Summary
Das vorgestellte Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung einer 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte. Der Einsatz von Dialysatorröhrchen für die großskalige Züchtung von Mikrokristallen wird auch für serielle Kristallographie und MicroED-Anwendungen demonstriert.
Abstract
Das Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen von Makromolekülen, wie z.B. Proteinen, auf molekularer Ebene ist für die Biomedizin und die moderne Arzneimittelforschung von entscheidender Bedeutung. Bis heute ist die Röntgenkristallographie die erfolgreichste Methode, um dreidimensionale Proteinstrukturen mit atomarer Auflösung zu lösen. Mit den jüngsten Fortschritten in der seriellen Kristallographie, entweder unter Verwendung von Röntgenlasern mit freien Elektronen (XFELs) oder Synchrotronlichtquellen, ist die Proteinkristallographie in die nächste Dimension vorgedrungen, wo die Fähigkeit, zeitaufgelöste Daten zu erfassen, wichtige mechanistische Einblicke in das Verhalten biologischer Moleküle bei Raumtemperatur liefert. Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Hochdurchsatz-Workflow (HTP) für das Screening der Kristallisationsbedingungen unter Verwendung einer 96-Well-Dialyseplatte. Diese Platten entsprechen dem Standard der Society for Biomolecular Screening (SBS) und können mit jedem Standard-Kristallisationslabor einfach eingerichtet werden. Sobald die optimalen Bedingungen identifiziert sind, können mit dem Dialysator große Mengen an Kristallen (Hunderte von Mikrokristallen) hergestellt werden. Um die Robustheit und Vielseitigkeit dieses Ansatzes zu validieren, wurden vier verschiedene Proteine kristallisiert, darunter zwei Membranproteine.
Introduction
Im letzten Jahrhundert hat die Röntgenkristallographie entscheidend dazu beigetragen, das Struktur-Funktions-Paradigma biologischer Makromoleküle aufzuklären und zu verstehen. Bis heute ist es eine der erfolgreichsten Methoden zur Aufklärung atomarer Auflösungsstrukturen vieler einzigartig unterschiedlicher Proteine, die für das grundlegende Verständnis der Zellbiochemie, der Medizin und der frühen Wirkstoffforschung von entscheidender Bedeutung sind 1,2. Die Proteinkristallisation bleibt jedoch ein Engpass bei der Untersuchung vieler Proteinziele, insbesondere von Membranproteinen und großen Proteinkomplexen3. Folglich wird die Proteinkristallisation aufgrund der arbeitsintensiven Trial-and-Error-Ansätze fast immer als Kunst angesehen 4,5,6.
Ein Fällungsmittel wird normalerweise in hoher Konzentration zu einer Proteinlösung hinzugefügt, um eine wohlgeordnete, regelmäßige und sich wiederholende Gitteranordnung von Proteinmolekülen, den sogenannten Kristallen, zu bilden. Unter günstigen Bedingungen wie Temperatur, pH-Wert, Konzentration und Fällungsmittel bildet sich schließlich eine übersättigte Lösung, gefolgt von Kristallkeimbildung und Wachstum 7,8. Obwohl es viele Fortschritte bei Kristallisationsversuchsaufbauten gegeben hat, vor allem mit der Entwicklung von Hochdurchsatz-Robotersystemen und der Verfügbarkeit von vorgefertigten "Sparse Matrix"-Bildschirmen, sind die allgemeinen Ansätze zur Proteinkristallisation im Laufe der Jahre weitgehend unverändert geblieben. Zu den gängigen experimentellen Proteinkristallisationstechniken gehören die Dampfdiffusion (hängender Tropfen und sitzender Tropfen)9, die Mikrocharge (unter Öl)10,11, die Diffusion mit freier Schnittstelle (mikrofluidische Geräte)12 und die Dialyse (unter Verwendung von Knöpfen und anderen Techniken)13,14,15. Es existieren jedoch auch andere, speziellere Aufbauten, wie z. B. Mesophasenansätze zur Kristallisation von Membranproteinen16,17. Während die Mehrzahl der in der Proteindatenbank hinterlegten Röntgenproteinstrukturen bisher durch Kristallisation mit Dampfdiffusionsmethoden 6,18 gelöst wurde, scheinen andere Ansätze, wie z.B. die Kristallisation durch Dialyse, zu wenig genutzt zu werden, was wahrscheinlich auf die praktischen Aspekte ihres Versuchsaufbaus zurückzuführen ist.
