Summary
在这里,我们提出了一种从快速冷冻,存档的肝组织中分离细胞核的方案,用于单核RNA-seq,ATAC-seq和联合多组学(RNA-seq和ATAC-seq)。
Abstract
肝脏是一个复杂且异质的组织,负责执行许多关键的生理功能,例如维持能量稳态和异生素的代谢等。这些任务是通过肝实质和非实质细胞之间的紧密协调来完成的。此外,各种代谢活动仅限于肝小叶的特定区域 - 一种称为肝分区的现象。单细胞测序技术的最新进展使研究人员能够以单细胞分辨率研究组织异质性。在许多复杂的组织中,包括肝脏,苛刻的酶促和/或机械解离方案会对全面表征该器官在健康和疾病中所需的单细胞悬浮液的活力或质量产生负面影响。
本文描述了一种从冷冻、存档的肝组织中分离细胞核的稳健且可重复的方案。该方法产生与下游单细胞组学方法兼容的高质量细胞核,包括单核RNA-seq,转座酶可接近染色质的高通量测序(ATAC-seq)测定,以及多模态组学(联合RNA-seq和ATAC-seq)。该方法已成功用于从健康和患病的人、小鼠和非人灵长类动物冷冻肝脏样本中分离细胞核。这种方法允许无偏分离肝脏中的所有主要细胞类型,因此为以单细胞分辨率研究肝脏提供了一种可靠的方法。
Introduction
单细胞基因组学正迅速成为研究肝功能和评估细胞异质性对健康和疾病状况的影响的重要方法1。用于同时测量不同信息层的“多组学”的快速发展以及强大的计算管道的并行扩展正在为在正常和患病肝脏中发现以前未知的细胞类型和亚型铺平道路2。
探索生物样本库和存档冷冻样本的可能性大大增加了重新审视和发现非实质细胞的作用的机会3,4,5 并研究多倍体肝细胞在衰老和慢性疾病中的作用6,7,8,9.因此,本文描述了一种用于快速冷冻(FF)存档肝脏的稳健且可重复的单核分离方案,该方案与下游单核RNA测序和ATAC测序以及多模态组学(联合RNA-seq和ATAC-seq)兼容(图1)。
该工作流程允许在酶解离方案中研究肝脏中所有细胞类型的转录组和染色质可及性,而与细胞大小或脆性无关。它可以与来自珍贵人类样品或转基因小鼠的小组织切片(15-30 mg或5-10 mm3)进行。确定细胞核分离的高纯度包括细胞大小的定量和测量,这可能与细胞大小增加和衰老相关10,11,并且该纯度与肝细胞倍性12和细胞大小依赖性转录机制的分析有关11,13,14,15.此外,从冷冻肝脏中分离的细胞核保留了有关肝脏分区的宝贵信息。工作流程和组织收集允许验证单细胞基因组学数据或进一步的互补分析,例如来自同一组织和同一个体的免疫组织化学或空间转录组学。因此,这种方法可以系统可靠地应用于多种肝病状况和模式生物。
Protocol
所有动物实验均按照德国动物福利立法和上巴伐利亚州政府的规定进行。动物饲养是根据《德国动物福利法》第11条批准的,并按照指令2010/63 / EU执行。
1. 组织准备
- 通过颈椎脱位处死3个月大至22个月大的雄性C57BL / 6J小鼠。将动物放在解剖板上,用别针固定四肢,并用 70% 乙醇对腹部进行消毒。
- 按照Treuting等人的建议进行尸检16。
- 打开腹部直至胸腔,观察肝脏,然后用镊子小心地取出肝脏,不要刺穿小叶。
- 用镊子握住横膈膜并用剪刀去除连接组织来提取完整的肝脏。
- 用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗器官,用干净的纸巾拍干,然后将肝小叶切成几块用于不同目的:FF用于单核分离和多组学;多聚甲醛固定(10%PFA)用于石蜡包埋;和/或嵌入最佳切割温度(OCT)化合物中,以进行进一步的组织学分析(图1A)。
- 将肝脏碎片分装到冷冻管或 5 mL 螺旋盖管中,并立即在液氮中快速冷冻。将冷冻肝脏样品储存在-80°C,用于下游单核多组学实验(图1B,C)。
注意:冷冻保存的组织可以在-80°C下安全储存数年,并且在使用前应始终在-80°C的干冰上运输。
2. 细胞核分离
- 台式清洁以及缓冲液和耗材的制备
- 用 70% 乙醇和 RNase 净化溶液清洁工作台和移液器,或使用专用的无 RNase 台面和材料。
- 将水平吊篮和固定角度离心机、1.5 mL/2 mL 管和多孔板预冷至 4 °C,详情如下。
- 在干冰(-60°C)上预冷用于组织处理的无RNase一次性镊子,一次性无菌手术刀和培养皿。
- 将Dounce玻璃均质器和杵在冰上预冷(4°C)。将每个研杵(A 和 B)放入 5 mL 管中,以避免直接接触冰和潜在的 RNase 污染。
- 制备碘沙醇培养基(IDM)的稀释液(表1A),并用它来对60%碘沙醇储备密度梯度培养基进行50%和29%的稀释(分别为表1B和表1C)。
- 预冷所有试管。对于要处理的每个样品,请准备以下试管:
- 准备三个 1.5 mL 低 DNA 结合管(一个用于过滤的组织匀浆,第二个用于 250 μL 50% 稀释的碘沙醇溶液,第三个用于清洁的细胞核悬浮液)。
- 准备一个含有 500 μL 29% 稀释度碘沙醇溶液的 2 mL 圆底管,用于密度梯度分离。
- 为细胞核分离培养基-2 (NIM-2) 和匀浆缓冲液 (HB) 准备一个 15 mL 锥形管。
