Summary
在这里，我们描述了一个协议，概述了如何从冷冻解冻的皮质组织中分离人类卵巢卵泡以进行基因表达分析。
Abstract
卵巢是由不同细胞类型组成的异质器官。为了研究卵泡生成过程中发生的分子机制，可以在固定组织上进行蛋白质的定位和基因表达。然而，为了正确评估人类卵泡中的基因表达水平，必须分离这种复杂而微妙的结构。因此，Woodruff实验室先前描述的适应方案已被开发用于将卵泡（卵母细胞和颗粒细胞）与其周围环境分开。首先使用两种工具手动处理卵巢皮质组织以获得小碎片：组织切片机和组织切碎器。然后用0.2%胶原酶和0.02%DNA酶酶消化组织至少40分钟。该消化步骤在37°C和5%CO2 下进行，并伴随着每10分钟机械移液培养基。孵育后，在显微镜放大镜下使用校准的微毛细管移液管手动收集分离的卵泡。如果卵泡仍然存在于组织碎片中，则通过手动显微切割完成该过程。将卵泡收集在培养基中的冰上，并在磷酸盐缓冲盐溶液液滴中冲洗两次。必须仔细控制这种消化过程，以避免卵泡恶化。一旦卵泡的结构似乎受损或最多90分钟后，用含有10%胎牛血清的4°C封闭溶液停止反应。应收集至少20个分离的卵泡（大小小于75μm），以便在RNA提取后获得足够量的总RNA，以进行实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。提取后，来自20个卵泡的总RNA的定量达到5ng / μL的平均值。然后将总RNA逆转录成cDNA，并使用RT-qPCR进一步分析感兴趣的基因。
Introduction
卵巢是由功能和结构单元组成的复杂器官，包括皮层内的滤泡和基质。卵泡发生，即卵泡活化、生长和成熟从原始静止状态到能够受精并支持早期胚胎发育的成熟卵泡的过程，在研究中被广泛研究1。揭示推动这一现象的机制可以改善妇女的生育护理2.对固定人体组织的分析可以评估卵巢功能单位内的蛋白质表达和基因定位3，4。然而，需要特定的技术将卵泡与周围的皮层分离，以准确评估卵巢卵泡内的基因表达水平。因此，在之前的一项研究中，开发了一种卵泡分离技术，允许直接从卵巢的功能单元分析基因表达5。已经开发了不同的方法，例如酶消化和/或机械分离，以及激光捕获显微切割，允许在一块组织内分离卵泡6，7，8，9。卵泡分离广泛用于人类或动物卵巢组织，以评估卵泡在发育各个阶段的基因表达谱10，11，12。然而，最佳分离程序应考虑到致密皮层内卵泡的脆弱结构，因此应小心执行以避免任何损害7。这份手稿描述了一种程序，改编自Woodruff实验室描述的方案，从冷冻解冻的卵巢皮层中分离出人类卵泡，以便进行基因表达分析13。
从冷冻人体组织中分离卵巢卵泡的第一步是解冻程序。该过程基于用于移植冷冻保存的卵巢组织的临床方案进行，如前所述14，15。该过程旨在通过以降低培养基浓度冲洗卵巢皮层来去除冷冻保护剂。然后，在酶和机械分离之前将组织碎片化以取回卵泡。可以使用具有高放大倍率和高质量光学元件的体视显微镜区分不同阶段的卵泡，以分离感兴趣的卵泡。使用集成到显微镜中的尺子测量每个分离的卵泡，并且可以根据卵泡的发育阶段合并卵泡：原始卵泡（30μm），初级卵泡（60μm），次级卵泡（120-200μm）和窦卵泡（>200μm）16。可以根据卵泡的形态进行进一步的分类：原始卵泡有一层扁平的颗粒细胞（GC），原代卵泡有一层立方体GC，次级卵泡至少有两层立方体GC，GC中存在空腔是窦期的特征。当选择感兴趣的卵泡时，进行RNA提取。在实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）之前评估RNA的数量和质量（图1）。
