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Biology

चूहों में ऑटोइम्यून मधुमेह के दत्तक स्थानांतरण मॉडल में ग्राफ्ट सर्वाइवल की बायोल्यूमिनेसेंट निगरानी

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64836
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Section for Islet Cell and Regenerative Biology, Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School, 2Section for Immunology, Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

Summary

यह प्रोटोकॉल गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (एनओडी) में एनआईटी -1 कोशिकाओं के प्रत्यारोपण और इमेजिंग के लिए एक सरल और न्यूनतम इनवेसिव विधि का वर्णन करता है - गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों को स्प्लेनोसाइट्स के साथ चुनौती दी जाती है।

Abstract

टाइप 1 मधुमेह अग्न्याशय के इंसुलिन उत्पादक बीटा कोशिकाओं के ऑटोइम्यून विनाश की विशेषता है। इस बीमारी के लिए एक आशाजनक उपचार स्टेम सेल-व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं का प्रत्यारोपण है। आनुवंशिक संशोधन, हालांकि, प्रत्यारोपित कोशिकाओं को लगातार ऑटोइम्यूनिटी से बचाने के लिए आवश्यक हो सकते हैं। डायबिटिक माउस मॉडल ऑटोइम्यून हमले से प्रत्यारोपित कोशिकाओं की रक्षा के लिए रणनीतियों के प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं। यहां वर्णित चूहों में मधुमेह के दत्तक हस्तांतरण मॉडल में प्रत्यारोपण और इमेजिंग सेल ग्राफ्ट के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव विधि है। इस प्रोटोकॉल में, जुगनू लूसिफेरस ट्रांसजीन ल्यूक 2 को व्यक्त करने वाली मुराइन अग्नाशयी बीटा सेल लाइन एनआईटी -1 से कोशिकाओं को इम्यूनोडेफिशिएंसी गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (एनओडी) -गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंसी (स्सिड) चूहों में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया जाता है। इन चूहों को एक साथ ऑटोइम्यूनिटी को स्थानांतरित करने के लिए अनायास मधुमेह नोड चूहों से स्प्लेनोसाइट्स के साथ अंतःशिरा इंजेक्शन दिया जाता है। सेल के अस्तित्व की निगरानी के लिए गैर-इनवेसिव बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के माध्यम से ग्राफ्ट को नियमित अंतराल पर चित्रित किया जाता है। उत्परिवर्ती कोशिकाओं के अस्तित्व की तुलना एक ही माउस में प्रत्यारोपित नियंत्रण कोशिकाओं से की जाती है।

Introduction

टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) अग्न्याशय के इंसुलिन उत्पादक बीटा कोशिकाओं के ऑटोइम्यून विनाश के कारण होता है। बीटा सेल द्रव्यमान के नुकसान के परिणामस्वरूप इंसुलिन की कमी और हाइपरग्लेसेमिया होता है। टी 1 डी रोगी बहिर्जात इंसुलिन के कई दैनिक इंजेक्शन पर भरोसा करते हैं और अपने पूरे जीवन में गंभीर हाइपरग्लेसेमिया और हाइपोग्लाइसीमिया के एपिसोड का अनुभव करते हैं। इन एपिसोड से संबंधित जटिलताओं में मधुमेह रेटिनोपैथी, गुर्दे के कार्य में कमी और न्यूरोपैथी1 शामिल हैं।

इंसुलिन इंजेक्शन एक उपचार है लेकिन टी 1 डी के लिए इलाज नहीं है। खोए हुए बीटा सेल द्रव्यमान को प्रतिस्थापित करना, हालांकि, रोगियों को अपने स्वयं के इंसुलिन का उत्पादन करने में सक्षम बनाकर बीमारी को उलटने की क्षमता है। हालांकि, कैडवेरिक दाता आइलेट्स की आपूर्ति सीमित है। स्टेम सेल-व्युत्पन्न आइलेट्स (एससी-आइलेट्स) प्रत्यारोपण के लिए बीटा कोशिकाओं की लगभग असीमित आपूर्ति प्रदान कर सकते हैं। कई समूहों ने प्रदर्शित किया है कि मानव भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) को कार्यात्मक बीटा जैसी कोशिकाओं 3,4,5 उत्पन्न करने के लिए विभेदित किया जा सकता है। प्रारंभिक नैदानिक परीक्षण डेटा का वादा करने से संकेत मिलता है कि ये कोशिकाएं प्रत्यारोपण के बाद अपना कार्य बनाए रखती हैं और रोगियों को इंसुलिन-स्वतंत्र बनने में सक्षम कर सकतीहैं। क्रोनिक इम्यूनोसप्रेशन की आवश्यकता होती है, हालांकि, इस प्रकार कैंसर और संक्रमण के लिए उनकी संवेदनशीलता बढ़ जाती है। इसके अलावा, इम्यूनोसप्रेसिव एजेंट लंबी अवधि में ग्राफ्ट के लिए साइटोटोक्सिक हो सकतेहैं। इम्यूनोसप्रेशन की आवश्यकता को खत्म करने के लिए, एससी-आइलेट्स को आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है ताकि उन्हें आवर्तक ऑटोइम्यूनिटी के साथ-साथ प्रत्यारोपण के बाद एलोइम्यूनिटी से बचाया जा सके।

