Här presenterar vi ett protokoll för att isolera kärnor från blixtfrysta, arkiverade levervävnader för enkärniga RNA-seq, ATAC-seq och ledmultiomik (RNA-seq och ATAC-seq).
Levern är en komplex och heterogen vävnad som ansvarar för att utföra många kritiska fysiologiska funktioner, såsom upprätthållande av energihomeostas och metabolism av xenobiotika, bland andra. Dessa uppgifter utförs genom tät samordning mellan leverparenkymala och icke-parenkymala celler. Dessutom är olika metaboliska aktiviteter begränsade till specifika områden i leverlobule-ett fenomen som kallas leverzonering. De senaste framstegen inom encellssekvenseringsteknik har gjort det möjligt för forskare att undersöka vävnadsheterogenitet vid en encellsupplösning. I många komplexa vävnader, inklusive levern, kan hårda enzymatiska och / eller mekaniska dissociationsprotokoll negativt påverka livskraften eller kvaliteten på de encelliga suspensioner som behövs för att fullständigt karakterisera detta organ i hälsa och sjukdom.
Detta dokument beskriver ett robust och reproducerbart protokoll för att isolera kärnor från frysta, arkiverade levervävnader. Denna metod ger högkvalitativa kärnor som är kompatibla med nedströms, encelliga omics-metoder, inklusive RNA-seq med en kärna, analys för transposastillgängligt kromatin med högkapacitetssekvensering (ATAC-seq), samt multimodal omik (gemensam RNA-seq och ATAC-seq). Denna metod har framgångsrikt använts för isolering av kärnor från friska och sjuka mänskliga, mus- och icke-mänskliga primatfrysta leverprover. Detta tillvägagångssätt möjliggör opartisk isolering av alla större celltyper i levern och erbjuder därför en robust metod för att studera levern vid encellsupplösningen.
Encellsgenomik håller snabbt på att bli en viktig metod för att studera leverfunktion och bedöma effekterna av cellulär heterogenitet vid hälso- och sjukdomstillstånd1. Den snabba utvecklingen av “multiomik” för samtidig mätning av olika informationslager och den parallella expansionen av robusta beräkningsledningar banar väg för upptäckten av tidigare okända celltyper och subtyper i den normala och sjuka levern2.
Möjligheten att utforska biobanker och arkiverade frysta prover har avsevärt ökat möjligheterna att återbesöka och upptäcka rollen av icke-parenkymala celler 3,4,5 och undersöka rollen av polyploida hepatocyter under åldrande och vid kroniska sjukdomar 6,7,8,9 . Därför beskriver detta dokument ett robust och reproducerbart isoleringsprotokoll med en kärna för flash-frozen (FF) arkiverade lever som är kompatibelt med nedströms enkärnig RNA-sekvensering och ATAC-sekvensering, samt med multimodal omics (gemensam RNA-seq och ATAC-seq) (Figur 1).
Detta arbetsflöde möjliggör undersökning av transkriptomet och kromatintillgängligheten för alla celltyper i levern, oberoende av cellstorlek eller bräcklighet, i enzymatiska dissociationsprotokoll. Det kan utföras med små vävnadssektioner (15-30 mg eller 5-10 mm3) från värdefulla mänskliga prover eller transgena möss. Bestämning av kärnisoleringens höga renhet innefattar kvantifiering och mätning av kärnstorleken, vilket kan korrelera med ökad cellstorlek och åldrande 10,11, och denna renhet är relevant för analysen av både hepatocytploidi12 och cellstorleksberoende transkriptionsmekanismer 11,13,14,15 . Dessutom behåller kärnor isolerade från frysta lever värdefull information om leverzonering. Arbetsflödet och vävnadsinsamlingen möjliggör validering av encellsgenomikdata eller ytterligare kompletterande analyser, såsom immunohistokemi eller rumslig transkriptomik från samma vävnad och samma individ. Därför kan detta tillvägagångssätt tillämpas på flera leversjukdomstillstånd och modellorganismer systematiskt och tillförlitligt.
Dissekering av leverns cellulära sammansättning med encellig eller enkärnig RNA-seq ger en djupare förståelse för leversjukdomsutveckling och progression 3,4,5,24. Encellsisolering från lever är tidskrävande och kräver protokoll som involverar hård mekanisk eller enzymatisk dissociation25,26,27. Det är allmänt accepterat att varje vävnad kräver en systematisk utvärdering för att bestämma det optimala vävnadsdissociationsprotokollet, liksom en lämplig lagringsmetod för att fånga bräckliga celltyper eller kärnor28. Beroende på vävnadstillgänglighet, sjukdom av intresse, utvecklingsstadium eller modellorganism kan beredningen av en enkärnig suspension för nedströms bearbetning vara en lämpligare metod än att använda encellssuspensioner. Viktigt är att scRNA-seq och snRNA-seq i levern har visat en hög korrelation mellan nukleärt och cytoplasmatiskt mRNA, vilket tyder på att båda metoderna presenterar kompletterande information 2,3,4,6,29.