- 制备细胞核分离介质-1(NIM-1)(表1D),并用它来制备NIM-2(表1E),然后制备HB(表1F)。在使用前添加两种RNAse抑制剂,如下文方案所述。
- 如 表1G所述制备细胞核储存缓冲液(NSB)。使用前加入重组RNA酶抑制剂。在用于 FACS 分选之前,将基于蛋白质的 RNA 酶抑制剂添加到 NSB 中(可选)。
- 在组织均质化后,用无菌水准备一个 500 mL 烧杯,浸泡 Dounce 均质机和杵,以实现均质机的最佳清洁和维护。
- 组织均质化
- 在干冰上的培养皿内用预冷的手术刀切割20-30毫克(或5毫米3)的组织片。然后,立即将培养皿转移到湿冰(4°C)中。加入 1 mL HB,并使用冷手术刀尽可能切碎组织,使其易于用 1 mL 宽孔尖端吸出。
注意:始终使用宽孔尖端进行所有组织/细胞核转移。作为替代方案,可以用无菌手术刀在无菌塑料盖上切割 1 mL 吸头以产生宽孔(图 2A)。 - 收集组织悬浮液,并将其转移到预冷的2 mL玻璃Dounce均质器中(图2B)。
- 用额外的 0.5-1 mL HB 清洗培养皿,并收集所有剩余的组织碎片,同时将所有东西放在冰上。
- 用松散的杵 A 在冰上缓慢而小心地做五笔。上下拉杵时,使用杵的扭转动作避免产生气泡。确保杵在每次冲程时小心地从均质器的顶部移动到底部。
- 随后,用紧杵 B 在冰上进行10-15次缓慢的划动。避免产生气泡。
注意:建议在用研杵 B 划10次后在显微镜下目视检查细胞核,以确定是否需要更多笔划。通过使用台盼蓝染色(台盼与样品的比例为 1:1)和手动血细胞计数器(例如,将 10 μL 台盼蓝与 10 μL 细胞核悬浮液混合,并使用 10 μL 混合物在显微镜下检查; 图 2C)。 - 通过 50 μm 细胞过滤器过滤匀浆,同时将其转移到预冷的 1.5 mL 管中。对含有大量结缔组织团块的匀浆使用多个过滤器和/或管。
- 冲洗均质器和过滤器,并用额外的 0.5-1 mL HB 彻底收集所有组织匀浆。进行密度梯度离心。
- 在干冰上的培养皿内用预冷的手术刀切割20-30毫克(或5毫米3)的组织片。然后,立即将培养皿转移到湿冰(4°C)中。加入 1 mL HB,并使用冷手术刀尽可能切碎组织,使其易于用 1 mL 宽孔尖端吸出。
- 密度梯度离心
- 将过滤后的匀浆在预冷的固定角度离心机中以1,000×g 在4°C下离心8分钟。
- 样品旋转时,制备一个含有 250 μL 50% 碘沙醇稀释液的 1.5 mL 管和一个含有 500 μL 29% 碘沙醇稀释液的 2 mL 管。将两个管子放在冰上。
- 离心后,使用真空泵在不干扰沉淀的情况下吸出上清液。
注意:使用手动移液会影响最终细胞核悬浮液的质量。 - 使用 1 mL 宽孔移液器吸头向沉淀中加入 250 μL HB,然后非常缓慢地重悬。
- 将 250 μL 细胞核悬浮液转移到含有 250 μL 50% 碘沙醇稀释液的预冷 1.5 mL 管中,轻轻但彻底地混合以产生 25% 碘沙醇/细胞核悬浮液。
- 将 500 μL 的 25% 碘沙醇/细胞核悬浮液转移到含有 500 μL 29% 碘沙醇稀释液的预冷 2 mL 管中。
注意:将 500 μL 的 25% 碘沙醇/细胞核悬浮液轻轻沉积在 500 μL 29% 碘沙醇溶液的顶部,以使 25%/29% 碘沙醇混合物显示出清晰的相分离。使用管壁的侧面,将移液器吸头定位为45°角,以创建此梯度界面。从那时起,必须轻柔地处理管子,以免干扰这种梯度。 - 将试管在预冷的摆动桶离心机中以 12,500 g 离心 20 分钟,制动器设置为 OFF。
- 在离心步骤完成之前,在进行scRNA-seq管道时将RNAse抑制剂添加到NSB缓冲液中(参见 表1G)。
- 离心后,使用真空泵在不干扰沉淀的情况下吸出上清液。
注意:使用手动移液会影响最终细胞核悬浮液的质量。 - 使用 1 mL 宽孔移液器吸头,将沉淀轻轻重悬于 100-300 μL NSB 中,并将细胞核悬浮液转移到干净的预冷 1.5 mL 管中。
- 使用台盼蓝溶液(台盼与样品的比例为 1:1)和手动血细胞计数器(例如,将 10 μL 台盼蓝与 10 μL 细胞核悬浮液混合,并使用 10 μL 混合物进行计数; 图 2D)。
- 立即使用获得的细胞核悬浮液进行单核基因组学测定。
注意:NSB中的细胞核悬浮液可以在4°C下冷藏长达1周,以便通过流式和/或成像流式细胞术进行进一步分析,但不能用于snRNA-seq或snATAC-seq。
3. 用于肝细胞倍性分析或基于良好的测序方法的细胞核分选
- 对于基于流式细胞术的细胞分选,通过 50 μm 过滤器将细胞核悬浮液过滤到预冷的 5 mL FACS 管中。
- 使用装有 100 μm 喷嘴的流式细胞术分选仪。将FACS管装载到分选机上,并预览样品。
- 为细胞核分选设置门控策略,从散射门开始,绘制前向散射区域与侧向散射区域 (FSC-A/SSC-A),然后是 Hoechst-高度与 Hoechst-区域(细胞核门),然后是 Hoechst-宽度与 Hoechst-区域(单线门)。在赫斯特面积直方图上可视化细胞核倍性剖面。