Die Kristallisation durch Dialyse beruht einfach auf der langsamen Diffusion von gelösten Stoffen (Fällungsmitteln, Ionen, Additiven und Puffern) durch eine semipermeable Membran, die gleichzeitig die Zirkulation von Proteinmolekülen verhindert. Auf diese Weise wird die Proteinlösung langsam ins Gleichgewicht gebracht, wobei das Fällungsmittel die notwendige Konzentration erreicht, um zu kristallisieren. Die Kinetik des Systems hängt von der Temperatur, der Fällmittelkonzentration und dem Molekulargewichtsgrenzwert (MWCO) der Zellulosemembran ab19. Das bisher beliebteste Kristallisationssystem in der Dialyse sind Mikrodialyseknöpfe aus transparenten Acrylplatten. Diese werden in der Regel in Reservoirs getaucht (meist unter Verwendung von Dampfdiffusions-Hängetropfenplatten), die die Kristallisationsfällungslösungen enthalten. Diese Methode mit niedrigerem Durchsatz erfordert jedoch auch eine spezielle Montage, um die Proteinlösung innerhalb der Dialysemembran zu versiegeln, die über der Knopfkammer platziert ist, wie in Abbildung 1 dargestellt. Darüber hinaus sind Luftblasen, die zwischen der Dialysemembran und der Proteinlösung eingeschlossen sind, ein häufiges Problem, das das Kristallwachstum beeinträchtigen. Eine weitere Einschränkung des Verfahrens sind die Probenanforderungen, bei denen im Vergleich zu Dampfdiffusionsmethoden wesentlich höhere Konzentrationen und Volumina erforderlich sind, um die Dialysetasten unterzubringen. Daher wurde die Kristallisation mit Mikrodialyseknöpfen als unattraktiv empfunden, insbesondere für schwierige Ziele wie Membranproteine, deren Reinigungsausbeute frustrierend gering ist. In jüngster Zeit wurden mikrofluidische Geräte entwickelt, um die Proteinkristallisation durch Dialyse zu erleichtern15. Diese Chips wurden auch so konzipiert, dass sie eine hohe Röntgentransparenz bei niedrigem Hintergrund aufweisen, so dass die Chips für die In-situ-Datenerfassung bei Raumtemperatur verwendet werden können, wodurch die Unannehmlichkeiten der Ernte und Kryokühlung von Kristallen entfallen. Trotz dieser Fortschritte ist der Ansatz immer noch sehr durchsatzarm und teuer.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Kristallisation durch Dialyse mit Hilfe von Dialysetasten. (A) Schematische Darstellung eines Kristallisationsdialyseknopfes. (B) Die Proteinlösung wird in die Mikrodialyse-Knopfkammer gegeben. (C) Die Dialysemembran wird mit Hilfe eines Gummirings (O-Rings), der über einen Applikator angebracht wird, am Mikrodialyseknopf gehalten. (D) Der Dialyseknopf kann in das Reservoir mit der Kristallisationslösung (Dialyselösung) eingetaucht werden, wie in (E) gezeigt. Die Durchstechflasche mit dem eingetauchten Dialyseknopf muss verschlossen sein, um eine Verdunstung zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Hier wird ein einfaches Protokoll für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung der 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte vorgestellt. Diese Einwegplatten sind so konzipiert, dass sie ähnlich wie die Dampfdiffusionskristallisationsplatten (Pipette und dann Versiegelung) verwendet werden können, wie in Abbildung 2 gezeigt. Die Platten können bis zu 3,2 μl Protein und 350 μl Dialyselösung aufnehmen. Jedes Bohrloch verfügt über eine separate, regenerierte Zellulosemembran, um eine Kreuzkontamination zwischen den Bohrlöchern zu verhindern. Der Aufbau dauert etwa 10 Minuten und erfordert keine spezielle Ausrüstung, außer denen, die in allen Standard-Kristallisationslabors zu finden sind. Vier verschiedene Proteine, darunter zwei Membranproteine, werden verwendet, um diesen Ansatz als effektive Methode für die Hochdurchsatz-Proteinkristallographie (HTP) zu demonstrieren und zu validieren.