Detta dokument ger en standardiserad, robust och reproducerbar isolering med en kärna från frysta, arkiverade leverprover från möss och andra arter, inklusive människor och makaker. Denna metod kan användas för vildtypsmöss som matas med chow och en fettrik diet (HFD) och för musmodeller av leverfibros med både väl plattbaserade och droppbaserade enkärniga genomiska metoder6. Denna metod bygger på det protokoll som ursprungligen beskrevs för hjärnvävnad av Krishnaswami et al.30 med ytterligare modifieringar skräddarsydda för blixtfrusen lever. Optimal homogenisering frigör de flesta kärnorna från vävnaden utan att negativt påverka kärnmembranets integritet. Överdouncing kan dock skada de bräckliga kärnorna och minska deras övergripande kvalitet. Unga och / eller feta lever kräver vanligtvis bara 5 slag med stöt A och 10 slag med stöt B, medan gamla och / eller fibrotiska lever kan kräva 15 slag med stöt B men inte mer. Det rekommenderas därför inte att utföra fler slag utöver de siffror som anges här. Överdouncing kan påverka kvaliteten på enkärnssuspensionen negativt och öka mängden omgivande RNA. Därefter kan detta leda till behovet av att utföra ytterligare beräkningsfiltreringssteg under dataanalyserna nedströms.
Protokollet som presenteras här är mångsidigt och kan anpassas till olika leverförhållanden hos unga (3 månader) och gamla (24 månader) möss. Eftersom vi fann att en större del av levern är nödvändig för gamla, HFD och fibrotiska vävnader, kan storleken på vävnaden som är tillgänglig för bearbetning utgöra en begränsning för vissa användare med mindre mängder utgångsbiologiskt material. Gradientrening rekommenderas dock starkt för omedelbar provbehandling med droppbaserade genomiska analyser. Om kärnorna behöver FACS sorteras i 96-/384-brunnsplattor för välbaserade analyser kan gradientrening utelämnas. Vi uppmuntrar fortfarande användare att utföra gradientrening om det finns tillräckligt med vävnadsprov för att få den rekommenderade kärnkoncentrationen för FACS-sortering (dvs. ~ 1 × 105 kärnor / ml).
Levern kännetecknas av hepatocyternas polyploida natur9, men hepatocytploidens roll i normal fysiologi och sjukdom är ännu inte klar. Det finns en växande mängd bevis som tyder på att ploidi ger genomisk variation31, och det är välkänt att ploidy ökar med32,33 års ålder. Anrikningen av mononukleerade tetraploida hepatocyter är emellertid också kliniskt associerad med dålig prognos vid humant hepatocellulärt karcinom (HCC)34. På samma sätt är förändringar i hepatocytploidinivåer kopplade till åldranderelaterade kroniska leversjukdomar såsom alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD)35,36,37. Ploidy är villkoret att ha mer än två kopior av genomet, vilket kan utforskas genom att färga genominnehållet med ett DNA-färgämne som Hoechst38. Hoechst-färgämnet, som tillsätts till HB före extraktion, märker alla kärnor under isoleringsprotokollet. Detta möjliggör skillnaden mellan diploida och polyploida kärnor baserat på deras DNA-innehåll när de exciteras av en UV (350 nm) eller violett (450 nm) laser på ett flödescytometriinstrument. Med den visade gatingstrategin kan 2n, 4n, 8n och högre nivåer av hepatocytploidi undersökas i frysta, arkiverade lever för att bättre förstå rollen av cellulär heterogenitet i vävnadsfunktion1 (Figur 3A). Vidare kan kärnmorfologin, inklusive storlek och volym, kvantifieras med hjälp av avbildningsflödescytometri för att korrelera förändringar i kärnstorleken med förändringar i det totala antalet räkningar eller antal gener beroende på ploidinivån (figur 3B, C).
Multimodal omics-mätning ger möjlighet att undersöka flera lager av genomisk organisation samtidigt. Den gemensamma RNA + ATAC-multiomikmetoden möjliggör undersökning av uppströmsregulatorer och nedströms metaboliska gener, vilket ger ett omfattande tillvägagångssätt för att studera transkriptionella nätverk och kromatinarkitekturen associerad med leverfunktion vid encellsupplösningen. Dessutom, med framstegen inom beräkningsmetoder som kan ta hänsyn till datasparsitet och minskningen av sekvenseringskostnader, är encells multiomik banbrytande för bedömningen av flera modaliteter från samma cell. Detta isoleringsprotokoll med en kärna är kompatibelt med den individuella och gemensamma bedömningen av uttrycks- och kromatindatauppsättningar. Vi har använt standardledningar som fastställts av Stuart et al.23 (Signac-paketet) för att illustrera kvaliteten på data, medan flera tillgängliga och alternativa beräkningsmetoder enkelt kan antas för nedströmsanalyser23,39,40,41.