स्टेम सेल अनुसंधान लागत और श्रम में अत्यधिक मांग है। माउस सेल लाइनें और पशु मॉडल ऑटोइम्यूनिटी से प्रत्यारोपित कोशिकाओं की रक्षा के लिए रणनीतियों की प्रारंभिक पहचान और प्रयोगात्मक सत्यापन के लिए उपयोगी उपकरण हैं। एनओडी माउस मानव टी 1 डी8 के लिए कई समानताओं के साथ सहज ऑटोइम्यून मधुमेह विकसित करता है, और एनआईटी -1 इंसुलिनोमा सेल लाइन इस माउस स्ट्रेन 9 के साथ एक आनुवंशिक पृष्ठभूमि साझा करतीहै। प्रयोगात्मक चूहों 10 में मधुमेह की शुरुआत को अस्थायी रूप से सिंक्रनाइज़ करने के लिए एनओडी चूहों से मधुमेह स्प्लेनोसाइट्स के इंजेक्शन के माध्यम से मधुमेह को संबंधित इम्यूनोडेफिशिएंट एनओडी-स्सिड माउस स्ट्रेन में स्थानांतरितकिया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग एससी-आइलेट्स में आगे के सत्यापन के लिए अपेक्षाकृत जल्दी और सस्ते में आनुवंशिक लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। हाल ही में, इस विधि को आरएनएलएस की पहचान और मान्य करने के लिए लागू किया गया था, एक लक्ष्य जो विवो में ऑटोइम्यूनिटी से प्राथमिक मानव आइलेट्स की रक्षा करने और विट्रो11 में बीटा सेल तनाव से आईपीएससी-व्युत्पन्न आइलेट्स की रक्षा के लिए पाया गया था। यहां वर्णित आनुवंशिक रूप से इंजीनियर एनआईटी -1 कोशिकाओं को प्रत्यारोपण करने और चूहों में ऑटोइम्यून मधुमेह के दत्तक हस्तांतरण मॉडल में उनके अस्तित्व की गैर-आक्रामक रूप से निगरानी करने के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल है।

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Protocol

Figure 1
चित्रा 1: चूहों में मधुमेह के दत्तक हस्तांतरण मॉडल में रोपाई और इमेजिंग ग्राफ्ट के लिए वर्कफ़्लो। जुगनू ट्रांसजीन लूसिफेरस (ल्यूक 2) को व्यक्त करने वाली एनआईटी -1 कोशिकाओं को एनओडी-स्सिड चूहों में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया जाता है। चूहों को एक साथ ऑटोरिएक्टिव स्प्लेनोसाइट्स के साथ इंजेक्ट किया जाता है जो अनायास मधुमेह नोड माउस से अलग होता है। ग्राफ्ट को गैर-इनवेसिव बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग द्वारा नियमित अंतराल पर चित्रित किया जाता है। BioRender.com द्वारा बनाया गया चित्र। संक्षेप: NOD = गैर-मोटे मधुमेह; स्सिड = गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंसी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सभी पशु देखभाल और अध्ययन प्रोटोकॉल को जोसलिन डायबिटीज सेंटर में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के अनुसार अनुमोदित और प्रदर्शन किया गया था। NOD और NOD-scid चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। इस अध्ययन में सभी चूहों को एक सेंटिनल-मॉनिटर सुविधा में बनाए रखा जाता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, जानवरों, उपकरणों और सॉफ़्टवेयर से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. एनआईटी -1 सेल लाइनों की इंजीनियरिंग और रखरखाव

  1. एनआईटी -1 सेल लाइनों को बनाए रखें, जो एनओडी चूहों के साथ आनुवंशिक पृष्ठभूमि साझा करते हैं, और डीएमईएम में ऊतक संस्कृति-उपचारित व्यंजनों में 293एफटी कोशिकाएं जिसमें 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज होता है, जिसमें 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है।
  2. अभिकर्मक के लिए 293एफटी कोशिकाओं को 70% -80% संगम तक बढ़ाएं।
  3. 293एफटी कोशिकाओं के प्रति 10 सेमी डिश में, 10 μg pLenti-lusiferase-blast (पूरक फ़ाइल 1 देखें) को संयोजित करें, जो संवैधानिक रूप से सक्रिय EF1: प्रोमोटर के नियंत्रण में जुगनू लूसिफेरस ट्रांसजीन (luc2) को व्यक्त करता है, पैकेजिंग प्लास्मिड pMD2.G, pMDLg/pRRE, और PRSV-Rev, 4 μg के लिफाफा प्रोटीन pCMV-VSV-G, और 60 μled pCMV-VSV-G, और 60 μg रैखिक पॉलीएथिलेनमाइन (PEI) के नियंत्रण में। स्थानांतरित की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या के आधार पर मात्रा समायोजित करें।
  4. डीएनए, पीईआई और डीएमईएम को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर छोड़ दें, और फिर उन्हें 293एफटी कोशिकाओं में जोड़ें।
  5. अभिकर्मक के 48 घंटे बाद लेंटिवायरल कणों वाले माध्यम को इकट्ठा करें।
  6. एनआईटी -1 कोशिकाओं को ~ 80% कंफ्लुएंसी पर 1 एमएल माध्यम के साथ ट्रांसड्यूस करें जिसमें 48-72 घंटे के लिए प्रति 106 कोशिकाओं में लेंटिवायरल कण होते हैं।
  7. 48 घंटे के लिए 5 μg / mL ब्लास्टिसिडिन के साथ ल्यूसिफेरस-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का चयन करें।
  8. प्रयोगात्मक प्रश्न के अनुरूप ल्यूसिफेरस-व्यक्त कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से संशोधित करें। तुलना के लिए एक ल्यूसिफेरस-व्यक्त जंगली-प्रकार या गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण सेल लाइन शामिल करें।
    नोट: लक्ष्य जीन संशोधनों के उदाहरणों में CRISPR नॉकआउट, CRISPRa / i, shRNA वध और ओवरएक्प्रेशन शामिल हैं।

