Summary
제시된 프로토콜은 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 접근 방식을 설명합니다. 미세 결정의 대규모 성장을 위한 투석기 튜브의 사용은 직렬 결정학 및 MicroED 응용 분야에서도 입증됩니다.
Abstract
분자 수준에서 단백질과 같은 거대분자의 구조-기능 관계를 이해하는 것은 생물의학 및 현대 신약 개발에 매우 중요합니다. 현재까지 X선 결정학은 원자 분해능에서 3차원 단백질 구조를 해결하는 가장 성공적인 방법으로 남아 있습니다. X선 자유 전자 레이저(XFEL) 또는 싱크로트론 광원을 사용하는 직렬 결정학의 최근 발전으로 단백질 결정학은 시간 분해 데이터를 획득할 수 있는 능력이 실온에서 생물학적 분자의 거동에 대한 중요한 기계론적 통찰력을 제공하는 다음 영역으로 발전했습니다. 이 프로토콜은 96웰 투석 플레이트를 사용하여 결정화 조건을 스크리닝하기 위한 간단한 고처리량(HTP) 워크플로우를 설명합니다. 이 플레이트는 SBS(Society for Biomolecular Screening) 표준을 따르며 모든 표준 결정화 실험실을 사용하여 쉽게 설정할 수 있습니다. 최적의 조건이 확인되면 투석기를 사용하여 대량의 결정(수백 개의 미세 결정)을 생성할 수 있습니다. 이 접근법의 견고성과 다양성을 검증하기 위해 2개의 막 단백질을 포함하여 4개의 서로 다른 단백질을 결정화했습니다.
Introduction
지난 세기 동안 X선 결정학은 생물학적 거대분자의 구조-기능 패러다임을 설명하고 이해하는 데 중요한 역할을 했습니다. 현재까지, 이것은 세포 생화학, 의학 및 초기 약물 발견에 대한 근본적인 이해에 중요한 많은 고유하게 다른 단백질의 원자 분해능 구조를 설명하는 가장 성공적인 방법 중 하나입니다 1,2. 그러나 단백질 결정화는 많은 단백질 표적, 특히 막 단백질과 대형 단백질 복합체를 연구하는 데 병목 현상으로 남아 있다3. 결과적으로, 단백질 결정화는 4,5,6을 사용하는 노동 집약적인 시행착오 접근법으로 인해 거의 항상 예술로 간주됩니다.
침전제는 일반적으로 고농도의 단백질 용액에 첨가되어 결정으로 알려진 단백질 분자의 잘 정렬되고 규칙적이며 반복적인 격자 배열을 형성합니다. 온도, pH, 농도 및 침전제와 같은 유리한 조건 하에서, 과포화 용액이 결국 형성되고, 결정 핵 형성 및 성장이 뒤 따른다 7,8. 결정화 시험 설정에 많은 발전이 있었지만, 주로 고처리량 로봇 시스템의 개발과 기성품 "희소 매트릭스" 스크린의 가용성으로 인해 단백질 결정화에 대한 일반적인 접근 방식은 수년 동안 크게 변하지 않았습니다. 일반적인 실험 단백질 결정화 기술에는 증기 확산 (매달린 드롭 및 앉아있는 드롭) 9, 마이크로 배치 (오일 아래) 10,11, 자유 계면 확산 (미세 유체 장치) 12 및 투석 (버튼 및 기타 기술 사용) 13,14,15이 포함됩니다. 그러나, 막 단백질을 결정화하기 위한 중간상 접근법과 같은 다른 보다 전문화된 설정도 존재한다16,17. 단백질 데이터 뱅크에 증착된 대부분의 X선 단백질 구조는 지금까지 증기 확산 방법 6,18에 의한 결정화를 통해 해결되었지만, 투석에 의한 결정화와 같은 다른 접근법은 실험 설정과 관련된 실용적인 측면으로 인해 활용도가 낮은 것으로 보입니다.