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Protocol
该项目得到了伊拉斯姆医院伦理委员会（比利时布鲁塞尔）的批准。该方案中包含的患者在2000年化疗暴露之前接受了卵巢组织冷冻保存（OTC）以保存生育能力。患者签署了知情书面同意书，在储存期结束时将其剩余的冷冻组织捐赠给研究。
1. 冷冻保存的卵巢组织解冻
- 准备含有五种解冻溶液的 6 孔板。第一个孔含有 5 mL 由 Leibovitz-15 培养基、0.1 mol/L 蔗糖、1.5 mol/L 二甲基亚砜 （DMSO） 和 1% 人血清白蛋白 （HSA） 组成的冷冻保护剂溶液。接下来的孔含有 5 mL Leibovitz-15 培养基，冷冻保护剂浓度降低：1 mol/L、0.5 mol/L 和 2 x 0 mol/L DMSO。
注意：冷冻保护剂溶液可能因生育诊所使用的方案而异。 - 按照安全规则（低温手套，防护眼镜和封闭的鞋子）从液氮中取出含有卵巢皮质碎片的小瓶，并将管子在室温（RT）下保持30秒。
- 将小瓶在室温下在室温下将小瓶浸泡在双蒸水中2分钟，然后打开垂直罩下的小瓶并将其直接转移到6孔板的第一个孔中（在冰上）。
- 将片段依次转移到 6 孔板的每个孔中，每个孔在 5 mL Leibovitz-15 培养基中含有浓度降低的冷冻保护剂。在每种培养基中轻轻搅拌组织5分钟（在冰上）。
2. 卵泡分离
注意：所有实验均使用不含RNase的材料并在垂直引擎盖下进行。
- 将解冻的组织转移到装有 10 mL 解剖培养基（Leibovitz-15 培养基、丙酮酸钠 [2 mmol/L]、L-谷氨酰胺 [2 mmol/L]、HSA [0.3%]、青霉素 G [30 μg/mL] 和链霉素 [50 μg/mL]）的 2 mm 网格培养皿中。如有必要，用手术刀调整组织的大小。
注意：根据临床方案，冷冻组织的大小可以从8毫米x 4毫米x 1毫米到4毫米x 2毫米x 1毫米不等。对于该协议，使用了两条4 mm x 2 mm x 1 mm的条带。 - 将三块组织切片机堆起来，将碎片放在两个块之间，然后用刀片将碎片切成两半，滑过块，得到两个0.5毫米厚的碎片。
- 使用组织切碎器切割碎片并获得较小的碎片。如有必要，用手术刀手动切割剩余的碎片，直到组织完全破碎。
- 将碎片组织转移到装有 7 mL 消化培养基（补充有 0.2% 胶原酶和 0.02% 脱氧核糖酶的培养基 [McCoy 的 5A 培养基、3 mmol/L 谷氨酰胺、0.1% HSA、30 μg/mL 青霉素 G、50 μg/mL 链霉素、2.5 μg/mL 转铁蛋白、4 ng/mL 硒和 50 μg/mL 抗坏血酸）的网格培养皿中]。
- 将培养皿放入5%CO2 和37°C的培养箱中。 每 10 分钟，将培养皿从培养箱中取出，并用 1 mL 移液管上下移液冲洗组织。
- 在消化培养基中孵育45分钟后，将培养皿置于放大倍数范围为5x-6.3x的立体显微镜下，并使用微毛细管移液管取出卵泡。选择感兴趣的卵泡，并通过用口腔移液管吸吮它们来分离它们。
注意：应小心进行口腔移液，以避免材料损失到管道中和污染。 - 如果卵泡仍然卡在一块皮层中，用两个 27 G 注射器机械地隔离它们，方法是用注射器的尖端撕下皮层以从基质中释放卵泡。
注意：不要用注射器触摸卵泡，以免损坏它们。 - 将微毛细管的卵泡转移到含有15μL校准培养基的液滴中，该培养基被500μL油培养物覆盖（每滴1至10个卵泡）。此步骤在收集过程中保持卵泡活力。在程序结束时，将卵泡冲洗两次，每次 5 秒，放入两滴 15 μL 磷酸盐缓冲盐溶液 （PBS） 中，覆盖 500 μL 油培养物（冰上）。