2. प्रत्यारोपण के लिए एनआईटी -1 कोशिकाओं की तैयारी

  1. लूसिफेरस-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को तब तक बढ़ाएं जब तक कि वे 80% -90% कॉन्फ्लुएंट न हों।
  2. विकास माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर ्ड खारा (पीबीएस, 10 सेमी डिश के लिए 5 एमएल) के साथ धोएं।
  3. 2 मिनट के लिए प्रत्येक डिश में 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का 1 एमएल जोड़ें।
  4. 5 एमएल विकास माध्यम के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें।
  5. डिश से कोशिकाओं को धोने और उन्हें शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: एक ही सेल लाइन के कई व्यंजनों से कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है।
  6. एक दाग का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें जैसे कि ट्राइपैन ब्लू मैन्युअल रूप से हेमोसाइटोमीटर के साथ या स्वचालित सेल काउंटर के साथ स्वचालित रूप से।
  7. आरटी में 5 मिनट के लिए 250 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और एक एस्पिरेटिंग पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  8. पीबीएस में सेल पेलेट को 5 × 107 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर पुन: निलंबित करें (प्रति माउस प्रति सेल लाइन 107 कोशिकाओं को 200 μL की मात्रा में प्रत्यारोपित किया जाएगा)।
  9. प्रत्यारोपण तक कोशिकाओं को बर्फ पर (3 घंटे तक) रखें।

3. एनओडी-स्सिड चूहों में एनआईटी -1 कोशिकाओं का प्रत्यारोपण

  1. प्राप्तकर्ता चूहों (स्प्लेनोसाइट्स को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों के समान लिंग के 8-10 सप्ताह के एनओडी-स्सिड चूहों) को एक वध कक्ष में आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन द्वारा एनेस्थेटाइज करें। कक्ष में 1.5 लीटर/मिनट की प्रवाह दर और 9 एल/मिनट की निकासी दर पर 2.5% आइसोफ्लुरेन वितरित करें।
  2. सूखने से रोकने के लिए नेत्र मरहम के साथ जानवर की आंखों को चिकनाई दें।
  3. गार्ड के साथ एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके, त्वचा को उजागर करने के लिए चूहों के पीछे (पृष्ठीय पक्ष) से बालों को हटा दें। मुंडा प्रत्यारोपण क्षेत्र लगभग 1 x 2 इंच होगा। प्रत्यारोपण तक शेव किए गए चूहों को वध कक्ष में वापस करें।
  4. चूहों को एक बार में एक आइसोफ्लुरेन नाक शंकु के साथ एक साफ सतह पर स्थानांतरित करें। धीरे से माउस के सिर को नाक शंकु में मार्गदर्शन करें। प्रत्यारोपण के दौरान संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए 0.25 एल / मिनट की आइसोफ्लुरेन प्रवाह दर का उपयोग करें।
  5. ढीले बालों को हटाने और त्वचा को कीटाणुरहित करने के लिए एक आइसोप्रोपिल अल्कोहल प्रेप पैड के साथ प्रत्यारोपण क्षेत्र को पोंछें।
  6. सुनिश्चित करें कि सिरिंज लोड करने से पहले कोशिकाओं को पूरी तरह से पुन: निलंबित किया गया है। 26 ग्राम सुई के साथ 1 एमएल बाँझ सिरिंज में कोशिकाओं की अतिरिक्त मात्रा (>300 μL) खींचें। किसी भी बुलबुले को हटा दें; फिर, अतिरिक्त कोशिकाओं को ट्यूब में वापस करें ताकि सिरिंज में 300 μL सेल निलंबन बना रहे।
  7. गैर-प्रमुख हाथ में रखे गए घुमावदार बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, धीरे से माउस की पीठ के एक तरफ (बाएं या दाएं) त्वचा को उठाएं ताकि चमड़े के नीचे की जगह तक आसान पहुंच हो सके।
  8. प्रमुख हाथ का उपयोग करके, सिरिंज को माउस के शरीर के कोरोनल और धनु विमानों के समानांतर रखें। सुई को माउस के सिर की ओर इंगित करने के साथ, सुई को पिछले हिस्से के पास की त्वचा में डालें, और धीरे से इसे चमड़े के नीचे के स्थान में मार्गदर्शन करें। सुनिश्चित करें कि पूरी सुई त्वचा के नीचे रहती है और अंदर से नहीं गुजरती है।
  9. सुई के आधार के चारों ओर त्वचा को धीरे से पकड़ने के लिए बल को समायोजित करें। धीरे-धीरे सेल निलंबन की एक छोटी मात्रा (<50 μL) को वितरित करें और पुष्टि करें कि इंजेक्शन की साइट पर त्वचा के नीचे एक छोटा उभार बनता है। सेल निलंबन को तब तक इंजेक्ट करना जारी रखें जब तक कि 200 μL चमड़े के नीचे के स्थान पर नहीं पहुंचा दिया जाता है।
  10. जगह-जगह बल पकड़कर और सुई को माउस के शरीर के समानांतर रखते हुए, धीरे-धीरे सुई को वापस ले लें। सुई को हटा दिए जाने के बाद, कोशिकाओं को पंचर घाव से बाहर निकलने से रोकने के लिए त्वचा को कुछ सेकंड के लिए बल के साथ बंद रखें।
  11. यदि आनुवंशिक संशोधन का मूल्यांकन किया जा रहा है, तो एक अलग सिरिंज का उपयोग करके माउस के विपरीत तरफ प्रत्यारोपण को दोहराएं ताकि उत्परिवर्ती और नियंत्रण कोशिकाओं दोनों को प्रत्येक माउस में इंजेक्ट किया जा सके, जिसमें एक सेल लाइन बाईं ओर और दूसरी दाईं ओर हो। यदि केवल एक सेल लाइन प्रत्यारोपित की जा रही है, तो कोशिकाओं को केवल एक तरफ इंजेक्ट करें।
  12. प्रत्यारोपण के बाद, प्रत्येक माउस को एक ताजा पिंजरे में स्थानांतरित करें। पिंजरे में अतिरिक्त चूहों को जोड़ने से पहले प्रत्येक माउस को संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक होने दें।
    नोट: चूहों को ठीक किया जाता है जब वे सामान्य गतिविधियों को फिर से शुरू करते हैं और सुस्ती या बिगड़ा आंदोलन के लक्षण नहीं दिखाते हैं।
  13. प्रत्यारोपण के बाद प्रयोग की अवधि के लिए प्रतिदिन चूहों की स्वास्थ्य स्थिति का मूल्यांकन करें। यदि ग्राफ्ट एक बड़ा उभार बनाते हैं या चूहे कमजोर और सुस्त हो जाते हैं, तो उनके रक्त शर्करा को मापें और सभी हाइपोग्लाइसेमिक चूहों को 10% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) सुक्रोज पानी एड लिबिटम प्रदान करें। सभी पशु चिकित्सा सिफारिशों का पालन करें और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार निरंतर खराब शरीर की स्थिति वाले किसी भी चूहे को इच्छामृत्यु दें। इस अध्ययन में, चूहों को गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 इनहेलेशन द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी।

