V strömförsörjning. Anslut 12 V-matningen till den svart/gröna adapterkontakten som är fäst med två röda ledningar på motorförarkortet.
   OBS: Anslut inte 12 V-matningen till mikrokontrollerkortets kontakt.
8. Ladda ner kontrollprogrammet (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) på mikrokontrollerkortet.
9. Använd en USB-kabel för att ansluta mikrokontrollerkortet till en dator, som också fungerar som strömkälla för mikrokontrollerkortet.
10. Kontrollera att användarkontroller fungerar.
    1. Kontrollera att skjutreglaget slår på och av det automatiska läget. I automatiskt läge tar systemet ett steg med jämna mellanrum som anges av användaren (se nedan).
    2. Kontrollera att den gröna lysdioden tänds när det automatiska läget är på.
    3. Kontrollera att den röda lysdioden blinkar 1 s innan motorn applicerar en puls. Den röda lysdioden är en varningslampa som indikerar när systemet är på väg att leverera en mekanisk puls.
    4. Testa den röda knappen, som utlöser ett 1/16 mikrosteg varje gång knappen trycks in, oavsett om systemet är i automatiskt läge.

Bild 3: Komponenter i tillvänjningsanordningen. All märkt elektronik krävs för att montera maskinen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Elektronikschema. Detta är kretsen på brödbrädan. Ledningarna som ansluter till mikrokontrollerkortet är numrerade enligt beskrivningen i protokollet. D1 och D2 är de röda respektive gröna lysdioderna och är anslutna till jord genom 330 Ω motstånd. De två omkopplarna dras upp med 10 KΩ motstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Ställa in tillvänjningsexperimentet

1. Skaffa Stentor.
2. Täck en 35 mm platta med 0,01% poly-ornitinlösning.
   1. Tillsätt 3 ml av 0,01% poly-ornitinlösning till plattan och låt stå över natten.
   2. Tvätta plattan två gånger med ultrarent vatten och en gång med pastöriserat källvatten (PSW) (Materialtabell).
3. Tillsätt 3,5 ml PSW till 35 mm-plattan.
4. Tvätta Stentor i en 6-brunnsplatta (Materialtabell).
   1. Tillsätt 3 ml PSW till den första brunnen och 5 ml PSW till den andra och tredje brunnen. Använd en P1,000-pipett för att tillsätta 2 ml Stentor från en odlingsskål till den första brunnen på 6-brunnsplattan.
   2. Identifiera enskilda Stentor med ett stereomikroskop (Materialtabell) och använd sedan en P20-pipett för att överföra 100 Stentor från den första brunnen till den andra brunnen.
   3. Identifiera enskilda Stentor med ett stereomikroskop och använd sedan en P20-pipett för att överföra 100 Stentor från den andra brunnen till den tredje brunnen.
5. Använd en P200-pipett för att överföra 100 Stentor i en total volym på 500 μl från den tredje brunnen på 6-brunnsplattan till 35 mm-plattan så att den slutliga volymen i 35 mm-plattan är 4 ml.
6. Tejpa en bit (7 cm x 7 cm) vitt papper på metalllinjalen på tillvänjningsanordningen. Se till att papperets vänstra kant är 2 cm från änden av linjalen närmast ankaret.
7. Använd dubbelhäftande tejp för att fästa botten på 35 mm-plattan i mitten av 2 tum x 2 i papper ovanpå linjalen på tillvänjningsanordningen.
8. Lämna 35 mm-plattan på tillvänjningsanordningen i minst 2 timmar (detta kan förlängas till över natten) med locket stängt. Under hela denna acklimatiseringsperiod, håll plattan i omgivande ljusförhållanden som matchar de experimentella ljusförhållandena (dvs. utsätt inte cellerna för ljusa / mörka fluktuationer). Se också till att plattan inte upplever några mekaniska störningar från oavsiktlig stötning.
9. Centrera USB-mikroskopkameran (Table of Materials) direkt ovanför Stentors 35 mm-platta. Placera vid behov en rekvisita som en pipettspetslåda under USB-mikroskopkameran (Universal Serial Bus) för att justera höjden. Alternativt kan ett ringställ användas för att justera höjden.
10. Installera webbkamerainspelningsprogrammet på en bärbar dator (materialtabell) och använd den för att visualisera cellerna via mikroskopingången.
    1. Öppna appen Webbkamerainspelare och välj USB-mikroskopet i rullgardinsmenyn. Justera fokus på USB-mikroskopkameran så att cellerna syns tydligt.
    2. Justera USB-mikroskopkamerans position för att maximera antalet celler i synfältet.
11. Öppna den seriella bildskärmen för mikrokontrollerkortet: välj No Line Ending och ställ in den på 9,600 baud.
12. Använd kommandot l på mikrokontrollerkortprogrammet för att sänka ankaret tills det knappt rör linjalen. Använd kommandot r för att höja armen om det behövs för att justera den exakta positionen.
    OBS: Om ankaret är ett betydande avstånd från linjalen, skriv in d-kommandot för att inaktivera motorspolens ström så att armen kan flyttas manuellt mot linjalen. När du har flyttat armen manuellt använder du kommandot e för att aktivera motorspolens ström och hålla armen låst på plats. När den sänks ordentligt före starten av ett experiment bör armaturens nedre spets vara 1 cm från linjalens vänstra kant. Ankaret kommer att leverera den mekaniska pulsen genom att slå linjalen.
13. Använd kommandot i för att initiera det automatiska läget på tillvänjningsenheten.
14. Ange stegstorleken i kommandoraden. Nivå 5 är det minsta steget och nivå 1 är det största steget. Nivå 4 är den stegstorlek som används för baslinjetillvänjningsexperiment.
    OBS: En nivå 5-stimulans resulterar i en nedåtgående förskjutning av linjalen med ~ 0,5 mm; Nivå 4 resulterar i förskjutning nedåt med ~ 1 mm; Nivå 3 resulterar i nedåtgående förskjutning med ~ 2 mm; Nivå 2 resulterar i nedåtgående förskjutning med ~ 3-4 mm; och nivå 1 resulterar i nedåtgående förskjutning med ~ 8 mm. En nivå 5-stimulans resulterar i en nedåtgående toppkraft för ankaret mot linjalen på ~ 0,122 N; Nivå 4 resulterar i en nedåtgående toppkraft på ~ 0,288 N; och nivå 3 resulterar i en nedåtgående toppkraft på ~ 0,557 N. De nedåtgående krafterna som genereras av nivå 1 och nivå 2 är svårare att empiriskt kvantifiera med en dynamometer på grund av de signifikanta linjaloscillationerna som uppstår efter att ankaret har kommit i kontakt.
15. Ange tiden mellan pulserna i minuter. Intervallet som används för baslinjetillvänjningsexperiment är 1 min.
16. Börja ta en video med webbkamerainspelningsappen genom att trycka på den röda inspelningsknappen. Vänd sedan på strömbrytaren på tillvänjningsapparaten för att börja experimentet med den första automatiserade mekaniska pulsleveransen.