Abbildung 2: Kristallisations-Workflow mit der Mikrodialyseplatte . (A) Entfernen der roten Klebefolie. (B) Abgabe der Proteintröpfchen in jede der Tropfenvertiefungen. (C) Die Vertiefungen werden mit der UV-"Abdeckfolie" abgedeckt. (D) Die Platte wird umgedreht, um die Dialyselösungen (oder das Kristallisationssieb) hinzuzufügen. (E) Die Platte wird versiegelt und inkubiert. (F,G) Mikroskopische Inspektion der Tropfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Verwendung dieses Kristallisationsprotokolls durch Dialyseprotokoll wurde anhand des 0,5-ml-Dialysatorröhrchens (Abbildung 3) für die Herstellung von Mikrokristallen im großen Maßstab (Hunderte bis Tausende) demonstriert, die für modernste Datenerfassungsmethoden wie die serielle Kristallographie an den beiden XFEL-Einrichtungen 20,21,22,23,24 und Synchrotrons25,26,27 geeignet sind , sowie für MicroED28,29,30 Ansätze.
Abbildung 3: Mikrodialysekristallisation im großen Maßstab mit dem Dialysatorröhrchen . (A) Schematische Darstellung des 0,5-ml-Dialysatorröhrchens. (B) Seitenansicht eines Becherglases, das die Kristallisationslösung enthält, und des schwimmenden Röhrchengestells, das ein Dialysatorröhrchen enthält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Protocol
1. Vorbereitung der Proteinprobe
- Präparation (durch rekombinante Methoden oder auf andere Weise) und Aufreinigung des/der interessierenden Protein(s) in einem geeigneten Puffer (d. h. einem, der für Proteinstabilität und Kristallisation geeignet ist), der mit einem 0,22-μm-Filter filtriert wurde (siehe Materialtabelle). Bewerten Sie die Proteinqualität (in Bezug auf Reinheit, Polydispersität und Stabilität) vor der Kristallisation31.
HINWEIS: Einzelheiten zu den in der vorliegenden Studie verwendeten Proteinen und Puffern finden Sie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse". - Konzentrieren Sie die Probe auf 10-50 mg.mL-1 oder höher (je nach Proteinziel) mit dem richtigen MWCO-Konzentrator (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die konzentrierte Probe kann sofort zur Kristallisation verwendet oder gefroren bei -80 °C gelagert werden. - Wenn das Protein eingefroren wurde, zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang in einer Tischzentrifuge (≥16.000 × g, bei Raumtemperatur oder 4 °C), um sie zu pelletieren und unerwünschtes Material (z. B. Ausfällungen) zu entfernen.
- Aliquotieren Sie das Protein in saubere 200-μl-PCR-Röhrchen. Bewahren Sie es auf Eis oder bei 4 °C auf, wenn das Protein bei Raumtemperatur instabil ist.
2. Einrichten der Mikrodialyseplatte
HINWEIS: Die kommerziell erhältliche Mikrodialyseplatte (siehe Materialtabelle) besteht aus zwei Seiten ("Proteinseite" und "Pufferseite") mit einer regenerierten Zellulosemembran (erhältlich in verschiedenen MWCOs), wie in Abbildung 2 dargestellt.
- Ziehen Sie mit der plattenorientierten Proteinseite nach oben das selbstklebende Abdeckband (Abbildung 2A) vom 200-μm-Druckabstandshalter ab und entfernen Sie es. Achten Sie auf die Position der Vertiefung A1.
- Laden Sie mit einer Mehrkanalpipette maximal 3,2 μl Protein (Schritt 1.4) in jede Vertiefung (Abbildung 2B).
Anmerkungen: Das Protein kann auch mit einer Wiederholungspipette beladen werden. Die Verwendung einer Einkanalpipette ist möglich, erhöht jedoch die Wahrscheinlichkeit, dass die Tropfen aufgrund der verlängerten Ladezeit teilweise dehydriert werden. - Positionieren Sie die 200 μm UV-Deckfolie (siehe Materialtabelle) über der 96-Well-Platte und überprüfen Sie ihre Unversehrtheit (Abbildung 2C). Achten Sie darauf, dass die Schutzfolie nach oben zeigt.
- Verwenden Sie ein Siegelpaddel (siehe Materialtabelle), drücken Sie die UV-Abdeckfolie nach unten, um den Druckkleber zu aktivieren und zu versiegeln.
- Drehen Sie die Platte um und notieren Sie sich die Position der Vertiefung A1. Stellen Sie sicher, dass die Platte mit der Pufferseite nach oben ausgerichtet ist und dass die Positionen der Bohrlöcher gespiegelt sind (Abbildung 2D).