4. ऑटोरिएक्टिव स्प्लेनोसाइट्स का अलगाव और शुद्धिकरण

  1. मूत्र (या रक्त) ग्लूकोज परीक्षण स्ट्रिप्स का उपयोग करके हाल ही में शुरू (10 दिनों से कम) मधुमेह वाले 10-16 सप्ताह के नर या मादा एनओडी चूहों की पहचान करें। एनओडी चूहों को मधुमेह माना जाता है जब उन्हें कम से कम 2 लगातार दिनों में मूत्र / रक्त ग्लूकोज ≥250 मिलीग्राम / डीएल होता है।
    नोट: प्रत्येक NOD-scid माउस के लिए, 10 मिलियन स्प्लेनोसाइट्स की आवश्यकता होती है; एक तिल्ली आमतौर पर 50 मिलियन से 150 मिलियन स्प्लेनोसाइट्स पैदा करती है। स्प्लेनोसाइट्स को एक सेंटिनल-मॉनिटर सुविधा में रखे गए रोगज़नक़-मुक्त चूहों से अलग किया गया था।
  2. मधुमेह नोड चूहों की उचित संख्या को यूथेनाइज़ करें।
    नोट: इस अध्ययन में, चूहों को मृत्यु सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 इनहेलेशन द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी।
  3. अपनी पीठ पर माउस के साथ, सर्जिकल कैंची के साथ त्वचा में लगभग 2 इंच लंबाई में एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं। शोधकर्ता के दृष्टिकोण से माउस के दाईं ओर खोलें और उज्ज्वल लाल तिल्ली का पता लगाएं। धीरे से प्लीहा को गुलाबी अग्न्याशय से दूर काट लें और इसे बाँझ 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल बाँझ पीबीएस होता है। जितना आवश्यक हो उतने चूहों के साथ विच्छेदन दोहराएं।
    नोट: कई चूहों से तिल्ली को एक डिश में जोड़ा जा सकता है। बाँझ हुड में बाँझ अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग करके निम्नलिखित चरणों का संचालन करें।
  4. एक बाँझ सिरिंज प्लंजर के सपाट शीर्ष के साथ तिल्ली (ओं) को मैश करें।
  5. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 40 μm या 70 μm छन्नी रखें और इसे प्राइम करने के लिए 5 एमएल पीबीएस के साथ छन्नी को धोएं। प्लीहा (ओं) निलंबन को छन्नी में स्थानांतरित करें और छन्नी के माध्यम से कोमल मैशिंग जारी रखें। पकवान को 10 एमएल पीबीएस के साथ धोएं और धोने को छन्नी में स्थानांतरित करें। जब तक छन्नी से लाल रंग गायब न हो जाए तब तक मैश करना जारी रखें।
  6. छन्नी को छोड़ दें और ट्यूब को 500 × ग्राम पर आरटी में 5 मिनट के लिए घुमाएं।
  7. एसीके लाइसिस बफर के 5 एमएल (तीन तिल्ली तक) में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें और 4 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिकाओं को लाइस करें। यदि अतिरिक्त तिल्ली की आवश्यकता हो तो प्रति प्लीहा 1-2 एमएल की मात्रा बढ़ाएं।
  8. लाइसिस बफर के प्रति 5 एमएल एनआईटी -1 सेल मीडिया (ऊपर वर्णित) के 5 एमएल के साथ प्रतिक्रिया बंद करें। झुरमुट को हटाने के लिए एक ताजा छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन पारित करें। छन्नी को छोड़ दें, और आरटी पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर स्पिन करें।
  9. पीबीएस के 20 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, और कोशिकाओं की गणना करें। 1.5 एमएल सेफ-लॉक रिएक्शन ट्यूब में 1 × × 108 कोशिकाओं /एमएल (इंजेक्शन की मात्रा 0.1 एमएल / माउस है) की एकाग्रता पर बाँझ पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  10. कोशिकाओं को बर्फ पर स्टोर करें (1 घंटे से अधिक नहीं) या कोशिकाओं को आरटी पर रखें, और तुरंत पूंछ नस इंजेक्शन के लिए आगे बढ़ें।

5. पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से मधुमेह स्प्लेनोसाइट्स का अंतःशिरा इंजेक्शन