注意:为了获得更好的峰分辨率,请在线性刻度上可视化Hoechst通道(450/50)(图3A)。 - 对于分选到 96/384 孔板中,设置液滴延迟,并使用联苯胺底物-辣根过氧化物酶 (TMB-HRP) 的比色法优化板对齐,如前所述 6.
- 将样品冷却和板架设置为在4°C冷却,样品旋转以300rpm打开。
- 以 ~1 x 105 个细胞核/mL 的样品浓度和 200-500 个事件/秒的流速对单个细胞核进行分选。
4. 通过成像细胞术对核参数进行目视检查和定量(可选)
- 加载含有 50 μL 细胞核悬浮液的 0.5 mL 管,浓度为 2 ×10 7 个细胞核/mL。
- 根据纵横比与Hoechst荧光通道设置 所有事件 门,以可视化细胞核倍性轮廓(图3B)。
- 使用明场 (BF) 和 Hoechst 荧光通道以 40 倍放大倍率采集样品。
- 使用成像细胞术软件使用明场测量和Hoechst荧光强度检查和定量2n和4n细胞核(图3C)。
5. 单核RNA-seq、ATAC-seq或多组文库构建和测序
- 对于基于液滴的snRNA-seq方法,将纯化的细胞核悬浮液直接加载到微流体装置中,以进行自动平行分配和分子条形码17。
- 在单细胞分区装置中完成微流控运行后,收集凝胶珠包封的细胞核,孵育并清洁,如制造商指南17中所述。
- 使用以下程序对cDNA预扩增进行11个聚合酶链反应(PCR)循环:在98°C下3分钟,(在98°C下15秒,在63°C下20秒,在72°C下1分钟)x 11,在72°C下1分钟,并在4°C下保持。 继续末端修复和A尾步骤和适配器连接,如制造商17所示。对于随后的最终基因表达文库构建,使用以下程序执行10个PCR循环:98°C下45秒,(98°C下20秒,54°C下30秒,72°C下20秒)x 10,72°C下1分钟,并保持在4°C。
- 将获得的文库排序为每个核~20,000-50,000个平均读取。
- 对于基于液滴的联合多组学(RNA + ATAC)测序,将肝核在裂解缓冲液中孵育5分钟,然后标记它们1小时,如前所述18。
- 将标记的细胞核直接加载到微流体装置中,以进行自动平行分区和分子条形码。
- 微流体运行完成后,收集凝胶珠包封的细胞核,孵育并按照制造商18的说明进行清洁。
- 使用以下程序对cDNA预扩增步骤进行六个PCR循环:72°C下5分钟,98°C下3分钟,(98°C下20秒,63°C下30秒,72°C下1分钟)x 6,72°C下1分钟,并保持在4°C。
- 取 35 μL 预扩增的样品,并按如下方式进行 cDNA 扩增:98 °C 下 3 分钟,(98 °C 下 15 秒,63 °C 下 20 秒,72 °C 下 1 分钟)x 6,72 °C 下 1 分钟,并保持在 4 °C。 继续末端修复和A尾步骤和适配器连接,如制造商18 所示。对于随后的最终样品索引PCR,执行15个PCR循环,如下所示:98°C下45秒,(98°C下20秒,54°C下30秒,72°C下20秒)x 15,72°C下1分钟,并保持在4°C。
- 对于ATAC文库的构建,请使用40μL,并使用以下程序扩增六个PCR循环以进行样品索引:98°C下45秒,(98°C下20秒,67°C下30秒,72°C下20秒)x 6,72°C下1分钟,并保持在4°C。
- 按照制造商的建议,将获得的多组基因表达文库测序为每个细胞核 20,000 个读取对的最小读取深度,将多组 ATAC 文库的最小读取深度为每个细胞 25,000 个读取对18。
Representative Results
这种从冷冻肝脏样本中分离单核的工作流程是为单核多组学量身定制的,依赖于三个主要步骤,可以概括为i)用于细胞异质性和组织结构的平行分析的样品收集,ii)单核悬浮液,以及iii)单核多组学(图1).从安乐死小鼠身上解剖提取的肝脏并切成碎片进行石蜡包埋、冷冻切片或两者兼而有之的组织学检查。其他切割件立即在液氮中快速冷冻,用于下游单核分离,用于多组学分析。这种组织收集系统允许用户进一步验证来自同一个体的组织切片的单核组学数据,从而在需要时通过空间转录组学或免疫组织化学分析补充数据集。
使用此处描述的方法对从冷冻肝脏中提取的细胞核进行显微镜检查表明,密度梯度离心步骤极大地促进了不需要的细胞和组织碎片的去除(图2C,D)。此外,该方法保留了所有水平的倍性,可以通过细胞术分析进行验证和定量(图3)。
为了进一步验证该协议的性能,我们对未分选和FACS分选的细胞核进行了基于液滴的snRNA-seq,并分析了修拉管道后的数据。简而言之,如前所述,为基于液滴的snRNA-seq制备提取的单个细胞核19。对于2n和4n核或更高水平的倍性snRNA-seq,cDNA扩增步骤使用11个周期,最终基因表达文库构建使用10个周期。将所得文库测序为每个细胞核~25,000-39,000个平均读数的读取深度。将获得的单核读数映射到GRCm39 / mm39小鼠基因组。在运行预处理管道时,添加了命令-- include-inlet ,以确定细胞核中存在的未剪接信使RNA(mRNA)的包含和定量。对准器中包含的空滴算法过滤掉并去除了 空液滴 。