- 使用口移液管（最大 10 μL）在空管中用最少量的 PBS 收集 20 个卵泡，并将管保持在冰上。
注意：为了RNA稳定性，在冰上执行步骤2.8和步骤2.9至关重要。大约需要20个卵泡（<75μm）才能有足够的RNA用于标准RT-qPCR（SYBR绿）。 - 在消化培养基中孵育最多90分钟后，通过将过量的冷（4°C）封闭溶液（7.5mL）加入培养皿中来停止酶促反应，该溶液由补充有10%胎牛血清（FBS）的培养基组成。
注意：一旦实验者观察到卵泡粘在平板上或受损的卵泡（不对称形状或颜色较深的卵泡），就可以添加封闭溶液。建议在最长2.5小时内进行卵泡分离，以避免卵泡损伤，并在分离后立即进行RNA提取。
3. 核糖核酸提取
注意：RNA提取按照RNA提取试剂盒提供的说明通过调整洗脱体积进行。
- 通过将 100 μL 随 RNA 提取试剂盒提供的裂解溶液添加到化学罩下包含卵泡的管中来悬浮分离的卵泡，并以高速 （2，500 rpm/min） 涡旋以破坏卵泡的结构。向管中加入 50 μL 乙醇 （100%），并短暂高速涡旋。
注意：由于裂解缓冲液含有2-巯基乙醇和硫氰酸，因此必须在化学罩下谨慎执行此步骤。 - 将管的总体积（约160μL）转移到由色谱柱和收集管组成的微滤芯组件中，并在4°C下以16，363× g 离心10秒。 用试剂盒随附的180μL洗涤溶液1洗涤色谱柱，并在4°C下以16，363× g 离心管10秒。
- 将试剂盒随附的180μL洗涤溶液2/3加入色谱柱中，并在4°C下以16，363× g 离心10秒。 执行此步骤两次。最后一次离心管1分钟以干燥过滤器，并在滤芯下方放置一个新的收集管。
- 分两步洗脱核酸：
- 首先，向过滤器中加入 8 μL 温洗脱溶液 （75 °C），在室温下等待 1 分钟，并在 4 °C 下以 16，363 x g 离心 30 秒。
- 用 7 μL 洗脱液重复此步骤。
注意：含有洗脱核酸的试管必须保存在冰上。为避免DNA污染，强烈建议使用DNA降解的补充步骤-步骤3.5。
- 将管与2IU DNA酶和1x DNAase缓冲液在37°C孵育20分钟。 在室温下用1/10 DNase灭活试剂阻断酶活性2分钟。
- 在4°C下以16，363× g 离心管1.5分钟。 最后，收集含有RNA的悬浮液，并将其转移到新管中。
- 使用分光光度计（NanoDrop 2000 >核酸> RNA）评估样品中存在的 RNA 量。使用 1 μL 洗脱液作为空白，并用 1 μL 溶液测量从分离的卵泡中提取的 RNA 量。
- 检查 260/280 比率的 RNA 纯度（约 2.0）。将样品储存在-80°C，或直接将其逆转录以进行RT-qPCR。
注意：为了评估RNA的完整性，可以在-80°C冷冻之前或之后使用高分辨率自动电泳系统处理样品。 在这项工作中，在逆转录后，以以下周期进行RT-qPCR：
在50°C下保持载物台20秒，在95°C下保持10分钟
40个PCR循环，95°C下15秒，60°C下1分钟
熔融曲线阶段，95°C下15秒，60°C下1分钟，95°C下30秒，60°C下15秒
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Representative Results
