Summary
प्रस्तुत प्रोटोकॉल 96-अच्छी तरह से उच्च-थ्रूपुट डायलिसिस प्लेट का उपयोग करके प्रोटीन क्रिस्टलीकरण स्थितियों और क्रिस्टल विकास की जांच के लिए एक सीधा दृष्टिकोण का वर्णन करता है। माइक्रोक्रिस्टल के बड़े पैमाने पर विकास के लिए डायलाइज़र ट्यूबों का उपयोग सीरियल क्रिस्टलोग्राफी और माइक्रोईडी अनुप्रयोगों के लिए भी प्रदर्शित किया गया है।
Abstract
आणविक स्तर पर प्रोटीन जैसे मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचना-कार्य संबंधों को समझना बायोमेडिसिन और आधुनिक दवा की खोज के लिए महत्वपूर्ण है। आज तक, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी परमाणु संकल्प पर तीन आयामी प्रोटीन संरचनाओं को हल करने के लिए सबसे सफल तरीका बनी हुई है। सीरियल क्रिस्टलोग्राफी में हालिया प्रगति के साथ, या तो एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर (एक्सएफईएल) या सिंक्रोट्रॉन प्रकाश स्रोतों का उपयोग करके, प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी अगली सीमा तक प्रगति की है, जहां समय-हल किए गए डेटा प्राप्त करने की क्षमता कमरे के तापमान पर जैविक अणुओं के व्यवहार में महत्वपूर्ण यांत्रिक अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। यह प्रोटोकॉल 96-वेल डायलिसिस प्लेट के उपयोग के माध्यम से क्रिस्टलीकरण स्थितियों की स्क्रीनिंग के लिए एक सीधा उच्च-थ्रूपुट (एचटीपी) वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। ये प्लेटें सोसाइटी फॉर बायोमोलेक्यूलर स्क्रीनिंग (एसबीएस) मानक का पालन करती हैं और किसी भी मानक क्रिस्टलीकरण प्रयोगशाला का उपयोग करके आसानी से स्थापित की जा सकती हैं। एक बार इष्टतम स्थितियों की पहचान हो जाने के बाद, डायलाइज़र का उपयोग करके बड़ी मात्रा में क्रिस्टल (सैकड़ों माइक्रोक्रिस्टल) का उत्पादन किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की मजबूती और बहुमुखी प्रतिभा को मान्य करने के लिए, चार अलग-अलग प्रोटीन क्रिस्टलीकृत किए गए थे, जिनमें दो झिल्ली प्रोटीन शामिल थे।
Introduction
पिछली शताब्दी में, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचना-कार्य प्रतिमान को स्पष्ट करने और समझने में महत्वपूर्ण रही है। आज तक, यह कई विशिष्ट रूप से अलग-अलग प्रोटीनों की परमाणु संकल्प संरचनाओं को स्पष्ट करने में सबसे सफल तरीकों में से एक है जो सेल बायोकैमिस्ट्री, चिकित्सा और प्रारंभिक दवा की खोज 1,2 की मौलिक समझ के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण कई प्रोटीन लक्ष्यों, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन और बड़े प्रोटीन कॉम्प्लेक्सका अध्ययन करने में एक बाधा बना हुआ है। नतीजतन, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण को लगभग हमेशा श्रम-गहन परीक्षण-और-त्रुटि दृष्टिकोण के कारण एक कला माना जाता है।
एक अवक्षेपण एजेंट को आमतौर पर उच्च सांद्रता पर प्रोटीन समाधान में जोड़ा जाता है ताकि प्रोटीन अणुओं की एक अच्छी तरह से व्यवस्थित, नियमित और दोहराई जाने वाली जाली व्यवस्था बनाई जा सके, जिसे क्रिस्टल के रूप में जाना जाता है। अनुकूल परिस्थितियों में, जैसे तापमान, पीएच, एकाग्रता, और प्रीसिपेटेंट एजेंट, एक सुपरसैचुरेटेड समाधान अंततः बनता है, इसके बाद क्रिस्टल न्यूक्लियेशन और विकास 7,8 होता है। यद्यपि क्रिस्टलीकरण परीक्षण सेटअप में कई प्रगति हुई है, मुख्य रूप से उच्च-थ्रूपुट रोबोटिक सिस्टम के विकास और तैयार "विरल मैट्रिक्स" स्क्रीन की उपलब्धता के साथ, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए सामान्य दृष्टिकोण काफी हद तक वर्षों से अपरिवर्तित रहे हैं। सामान्य प्रयोगात्मक प्रोटीन क्रिस्टलीकरण तकनीकों में वाष्प प्रसार (हैंगिंग ड्रॉप और सिटिंग ड्रॉप)9, माइक्रोबैच (तेल के नीचे) 10,11, फ्री-इंटरफ़ेस डिफ्यूजन (माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस) 12, और डायलिसिस (बटन और अन्य तकनीकों का उपयोग करके) 13,14,15 शामिल हैं। हालांकि, अन्य अधिक विशेष सेटअप भी मौजूद हैं, जैसे झिल्ली प्रोटीन16,17 को क्रिस्टलीकृत करने के लिए मेसोफ़ेज़ दृष्टिकोण। जबकि प्रोटीन डेटा बैंक में जमा एक्स-रे प्रोटीन संरचनाओं के बहुमत को अब तक वाष्प प्रसार विधियों 6,18 द्वारा क्रिस्टलीकरण के माध्यम से हल किया गया है, डायलिसिस द्वारा क्रिस्टलीकरण जैसे अन्य दृष्टिकोण, कम उपयोग किए जाते हैं, संभवतः उनके प्रयोगात्मक सेटअप से संबंधित व्यावहारिक पहलुओं के कारण।