R 包 Seurat (版本 4.1.1) 用于使用 snRNA-seq 分析管道输出的唯一分子标识符 (UMI) 计数矩阵计算质量控制 (QC) 指标。去除少于100个特征(基因)和少于10个细胞的计数。根据确定的QC阈值过滤细胞核:最小基因数= 200,最大基因数= 8,000,线粒体部分<1%和核糖体部分<2%)。前3,000个高度可变基因(HVG)用于修拉实施的主成分分析(PCA)。在输入 PCA 分析产生的前 15 个 PC 维度后,执行基于图形的聚类。为了对细胞进行聚类,我们应用了模块化优化技术(鲁汶算法),分辨率参数设置为0.5。为了可视化和探索这个数据集,我们运行了非线性降维,即均匀流形近似和投影(UMAP)。每个簇的身份是根据标记基因6,20,21的先验知识分配的。
图4A显示了使用这种细胞核提取方法获得的数据的高质量指标。UMAP表示所有细胞核和主要细胞类型的计数数,这些计数只能通过核转录组和相对较浅的测序(每个细胞~25,000-40,000个平均读数)可靠地识别(图4B)。这种方法允许研究肝脏特异性转录因子,如Hnf4a,Mlxipl和Ppara,以及参与异生素代谢的下游靶基因(即Cyp2e1和Cyp2f2)(图4C)。 值得注意的是,提取的细胞核保留了有关肝脏分区的关键信息,如中央周围Cyp2e1和门周Cyp2f2等标志性基因的互补模式所示(图4C)。
我们进一步评估了使用这种方法提取的未分类细胞核与更新的多组学测定的兼容性,以同时分析同一单个细胞核中的表观基因组景观(ATAC)和基因表达(RNA)18。我们将细胞核裂解孵育时间优化至转位前5分钟。通过运行六个PCR循环进行cDNA预扩增来构建测序文库。从预扩增的样品中取出35 μL,并通过15个PCR循环进一步扩增以进行样品索引以构建基因表达库。cDNA迹线的代表性电泳图如图 5A (上图)所示。为了构建ATAC文库,使用40 μL预扩增样品,并再运行6个PCR循环进行样品索引,DNA迹线的代表性电泳图如图 5A (底部)所示。所得基因表达文库(RNA)测序到每个细胞核44,600个读数的深度,ATAC文库测序到每个细胞核43,500个读数的深度(图5B)。
与上述单模态、基于液滴的测序方案类似,使用GRCm39/mm39参考基因组18按照标准指南进行读路映射、比对、空液去除和片段计数。使用修拉和Signac包22,我们对两种模式(RNA + ATAC)的多次测量进行了“加权最近邻”(WNN)分析(图5C),这使我们能够识别和注释主要和次要肝细胞类型,而不会因细胞大小或核脆性而产生明显的偏差(图5D)。该管道由Satija实验室22,23发布,包括标准QC步骤-预处理和尺寸缩减-在两种测定上独立完成。为了更好地表示RNA-seq和ATAC-seq模式的加权组合,绘制了WNN图,并根据先前鉴定的标记基因6,20,21绘制并用于UMAP可视化,聚类和注释。与使用单一模式的测定类似,我们还检测到上游转录调节因子(Hnf4a,Ppara,Mlxipl)和肝分区的标志性基因(Hamp,Cyp2e1和Cyp2f2)(图5E)。
图 1:实验概述、工作流程和单细胞基因组应用。 (A)组织学组织取样的说明性表示(左,选择三个部分用于石蜡包埋和/或冷冻切片),用于单细胞基因组学的快速冷冻组织收集(中)和代表性免疫组织化学和免疫荧光分析(右);比例尺 = 100 μm。 (B)高质量单核悬浮液的关键步骤。(C)细胞核悬浮液可以加载到10倍铬芯片上,或用于FACS分选和基于板的方法。缩写:H&E = 苏木精和伊红;DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚;FACS = 荧光激活细胞分选。 请点击此处查看此图的大图。
图2:肝脏解剖和Dounce-glass组织均质化。 (A)来自3个月大的C57BL6 / J小鼠的代表性鼠肝(左);用于单核分离的肝脏切片在用手术刀切碎组织之前(中)和之后(右)。比例尺 = 1 cm。 (B) 2 mL Dounce-glass 均质化的说明性图像,在用“松散”杵 A (左)和“紧密”杵 B (右)进行笔划之前。在梯度离心前使用血细胞计数器(C)和梯度离心后(D)监测组织匀浆。请点击此处查看此图的大图。