투석에 의한 결정화는 단백질 분자의 순환을 동시에 방지하는 반투과성 막을 통한 용질(침전제, 이온, 첨가제 및 완충액)의 느린 확산에 의존합니다. 이러한 방식으로 단백질 용액은 천천히 평형 상태가 되고 침전제는 결정화에 필요한 농도에 도달합니다. 시스템의 동역학은 온도, 침전제 농도 및 셀룰로오스 막 분자량 컷오프(MWCO)19에 따라 달라집니다. 현재까지 투석에 의한 가장 인기 있는 결정화 설정은 투명 아크릴 시트로 만들어진 미세 투석 버튼을 사용하는 것입니다. 이들은 일반적으로 결정화 침전제 용액을 포함하는 저장소(주로 증기 확산 매달린 드롭 플레이트 사용)에 잠겨 있습니다. 그러나 이 저처리량 방법은 그림 1과 같이 버튼 챔버 위에 놓인 투석막 내에서 단백질 용액을 밀봉하기 위한 특정 조립도 필요합니다. 더욱이, 투석막과 단백질 용액 사이에 갇힌 기포는 결정 성장을 저해하는 빈번한 문제이다. 이 방법의 또 다른 제약은 투석 버튼을 수용하기 위해 증기 확산 방법에 비해 훨씬 더 높은 농도와 부피가 필요한 샘플 요구 사항입니다. 따라서 미세 투석 버튼을 사용한 결정화는 특히 정제 수율이 실망스러울 정도로 낮은 막 단백질과 같은 어려운 표적에 대해 매력적이지 않은 방법으로 인식되어 왔습니다. 최근에, 투석에 의한 단백질 결정화를 촉진하기 위한 미세유체 장치(microfluidic devices)가 개발되었다(15). 이 칩은 또한 낮은 배경과 함께 높은 X선 투명도를 갖도록 설계되어 칩을 실온에서 현장 데이터 수집에 사용할 수 있으므로 결정을 수확하고 극저온 냉각하는 불편함을 없앨 수 있습니다. 이러한 발전에도 불구하고 이 접근 방식은 여전히 처리량이 매우 낮고 비용이 많이 듭니다.
그림 1: 투석 버튼을 사용한 투석에 의한 결정화의 개략도. (A) 결정화 투석 버튼의 개략도. (b) 단백질 용액을 미세투석 버튼 챔버에 첨가한다. (C) 투석막은 어플리케이터를 통해 적용된 고무 링(O-링)의 도움으로 미세 투석 버튼에 고정됩니다. (D) 투석 버튼은 (E)와 같이 결정화 용액(dialysis solution)이 들어있는 저장조에 침지될 준비가 된다. 침수된 투석 버튼이 들어 있는 바이알은 증발을 방지하기 위해 밀봉해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기에서는 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 프로토콜이 제시됩니다. 이 일회용 플레이트는 그림 2와 같이 증기 확산 결정화 플레이트(피펫 후 밀봉)와 유사하게 사용하도록 설계되었습니다. 플레이트는 최대 3.2 μL의 단백질과 350 μL의 투석 용액을 수용할 수 있습니다. 각 웰에는 웰 간의 교차 오염을 방지하기 위해 별도의 재생 셀룰로오스 멤브레인이 있습니다. 설정을 완료하는 데 약 10분이 소요되며 모든 표준 결정화 실험실에서 볼 수 있는 것 외에 특수 장비가 필요하지 않습니다. 2개의 막 단백질을 포함한 4개의 서로 다른 단백질을 사용하여 이 접근법이 고처리량(HTP) 단백질 결정학을 위한 효과적인 방법임을 입증하고 검증합니다.
그림 2: 미세 투석 플레이트를 사용한 결정화 워크플로우 . (A) 적색 접착제 "커버 필름"의 제거. (B) 단백질 방울을 각각의 드롭 웰에 분배하는 단계. (C) 웰은 UV "커버 필름"으로 덮여 있습니다. (D) 플레이트를 뒤집어 투석 용액(또는 결정화 스크린)을 추가합니다. (E) 플레이트를 밀봉하고 배양합니다. (에프, 지) 방울의 현미경 검사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
투석 프로토콜에 의한 이 결정화의 사용은 XFEL 시설 20,21,22,23,24 및 싱크로트론25,26,27 모두에서 직렬 결정학과 같은 최첨단 데이터 수집 방법에 적합한 대규모(수백에서 수천) 미세 결정 생산을 위해 0.5mL 투석기 튜브(그림 3)를 사용하여 입증되었습니다 뿐만 아니라 MicroED28,29,30 접근 방식.