डायलिसिस द्वारा क्रिस्टलीकरण केवल एक अर्ध-पारगम्य झिल्ली के माध्यम से विलेय (प्रीसिपेटेंट्स, आयन, एडिटिव्स और बफर) के धीमे प्रसार पर निर्भर करता है जो एक साथ प्रोटीन अणुओं को प्रसारित होने से रोकता है। इस तरह, प्रोटीन समाधान को धीरे-धीरे संतुलन में लाया जाता है, जिसमें प्रीसिपेटेंट क्रिस्टलीकृत करने के लिए आवश्यक एकाग्रता तक पहुंचता है। सिस्टम का कैनेटीक्स तापमान, प्रीसिपेटेंट एकाग्रता और सेल्यूलोज झिल्ली आणविक भार कट-ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) 19 पर निर्भर करता है। आज तक, डायलिसिस द्वारा सबसे लोकप्रिय क्रिस्टलीकरण सेटअप पारदर्शी ऐक्रेलिक शीट से बने माइक्रोडायलिसिस बटन का उपयोग कर रहा है। ये आमतौर पर जलाशयों में डूबे होते हैं (ज्यादातर वाष्प प्रसार हैंगिंग ड्रॉप प्लेटों का उपयोग करके) जिसमें क्रिस्टलीकरण प्रीसिपेटेंट समाधान होते हैं। हालांकि, इस निचले-थ्रूपुट विधि को बटन कक्ष पर रखे डायलिसिस झिल्ली के भीतर प्रोटीन समाधान को सील करने के लिए विशिष्ट असेंबली की भी आवश्यकता होती है, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। इसके अलावा, डायलिसिस झिल्ली और प्रोटीन समाधान के बीच फंसे हवा के बुलबुले एक लगातार समस्या है जो क्रिस्टल विकास को बाधित करते हैं। विधि की एक और बाधा नमूना आवश्यकताएं हैं, जिससे डायलिसिस बटन को समायोजित करने के लिए वाष्प प्रसार विधियों की तुलना में बहुत अधिक सांद्रता और मात्रा आवश्यक है। इसलिए, माइक्रोडायलिसिस बटन का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण को एक अप्रिय विधि के रूप में माना जाता है, खासकर झिल्ली प्रोटीन जैसे कठिन लक्ष्यों के लिए, जिनकी शुद्धि पैदावार निराशाजनक रूप से कम होती है। हाल ही में, डायलिसिस15 द्वारा प्रोटीन क्रिस्टलीकरण की सुविधा के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण विकसित किए गए हैं। इन चिप्स को कम पृष्ठभूमि के साथ उच्च एक्स-रे पारदर्शिता के लिए भी डिज़ाइन किया गया है, जिससे चिप्स को कमरे के तापमान पर सीटू डेटा संग्रह के लिए उपयोग किया जा सकता है, इस प्रकार कटाई और क्रायोकूलिंग क्रिस्टल की असुविधा को समाप्त किया जा सकता है। इन प्रगति के बावजूद, दृष्टिकोण अभी भी बहुत कम थ्रूपुट और महंगा है।
चित्रा 1: डायलिसिस बटन का उपयोग करके डायलिसिस द्वारा क्रिस्टलीकरण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) क्रिस्टलीकरण डायलिसिस बटन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) प्रोटीन समाधान को माइक्रोडायलिसिस बटन कक्ष में जोड़ा जाता है। (सी) डायलिसिस झिल्ली को एक एप्लिकेटर के माध्यम से लागू रबर रिंग (ओ-रिंग) की मदद से माइक्रोडायलिसिस बटन पर रखा जाता है। (डी) डायलिसिस बटन क्रिस्टलीकरण समाधान (डायलिसिस समाधान) वाले जलाशय में डुबोने के लिए तैयार है, जैसा कि (ई) में दिखाया गया है। वाष्पीकरण से बचने के लिए डूबे हुए डायलिसिस बटन वाली शीशी को सील किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