  1. नसों को वासोडिलेट करने के लिए वयस्क प्राप्तकर्ता NOD-scid चूहों (उदाहरण के लिए, ~ 5-10 मिनट के लिए गर्मी लैंप का उपयोग करके) के शरीर को गर्म करें (यह नस में विज़ुअलाइज़ेशन और इंजेक्शन के लिए मदद करता है)।
    नोट: चूहों के अति गर्म होने से बचने के लिए, इस समय से अधिक न करें। हमेशा स्वास्थ्य की स्थिति की निगरानी करें। यदि चूहे थके हुए या गतिहीन दिखाई देते हैं, तो गर्मी लैंप को तुरंत बंद कर दें।
  2. सेल निलंबन को गर्म करें। बाँझ सुई (27-30 ग्राम, 0.3 मिमी / 0.5 इंच या उससे छोटी) के साथ एक बाँझ सिरिंज (0.3-1.0 एमएल) तैयार करें, या 0.3 मिमी (0.5 इंच) सुई के साथ बाँझ 0.5 एमएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें। सुई को हमेशा बाँझ रखें और एक बाँझ ट्रे का उपयोग करें यदि सिरिंज को इंजेक्शन के बीच रखा जाना चाहिए।
  3. प्रत्येक इंजेक्शन से पहले स्प्लेनोसाइट समाधान को पुन: निलंबित करें। प्रत्येक माउस के लिए, सिरिंज में पूर्वनिर्मित और मिश्रित स्प्लेनोसाइट निलंबन के 100 μL खींचें। सुनिश्चित करें कि सिरिंज या निलंबन में कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं।
    नोट: माउस को संयम उपकरण में रखने से पहले सभी उपकरण और आपूर्ति तैयार करना सुनिश्चित करें (कीटाणुशोधन के लिए अल्कोहल वाइप्स, स्प्लेनोसाइट्स से भरी एक सिरिंज, और इंजेक्शन वाले चूहों को अलग करने के लिए एक ताजा पिंजरा)।
  4. माउस को संयम डिवाइस में रखें। गैर-प्रमुख हाथ से पूंछ को पकड़ें और दो पार्श्व पूंछ नसों में से एक का पता लगाएं। यदि आवश्यक हो तो धीरे से पूंछ को घुमाएं। त्वचा को साफ करने और नस की दृश्यता बढ़ाने के लिए एक कीटाणुशोधन पोंछ (70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल) के साथ पूंछ को पोंछें।
  5. सुई को प्रमुख हाथ के साथ पूंछ के मध्य क्षेत्र में एक तीव्र कोण पर डालें। सुई के झुकाव के साथ, सुई को त्वचा के माध्यम से कुछ मिलीमीटर स्लाइड करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सुई नस के समानांतर है और त्वचा के नीचे थोड़ा सा रखा गया है। पोत की दीवार को भेदने के बाद सीधे माउस / पूंछ के अचानक आंदोलनों के लिए तैयार रहें। सुई का एक सफल सम्मिलन नस में "चिकनी स्लाइड" की तरह महसूस होना चाहिए। यदि एक और प्रयास की आवश्यकता है, तो पूंछ को शरीर की ओर आगे बढ़ाएं।
  6. स्प्लेनोसाइट सस्पेंशन को इंजेक्ट करने के लिए सिरिंज पर कोमल दबाव लागू करें। इंजेक्शन लगाते समय सुई को आगे या बाहर न बढ़ने दें। सफल इंजेक्शन इंजेक्शन के दौरान किसी भी पीठ दबाव को महसूस किए बिना चिकने होते हैं और इंजेक्शन के तुरंत बाद एक पारदर्शी / सफेद रक्त प्रवाह द्वारा इंगित किए जाते हैं।
  7. धीरे से सुई को नस से बाहर छोड़ें, और रक्तस्राव बंद होने तक कीटाणुशोधन पोंछे के साथ पूंछ पर हल्का दबाव लागू करें। संयम डिवाइस से माउस छोड़ दें, और धीरे से इसे ताजा तैयार पिंजरे में स्थानांतरित करें।
    नोट: मधुमेह को प्रेरित करने के लिए ऑटोरिएक्टिव स्प्लेनोसाइट्स की क्षमता की पुष्टि करने के लिए स्प्लेनोसाइट्स के साथ एनआईटी -1 सेल प्रत्यारोपण प्राप्त नहीं करने वाले दो से तीन नियंत्रण चूहों को इंजेक्ट करें, जिसमें इंजेक्शन के बाद लगभग 2-4 सप्ताह लगते हैं।

6. एनआईटी -1 ग्राफ्ट के विवो बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग में

नोट: प्रति सप्ताह एक से दो बार ग्राफ्ट की छवि बनाएं। प्रत्यारोपण के दिन, प्रत्यारोपण के बाद कम से कम 2 घंटे प्रतीक्षा करें ताकि ग्राफ्ट को व्यवस्थित किया जा सके और स्थिर लूसिफेरस अभिव्यक्ति सुनिश्चित की जा सके। यदि समय एक सीमित कारक है, तो प्रारंभिक माप इसके बजाय दिन 1 पर लिया जा सकता है। एक अनुशंसित प्रारंभिक इमेजिंग शेड्यूल दिन 0 या दिन 1 पोस्ट इंजेक्शन, दिन 5, दिन 10, दिन 14, दिन 18 और दिन 25 है। हालांकि, बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल के नुकसान से आंका गया ऑटोइम्यूनिटी की प्रगति के आधार पर अनुसूची को समायोजित करें।

  1. डलबेको के पीबीएस में 15 मिलीग्राम / एमएल डी-लूसिफेरिन समाधान तैयार करें। आरटी को भंग करने के लिए आंदोलन करें, और बाँझ-फ़िल्टर (0.22 μm)। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट स्टोर करें, और आवश्यकतानुसार पिघलें।
    नोट: एलिकोट को फिर से बनाया जा सकता है।
  2. इमेजिंग से कम से कम 5 मिनट पहले, चूहों को 1 एमएल सिरिंज और 26 जी सुई के साथ डी-लूसिफेरिन समाधान का उपयोग करके 150 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर इंजेक्ट करें।
    नोट: प्रत्येक माउस के लिए एक ताजा सिरिंज और सुई का उपयोग करें।
  3. संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें। अनुशंसित स्थितियां 2.5% आइसोफ्लुरेन हैं, जिसमें वध कक्ष में 1.5 एल / मिनट की प्रवाह दर और 9 एल / मिनट की निकासी दर है।
  4. सूखने से रोकने के लिए नेत्र मरहम के साथ जानवर की आंखों को चिकनाई दें।
  5. इमेजिंग उपकरण से जुड़े सॉफ़्टवेयर खोलें। एक नया उपयोगकर्ता बनाएं और / या लॉगिन करें। नीचे दाईं ओर नियंत्रण कक्ष पर, प्रारंभिक (चित्रा 2 ए) का चयन करें। इमेजिंग डेटा को स्वत: सहेजने के लिए, कंप्यूटर पर उपयुक्त फ़ोल्डर बनाएँ , और उसके बाद अधिग्रहण का चयन करें | ऑटो-सेव टू... (चित्र 2ए)। एक बार जब उपकरण शुरू हो जाता है, तो एक्सपोजर समय को 1 मिनट तक सेट करें।
    नोट: पूर्ण इमेजिंग पैरामीटर चित्रा 2 बी में दिखाए गए हैं।
  6. चूहों को एक बार में वध कक्ष से इमेजिंग उपकरण में स्थानांतरित करें। माउस को अपने अंगों के साथ अपने पेट पर रखें, और धीरे से अपने सिर को नाक शंकु में निर्देशित करें। इमेजिंग के दौरान संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए नाक शंकु के माध्यम से वितरित 0.25 एल / मिनट की आइसोफ्लुरेन प्रवाह दर उपयुक्त है। धीरे से माउस को दोनों हाथों से अपनी पीठ के केंद्र को दबाकर समतल करें और फिर हाथों को बाहर और अलग फैलाएं।
  7. अधिग्रहण का चयन करें (चित्रा 2 बी)। पॉप-अप विंडो (चित्रा 2 सी) में प्रयोग के किसी भी प्रासंगिक विवरण को रिकॉर्ड करें।
    नोट: विभिन्न समय बिंदुओं पर दो ग्राफ्ट के साथ प्रत्यारोपित तीन 8 सप्ताह की मादा एनओडी-स्सिड चूहों की प्रतिनिधि छवियों के लिए चित्रा 3 ए देखें।