- Laden Sie mit einer Mehrkanalpipette maximal 350 μl der Dialyselösung in jede der Vertiefungen (Abbildung 2D).
HINWEIS: In diesem Schritt können entweder handelsübliche Kristallisationssiebe (Sparse-Matrix-Siebe) oder im Labor hergestellte kundenspezifische Siebe (Rastersiebe) verwendet werden (siehe Materialtabelle). - Verschließen Sie die Vertiefungen vorsichtig mit der "Reservoir-Deckfolie" (siehe Materialtabelle) (Abbildung 2E).
- Legen Sie die Platte (Pufferseite nach oben) in einen geeigneten temperaturgesteuerten Inkubator (20 °C) für die Kristallzüchtung.
HINWEIS: Bei den Proteinen, die für die vorliegende Studie ausgewählt wurden, begannen die Kristalle zwischen 1-8 h bei 20 °C zu erscheinen. - Um unter dem Mikroskop nach Kristallen zu suchen, drehen Sie die Platte um, um die Proteinseite nach oben zu bringen, und entfernen Sie die Schutzfolie von der 200 μm UV-Deckfolie (Schritt 2.3), wie in Abbildung 2F,G gezeigt.
3. Großflächige Kristallisation mit Dialysatorröhrchen
HINWEIS: Nachdem die Kristallisationsbedingungen mit der Mikrodialyseplatte untersucht wurden, kann eine Kristallisation des Proteins in großem Maßstab (für die serielle Kristallographie oder andere Zwecke) mit dem Dialysatorröhrchen durchgeführt werden, wie in Abbildung 3 gezeigt. Ähnlich wie die Mikrodialyseplatte sind diese Geräte mit 3, 5, 10 und 30 kDa MWCO-Dialysemembranen erhältlich.
- Bereiten Sie die optimierte Kristallisationsbedingung für die Züchtung von Mikrokristallen in großen Behältern vor (unter Verwendung der mit der Mikrodialyseplatte optimierten Bedingungen). Stellen Sie sicher, dass der Puffer zuvor mit einem 0,2-μm-Filter gefiltert wurde.
- Pipettieren Sie das Protein in das Dialysatorröhrchen (maximales Volumen von 0,5 ml) und verschließen Sie das Ende mit der mitgelieferten roten Plastikkappe (Abbildung 3A).
- Legen Sie das 500-μl-Dialysatorröhrchen in einen Behälter geeigneter Größe (abhängig vom Gesamtvolumen der Dialyselösung), in dem sich das schwimmende Gestell befindet (siehe Materialtabelle), wie in Abbildung 3B dargestellt.
Anmerkungen: Das schwimmende Gestell, das mit dem Dialysator-Kit geliefert wird, fasst bis zu 18 Dialysatorröhrchen gleichzeitig. - Stellen Sie den Behälter stationär in einen geeigneten temperaturgeregelten Inkubator (20 °C) für die Kristallzüchtung.
- Um auf Kristalle zu prüfen, pipettieren Sie 1-2 μl der Lösung auf einen Objektträger. Decken Sie den Deckel mit einem zweiten Glasdeckobjektträger ab (um ein übermäßiges Austrocknen zu verhindern) und betrachten Sie ihn unter einem Mikroskop (siehe Materialtabelle).
Anmerkungen: Kristalle können beschädigt werden, wenn sie während der Inspektion zwischen zwei Glasabdeckungen eingeklemmt werden. Kristalle können auch direkt betrachtet werden, indem das Dialysatorrohr unter ein Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung gehalten wird.