यहां, 96-अच्छी तरह से उच्च-थ्रूपुट डायलिसिस प्लेट का उपयोग करके प्रोटीन क्रिस्टलीकरण स्थितियों और क्रिस्टल विकास की जांच के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इन डिस्पोजेबल प्लेटों को वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण प्लेटों (पिपेट फिर सील) के समान उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। प्लेटें 3.2 μL प्रोटीन और 350 μL डायलिसिस समाधान को समायोजित कर सकती हैं। कुओं के बीच क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में एक अलग पुनर्जीवित सेल्यूलोज झिल्ली होती है। सेटअप को पूरा करने में लगभग 10 मिनट लगते हैं और सभी मानक क्रिस्टलीकरण प्रयोगशालाओं में जो पाया जा सकता है, उसके अलावा किसी भी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है। दो झिल्ली प्रोटीन सहित चार अलग-अलग प्रोटीन, उच्च-थ्रूपुट (एचटीपी) प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक प्रभावी विधि के रूप में इस दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने और मान्य करने के लिए उपयोग किए जाते हैं।
चित्रा 2: माइक्रोडायलिसिस प्लेट का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण वर्कफ़्लो। (ए) लाल चिपकने वाला "कवर फिल्म" को हटाना। (बी) प्रत्येक बूंद कुओं में प्रोटीन की बूंदों को वितरित करना। (सी) कुओं को यूवी "कवर फिल्म" के साथ कवर किया गया है। (डी) डायलिसिस समाधान (या क्रिस्टलीकरण स्क्रीन) जोड़ने के लिए प्लेट उलटा है। (ई) प्लेट को सील और इनक्यूबेट किया जाता है। (F, G) बूंदों का माइक्रोस्कोप निरीक्षण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
डायलिसिस प्रोटोकॉल द्वारा इस क्रिस्टलीकरण का उपयोग माइक्रोक्रिस्टल के बड़े पैमाने पर (सैकड़ों से हजारों) उत्पादन के लिए 0.5 एमएल डायलाइज़र ट्यूब (चित्रा 3) का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था, जो एक्सएफईएल सुविधाओं20,21,22,23,24 और सिंक्रोट्रॉन 25,26,27 दोनों में सीरियल क्रिस्टलोग्राफी जैसे अत्याधुनिक डेटा संग्रह विधियों के लिए उपयुक्त है। , साथ ही माइक्रोईडी 28,29,30 दृष्टिकोणों के लिए।
चित्रा 3: डायलाइज़र ट्यूब का उपयोग करके बड़े पैमाने पर माइक्रोडायलिसिस क्रिस्टलीकरण। (ए) 0.5 एमएल डायलाइज़र ट्यूब का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) क्रिस्टलीकरण समाधान वाले बीकर का साइड व्यू और एक डायलाइज़र ट्यूब रखने वाले फ्लोटिंग ट्यूब रैक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
1. प्रोटीन नमूना तैयार करना
- तैयार करें (पुनः संयोजक विधियों के माध्यम से या अन्यथा) और एक उपयुक्त बफर (यानी, जो प्रोटीन स्थिरता और क्रिस्टलीकरण के लिए उत्तरदायी है) में रुचि के प्रोटीन (ओं) को शुद्ध करें जिसे 0.22 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर किया गया है ( सामग्री की तालिका देखें)। क्रिस्टलीकरणसे पहले प्रोटीन की गुणवत्ता (शुद्धता, पॉलीस्प्रेटिटी और स्थिरता के संदर्भ में) का मूल्यांकन करें।
नोट: कृपया वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन और बफर पर विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें। - सही एमडब्ल्यूसीओ कंसंट्रेटर का उपयोग करके नमूने को 10-50 mg.mL-1 या उससे अधिक (प्रोटीन लक्ष्य के आधार पर) तक केंद्रित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: केंद्रित नमूने का उपयोग क्रिस्टलीकरण के लिए तुरंत किया जा सकता है या -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है। - यदि प्रोटीन जम गया है, तो किसी भी अवांछित सामग्री (जैसे, अवक्षेप) को गोली मारने और हटाने के लिए बेंच-टॉप सेंट्रीफ्यूज (≥16,000 × ग्राम, कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर) में 10 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
- प्रोटीन को साफ 200 μL पीसीआर ट्यूबों में मिलाएं। यदि प्रोटीन कमरे के तापमान पर अस्थिर है तो इसे बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
2. माइक्रोडायलिसिस प्लेट स्थापित करना
नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोडायलिसिस प्लेट ( सामग्री की तालिका देखें) में एक पुनर्जीवित सेल्यूलोज झिल्ली (विभिन्न एमडब्ल्यूसीओ में उपलब्ध) के साथ दो पक्ष ('प्रोटीन साइड' और 'बफर साइड') होते हैं, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।