그림 3: 투석기 튜브를 사용한 대규모 미세 투석 결정화. (A) 0.5mL 투석기 튜브의 개략도. (B) 결정화 용액을 담고 있는 비커와 투석기 튜브를 고정하는 플로팅 튜브 랙의 측면도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
1. 단백질 시료 전처리
- 0.22μm 필터로 여과된 적절한 완충액(즉, 단백질 안정성 및 결정화에 적합한 완충액)에서 관심 있는 단백질(들)을 준비하고(재조합 방법 또는 기타를 통해) 정제합니다( 재료 표 참조). 결정화 전에 단백질 품질(순도, 다분산성 및 안정성 측면에서)을 평가합니다31.
참고: 본 연구에 사용된 단백질 및 완충액에 대한 자세한 내용은 대표 결과 섹션을 참조하십시오. - 샘플을 최대 10-50 mg.mL-1 이상(단백질 표적에 따라 다름)까지 올바른 MWCO 농축기를 사용하여 농축합니다( 재료 표 참조).
참고: 농축된 샘플은 결정화를 위해 즉시 사용하거나 -80°C에서 냉동 보관할 수 있습니다. - 단백질이 냉동된 경우 벤치탑 원심분리기(≥16,000 × g, 실온 또는 4°C)에서 샘플을 10분 동안 원심분리하여 펠릿을 제거하고 원치 않는 물질(예: 침전물)을 제거합니다.
- 단백질을 깨끗한 200 μL PCR 튜브에 분취합니다. 얼음 위에 보관하거나 단백질이 실온에서 불안정한 경우 4 °C에서 보관하십시오.
2. 미세 투석판 설정
참고: 시중에서 판매되는 미세 투석 플레이트( 재료 표 참조)는 그림 2와 같이 재생 셀룰로오스 막(다른 MWCO에서 사용 가능)이 있는 두 면('단백질 측' 및 '완충액 측')으로 구성됩니다.
- 플레이트 방향의 단백질 면이 위로 향하게 하여 200μm 압력 접착 스페이서에서 접착 커버 테이프(그림 2A)를 떼어내고 제거합니다. 우물 A1의 위치를 기록해 두십시오.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 최대 3.2μL의 단백질(단계 1.4)을 각 웰에 로드합니다(그림 2B).
참고: 단백질은 반복 분주 피펫을 사용하여 로드할 수도 있습니다. 단일 채널 피펫을 사용하는 것은 가능하지만 로딩 시간이 길어짐에 따라 방울이 부분적으로 탈수될 가능성이 높아집니다. - 200 μm UV 커버 필름 ( 재료 표 참조)을 96 웰 플레이트 위에 놓고 무결성을 확인합니다 (그림 2C). 보호 필름이 위를 향하도록 하십시오.
- 밀봉 패들( 재료 표 참조)을 사용하여 UV 커버 필름을 눌러 압력 접착제를 활성화하고 밀봉합니다.
- 플레이트를 뒤집고 웰 A1의 위치를 기록해 둡니다. 플레이트가 버퍼 쪽이 위로 향하고 웰 위치가 미러링되었는지 확인합니다(그림 2D).
- 멀티채널 피펫을 사용하여 최대 350 μL의 투석 용액을 각 웰에 로딩합니다(그림 2D).
참고: 이 단계에서는 상업적으로 이용 가능한 결정화 스크린(희소 매트릭스 스크린) 또는 실험실에서 만든 맞춤형 스크린(그리드 스크린)을 사용할 수 있습니다( 재료 표 참조). - '저장소 덮개 필름'( 재료 표 참조)으로 우물을 조심스럽게 밀봉합니다(그림 2E).
- 결정 성장을 위해 플레이트(버퍼면이 위로 향하게)를 적절한 온도 조절 인큐베이터(20°C)에 놓습니다.
참고: 본 연구를 위해 선택된 단백질의 경우 결정이 20°C에서 1-8시간 사이에 나타나기 시작했습니다. - 현미경으로 결정을 검사하려면 플레이트를 뒤집어 단백질 면이 위로 오도록 하고 그림 2F,G와 같이 2.3μm UV 커버 필름에서 보호 필름을 제거합니다(단계 2.3).