图 3:用于高通量细胞核表征的荧光激活细胞分选和成像流式细胞术 。 (A)将单核FACS分选到板中的门控策略,用于询问不同水平的倍性。基于前向散射区域与侧散射区域设置的散射门,以排除碎片;基于赫斯特高度与包含多个细胞核群的赫斯特区域的核门;基于赫斯特宽度的单线门与赫斯特-A集的双精度判别;Hoechst-A 直方图允许可视化细胞核倍性分布。(B)所有事件(左)和单个(右)事件的代表性成像细胞术定量,显示二倍体和四倍体细胞核。(C)2n和4n细胞核的明场和Hoechst图像及其使用成像细胞术进行定量。缩写:FACS = 荧光激活细胞分选;FSC-A = 前向散射区域;SSC-A = 侧向散射区域;赫斯特-H = 赫斯特-高度;赫斯特-A = 赫斯特地区;Hoechst-W = Hoechst-width。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:使用 snRNA-seq 对肝细胞倍性进行深度表征。 (A) 小提琴图显示基因数量、计数、线粒体基因百分比和检测到的核糖体基因百分比。(B) UMAP展示了使用snRNA-seq检测的细胞类型(左),定量以细胞核的百分比表示(右)。(C)UMAP说明了计数的数量并指示了肝细胞特异性基因的表达。所有细胞核(上排)、2n 个细胞核(中排)和 4n 个细胞核(底行)。缩写:snRNA-seq = 单核 RNA-seq;UMAP = 均匀流形近似和投影;米托克。= 线粒体基因;里博斯。= 核糖体基因。请点击此处查看此图的大图。
图5:来自冷冻,存档的年轻肝脏的多组学(联合RNA-seq和ATAC-seq)的质量控制和分析 。 (A)多组学管道后获得的代表性自动电泳迹线,显示cDNA合成和ATAC后的分子量产物。(B)小提琴图显示了ATAC-seq,RNA-seq的计数数,线粒体基因的百分比以及过滤前后核糖体基因的百分比。(C)UMAP显示了RNA-seq(左),ATAC-seq(中)和关节模式-RNA-seq和ATAC-seq(右)的基因表达。(D)不同的细胞类型以不同的颜色注释,并表达指示肝细胞特异性基因。(E)特征图显示指示基因在指定细胞类型中的簇特异性表达。缩写:ATAC-seq = 转座酶可及染色质的高通量测序测定;中肝=中带肝细胞;远藤=内皮细胞;PV Hep = 门脉周围肝细胞;非z肝=非分区肝细胞;CV Hep = 中央周围肝细胞;Kup & DC = Kupffer & 树突状细胞;SC = 星状细胞,Neu = 中性粒细胞;胆汁=胆管细胞;米托克。= 线粒体基因;里博斯。= 核糖体基因。 请点击此处查看此图的大图。
试剂 | 股票 | 10毫升 | 15毫升 | 50毫升 | ||
(A ) 碘沙醇培养基 (IDM) | ||||||
250毫米蔗糖 | 1米 | 12.5毫升 | ||||
150 毫米氯化钾 | 2米 | 3.75毫升 | ||||
30 毫米氯化镁2 | 1米 | 1.5毫升 | ||||
60 mM Tris缓冲液pH 8.0 | 1米 | 3毫升 | ||||
超纯无核糖核酸酶的水 | 29.25毫升 | |||||
(B) 50 % IDM | ||||||
碘沙醇 | 60% | 12.5毫升 | ||||
IDM | 2.5毫升 | |||||
(C) 29% IDM | ||||||
碘沙醇 | 60% | 7.25毫升 | ||||
IDM | 7.75毫升 | |||||
(D ) 细胞核分离介质-1 (NIM-1) | ||||||
250毫米蔗糖 | 1米 | 12.5毫升 | ||||
25 毫米氯化钾 | 2米 | 0.625毫升 | ||||
5 毫米氯化镁2 | 1米 | 0.25毫升 | ||||
10 mM Tris 缓冲液 pH 8.0 | 1米 | 0.5毫升 | ||||
超纯无核糖核酸酶水 | 36.125毫升 | |||||
(E ) 细胞核分离介质-2 (NIM-2) | ||||||
NIM-1缓冲液 | 9.99毫升 | |||||
二硫苏糖醇 | 1 毫米米 | 0.01毫升 | ||||
蛋白酶抑制剂片剂(不含EDTA) | 1 | 1 片 | ||||
(F ) 均质缓冲液 (HB) | ||||||
尼姆-2缓冲液 | 9.697毫升 | |||||
重组核糖核酸酶抑制剂 | 40 微米/微升 | 0.1毫升 | ||||
基于蛋白质的RNA酶抑制剂(超级酶•IN) | 20 微米/微升 | 0.1毫升 | ||||
0.1% 海卫一-X | 10% | 0.1毫升 | ||||
3 μg/mL 赫斯特 33342 | 10毫克/毫升 | 0.003毫升 | ||||
(G) 细胞核储存缓冲液 | ||||||
166.5毫米蔗糖 | 1米 | 1.665毫升 | ||||
5 毫米氯化镁2 | 1米 | 0.05毫升 | ||||
10 毫米三分 pH 8.0 | 1米 | 0.1毫升 | ||||
重组核糖核酸酶抑制剂 | 40 微米/微升 | 0.1毫升 | ||||
基于蛋白质的核糖核酸酶抑制剂(超级酶•IN) * | 20 微米/微升 | 0.1毫升 | ||||
超纯无核糖核酸酶的水 | 8.085毫升 | |||||
* 可选(仅适用于 FACS 分拣) |
表 1:解决方案配方。 (A) 碘地沙醇培养基(IDM)的制备;(二)碘沙醇溶液稀释50%;(C)碘沙醇溶液稀释29%。(D)细胞核分离介质-1(NIM-1)的制备。(E) 制备细胞核分离介质-2 (NIM-2)。(F)均质缓冲液(HB)的制备。(G)细胞核储存缓冲液(NSB)的制备。
Discussion