- प्लेट केंद्रित प्रोटीन साइड के साथ, वापस छीलें और चिपकने वाला कवर टेप (चित्रा 2 ए) को 200 μm दबाव चिपकने वाला स्पेसर से हटा दें। वेल ए 1 की स्थिति पर ध्यान दें।
- मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में अधिकतम 3.2 μL प्रोटीन (चरण 1.4) लोड करें (चित्रा 2 बी)।
नोट: प्रोटीन को दोहराए जाने वाले डिस्पेंसिंग पिपेट का उपयोग करके भी लोड किया जा सकता है। एकल-चैनल पिपेट का उपयोग करना संभव है, लेकिन यह विस्तारित लोडिंग समय के कारण होने वाली बूंदों के आंशिक निर्जलीकरण की संभावना को बढ़ाएगा। - 96-वेल प्लेट पर 200 μm UV कवर फिल्म ( सामग्री की तालिका देखें) रखें और इसकी अखंडता की जांच करें (चित्रा 2C)। सुनिश्चित करें कि सुरक्षात्मक फिल्म का सामना करना पड़ रहा है।
- सीलिंग पैडल का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें), दबाव चिपकने वाले को सक्रिय और सील करने के लिए यूवी कवर फिल्म दबाएं।
- प्लेट को पलटें और अच्छी तरह से ए 1 की स्थिति पर ध्यान दें। सुनिश्चित करें कि प्लेट उन्मुख बफर साइड है और अच्छी स्थिति को प्रतिबिंबित किया गया है (चित्रा 2 डी)।
- मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुओं में डायलिसिस समाधान के अधिकतम 350 μL लोड करें (चित्रा 2 डी)।
नोट: इस चरण में, या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रिस्टलीकरण स्क्रीन (विरल मैट्रिक्स स्क्रीन) या प्रयोगशाला-निर्मित अनुकूलित स्क्रीन (ग्रिड स्क्रीन) का उपयोग किया जा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें)। - 'जलाशय कवर फिल्म' के साथ कुओं को सावधानीपूर्वक सील करें ( सामग्री की तालिका देखें) (चित्रा 2 ई)।
- क्रिस्टल विकास के लिए एक उपयुक्त तापमान-नियंत्रित इनक्यूबेटर (20 डिग्री सेल्सियस) में प्लेट (बफर साइड अप) रखें।
नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए चुने गए प्रोटीन के लिए, क्रिस्टल 20 डिग्री सेल्सियस पर 1-8 घंटे के बीच दिखाई देने लगे। - माइक्रोस्कोप के तहत क्रिस्टल का निरीक्षण करने के लिए, प्रोटीन साइड को ऊपर लाने के लिए प्लेट को उलटा करें और 200 μm UV कवर फिल्म (चरण 2.3) से सुरक्षात्मक फिल्म को हटा दें, जैसा कि चित्र 2F, G में दिखाया गया है।
3. डायलाइज़र ट्यूबों का उपयोग करके बड़े पैमाने पर क्रिस्टलीकरण
नोट: एक बार माइक्रोडायलिसिस प्लेट का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण की स्थिति का पता लगाने के बाद, प्रोटीन के बड़े पैमाने पर क्रिस्टलीकरण (सीरियल क्रिस्टलोग्राफी या अन्य उद्देश्यों के लिए) डायलाइज़र ट्यूब का उपयोग करके किया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। माइक्रोडायलिसिस प्लेट के समान, ये उपकरण 3, 5, 10 और 30 केडीए एमडब्ल्यूसीओ डायलिसिस झिल्ली के साथ उपलब्ध हैं।
- बड़े कंटेनरों में माइक्रोक्रिस्टल के विकास के लिए अनुकूलित क्रिस्टलीकरण स्थिति तैयार करें (माइक्रोडायलिसिस प्लेट का उपयोग करके अनुकूलित शर्तों को अपनाना)। सुनिश्चित करें कि बफर को पहले 0.2 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर किया गया है।
- प्रोटीन को डायलाइज़र ट्यूब (0.5 एमएल की अधिकतम मात्रा) में डालें और शामिल लाल प्लास्टिक टोपी (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके अंत को सील करें।
- 500 μL डायलाइज़र ट्यूब को एक उपयुक्त आकार के कंटेनर (डायलिसिस समाधान की कुल मात्रा के आधार पर) में रखें जिसमें फ्लोटिंग रैक ( सामग्री की तालिका देखें) शामिल है, जैसा कि चित्र 3 बी में दिखाया गया है।
नोट: डायलाइज़र किट के साथ प्रदान किए गए फ्लोटिंग रैक में एक साथ 18 डायलाइज़र ट्यूब होते हैं। - क्रिस्टल विकास के लिए कंटेनर को एक उपयुक्त तापमान-नियंत्रित इनक्यूबेटर (20 डिग्री सेल्सियस) में स्थिर रखें।