3. 투석기 튜브를 이용한 대규모 결정화
참고: 미세 투석 플레이트를 사용하여 결정화 조건을 탐색한 후에는 그림 3과 같이 투석기 튜브를 사용하여 단백질의 대규모 결정화(연속 결정학 또는 기타 목적)를 수행할 수 있습니다. 미세 투석 플레이트와 유사하게 이 장치는 3kDa, 5kDa, 10kDa 및 30kDa MWCO 투석막과 함께 사용할 수 있습니다.
- 대형 용기에서 미세결정의 성장을 위해 최적화된 결정화 조건을 준비합니다(미세투석 플레이트를 사용하여 최적화된 조건 채택). 버퍼가 이전에 0.2μm 필터로 필터링되었는지 확인합니다.
- 단백질을 투석기 튜브(최대 부피 0.5mL)에 피펫팅하고 포함된 빨간색 플라스틱 캡을 사용하여 끝을 밀봉합니다(그림 3A).
- 그림 500B와 같이 3μL 투석기 튜브를 플로팅 랙(재료 표 참조)이 들어 있는 적절한 크기의 용기(투석 용액의 총 부피에 따라 다름)에 넣습니다.
알림: 투석기 키트와 함께 제공되는 플로팅 랙에는 최대 18개의 투석기 튜브를 동시에 수용할 수 있습니다. - 결정 성장을 위해 용기를 적절한 온도 조절 인큐베이터(20°C)에 고정시킵니다.
- 결정을 검사하기 위해 1-2 μL의 용액을 유리 커버 슬라이드에 피펫팅합니다. 상단에 두 번째 유리 덮개 슬라이드로 덮고(과도한 탈수를 방지하기 위해) 현미경으로 봅니다( 재료 표 참조).
알림: 검사 중에 두 개의 유리 덮개 슬라이드 사이에 크리스탈이 끼워지면 손상될 수 있습니다. 크리스탈은 투석기 튜브를 스테레오 고배율 현미경 아래에 놓아서 직접 볼 수도 있습니다.
Representative Results
2개의 막 단백질을 포함하는 4개의 단백질을 미세투석 플레이트(10kDa MWCO 막 포함)를 사용하여 결정화했습니다. 동결건조된 분말(재료 표 참조)로부터 닭고기 달걀 흰자 리소자임은 20 mM NaOAc(pH 4.5) 중 50 mg.mL-1에서 제조되었고, 동결건조된 타우마틴(재료 표 참조)은 최종 농도 25 mg.mL-1이 되도록 물에 용해되었습니다. 이 연구에 사용된 두 가지 막 단백질은 대장균 다제 유출 펌프 AcrB와 대장균 유당 수송체 LacY 였습니다 . AcrB는 C43(DE3) 세포를 사용하여 발현되고 10mM Tris(pH 7.5), 300mM NaCl, 0.03%(w/v) n-도데실-β-D-말토사이드(DDM) 및 5%(v/v) 글리세롤32. 이어서, 단백질을 100 kDa MWCO 원심분리기를 사용하여 최종 농도 6 mg.mL-1로 농축하였다. LacY는 또한 C43 (DE3) 세포에서 발현되었고, Ni-세파로스 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 후, 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.03% (w/v) DDM에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 100 kDa MWCO 농축기를 사용하여 10 mg.mL-1 4,33으로 농축되었다.
리소자임 및 타우마틴 단백질의 경우, 96-웰 미세 투석 플레이트는 투석 용액으로서 사내에서 제조된 결정화 그리드 스크린으로 채워졌고, 막 단백질 AcrB의 경우, 그리드 스크린은 이전에 발표된 결정화 조건34로부터 사내에서 제조되었다. LacY의 경우 초기 히트 조건은 상용 스크린( 재료 표 참조)에서 발견되었으며 사내에서 만든 그리드 스크린으로 더욱 최적화되었습니다. 리소자임, 타우마틴 및 AcrB에 대한 결정화 적하비는 1:100이었고, 단백질 2μL와 침전제 200μL(투석액)였습니다. LacY 결정화 방울은 또한 사용 가능한 단백질의 양이 적기 때문에 1 μL의 단백질과 100 μL의 투석 용액과 함께 1:100 비율로 나타났습니다.