Representative Results
Vier Proteine wurden mit der Mikrodialyseplatte (mit 10 kDa MWCO-Membranen) kristallisiert, darunter zwei Membranproteine. Das Hühnereiweiß-Lysozym aus dem lyophilisierten Pulver (siehe Materialtabelle) wurde bei 50 mg.mL-1 in 20 mM NaOAc (pH 4,5) hergestellt, und das lyophilisierte Thaumatin (siehe Materialtabelle) wurde in Wasser bis zu einer Endkonzentration von 25 mg.mL-1 gelöst. Die beiden Membranproteine, die in dieser Studie verwendet wurden, waren die E. coli-Multidrug-Efflux-Pumpe AcrB und der E. coli-Laktose-Transporter LacY. AcrB wurde unter Verwendung von C43 (DE3)-Zellen exprimiert und mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie und Größenausschlusschromatographie in 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03 % (w/v) n-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM) und 5 % (v/v) Glycerin32 gereinigt. Anschließend wurde das Protein mit einem 100 kDa MWCO-Zentrifugalkonzentrator auf eine Endkonzentration von 6 mg.mL-1 eingeengt. LacY wurde auch in C43 (DE3)-Zellen exprimiert, mittels Ni-Sepharose-Affinitätschromatographie und anschließender Größenausschlusschromatographie in 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03 % (w/v) DDM aufgereinigt und mit einem 100 kDa MWCO-Konzentrator auf 10 mg.mL-1 konzentriert 4,33.
Für die Proteine Lysozym und Thaumatin wurde die 96-Well-Mikrodialyseplatte mit einem intern als Dialyselösung hergestellten Kristallisationsgitter-Screening gefüllt, während für das Membranprotein AcrB ein intern hergestelltes Gitter-Screening aus einer zuvor veröffentlichten Kristallisationsbedingung34 hergestellt wurde. Für LacY wurden die anfänglichen Trefferbedingungen von einem kommerziellen Sieb (siehe Materialtabelle) gefunden und mit einem selbst hergestellten Gittersieb weiter optimiert. Das Kristallisationstropfenverhältnis für Lysozym, Thaumatin und AcrB betrug 1:100, mit 2 μl Protein auf 200 μl Fällungsmittel (Dialyselösung). Die LacY-Kristallisationstropfen lagen ebenfalls in einem Verhältnis von 1:100 auf, mit 1 μl Protein auf 100 μl Dialyselösung, was auf eine geringere Menge an verfügbarem Protein zurückzuführen ist.
Kristalle aus allen vier Proteinen, einschließlich der Membranproteine, traten zwischen 1 und 8 h bei 20 °C nach dem Aufbau mit der Mikrodialyseplatte auf. In diesem Fall war es nicht erforderlich, die Dialyselösung mit einem Detergenz für die Kristallisation des Membranproteins zu ergänzen, was typischerweise während des Standarddialyseprozesses geschieht, um eine Aggregation von Membranproteinen zu verhindern, da erwartet wurde, dass die Detergenzmizellen größer sein würden als die MWCO der Dialysemembranen35.
Nach der erfolgreichen Kristallisation der Proteine auf der Mikrodialyseplatte (Abbildung 4) wurden die Kristallisationsbedingungen festgestellt und eine großtechnische Kristallisation durch Dialyse unter Verwendung des Dialysatoröhrchens mit den gleichen 10 kDa MWCO-Dialysemembranen durchgeführt. Tausende von Mikrokristallen für jedes der einzelnen Proteine wuchsen im Dialysator, wie in Abbildung 5 dargestellt. Für die Thaumatinkristallisation wurden 250 μL Protein auf den Dialysator geladen und gegen 50 mL dialysiert (Verhältnis 1:200). Für AcrB wurden 250 μl Protein gegen 25 ml Dialyselösung dialysiert (1:100). Die LacY-Kristallisation wurde ebenfalls im gleichen Verhältnis mit 100 μl Protein zu 10 ml Dialyselösung durchgeführt.