- क्रिस्टल का निरीक्षण करने के लिए, ग्लास कवर स्लाइड पर घोल के 1-2 μL का उपयोग करें। शीर्ष पर एक दूसरे ग्लास कवर स्लाइड के साथ कवर करें (अतिरिक्त निर्जलीकरण को रोकने के लिए) और माइक्रोस्कोप के तहत देखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: निरीक्षण के दौरान दो ग्लास कवर स्लाइड के बीच सैंडविच होने पर क्रिस्टल क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। क्रिस्टल को सीधे एक स्टीरियो उच्च-आवर्धन माइक्रोस्कोप के नीचे डायलाइज़र ट्यूब रखकर भी देखा जा सकता है।
Representative Results
माइक्रोडायलिसिस प्लेट (10 केडीए एमडब्ल्यूसीओ झिल्ली के साथ) का उपयोग करके चार प्रोटीनों को क्रिस्टलीकृत किया गया था, जिसमें दो झिल्ली प्रोटीन शामिल थे। लियोफिलाइज्ड पाउडर से चिकन अंडे-सफेद लाइसोजाइम (सामग्री की तालिका देखें) को 20 एमएम एनएओएसी (पीएच 4.5) में 50 mg.mL-1 पर तैयार किया गया था, और लियोफिलाइज्ड थाउमैटिन (सामग्री की तालिका देखें) को 25 mg.mL -1 की अंतिम एकाग्रता तक पानी में भंग कर दिया गया था। इस अध्ययन में उपयोग किए गए दो झिल्ली प्रोटीन ई कोलाई मल्टीड्रग एफ्लक्स पंप एसीआरबी और ई कोलाई लैक्टोज ट्रांसपोर्टर लैसी थे। एसीआरबी को सी 43 (डीई 3) कोशिकाओं का उपयोग करके व्यक्त किया गया था और एनआई-एनटीए आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा 10 एमएम ट्राइस (पीएच 7.5), 300 एमएम एनएसीएल, 0.03% (डब्ल्यू / वी) एन-डोडेसिल-β-डी-माल्टोसाइड (डीडीएम), और 5% (वी / वी) ग्लिसरॉल32 में शुद्ध किया गया था। इसके बाद, प्रोटीन को 6 mg.mL -1 की अंतिम एकाग्रता के लिए 100 केडीए एमडब्ल्यूसीओ केन्द्रापसारक सांद्रक का उपयोग करके केंद्रित किया गया था। LacY को C43 (DE3) कोशिकाओं में भी व्यक्त किया गया था, जिसे Ni-sepharose आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया था, इसके बाद 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.03% (w/v) DDM में आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी थी, और 100 kDA MWCO कंसंट्रेटर का उपयोग करके 10 mg.mL-1 4,33 तक केंद्रित किया गया था।
लाइसोजाइम और थाउमेटिन प्रोटीन के लिए, 96-वेल माइक्रोडायलिसिस प्लेट को डायलिसिस समाधान के रूप में घर में तैयार क्रिस्टलीकरण ग्रिड स्क्रीन से भरा गया था, जबकि झिल्ली प्रोटीन एसीआरबी के लिए, पहले प्रकाशित क्रिस्टलीकरण स्थिति34 से घर में एक ग्रिड स्क्रीन तैयार की गई थी। LacY के लिए, प्रारंभिक हिट स्थितियां एक वाणिज्यिक स्क्रीन ( सामग्री की तालिका देखें) से पाई गईं और आगे इन-हाउस बनाई गई ग्रिड स्क्रीन के साथ अनुकूलित की गईं। लाइसोजाइम, थाउमेटिन और एसीआरबी के लिए क्रिस्टलीकरण ड्रॉप अनुपात 1: 100 था, जिसमें 2 μL प्रोटीन और 200 μL प्रीसिपेटेंट (डायलिसिस समाधान) था। उपलब्ध प्रोटीन की कम मात्रा के कारण, 1 μL प्रोटीन से 100 μL डायलिसिस समाधान के साथ LacY क्रिस्टलीकरण बूंदें भी 1: 100% अनुपात में थीं।
माइक्रोडायलिसिस प्लेट के साथ सेटअप के बाद झिल्ली प्रोटीन सहित सभी चार प्रोटीनों के क्रिस्टल 1-8 घंटे के बीच 20 डिग्री सेल्सियस पर दिखाई देने लगे। इस मामले में, झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए डिटर्जेंट के साथ डायलिसिस समाधान को पूरक करना आवश्यक नहीं था, आमतौर पर झिल्ली प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने के लिए मानक डायलिसिस प्रक्रिया के दौरान किया जाता है, क्योंकि डिटर्जेंट मिसेल डायलिसिस झिल्ली35 के एमडब्ल्यूसीओ से बड़े होने की उम्मीद थी।