막 단백질을 포함한 4가지 단백질 모두의 결정은 미세 투석 플레이트로 설정한 후 20°C에서 1-8시간 사이에 나타나기 시작했습니다. 이 경우, 막 단백질 결정화를 위해 투석 용액에 세제를 보충할 필요가 없었으며, 일반적으로 막 단백질 응집을 방지하기 위해 표준 투석 과정 동안 수행되었는데, 이는 세제 마이셀이 투석 막의 MWCO보다 클 것으로 예상되었기 때문이다(35).
미세 투석 플레이트에서 단백질의 성공적인 결정화에 이어(그림 4), 결정화 조건이 기록되었고, 동일한 10kDa MWCO 투석막이 있는 투석기 튜브를 사용하여 투석에 의한 대규모 결정화가 수행되었습니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 각 개별 단백질에 대한 수천 개의 미세 결정이 투석기 내부에서 성장했습니다. 타우마틴 결정화를 위해 250μL의 단백질을 투석기에 로드하고 50mL(1:200 비율)에 대해 투석했습니다. AcrB의 경우, 250 μL의 단백질을 25 mL의 투석 용액 (1 : 100)에 대해 투석 하였다. LacY 결정화는 또한 10 mL의 투석 용액에 100 μL의 단백질과 동일한 비율로 설정되었다.
그림 4: 미세 투석 플레이트를 사용한 투석에 의해 결정이 성장합니다. 이 프로토콜은 용해성 단백질을 사용한 설정의 적용 가능성을 보여줍니다: (A) 리소자임은 0.1M NaOAc(pH 4.0), 0.5M NaCl 및 25%(v/v) 글리세롤에 대해 투석되었습니다. (B) 타우마틴은 0.1M 비스-트리스 프로판(pH 6.6), 1M K/Na 타르타르산염 및 18%(v/v) 에틸렌 글리콜에 대해 투석되었습니다. 멤브레인 단백질에 대한 결정도 얻어졌다: (C) AcrB는 0.1 M MES (pH 5.5), 0.3 M NaCl, 및 20% (v/v) PEG-400에 대해 투석되었다. (D) LacY는 0.1M MES(pH 6.5), 0.1M NaCl 및 32%(v/v) PEG-300에 대해 투석되었습니다. 이미지는 교차 편광판이 있는 스테레오 고배율 현미경을 사용하여 캡처되었습니다. 스케일 바: (A,B,D) = 1mm; (C) = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 투석기 튜브를 사용한 투석으로 성장한 막 단백질 결정의 대표 이미지. (A) 미세 결정으로 가득 찬 튜브를 보여주는 이미지(검은색 화살표로 표시). (B) 0.5mL 투석기 튜브를 사용하여 투석하여 성장한 타우마틴 결정 슬러리에서 2μL의 현미경 이미지, 0.1M Bis-Tris 프로판(pH 6.6), 1.4M K/Na 타르타르산염 및 18%(v/v) 에틸렌 글리콜. (C) 0.1M MES(pH 5.5), 0.3M NaCl 및 20%(v/v) PEG-400에 대한 투석으로 성장한 AcrB 미세결정의 암시야(왼쪽) 및 명시야(오른쪽) 이미지. (D) 0.1M MES(pH 6.5), 0.1M NaCl 및 32%(v/v) PEG-300에 대한 투석으로 성장한 LacY 미세결정의 암시야(왼쪽) 및 명시야(오른쪽) 이미지. 일부 침전물이 관찰됩니다. 스케일 바: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
현재 투석에 의한 결정화는 가장 활용도가 낮은 결정화 방법이며, 이는 버튼을 사용한 미세 투석과 같은 기존 접근 방식의 처리량이 낮고 지루한 특성으로 인해 발생합니다. 여기에서 간단하지만 강력한 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 미세 투석 플레이트와 투석기 튜브를 통한 투석에 의한 단백질 결정 성장을 위한 HTP 워크플로우를 따릅니다. 표적 단백질에 따라 절차에 사용되는 미세 투석 플레이트와 투석기 튜브는 3, 5, 10 또는 30kDa MWCO가 있는 투석 멤브레인을 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 모든 표준 결정화 시설에서 쉽게 설정할 수 있으며 가용성 단백질과 막 단백질 모두에 적용할 수 있다는 큰 장점이 있습니다. 그러나 단백질-단백질 및 단백질-핵산 복합체는 이 프로토콜 동안 테스트되지 않았습니다.