Figure 2
चित्र 2: इमेजिंग बायोल्यूमिनेसेंट ग्राफ्ट के लिए सॉफ्टवेयर कमांड के स्क्रीनशॉट। (A) इमेजिंग से पहले, उपकरण तैयार करने के लिए प्रारंभिक का चयन करें। अधिग्रहण का चयन करके छवियों को पसंद के फ़ोल्डर में स्वचालित रूप से सहेजा जा सकता है | ऑटो-सेव टू... (बी) इमेजिंग मापदंडों का अवलोकन। एक बार जब माउस को उपकरण में तैनात कर दिया जाता है, तो अधिग्रहण का चयन करें। (सी) इमेजिंग के दौरान पॉप अप होने वाले संवाद बॉक्स का स्क्रीनशॉट। समय बिंदु और माउस तनाव जैसे विवरण यहां दर्ज किए जा सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

7. डेटा विश्लेषण

  1. इमेजिंग के बाद किसी भी समय बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल की मात्रा निर्धारित करें। इमेजिंग उपकरण से जुड़े सॉफ़्टवेयर खोलें। फ़ाइल का चयन करें | खोलें, और विश्लेषण किए जाने वाले माउस से संबद्ध ClickInfo.txt फ़ाइल का चयन करें।
  2. उपकरण पैलेट में, ROI उपकरण (चित्रा 3B, चरण 1) का चयन करें। अंडाकार ड्रॉपडाउन मेनू (चित्रा 3 बी, चरण 1, लाल तीर) से, माउस में प्रत्यारोपित ग्राफ्ट की संख्या का चयन करें।
  3. अंडाकार को स्थानांतरित करें ताकि उनमें प्रत्येक ग्राफ्ट से बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल हो, और माप आरओआई का चयन करें (चित्रा 3 बी, चरण 2)।
  4. प्रत्येक ग्राफ्ट के लिए कुल गणना रिकॉर्ड करें (चित्रा 3 बी, चरण 3)।
  5. प्रत्येक ग्राफ्ट के लिए, पहली बार बिंदु पर मापा गया सिग्नल द्वारा हर समय बिंदु पर मापा गया बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल विभाजित करें। प्रारंभिक बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल के सापेक्ष अवशिष्ट बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल के अनुपात या प्रतिशत के रूप में ग्राफ्ट उत्तरजीविता की रिपोर्ट करें।
    नोट: यदि प्रत्यारोपण के बाद ग्राफ्ट का विस्तार होता है, तो ग्राफ्ट जीवित रहने का अनुपात या प्रतिशत क्रमशः 1 या 100% से अधिक होगा। प्रत्यारोपण प्राप्त करने वाले सभी चूहों को प्रतिकूल स्वास्थ्य प्रभावों के लिए निगरानी की जानी चाहिए।

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Representative Results

प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 में उल्लिखित है। दो सेल लाइनों के अस्तित्व, जैसे कि एक उत्परिवर्ती और एक गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण, की तुलना की जा सकती है, या एक सेल लाइन के अस्तित्व को चूहों के कई समूहों में मापा जा सकता है, जैसे कि दवा-उपचारित चूहे बनाम वाहन-उपचारित नियंत्रण। चित्रा 3 ए तीन 8 सप्ताह की महिला एनओडी-स्सिड चूहों को एक गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण (बाएं) और एक उत्परिवर्ती (दाएं) सेल लाइन के साथ प्रत्यारोपित करता है। चूहों को मधुमेह को स्थानांतरित करने के लिए ऑटोरिएक्टिव स्प्लेनोसाइट्स के साथ अंतःशिरा इंजेक्शन भी दिया गया था।

चूहों को इंजेक्शन के बाद दिन 0, दिन 5, दिन 10, दिन 14 और दिन 18 पर चित्रित किया गया था। तीन चूहों में से दो में, नियंत्रण ग्राफ्ट को 18 वें दिन तक नष्ट कर दिया गया था, जैसा कि बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल के नुकसान से स्पष्ट है, जबकि उत्परिवर्ती ग्राफ्ट को संरक्षित किया गया था। एक माउस में, उत्परिवर्ती ग्राफ्ट लेकिन नियंत्रण ग्राफ्ट को नष्ट कर दिया गया था, जो जानवरों के बीच जैविक भिन्नता को उजागर करता है। बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल को चित्रा 3 बी में वर्णित के रूप में परिमाणित किया गया था। ग्राफ्ट उत्तरजीविता को पहली बार बिंदु (चित्रा 3 सी) की तुलना में अवशिष्ट बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल के प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट किया गया है। जानवरों के बीच भिन्नता की कल्पना करने के लिए प्रत्येक माउस के लिए ल्यूमिनेसेंट संकेतों को नियंत्रित करने के लिए उत्परिवर्ती के अनुपात की गणना करना भी उपयोगी है (चित्रा 3 डी)। डेटा संग्रह अवधि के अंत में, चूहों को सीओ2 इनहेलेशन द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी, जिसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था हुई थी।