3. Analysera experimentvideon

1. Omedelbart innan den första mekaniska pulsen visas på videon, pausa och räkna antalet Stentor som både är förankrade i botten av 35 mm-plattan och utsträckta i en långsträckt, trumpetliknande form (figur 5A, video 1).
2. Omedelbart efter den första pulsen, räkna antalet Stentor som både är förankrade i botten av plattan och sammandragna i en bollliknande form (figur 5B, video 1).
   OBS: Kontrakterade celler är lätta att urskilja från långsträckta celler eftersom Stentor förkortar deras kroppslängd med över 50% inom 10 ms under en sammandragningshändelse³.
3. Dela den andra räkningen med den första räkningen för att bestämma fraktionen av Stentor som kontrakterade som svar på den mekaniska stimulansen.
4. Upprepa steg 3.1–3.3 för alla mekaniska pulser i experimentvideon.

Figur 5: Stentor kontraherar efter att ha fått en mekanisk stimulans. (A) Stentor är i sitt långsträckta tillstånd och förankrade i botten av petriplattan. (B) Stentor har dragit ihop sig efter att ha fått en mekanisk stimulering på nivå 4 från tillvänjningsanordningen. Bilderna är tagna med ett USB-mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1: Video av Stentor-kontrakt. Stentor får en mekanisk stimulans på nivå 4 från tillvänjningsanordningen varje minut. Dessa celler har ännu inte vant sig, så de kontraherar efter att ha fått pulsen. Cellerna finns i petriplattan placerad ovanpå tillvänjningsanordningen. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Representative Results

Metoden som beskrivs ovan, med användning av den mekaniska pulsen på nivå 4 med en frekvens av 1 kran/min, bör resultera i en progressiv minskning av Stentors sammandragningssannolikhet inom 1 h. Detta är ett tecken på tillvänjning (se figur 6, video 2).

Figur 6: Baslinjetillvänjning. Kontraktionssannolikheten för Stentor minskar gradvis under 1 h efter att ha fått mekaniska pulser på nivå 4 med en frekvens av 1 kran/min (n = 22-27). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Videor 2. Video av van Stentor. Cellerna får en mekanisk stimulans på nivå 4 efter 1 h mottagande av mekaniska pulser med samma kraft med en frekvens av 1 kran / min. De flesta cellerna har vant sig vid stimuli under timmen och drar därmed inte ihop sig. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Att ändra kraften och/eller frekvensen för den mekaniska pulstillförseln kan förändra Stentors tillvänjningsdynamik. Om du till exempel använder pulsen på nivå 2 med en frekvens på 1 kran/min utesluter du tillvänjning under 1 timme (se figur 7). En nivå 5-puls bör framkalla sammandragningar hos få till noll Stentor.