투석에 의한 모든 결정화 접근법에서와 마찬가지로, 단백질 샘플과 투석 용액 사이의 부피 비율이 중요합니다. 이 프로토콜에서는 샘플과 투석 용액 사이의 1:100 비율이 권장되지만 미세 투석 플레이트는 최대 350μL의 투석 용액 용량을 허용하므로 이러한 비율을 탐색하여 결정 적중을 얻을 수 있습니다. 1-2 μL의 단백질 부피가 결정화 플레이트를 설정할 때 제시된 프로토콜에 사용됩니다. 이는 수동 멀티채널 피펫으로 방울이 정확하게 설정되도록 하기 위한 것입니다. 전자 피펫(다채널 또는 반복 분주 피펫) 또는 HTP 액체 분주 로봇을 사용하면 더 적은 양의 방울을 정확하게 얻을 수 있으므로 필요한 단백질의 양을 줄일 수 있습니다. 또한, 미세 투석 플레이트에 필요한 투석 완충액의 부피가 상대적으로 적기 때문에(다른 종래의 투석 방법과 달리), 상업적으로 이용 가능한 결정화 스크린을 사용할 뿐만 아니라 최적화 스크린(초기 결정화 히트 조건을 중심으로 설계됨)을 사용하여 넓은 화학 공간을 탐색할 수 있습니다(광범위한 자원 사용 없이).
제시된 HTP 절차의 중요한 단계는 탈수 및 샘플 손실을 제한하기 위해 투석 플레이트에 소량의 단백질(조건당 0.50-3.2μL)을 적시에 적용하는 것입니다. 이는 멀티채널 피펫, 반복 분주 피펫 또는 로봇 결정화 시스템을 사용하여 쉽게 완화할 수 있습니다. 20°C에서 플레이트의 긴 배양 시간, 예컨대 2주 이상은 단백질 방울의 탈수 또는 최근에 형성된 결정의 손상을 초래할 수 있다. 투석판을 가습실이나 밀봉 가능한 백 안에 보관하면 이러한 효과를 완화할 수 있습니다. 또한 박테리아 성장을 피하기 위해 멸균 재료와 기술을 사용하는 것이 좋습니다.
서론에서 언급했듯이, 최근 질병 메커니즘, 단백질-리간드 결합 상호작용 및 단백질-단백질 상호작용에 대한 단백질 구조 역학을 이해해야 할 필요성이 증가함에 따라 단백질 X선 결정학 분야는 신규 및 기존 결정화 기술의 개발, 결정 샘플 전달에 대한 현대적인 접근 방식, 차세대 X선 소스, 데이터 수집 및 처리를 위한 새롭고 정교한 방법을 통해 혁명을 일으켰습니다36 ,37,38. 그러므로, XFELs 또는 싱크로트론 광원을 사용하여 수행되는 실온 직렬 미세 결정학의 출현은 구조 생물학, 특히 막 단백질 분야에서 주목할만한 도구로 부상했다39. 그러나 견고한 구조 용액을 위한 충분한 데이터를 생성하려면 수천 개의 미세 결정이 필요하며, 이는 쉬운 작업이 아닙니다(적어도 기존의 결정화 방법으로는). 여기에 기술된 투석 결정화 방법은 다수의 미세 결정의 생산을 가능하게 한다. 미세 투석 플레이트를 사용하여 미세 결정(1-10μm) 생산을 위한 결정화 조건이 결정되면 0.5mL 투석기 장치를 사용하여 대량의 고밀도 미세 결정을 생산할 수 있습니다(그림 5). 이러한 결정은 고정 타겟 또는 액체 제트 샘플 전달 시스템27,40을 사용한 데이터 수집에 이상적으로 적합합니다. 이 방법을 통해 얻은 결정은 MicroED 응용 분야에도 적합할 수 있습니다. 그러나, 전자는 X선 광자(41)보다 결정과 훨씬 더 강하게 상호작용하기 때문에, 이들은 이러한 특정 용도에 적합한 크기 및 두께로 밀링될 필요가 있을 수 있다.