रोग हस्तांतरण से पहले, प्रत्यारोपित कोशिकाएं प्रतिकृति हो सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप विस्तारित ग्राफ्ट होते हैं जो त्वचा के माध्यम से दिखाई देते हैं (चित्रा 4 ए)। इन ग्राफ्ट में छवि बनने पर संतृप्त बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल होंगे (चित्रा 4 बी), जिसे सटीक रूप से निर्धारित नहीं किया जा सकता है।

Figure 3
(A) तीन 8 सप्ताह की मादा NOD-scid चूहों को गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण (दाएं) और उत्परिवर्ती कोशिकाओं (बाएं) के साथ प्रत्यारोपित किया गया और मधुमेह को प्रेरित करने के लिए ऑटोरिएक्टिव स्प्लेनोसाइट्स के साथ अंतःशिरा इंजेक्शन दिया गया। इंजेक्शन के बाद चूहों को दिन 0, दिन 5, दिन 10, दिन 14 और दिन 18 पर गैर-आक्रामक रूप से चित्रित किया गया था। बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल को कम तीव्रता (नीले) से लेकर उच्च तीव्रता (लाल) तक के रंग स्पेक्ट्रम द्वारा चित्रित किया गया है। (बी) बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल की मात्रा निर्धारित करने के लिए निर्देश। (ग) ग्राफ्ट ल्यूमिनेसेंस का औसत प्रतिशत समय के साथ शेष रहता है। (डी) प्रत्येक माउस के लिए उत्परिवर्ती बनाम गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण ग्राफ्ट के लिए समय के साथ ग्राफ्ट ल्यूमिनेसेंस के प्रतिशत का अनुपात। अनुपात = 1 समय बिंदुओं को इंगित करता है जिस पर शेष सिग्नल का प्रतिशत दोनों ग्राफ्ट के लिए बराबर है। संक्षेप: NOD = गैर-मोटे मधुमेह; सिड = गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंट; एनटीसी = गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण; म्यूट = उत्परिवर्ती। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: ग्राफ्ट के उदाहरण जो अत्यधिक विस्तारित होते हैं। (A) विस्तारित ग्राफ्ट माउस की त्वचा के माध्यम से उभर सकते हैं (लाल तीर द्वारा इंगित)। (बी) विस्तारित ग्राफ्ट संतृप्त बायोल्यूमिनेसेंट संकेत दे सकते हैं। बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल को कम तीव्रता (नीले) से लेकर उच्च तीव्रता (लाल) तक के रंग स्पेक्ट्रम द्वारा चित्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: pLenti-लुसिफेरस-ब्लास्ट अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

टी 1 डी एक विनाशकारी बीमारी है जिसके लिए वर्तमान में कोई इलाज मौजूद नहीं है। बीटा सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी इस बीमारी वाले रोगियों के लिए एक आशाजनक उपचार प्रदान करती है, लेकिन इस रणनीति के लिए महत्वपूर्ण बाधा प्रत्यारोपित बीटा कोशिकाओं के खिलाफ आवर्तक ऑटोइम्यून हमले की क्षमता है। एससी-बीटा कोशिकाओं की आनुवंशिक इंजीनियरिंग उनकी प्रतिरक्षा दृश्यता या संवेदनशीलता को कम करने के लिए इस समस्या का एक संभावित समाधान है। यहां वर्णित चूहों में ऑटोइम्यून मधुमेह के दत्तक हस्तांतरण मॉडल में उनके अस्तित्व को मापने के लिए गैर-इनवेसिव इमेजिंग प्रत्यारोपित बीटा कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल है।

इस विधि का एक प्रमुख लाभ प्रोटोकॉल की अनुकूलनशीलता है। एक उत्परिवर्ती सेल लाइन की तुलना गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण (चित्रा 3) से करने के लिए विधि यहां लागू की जाती है, लेकिन प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक प्रश्नों को समायोजित कर सकता है। ऑटोइम्यून हमले के खिलाफ आनुवंशिक संशोधनों, दवाओं या अन्य उपचारों की एक विस्तृत श्रृंखला के सुरक्षात्मक प्रभावों का पता लगाया जा सकता है। ऑटोइम्यूनिटी से बचाने में दवा या अन्य उपचार की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करते समय, केवल बिना किसी अतिरिक्त आनुवंशिक संशोधनों के ल्यूसिफेरस व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। जबकि इस पेपर में ऑटोइम्यून सुरक्षा का परीक्षण करने के लिए सिंजेनिक प्रत्यारोपण का उपयोग किया जाता है, विधि को सेल लाइन और माउस स्ट्रेन के संयोजन का उपयोग करके एलोइम्यून अस्वीकृति का मूल्यांकन करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि एनआईटी -1 कोशिकाएं और सी 57बीएल / 6 जे चूहे। ग्राफ्ट में प्रतिरक्षा घुसपैठ का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल को भी संशोधित किया जा सकता है। अतिरिक्त चूहे जिनसे ग्राफ्ट को विभिन्न समय बिंदुओं पर पुनर्प्राप्त किया जाता है, को शामिल किया जा सकता है, और घुसपैठ करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या फ्लो साइटोमेट्री द्वारा प्रोफाइल किया जा सकता है।