使用此分离程序，实验者可以从基质环境中检索卵泡以进行特定的基因表达分析。根据卵泡的大小和形态，可以区分卵泡生成的不同阶段。实验者可以使用适应的微毛细管移液管根据卵泡的大小选择感兴趣的卵泡。通过使用最大75μm的微毛细血管，可以将原始和初级卵泡与次级，窦和成熟卵泡区分开来。此外，实验者可以根据卵泡形态确认卵泡阶段。在研究卵泡活化时，选择静止和原代卵泡，大约需要 20 个卵泡才能达到约 5 ng/μL 的 RNA 浓度。
使用该方案处理来自同一患者的两个匀浆卵巢碎片（4 mm x 2 mm x 1 mm）以分离卵泡（图2）。在1.5小时分离程序后，根据发育阶段检索两个卵泡群以比较RNA数量并突出卵泡选择的相关性：20个<75μm的卵泡（管1）和15个<200μm的卵泡（管2）。然后，进行RNA提取，使用分光光度计从试管1中获得4.8ng/μL总RNA和从试管2中获得10.5ng/μL总RNA（表1）。使用该微量分光光度计系统，还测量了260/280比率以评估RNA纯度。该比率反映了提取过程中蛋白质或其他试剂的潜在污染，RNA样品必须接近2.0。试管1和试管2中的260/280比率分别为1.89和1.74，验证了样品的纯度（表1）。然后通过用高分辨率自动电泳处理样品来验证RNA质量。按照此过程，估计RNA完整性数（RIN）。RIN值从1（降解）到10（完整）反映了样品中RNA的降解水平。试管1和试管2中的RIN值分别为7.1和7.9，验证了我们样品中RNA的质量（表1）。为了进行RT-qPCR，首先将提取的RNA的总体积逆转录成cDNA。然后，在96孔板上每孔加入1.25 ng的cDNA，并带有用于管家和靶基因（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 [HPRT]， 试剂盒配体 [KL]和 生长分化因子9 [GDF9]）和SYBR Green预混液17，18的引物。在实时荧光定量PCR系统上运行标准循环后， HPRT获得的循环阈值（Ct）分别为30.87（管1）和29.56（管2）， KL为33.5（管1）和31.77（管2）， GDF9 为30.71（管1）和30.57（管2）（表1）。
图 1：评估从分离的人卵巢卵泡中提取 RNA 的方法的示意图。 本手稿描述了三个步骤：组织解冻、分离程序（包括机械和酶处理）以及从卵泡中提取 RNA。 请点击此处查看此图的大图。
图2：按照分离方案收集的卵泡。 （A）解冻的皮质组织。（B）组织切片机和（C）用于组织碎片的组织切碎机。（D-E）用带有10倍目镜和宽变焦范围（1x-6.3x）的体视显微镜观察到的检索到的分离卵泡的图像;使用50x-63x的放大倍率设置来鉴定原始卵泡和初级卵泡。比例尺：100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
| 管 | 卵泡数量 | 卵泡大小（μm） | 核糖核酸浓度（纳克/微升） | 260/280 比率 | 核糖核酸完整性数 | 高效液相色谱 仪中电 | 吉隆坡 中电 | GDF9 中电 | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
表 1：两种匀浆卵巢片段的纯度、RIN 和循环阈值。
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Discussion
卵巢组织的冷冻保存是保存癌症患者生育能力的一种有前途的方法。在临床上，解冻的皮质组织在缓解后移植回患者体内，允许卵巢功能和生育能力恢复19，20。除了临床使用外，残留的卵巢碎片也可以在储存期结束时捐赠用于研究，以研究调节卵泡生成的机制。此外，当不可行时，这种组织对于开发移植的替代方案特别有用，例如 体外 培养系统或人工卵巢。然而，患者内部和患者之间的差异限制了实验的可行性和可重复性以及对结果的解释。事实上，卵泡密度随着年龄的增长而显着降低，并且卵泡在片段之间分布不均匀21。由于可用片段的数量有限，人体组织需要采用尖端技术。可以在固定组织上进行广泛的技术，例如免疫组织化学和免疫荧光以及 原位 杂交，以评估蛋白质和基因定位3，18。为了研究在不同发育阶段卵巢功能单元内调节卵泡生成的分子机制，需要分离卵泡。