通过单细胞或单核RNA-seq解剖肝脏的细胞组成可以更深入地了解肝病的发展和进展3,4,5,24。从肝脏中分离单细胞非常耗时,并且需要涉及苛刻的机械或酶解离的方案25,26,27。人们普遍认为,每个组织都需要系统评估以确定最佳的组织解离方案,以及捕获脆弱细胞类型或细胞核的合适储存方法28。根据组织可用性、感兴趣的疾病、发育阶段或模式生物,制备用于下游处理的单核悬液可能是比使用单细胞悬液更合适的方法。重要的是,在肝脏中,scRNA-seq和snRNA-seq显示出核和细胞质mRNA之间的高度相关性,这表明两种方法都提供了互补的信息2,3,4,6,29。
本文从小鼠和其他物种(包括人类和猕猴)的冷冻、存档肝脏样本中提供了一种标准化、稳健且可重复的单核分离。该方法可用于喂食食物和高脂肪饮食(HFD)的野生型小鼠,以及使用基于良好板和基于液滴的单核基因组方法的肝纤维化小鼠模型6。该方法依赖于Krishnaswami等人最初为脑组织描述的方案30,并为快速冷冻肝脏量身定制了额外的修改。最佳均质化可将大部分细胞核从组织中释放出来,而不会对核膜完整性产生负面影响。然而,过度增印会损坏脆弱的细胞核并降低其整体质量。年轻和/或脂肪肝通常只需要用研杵 A 中风 5 次,用杵 B 中风 10 次,而老年和/或纤维化肝脏可能需要用研杵 B 中风 15 次,但不会更多。因此,不建议执行超出此处指示的数字的更多冲程。过度扩增可能会对单核悬浮液的质量产生负面影响,并增加环境RNA的量。随后,这可能导致需要在下游数据分析期间执行额外的计算过滤步骤。
这里介绍的方案是通用的,可以根据年轻(3个月)和老年(24个月)小鼠的不同肝脏状况进行调整。由于我们发现较大部分的肝脏对于旧的,HFD和纤维化组织是必需的,因此可用于处理的组织的大小可能会对一些起始生物材料量较少的用户构成限制。但是,强烈建议使用基于液滴的基因组测定进行即时样品处理梯度纯化。如果需要将细胞核分选到 96/384 孔板中进行基于孔的测定,则可以省略梯度纯化。如果有足够的组织样品来获得用于FACS分选的推荐细胞核浓度(即~1 × 105 个细胞核/ mL),我们鼓励用户仍进行梯度纯化。
肝脏的特征是肝细胞9的多倍体性质,但肝细胞倍性在正常生理和疾病中的作用尚不清楚。越来越多的证据表明,倍性提供了基因组变异性31,众所周知,倍性随着年龄的增长而增加32,33。然而,单核四倍体肝细胞的富集在临床上也与人肝细胞癌(HCC)预后不良有关34。同样,肝细胞倍性水平的变化与衰老相关的慢性肝病有关,例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)35,36,37。倍性是拥有两个以上基因组拷贝的条件,可以通过用 DNA 染料(如 Hoechst38)染色基因组内容来探索。在提取前添加到HB中的Hoechst染料在分离方案期间标记所有细胞核。这允许在流式细胞仪上被紫外(350 nm)或紫色(450 nm)激光激发时,根据其DNA含量区分二倍体和多倍体核。通过展示的门控策略,可以在冷冻、存档的肝脏中研究 2n、4n、8n 和更高水平的肝细胞倍性,以更好地了解细胞异质性在组织功能中的作用 1(图 3A)。此外,可以使用成像流式细胞术量化核形态,包括大小和体积,以将细胞核大小的变化与计数总数或基因数量的变化相关联,具体取决于倍性水平(图3B,C)。
多模态组学测量提供了同时研究基因组组织的多层的机会。RNA + ATAC联合多组学方法允许研究上游调节因子和下游代谢基因,为在单细胞分辨率下研究转录网络和与肝功能相关的染色质结构提供了一种全面的方法。此外,随着可以解释数据稀疏性的计算方法的进步和测序成本的降低,单细胞多组学正在率先评估来自同一细胞的多种模式。这种单核分离方案与表达和染色质数据集的单独和联合评估兼容。我们使用Stuart等人建立的标准管道23(Signac包)来说明数据的质量,同时可以轻松采用几种可用的替代计算方法进行下游分析23,39,40,41。
总体而言,单核多组学允许通过实施此处介绍的细胞核提取方案,使用非常少量的起始样品材料研究生物存档的FF小鼠,人和非人灵长类动物肝组织。这一宝贵的工具将使肝脏生物学家能够在各种肝脏病理学的背景下询问基因表达和染色质可及性。此外,不同水平的肝细胞倍性以及根据其在肝小叶中的位置而引起的基因表达调整可能揭示它们在肝脏病理中的作用。因此,我们预计细胞异质性的研究将为精准医学的发展和针对HCC和NAFLD等疾病的针对性干预措施提供新的机会。
Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了亥姆霍兹先锋校区(M.S.,K.Y.,C.P.M.-J.)和计算生物学研究所(C.T.-L.)的支持。这项研究也得到了AMED的支持,资助号为JP20jm0610035(C.P.M.-J.)。我们感谢HMGU(I. de la Rosa)和生物信息学(T. Walzthoeni)的核心基因组学支持,特别是Xavier Pastor的培训和指导。我们感谢 A. Feuchtinger、U. Buchholz、J. Bushe 和 HMGU 病理学和组织分析核心设施的所有其他工作人员的技术和科学支持,以及 J. Zorn、R. Erdelen、D. Würzinger、E-Streifen 的工作人员以及实验动物服务核心设施的持续科学支持和讨论。我们感谢TranslaTUM(R. Mishra)和Luminex,A DiaSorin公司(P. Rein)的核心设施细胞分析。我们感谢I Deligiannis博士的技术支持。M. Hartman博士,A. Schröder博士和A. Barden女士(亥姆霍兹先锋校区)是他们法律,管理和行政支持的基础。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Tween 20 - 5 mL | Bio-Rad | 1662404 | |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
Adhesive PCR film | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | |
Cell Sorter | For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. | ||
Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000619 | Use chilled at 4 °C |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | 1000127 | |
Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions | 10X Genomics | 1000230 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reactions | 10X Genomics | 1000269 | |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions | 10X Genomics | 1000285 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
Dithiothreitol (DTT) 1 M solution | Sigma Aldrich | 646563 | Make 1 mM stock solution and use at 1 µM final concentration. |
DNA AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 10223471 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 16628742 | |
DNA LoBind Tubes, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 16638742 | |
Elution Buffer (EB) - 250 mL | Qiagen | 19086 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 13527550 | |
Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock | Thermo Fisher Scientific | 13518470 | |
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade - 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10517694 | |
Filters 50 µm, sterile | SYSMEX PARTEC - CELLTRICS | 04-004-2327 | Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) - 1 L | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3905 | |
Herenz Heinz ABS Forceps | Thermo Fisher Scientific | 1131884 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Invitrogen | H3570 | Light-sensitive |
Imaging Flow Cytometer | For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream | ||
Invitrogen TE Buffer - 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 11568846 | |