माइक्रोडायलिसिस प्लेट (चित्रा 4) पर प्रोटीन के सफल क्रिस्टलीकरण के बाद, क्रिस्टलीकरण की स्थिति का उल्लेख किया गया था, और डायलिसिस द्वारा बड़े पैमाने पर क्रिस्टलीकरण उसी 10 केडीए एमडब्ल्यूसीओ डायलिसिस झिल्ली के साथ डायलाइज़र ट्यूब का उपयोग करके किया गया था। प्रत्येक व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए हजारों माइक्रोक्रिस्टल डायलाइज़र के अंदर बढ़े, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है। थाउमेटिन क्रिस्टलीकरण के लिए, 250 μL प्रोटीन को डायलाइज़र पर लोड किया गया था और 50 एमएल (1: 200 अनुपात) के खिलाफ डायलाइज्ड किया गया था। एसीआरबी के लिए, 25 एमएल डायलिसिस समाधान (1: 100) के खिलाफ 250 μL प्रोटीन डायलिसिस किया गया था। लैकी क्रिस्टलीकरण भी 100 μL प्रोटीन से 10 एमएल डायलिसिस समाधान के साथ उसी अनुपात में स्थापित किया गया था।
चित्रा 4: क्रिस्टल माइक्रोडायलिसिस प्लेट का उपयोग करके डायलिसिस द्वारा उगाए जाते हैं। प्रोटोकॉल घुलनशील प्रोटीन के साथ सेटअप की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करता है: (ए) लाइसोजाइम को 0.1 एम एनएओएसी (पीएच 4.0), 0.5 एम एनएसीएल और 25% (वी / वी) ग्लिसरॉल के खिलाफ डायलाइज्ड किया गया था। (बी) थौमेटिन को 0.1 एम बिस-ट्रिस प्रोपेन (पीएच 6.6), 1 एम के / ना टार्टरेट और 18% (वी / वी) एथिलीन ग्लाइकोल के खिलाफ डायलाइज्ड किया गया था। झिल्ली प्रोटीन के लिए क्रिस्टल भी प्राप्त किए गए थे: (सी) एसीआरबी को 0.1 एम एमईएस (पीएच 5.5), 0.3 एम एनएसीएल और 20% (वी / वी) पीईजी -400 के खिलाफ डायलिसिस किया गया था। (घ) 01 एम एमईएस (पीएच 65), 01 एम एनएसीएल और 32% (वी/वी) पीईजी-300 के विरुद्ध लैकवाई का डायलिसिस किया गया था। क्रॉस पोलराइज़र के साथ स्टीरियो हाई-आवर्धन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को कैप्चर किया गया था। स्केल बार: (ए, बी, डी) = 1 मिमी; (C) = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: डायलाइज़र ट्यूब का उपयोग करके डायलिसिस द्वारा उगाए गए झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल की प्रतिनिधि छवियां। (ए) माइक्रोक्रिस्टल से भरी ट्यूब दिखाने वाली छवि (काले तीर द्वारा इंगित)। (बी) 0.5 एमएल डायलाइज़र ट्यूब का उपयोग करके डायलिसिस द्वारा उगाए गए थाउमैटिन क्रिस्टल के घोल से 2 μL की माइक्रोस्कोपिक छवि, 0.1 M Bis-Tris प्रोपेन (pH 6.6), 1.4 M K/Na tartrate, और 18% (v/v) एथिलीन ग्लाइकोल के खिलाफ डायलाइज्ड। (सी) 0.1 एम एमईएस (पीएच 5.5), 0.3 एम एनएसीएल, और 20% (वी / वी) पीईजी -400 के खिलाफ डायलिसिस द्वारा उगाए गए एसीआरबी माइक्रोक्रिस्टल की डार्क-फील्ड (बाएं) और उज्ज्वल-क्षेत्र (दाएं) छवियां। (डी) 0.1 एम एमईएस (पीएच 6.5), 0.1 एम एनएसीएल, और 32% (वी / वी) पीईजी -300 के खिलाफ डायलिसिस द्वारा उगाए गए लैकवाई माइक्रोक्रिस्टल की डार्क-फील्ड (बाएं) और उज्ज्वल-क्षेत्र (दाएं) छवियां। कुछ अवक्षेप देखे जाते हैं। स्केल सलाखों: (बी, डी) = 200 μm; (C) = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
वर्तमान में, डायलिसिस द्वारा क्रिस्टलीकरण सबसे कम उपयोग की जाने वाली क्रिस्टलीकरण विधि है, अर्थात् मौजूदा दृष्टिकोणों की कम-थ्रूपुट और थकाऊ प्रकृति के कारण, जैसे कि बटन के साथ माइक्रोडायलिसिस। यहां, एक सरल लेकिन मजबूत प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोडायलिसिस प्लेट और डायलाइज़र ट्यूब के माध्यम से डायलिसिस द्वारा प्रोटीन क्रिस्टल विकास के लिए एक एचटीपी वर्कफ़्लो का पालन करता है। लक्ष्य प्रोटीन के आधार पर, प्रक्रिया में उपयोग की जाने वाली माइक्रोडायलिसिस प्लेट और डायलाइज़र ट्यूब 3, 5, 10, या 30 केडीए एमडब्ल्यूसीओ के साथ डायलिसिस झिल्ली के विकल्प के साथ आते हैं। प्रोटोकॉल को आसानी से किसी भी मानक क्रिस्टलीकरण सुविधा में स्थापित किया जा सकता है और घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन दोनों पर लागू होने का बड़ा लाभ है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के दौरान प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड कॉम्प्लेक्स का परीक्षण नहीं किया गया था।