Abbildung 4: Kristalle werden durch Dialyse mit Hilfe der Mikrodialyseplatte gezüchtet. Das Protokoll demonstriert die Anwendbarkeit des Aufbaus mit löslichen Proteinen: (A) Lysozym wurde gegen 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl und 25% (v/v) Glycerin dialysiert. (B) Thaumatin wurde gegen 0,1 M Bis-Tris-Propan (pH 6,6), 1 M K/Na-Tartrat und 18% (v/v) Ethylenglykol dialysiert. Kristalle wurden auch für Membranproteine erhalten: (C) AcrB wurde gegen 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl und 20% (v/v) PEG-400 dialysiert. (D) LacY wurde gegen 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl und 32% (v/v) PEG-300 dialysiert. Die Bilder wurden mit einem Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung und Kreuzpolarisator aufgenommen. Maßstabsbalken: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative Bilder von Membranproteinkristallen, die durch Dialyse mit dem Dialysatoröhrchen gezüchtet wurden. (A) Das Bild zeigt das Röhrchen voller Mikrokristalle (gekennzeichnet durch den schwarzen Pfeil). (B) Mikroskopische Aufnahme von 2 μl aus einer Aufschlämmung von Thaumatinkristallen, die durch Dialyse mit dem 0,5-ml-Dialysatorröhrchen gezüchtet wurden, dialysiert gegen 0,1 M Bis-Tris-Propan (pH 6,6), 1,4 M K/Na-Tartrat und 18 % (v/v) Ethylenglykol. (C) Dunkelfeld- (links) und Hellfeldbilder (rechts) von AcrB-Mikrokristallen, die durch Dialyse gegen 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl und 20% (v/v) PEG-400 gezüchtet wurden. (D) Dunkelfeld- (links) und Hellfeldbilder (rechts) von LacY-Mikrokristallen, die durch Dialyse gegen 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl und 32% (v/v) PEG-300 gezüchtet wurden. Es werden einige Ausscheidungen beobachtet. Maßstabsbalken: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Derzeit ist die Kristallisation durch Dialyse die am wenigsten genutzte Kristallisationsmethode, insbesondere aufgrund des geringen Durchsatzes und der langwierigen Natur der bestehenden Ansätze, wie z. B. der Mikrodialyse mit Knöpfen. Hier folgt ein einfaches, aber robustes Protokoll einem HTP-Workflow für die Züchtung von Proteinkristallen durch die Dialyse durch eine kommerziell erhältliche Mikrodialyseplatte und einen Dialysatorschlauch. Je nach Zielprotein sind die Mikrodialyseplatte und das Dialysatoröhrchen wahlweise mit einer Dialysemembran mit einem MWCO von 3, 5, 10 oder 30 kDa ausgestattet. Das Protokoll kann problemlos in jeder Standard-Kristallisationsanlage eingerichtet werden und hat den großen Vorteil, dass es sowohl auf lösliche als auch auf Membranproteine anwendbar ist. Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Komplexe wurden während dieses Protokolls jedoch nicht getestet.
Wie bei jedem Kristallisationsansatz durch Dialyse ist das Volumenverhältnis zwischen Proteinprobe und Dialyselösung entscheidend. In diesem Protokoll wird ein Verhältnis von 1:100 zwischen der Probe und der Dialyselösung empfohlen, aber da die Mikrodialyseplatte eine maximale Kapazität von 350 μl Dialyselösung zulässt, können diese Verhältnisse untersucht werden, um Kristalltreffer zu erhalten. Ein Volumen von 1-2 μL Protein wird im vorgestellten Protokoll beim Aufbau von Kristallisationsplatten verwendet. Dadurch soll sichergestellt werden, dass die Tropfen mit einer manuellen Mehrkanalpipette genau aushärten. Durch den Einsatz von elektronischen Pipetten (Mehrkanal- oder Wiederholungspipetten) oder HTP-Flüssigkeitsdosierrobotern können Tropfen mit geringerem Volumen genau erreicht werden, wodurch die benötigte Proteinmenge gesenkt wird. Darüber hinaus ist es aufgrund der relativ geringen Mengen an Dialysepuffer, die von der Mikrodialyseplatte benötigt werden (im Gegensatz zu anderen konventionellen Dialysemethoden), möglich (ohne den umfangreichen Einsatz von Ressourcen), große chemische Räume zu erkunden, und zwar nicht nur mit kommerziell erhältlichen Kristallisationssieben, sondern auch mit Optimierungsbildschirmen (die um die anfängliche Kristallisationstrefferbedingung herum ausgelegt sind).
Ein kritischer Schritt im vorgestellten HTP-Verfahren ist die rechtzeitige Applikation kleiner Proteinvolumina (0,50-3,2 μl pro Bedingung) auf die Dialyseplatte, um Dehydratisierung und Probenverlust zu begrenzen. Dies kann leicht durch den Einsatz einer Mehrkanalpipette, einer Wiederholungspipette oder eines robotergestützten Kristallisationssystems gemildert werden. Die lange Inkubationszeit, z. B. mehr als 2 Wochen, der Platten bei 20 °C kann zu einer Austrocknung der Proteintröpfchen oder zu einer Schädigung der neu gebildeten Kristalle führen. Die Aufbewahrung der Dialyseplatten in einer Befeuchtungskammer oder einem verschließbaren Beutel kann diesen Effekt abmildern. Darüber hinaus wird die Verwendung steriler Materialien und Techniken empfohlen, um Bakterienwachstum zu vermeiden.