결론적으로, 여기에 설명된 투석에 의한 결정화 접근법은 구조 결정을 위한 단백질 결정화의 진화하는 전략에 추가되고 이전에 다른 기존 방법으로는 성공하지 못했던 새로운 단백질 표적을 결정하기 위해 사용할 수 있는 것보다 더 많은 노력을 확장합니다.
Disclosures
공동 저자 인 Pascelle Draper와 Paul Reardon은 SWISSCI에 고용되어 있습니다.
Acknowledgments
우리는 영국의 비즈니스, 에너지 및 산업 전략부(BEIS)의 자금 지원을 인정합니다. 원고에 대한 피드백을 주신 National Physical Laboratory의 Alex R. Jones와 Mike Shaw에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tubes | Thermo Scientific | AB0620 | For aliquoting protein solutions. |
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17823----------K | Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions. |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | GSTF04700 | Membrane filters for filtering large volumes of buffers |
| 12-channel, variable 0.5 – 10 µL Research plus pipette | Eppendorf | 3125000028 | For dispensing protein drops onto the Diaplate. |
| 12-channel, variable 30 – 300 µL Eppendorf Research plus pipette | Eppendorf | 3125000060 | For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs. |
| 20 mL syringe | Fisherbrand | 15889152 | For use with syringe filters. |
| 96 well 2.2 mL deep-well plates | Thermo Scientific | AB0788 | Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet. |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000565 | With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g. |
| Diacon dialyser | SWISSCI | W72010 | Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL. |
| Diaplate 96-well plate | SWISSCI | W82010 | Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa. |
| Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | For holding dialysis solutions. |
| Floating rack | SWISSCI | n/a | Included in the Diacon kit |
| Floor-standing vibration-free incubator | Molecular Dimensions | MD5-01 | 400 L temperature-controlled incubator set to 20 °C. |
| Leica M205 C stereo microscope | Leica | Planapo 1.0x objective, 7.8x – 160x zoom range with DMC 4500 camera | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 62971 | Lyophilized protein |
| Memgold2 | Molecular Dimensions | MD1-64 | Sparse-matrix screen |
| Microlab STARlet | Hamilton | n/a | Liquid handler system. |
| Reservoir cover film | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
| Reusable bottle top filter | Thermo Scientific | DS0320-5045 | For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 µm membrane filters |
| Sealing paddle | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma Aldrich | T7638 | Lyophilized protein |
| UV cover film | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
References
- Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. The nobel science: One hundred years of crystallography. Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).
- Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), (2020).
- Kwan, T. O. C., Axford, D., Moraes, I. Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).
- Birch, J., et al. The fine art of integral membrane protein crystallisation. Methods. 147, 150-162 (2018).
- Gorrec, F., Löwe, J. Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology. Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).
- Govada, L., Chayen, N. E. Choosing the method of crystallization to obtain optimal results. Crystals. 9 (2), 106 (2019).
- Chayen, N. E. Turning protein crystallisation from an art into science. Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).
- McPherson, A., Gavira, J. A.
- Gulbis, J.
- D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).
- Shaw Stewart,, D, P., Kolek, S. A., Briggs, R. A., Chayen, N. E., Baldock, P. F. Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).
- Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).
- Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova-Spano, M. Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).
- Jaho, S., et al. Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. Journal of Visualized Experiments. 49, 2501 (2011).
- Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).
- Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).
- Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).
- Neutze, R., Wouts, R., Vander Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- Chapman, H. N., et al.
- Mizohata, E., Nakane, T., Fukuda, Y., Nango, E., Iwata, S. Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology. Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
- Johansson, L. C., et al. XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity. Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).
- Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).
- Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature communications. 8 (1), 542 (2017).
- Axford, D., et al. Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED). Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).
- Nguyen, C., Gonen, T. Beyond protein structure determination with MicroED. Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).
- Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).
- Kwan, T. O. C., et al. Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605 (2019).
- Pos, K. M., Purification Diederichs, K. crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).
- Guan, L., Mirza, O., Verner, G., Iwata, S., Kaback, H. R. Structural determination of wild-type lactose permease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).
- Kwan, T. O. C., Reis, R., Moraes, I. In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study. Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).
- Wickstrand, C., et al. A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 7 (2), 024701 (2020).
- Orville, A. M. Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs. Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).
- Schulz, E. C., Yorke, B. A., Pearson, A. R., Mehrabi, P. Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).
- Neutze, R., Brändén, G., Schertler, G. F. Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers. Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).
- Wierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T.