一些研究已经探索了将人类和动物物种的卵泡与周围组织分离的有效方法22.提取后的卵泡数量和RNA质量可能因所使用的技术而异。为了研究卵泡活化（即原始和原代卵泡），至少需要20个混合卵泡来进行标准的RT-qPCR。通过使用替代方法，如RNA或cDNA扩增或巢式PCR，可以处理更少的卵泡23，24。
卵巢皮层的致密性质使得卵泡分离具有挑战性，这导致使用涉及酶和机械分离相结合的方法25。可以使用不同类型的酶，例如胶原酶和DNase26。然而，研究报告了酶消化后卵泡损伤，进一步影响体外发育27，28。为了保持卵泡的完整性，几个团队目前正在使用适应的酶消化方案或仅进行机械分离以进行后续卵泡培养25，29，30，31。本手稿报告了一种简单有效的方法来获得分离的卵泡以进行定量PCR分析。然而，所有实验都需要一个学习曲线才能达到最佳结果。
出于基础研究目的，开发了对先前方案的修订版，以在不影响其完整性的情况下检索大量卵泡13。基因表达分析的处理在分离后直接进行，以优化RNA质量。避免长时间消化以限制选择退化卵泡的风险也很重要。因此，消化步骤在该协议中仍然至关重要。需要特别注意的三点：（1）酶促反应过程中组织每10分钟冲洗一次，以提供均匀的酶作用;（2）通过在手术过程中选择健康的卵泡并在观察到损伤时立即用封闭液停止反应来控制卵泡完整性;（3）胶原酶浓度的适应，因为组织硬度可能因患者年龄而异。在某些情况下，胶原酶的浓度可以降低（至0.12%）以防止损伤（即青春期前患者）32。
在本协议的最后一部分，按照适应的说明从分离的卵泡中提取RNA。这允许进行广泛的实验，例如RT-qPCR或RNA测序，提供有关卵母细胞和颗粒细胞特异性的各种细胞过程的基本信息。有许多方案和试剂盒可用于从组织中提取RNA。我们在这里报告了一种在我们的实验室中使用的有效技术，该技术允许提取足够数量的RNA以通过RT-qPCR进行基因表达分析。虽然强烈建议在卵泡分离后直接提取RNA以保持RNA完整性，但如果提取不能在同一天进行，也可以在-80°C下冷冻分离的卵泡。RNA数量可能根据卵泡的大小而变化，如果与静止卵泡合并，生长中的卵泡可能会干扰分析。根据研究目标，基于大小的选择非常相关，特别是对于卵泡生成的第一步。然而，仅基于大小的原始卵泡和初级卵泡之间的区分在正确评估原始卵泡基因表达水平方面仍然具有挑战性。原始卵泡和原发性卵泡的选择可以根据它们的形态进行，但是用63倍放大倍率的体视显微镜很难区分它们。
总之，实验者必须意识到卵泡分离的挑战，并在分析结果时将其考虑在内。必须考虑重要参数，例如（1）患者之间卵泡密度的内/相互变异;（2）卵泡分离过程中的卵泡完整性;（3）不同卵泡分期的分化;（4）RNA的稳定性和完整性。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了卓越科学（EOS）资助（ID：30443682）的支持。I.D.是比利时国家科学研究基金会（FNRS）的副研究员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
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