Wie in der Einleitung erwähnt, wurde das Gebiet der Protein-Röntgenkristallographie in jüngster Zeit durch die Entwicklung neuer und bestehender Kristallisationstechniken, moderner Ansätze zur Kristallprobenabgabe, neuer Generationen von Röntgenquellen und neuer ausgeklügelter Methoden zur Datenerfassung und -verarbeitung revolutioniert36 ,37,38. Daher hat sich das Aufkommen der seriellen Mikrokristallographie bei Raumtemperatur, die entweder mit XFELs oder Synchrotronlichtquellen durchgeführt wird, zu einem bemerkenswerten Werkzeug in der Strukturbiologie entwickelt, insbesondere auf dem Gebiet der Membranproteine39. Es sind jedoch Tausende von Mikrokristallen erforderlich, um genügend Daten für eine robuste Strukturlösung zu generieren, was (zumindest mit herkömmlichen Kristallisationsmethoden) keine leichte Aufgabe ist. Das hier beschriebene Dialysekristallisationsverfahren ermöglicht die Herstellung einer großen Anzahl von Mikrokristallen. Nachdem die Kristallisationsbedingungen für die Herstellung von Mikrokristallen (1-10 μm) durch den Einsatz einer Mikrodialyseplatte bestimmt wurden, können mit dem 0,5-ml-Dialysator große Mengen an Mikrokristallen hoher Dichte hergestellt werden (Abbildung 5). Diese Kristalle eignen sich ideal für die Datenerfassung mit festen Targets oder Flüssigstrahl-Probenzufuhrsystemen27,40. Kristalle, die mit dieser Methode gewonnen werden, können auch für MicroED-Anwendungen geeignet sein. Diese müssen jedoch möglicherweise auf eine für diese spezielle Anwendung geeignete Größe und Dicke gefräst werden, da Elektronen viel stärker mit Kristallen wechselwirken als Röntgenphotonen41.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hier beschriebene Ansatz der Kristallisation durch Dialyse zu den sich entwickelnden Strategien in der Proteinkristallisation zur Strukturaufklärung beiträgt und das Spektrum der Anstrengungen erweitert, die zur Bestimmung neuer Proteinziele eingesetzt werden können, die bisher mit anderen konventionellen Methoden erfolglos waren.
Disclosures
Die Co-Autoren Pascelle Draper und Paul Reardon sind bei SWISSCI angestellt.
Acknowledgments
Wir erkennen die Finanzierung durch das britische Ministerium für Wirtschaft, Energie und Industriestrategie (BEIS) an. Wir danken Alex R. Jones und Mike Shaw vom National Physical Laboratory für ihr Feedback zum Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tubes | Thermo Scientific | AB0620 | For aliquoting protein solutions. |
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17823----------K | Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions. |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | GSTF04700 | Membrane filters for filtering large volumes of buffers |
| 12-channel, variable 0.5 – 10 µL Research plus pipette | Eppendorf | 3125000028 | For dispensing protein drops onto the Diaplate. |
| 12-channel, variable 30 – 300 µL Eppendorf Research plus pipette | Eppendorf | 3125000060 | For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs. |
| 20 mL syringe | Fisherbrand | 15889152 | For use with syringe filters. |
| 96 well 2.2 mL deep-well plates | Thermo Scientific | AB0788 | Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet. |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000565 | With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g. |
| Diacon dialyser | SWISSCI | W72010 | Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL. |
| Diaplate 96-well plate | SWISSCI | W82010 | Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa. |
| Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | For holding dialysis solutions. |
| Floating rack | SWISSCI | n/a | Included in the Diacon kit |
| Floor-standing vibration-free incubator | Molecular Dimensions | MD5-01 | 400 L temperature-controlled incubator set to 20 °C. |
| Leica M205 C stereo microscope | Leica | Planapo 1.0x objective, 7.8x – 160x zoom range with DMC 4500 camera | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 62971 | Lyophilized protein |
| Memgold2 | Molecular Dimensions | MD1-64 | Sparse-matrix screen |
| Microlab STARlet | Hamilton | n/a | Liquid handler system. |
| Reservoir cover film | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
| Reusable bottle top filter | Thermo Scientific | DS0320-5045 | For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 µm membrane filters |
| Sealing paddle | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma Aldrich | T7638 | Lyophilized protein |
| UV cover film | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
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