KCl (2 M), RNase-free, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
MgCl2 (1 M), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips | Thermo Fisher Scientific | 10209104 | |
MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips | Thermo Fisher Scientific | 10733087 | |
Mörser 2 mL DOUNCE | Wagner & Munz GmbH | 9651632 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012 | Benchmark Scientific | C1012 | Or any other strip and tube mini centrifuge |
Neubauer Hemocytometer | OMNILAB LABORZENTRUM | 5435293 | Visualize and count nuclei under microscope |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL, Wide-O | Mettler Toledo | 30389218 | |
Pistill "A" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651621 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Pistill "B" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651627 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | 10579691 | |
Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 10634141 | |
Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes | Thermo Fisher Scientific | 10100151 | |
Protector RNase inhibitor - 2,000 U | Sigma Aldrich | 3335399001 | Keep in -20 °C until use |
Protein-based RNase Inhibitor SUPERase•In (20 U/μL) | Thermo Fisher Scientific | AM2696 | Keep in -20 °C until use |
Recombinant RNase Inhibitor | Clontech Takara | 2313B | Keep in -20 °C until use |
RNAse free microfuge tubes - 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
SPRIselect - 60 mL | Beckman Coulter | B23318 | Aliquot and store in 4 °C |
Sucrose, 500 g | Sigma Aldrich | S0389-500G | Make a 1 M stock solution |
Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels | Thermo Fisher Scientific | 11798343 | |
Tris-HCI (1M), pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100, 98%, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10671652 | Make 10% stock solution. Keep at 4 °C and protect from light. |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 11538886 | |
Vortex- Mixer | VWR | 444-1372 | Or any other type of vortex |
References
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