Figur 7: Brist på tillvänjning inom 1 h för starkare krafter. Kontraktionssannolikheten för Stentor minskar inte märkbart under 1 timme efter att ha fått mekaniska pulser på nivå 2 med en frekvens av 1 kran/min (n = 7-33). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

De mest kritiska stegen i protokollet avser att säkerställa att Stentor förblir i optimala förhållanden för att sammandragningar ska inträffa. Sammandragningssvaret i tillvänjningsanalysen kräver att stentorer är förankrade i en yta med hjälp av sin klibbiga hållfasthet eftersom de sällan drar ihop sig när de simmar fritt. Bottenytan på den 35 mm petriplatta som används för tillvänjningsexperiment bidrar dock vanligtvis inte till förankring om den inte är belagd med polyornitin. Dessutom kan Stentor inte utsättas för någon mekanisk störning i minst 2 timmar före tillvänjningsexperimentets början eftersom Stentor-glömskans tidsskala är 2-6 h³. Om Stentor får mekanisk stimulering inom 2 timmar efter tillvänjningsexperimentets starttid, finns det en möjlighet att denna tidigare stimulering kommer att inducera en liten nivå av tillvänjning före experimentet, vilket minskar sammandragningssannolikheten efter att tillvänjningsanordningen levererar den första mekaniska pulsen. Slutligen, under analyssteget, är det viktigt att bara räkna antalet Stentor som dras samman efter en puls - snarare än några tillfälliga spontana sammandragningar som inträffar före pulsleveransen - för att få en korrekt avläsning av den fraktion av celler som drog ihop sig som svar på den mekaniska stimuleringen.

Protokollet kan lätt modifieras för att studera olika typer av tillvänjningsdynamik genom att ändra kraften och frekvensen hos de mekaniska pulser som levereras av tillvänjningsanordningen. Detta ger också en möjlighet att utforska andra typer av lärande, såsom sensibilisering, som kan uppstå i Stentor. Själva programkoden för mikrokontrollerkortet kan också justeras för att leverera olika mönster av mekaniska kranar till Stentor.

Ett potentiellt problem att felsöka med detta protokoll är den låga frekvensen av Stentor-förankring , vilket kan begränsa antalet Stentor som kan observeras i tillvänjningsexperimentet. Förankringsfrekvensen reduceras ibland i Stentor-kulturer som inte nyligen har matats eller är förorenade. För att lösa detta problem bör man tvätta en ny sats Stentor för att starta en ny kultur och mata dem regelbundet enligt protokollet som beskrivs i Lin et ^al.10.

Detta protokoll är begränsat genom att endast en enda platta av Stentor kan testas åt gången, vilket resulterar i relativt låga genomströmningsmätningar. Dessutom tillåter nuvarande programvara inte automatisering av encellsbildanalys. De flesta uppgifter som inhämtas är därför på befolkningsnivå. Framtida modeller av tillvänjningsanordningen och bildanalysverktyg kan underlätta encellsexperiment med hög genomströmning.

Tillvänjning i Stentor har tidigare studerats med metoder som beskrivs av Wood³, men detta nya protokoll gör det möjligt att automatisera experiment. Automatisering gör det inte bara möjligt för forskaren att reproducerbart leverera mekaniska pulser med en viss kraft och frekvens utan underlättar också långsiktiga tillvänjningsexperiment eftersom enheten kan lämnas igång utan övervakning i flera dagar. Att använda en stegmotor snarare än solenoiden som används i Woods experiment³ minskar dessutom risken för avmagnetisering över tid och gör det också möjligt att variera stimulansens styrka under ett enda experiment.

Att studera cellulär tillvänjning kan avslöja kliniska insikter för tillstånd som uppmärksamhetsunderskott / hyperaktivitetsstörning (ADHD) och Tourettes syndrom där tillvänjningen är nedsatt¹¹. Stentors tillvänjningsmekanismer kan också avslöja nya icke-synaptiska inlärningsparadigmer oberoende av komplexa cellulära kretsar. Slutligen kan insikter om encellsinlärning inspirera metoder för omprogrammering av celler i flercelliga vävnader - en annan potentiell väg att bekämpa sjukdomar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% Poly-ornithine	Millipore Sigma	P4957	Used to coat Petri plate
35-mm Petri plate	Benz Microscope Optics Center Inc.	L331	Contains Stentor during experiments
6-well plate	StemCell Technologies	38016	Used to wash Stentor
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1)	Thorlabs	MB424	Used to construct habituation device
Big easy driver stepper motor driver board (x1)	Sparkfun	ROB-12859	Used to construct habituation device
Construction rail, 1" x 5'' (x2)	Newport	Newport CR-1	Used to construct habituation device
Laptop	Apple Store	https://www.apple.com/macbook-air-m1/	Connect laptop to USB microscope to visualize experiments
Large right-angle bracket (x1)	Thorlabs	AP90RL	Used to construct habituation device
Microcontroller board	Arduino	A000066	Used to control habituation device
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead	Stepperonline.com	5-17HS19-2004S1	Used to construct habituation device
Pasteurized spring water	Carolina	132458	Media for Stentor experiments
Right-angle bracket (x3)	Thorlabs	AP90	Used to construct habituation device
Stemi 2000 stereo microscope	Zeiss		Used to visualize Stentor during wash steps
Stentor coeruleus	Carolina	131598	These are the cells used for habituation experiments
USB microscope	Celestron	44308	Used to visualize and record experiments
Webcam recorder	Apple Store	https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12	Install this application to take videos of experiments