डायलिसिस द्वारा किसी भी क्रिस्टलीकरण दृष्टिकोण के रूप में, प्रोटीन नमूने और डायलिसिस समाधान के बीच मात्रा अनुपात महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, नमूना और डायलिसिस समाधान के बीच 1: 100 के अनुपात की सिफारिश की जाती है, लेकिन चूंकि माइक्रोडायलिसिस प्लेट डायलिसिस समाधान की अधिकतम क्षमता 350 μL की अनुमति देती है, इसलिए क्रिस्टल हिट प्राप्त करने के लिए इन अनुपातों का पता लगाया जा सकता है। क्रिस्टलीकरण प्लेटों की स्थापना करते समय प्रस्तुत प्रोटोकॉल में प्रोटीन की 1-2 μL की मात्रा का उपयोग किया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए है कि ड्रॉप्स को मैनुअल मल्टीचैनल पिपेट के साथ सटीक रूप से सेट किया जाए। इलेक्ट्रॉनिक पिपेट (मल्टीचैनल या रिपीट डिस्पेंसिंग पिपेट) या एचटीपी तरल वितरण रोबोट का उपयोग करके, कम मात्रा की बूंदों को सटीक रूप से प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार आवश्यक प्रोटीन की मात्रा कम हो जाती है। इसके अलावा, माइक्रोडायलिसिस प्लेट (अन्य पारंपरिक डायलिसिस विधियों के विपरीत) द्वारा आवश्यक डायलिसिस बफर की अपेक्षाकृत कम मात्रा के कारण, बड़े रासायनिक रिक्त स्थान का पता लगाना (संसाधनों के व्यापक उपयोग के बिना) संभव है, न केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रिस्टलीकरण स्क्रीन का उपयोग करके बल्कि अनुकूलन स्क्रीन (प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण हिट स्थिति के आसपास डिज़ाइन किया गया)।
प्रस्तुत एचटीपी प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम निर्जलीकरण और नमूना हानि को सीमित करने के लिए डायलिसिस प्लेट में छोटे प्रोटीन वॉल्यूम (0.50-3.2 μL प्रति स्थिति) का समय पर आवेदन है। इसे मल्टीचैनल पिपेट, रिपीट डिस्पेंसिंग पिपेट या रोबोटिक क्रिस्टलाइजेशन सिस्टम का उपयोग करके आसानी से कम किया जा सकता है। 20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों के लंबे इनक्यूबेशन समय, जैसे कि 2 सप्ताह से अधिक, प्रोटीन की बूंदों के निर्जलीकरण या हाल ही में गठित क्रिस्टल को नुकसान पहुंचा सकता है। डायलिसिस प्लेटों को आर्द्रीकरण कक्ष या सील करने योग्य बैग के अंदर रखने से इस प्रभाव को कम किया जा सकता है। इसके अलावा, जीवाणु विकास से बचने के लिए बाँझ सामग्री और तकनीकों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, हाल ही में, रोग तंत्र, प्रोटीन-लिगैंड बाइंडिंग इंटरैक्शन और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए प्रोटीन संरचनात्मक गतिशीलता को समझने कीबढ़ती आवश्यकता के साथ, प्रोटीन एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के क्षेत्र में नई और मौजूदा क्रिस्टलीकरण तकनीकों के विकास, क्रिस्टल नमूना वितरण के लिए आधुनिक दृष्टिकोण, एक्स-रे स्रोतों की नई पीढ़ियों और डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण के लिए नए परिष्कृत तरीकों के माध्यम से क्रांति आई है। 37,38. इसलिए, कमरे के तापमान सीरियल माइक्रो-क्रिस्टलोग्राफी का आगमन, या तो एक्सएफईएल या सिंक्रोट्रॉन प्रकाश स्रोतों का उपयोग करके किया जाता है, संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक उल्लेखनीय उपकरण के रूप में उभरा है, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन39 के क्षेत्र में। हालांकि, एक मजबूत संरचना समाधान के लिए पर्याप्त डेटा उत्पन्न करने के लिए हजारों माइक्रोक्रिस्टल की आवश्यकता होती है, जो एक आसान काम नहीं है (कम से कम पारंपरिक क्रिस्टलीकरण विधियों द्वारा)। यहां वर्णित डायलिसिस क्रिस्टलीकरण विधि बड़ी संख्या में माइक्रोक्रिस्टल के उत्पादन को सक्षम बनाती है। एक बार माइक्रोक्रिस्टल (1-10 μm) के उत्पादन के लिए क्रिस्टलीकरण की स्थिति एक माइक्रोडायलिसिस प्लेट के उपयोग के माध्यम से निर्धारित की गई है, तो 0.5 एमएल डायलाइज़र डिवाइस (चित्रा 5) का उपयोग करके बड़ी मात्रा में उच्च घनत्व वाले माइक्रोक्रिस्टल का उत्पादन किया जा सकता है। ये क्रिस्टल निश्चित लक्ष्यों या तरल जेट नमूना वितरण प्रणाली27,40 का उपयोग करके डेटा संग्रह के लिए आदर्श रूप से अनुकूल हैं। इस विधि के माध्यम से प्राप्त क्रिस्टल माइक्रोईडी अनुप्रयोगों के लिए भी उपयुक्त हो सकते हैं। हालांकि, इन्हें इस विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए उपयुक्त आकार और मोटाई तक कम करने की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि इलेक्ट्रॉन एक्स-रे फोटॉन41 की तुलना में क्रिस्टल के साथ बहुत अधिक दृढ़ता से बातचीत करते हैं।