Sammantaget möjliggör multiomik med en kärna undersökning av bioarkiverade, FF-mus-, mänskliga och icke-mänskliga primatlevervävnader med hjälp av en mycket liten mängd utgångsprovmaterial genom att implementera kärnextraktionsprotokollet som presenteras här. Detta ovärderliga verktyg kommer att ge leverbiologer möjlighet att förhöra både genuttryck och kromatintillgänglighet i samband med olika leverpatologier. Dessutom kan olika nivåer av hepatocytploidi och den resulterande justeringen av genuttryck beroende på deras plats i leverlobule avslöja deras roll i leverpatologier. Därför förväntar vi oss att undersökningen av cellulär heterogenitet kommer att ge nya möjligheter för utveckling av precisionsmedicin och riktade interventioner mot sjukdomar som HCC och NAFLD.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Helmholtz Pioneer Campus (M.S., K.Y., C.P.M.-J.) och Institute of Computational Biology (C. T.-L.). Denna forskning stöddes också av AMED under bidragsnummer JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Vi tackar Core Genomics vid HMGU (I. de la Rosa) och Bioinformatics (T. Walzthoeni) stöd, särskilt Xavier Pastor för utbildning och vägledning. Vi tackar A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe och alla andra anställda från HMGU Pathology and Tissue Analytic core facility för deras tekniska och vetenskapliga stöd, samt J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, anställda på E-Streifen, samt Laboratory Animal Services kärnanläggning för deras pågående vetenskapliga stöd och diskussion. Vi är tacksamma för Core Facility Cell Analysis på TranslaTUM (R. Mishra) och Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Vi tackar Dr. I Deligiannis för hans tekniska support. Dr. M. Hartman, Dr. A. Schröder och Ms. A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) var grundläggande för deras juridiska, ledande och administrativa stöd.
10% Tween 20 – 5 mL | Bio-Rad | 1662404 | |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
Adhesive PCR film | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | |
Cell Sorter | For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. | ||
Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000619 | Use chilled at 4 °C |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | 1000127 | |
Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions | 10X Genomics | 1000230 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reactions | 10X Genomics | 1000269 | |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions | 10X Genomics | 1000285 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
Dithiothreitol (DTT) 1 M solution | Sigma Aldrich | 646563 | Make 1 mM stock solution and use at 1 µM final concentration. |
DNA AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 10223471 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 16628742 | |
DNA LoBind Tubes, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 16638742 | |
Elution Buffer (EB) – 250 mL | Qiagen | 19086 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 13527550 | |
Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock | Thermo Fisher Scientific | 13518470 | |
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade – 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10517694 | |
Filters 50 µm, sterile | SYSMEX PARTEC – CELLTRICS | 04-004-2327 | Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) – 1 L | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3905 | |
Herenz Heinz ABS Forceps | Thermo Fisher Scientific | 1131884 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Invitrogen | H3570 | Light-sensitive |
Imaging Flow Cytometer | For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream | ||
Invitrogen TE Buffer – 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 11568846 | |
KCl (2 M), RNase-free, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
MgCl2 (1 M), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips | Thermo Fisher Scientific | 10209104 | |
MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips | Thermo Fisher Scientific | 10733087 | |
Mörser 2 mL DOUNCE | Wagner & Munz GmbH | 9651632 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012 | Benchmark Scientific | C1012 | Or any other strip and tube mini centrifuge |
Neubauer Hemocytometer | OMNILAB LABORZENTRUM | 5435293 | Visualize and count nuclei under microscope |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL, Wide-O | Mettler Toledo | 30389218 | |
Pistill "A" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651621 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Pistill "B" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651627 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | 10579691 | |
Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 10634141 | |
Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes | Thermo Fisher Scientific | 10100151 | |
Protector RNase inhibitor – 2,000 U | Sigma Aldrich | 3335399001 | Keep in -20 °C until use |
Protein-based RNase Inhibitor SUPERase•In (20 U/μL) | Thermo Fisher Scientific | AM2696 | Keep in -20 °C until use |
Recombinant RNase Inhibitor | Clontech Takara | 2313B | Keep in -20 °C until use |
RNAse free microfuge tubes – 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
SPRIselect – 60 mL | Beckman Coulter | B23318 | Aliquot and store in 4 °C |
Sucrose, 500 g | Sigma Aldrich | S0389-500G | Make a 1 M stock solution |
Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels | Thermo Fisher Scientific | 11798343 | |
Tris-HCI (1M), pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100, 98%, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10671652 | Make 10% stock solution. Keep at 4 °C and protect from light. |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 11538886 | |
Vortex- Mixer | VWR | 444-1372 | Or any other type of vortex |