अंत में, यहां वर्णित डायलिसिस दृष्टिकोण द्वारा क्रिस्टलीकरण संरचना निर्धारण के लिए प्रोटीन क्रिस्टलीकरण में विकसित रणनीतियों को जोड़ता है और नए प्रोटीन लक्ष्यों को निर्धारित करने के लिए नियोजित प्रयासों की सीमा का विस्तार करता है जो पहले अन्य पारंपरिक तरीकों से असफल रहे हैं।
Disclosures
सह-लेखक पास्सेल ड्रेपर और पॉल रियरडन स्विससीआई द्वारा नियोजित हैं।
Acknowledgments
हम यूनाइटेड किंगडम के व्यापार, ऊर्जा और औद्योगिक रणनीति विभाग (बीईआईएस) से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं। हम पांडुलिपि पर उनकी प्रतिक्रिया के लिए राष्ट्रीय भौतिक प्रयोगशाला से एलेक्स आर जोन्स और माइक शॉ को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tubes | Thermo Scientific | AB0620 | For aliquoting protein solutions. |
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17823----------K | Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions. |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | GSTF04700 | Membrane filters for filtering large volumes of buffers |
| 12-channel, variable 0.5 – 10 µL Research plus pipette | Eppendorf | 3125000028 | For dispensing protein drops onto the Diaplate. |
| 12-channel, variable 30 – 300 µL Eppendorf Research plus pipette | Eppendorf | 3125000060 | For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs. |
| 20 mL syringe | Fisherbrand | 15889152 | For use with syringe filters. |
| 96 well 2.2 mL deep-well plates | Thermo Scientific | AB0788 | Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet. |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000565 | With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g. |
| Diacon dialyser | SWISSCI | W72010 | Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL. |
| Diaplate 96-well plate | SWISSCI | W82010 | Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa. |
| Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | For holding dialysis solutions. |
| Floating rack | SWISSCI | n/a | Included in the Diacon kit |
| Floor-standing vibration-free incubator | Molecular Dimensions | MD5-01 | 400 L temperature-controlled incubator set to 20 °C. |
| Leica M205 C stereo microscope | Leica | Planapo 1.0x objective, 7.8x – 160x zoom range with DMC 4500 camera | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 62971 | Lyophilized protein |
| Memgold2 | Molecular Dimensions | MD1-64 | Sparse-matrix screen |
| Microlab STARlet | Hamilton | n/a | Liquid handler system. |
| Reservoir cover film | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
| Reusable bottle top filter | Thermo Scientific | DS0320-5045 | For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 µm membrane filters |
| Sealing paddle | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma Aldrich | T7638 | Lyophilized protein |
| UV cover film | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
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