इस पद्धति के आवेदन की एक बड़ी सीमा मानव कोशिकाओं और रोगियों में अनुवाद करने के लिए चूहों में प्राप्त परिणामों की विफलता है। ऑटोम्यून्यून सुरक्षा के लिए 500 से अधिक रणनीतियों को मधुमेह माउस मॉडल में सफलता के साथ लागू किया गया है, फिर भी बहुमत नैदानिक लाभ7 प्रदर्शित करने में विफल रहे हैं। प्राथमिक मानव आइलेट्स एक सीमित संसाधन हैं, हालांकि, और स्टेम सेल के काम में उच्च वित्तीय और श्रम लागत है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सस्ती और सरल माउस तकनीक का उपयोग करके संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की प्रारंभिक पहचान के लिए एक उपकरण है। बाद के प्रयोगों को प्राथमिक और / या एससी-आइलेट्स के साथ किया जाना चाहिए, जो आमतौर पर चूहों में किडनी कैप्सूल के नीचे प्रत्यारोपित होते हैं। यहां वर्णित विधि को मानव कोशिकाओं में चिकित्सीय रणनीतियों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्राथमिक और एससी-आइलेट्स दोनों को ल्यूसिफेरस को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, और उनके अस्तित्व को मानवकृत माउस मॉडल12,13 में किडनी कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपण के बाद बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग द्वारा मापा जा सकता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा आंख की पुतली पर प्रत्यारोपित आइलेट ग्राफ्ट के अस्तित्व की गैर-आक्रामक निगरानी के तरीकों कीभी सूचना दी गई है।

इस पेपर में वर्णित विधि से जुड़ी एक अतिरिक्त सीमा पृथक स्प्लेनोसाइट्स की ऑटोरिएक्टिव क्षमता में भिन्नता है। यद्यपि रोग हस्तांतरण की दर10 अधिक है, स्प्लेनोसाइट इंजेक्शन के बाद मधुमेह की शुरुआत की समयरेखा 2 सप्ताह से 4 सप्ताह तक भिन्न हो सकती है। इस समय के दौरान, प्रत्यारोपित कोशिकाओं का विस्तार हो सकता है (चित्रा 4), जिसके परिणामस्वरूप हाइपरइन्सुलिनमिया और गंभीर हाइपोग्लाइसीमिया होता है। कई मधुमेह दाता चूहों से स्प्लेनोसाइट्स का संयोजन प्रयोगों के बीच भिन्नता को कम कर सकता है।

इन सीमाओं के बावजूद, विधि ऑटोइम्यून सुरक्षा के लिए रणनीतियों के परीक्षण के लिए एक सीधा और सूचनात्मक उपकरण है। प्रोटोकॉल बुनियादी क्लोनिंग और सेल कल्चर तकनीकों, एक सरल और न्यूनतम इनवेसिव माउस सर्जरी और गैर-इनवेसिव इमेजिंग का उपयोग करता है, जिससे उपयोगकर्ता प्रति प्रयोग आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करते हुए डेटा संग्रह को अधिकतम कर सकता है। विवो बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग में एक विकल्प के रूप में , ग्राफ्ट को विभिन्न समय बिंदुओं पर पुनर्प्राप्त किया जा सकता है, वजन, फोटो खिंचवाया जा सकता है, और प्रतिरक्षा कोशिका लक्षण वर्णन के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है। इस रणनीति के लिए बड़ी संख्या में चूहों की आवश्यकता होती है, क्योंकि ग्राफ्ट रिकवरी के लिए इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है, और प्रत्येक समय बिंदु पर प्रतिकृति होना वांछनीय है। इसके अलावा, ग्राफ्ट पुनर्प्राप्ति विधि प्रति ग्राफ्ट केवल एक आकार माप लेने की अनुमति देती है। चूंकि ऑटोरिएक्टिव स्प्लेनोसाइट्स द्वारा बीटा सेल की हत्या की समयरेखा व्यक्तियों में भिन्न होती है, इसलिए ग्राफ्ट रिकवरी के लिए इष्टतम समय बिंदु निर्धारित करना मुश्किल हो सकता है। इस पेपर में वर्णित दृष्टिकोण शोधकर्ता को जीवित चूहों में ऑटोइम्यूनिटी की प्रगति की निगरानी करने और ग्राफ्ट विनाश की पूरी समयरेखा प्राप्त करने की अनुमति देता है। जब तक चूहे यूग्लिसीमिया को बनाए रखते हैं, तब तक संरक्षित ग्राफ्ट को चूहों में छोड़ा जा सकता है और सुरक्षा की डिग्री को स्पष्ट करने के लिए लंबे समय तक चित्रित किया जा सकता है।

यहां वर्णित ऑटोइम्यून मधुमेह के दत्तक स्थानांतरण माउस मॉडल में प्रत्यारोपण और गैर-इनवेसिव इमेजिंग बीटा सेल ग्राफ्ट के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल है। यह विधि जानवरों की न्यूनतम संख्या का उपयोग करने में सक्षम बनाती है और ग्राफ्ट विश्लेषण के समय में लचीलेपन की अनुमति देती है, जो ऑटोइम्यूनिटी की प्रगति में भिन्नता को देखते हुए महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल को प्रयोगात्मक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। माउस मॉडल नई चिकित्सीय रणनीतियों की खोज और सत्यापन में महत्वपूर्ण हैं, और यह विधि बीटा सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा क्षेत्र को आगे बढ़ाने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि विकसित करने के लिए डॉ एरिका पी काई और डॉ युकी इशिकावा को धन्यवाद देते हैं (रेफरी 11 देखें)। एस.के. और पी.वाई. की प्रयोगशालाओं में अनुसंधान को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (आर01डीके120445, पी30डीके036836), जेडीआरएफ, हार्वर्ड स्टेम सेल इंस्टीट्यूट और बीट्सन फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है। टी.एस. को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (एनआईडीडीके) (टी 32 डीके007260-45) से एक पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, और केबी को मैरी के. इयाकोका फाउंडेशन से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA Corning 25-052-CI
293FT Invitrogen R70007 Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol Amazon/Ever Ready First Aid B08NWF31DX
BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip BD 309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q BD 305115
BD 1 mL TB Syringe Slip Tip BD 309659
Blasticidin S HCl Corning  30-100-RB
Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile Southern Labware C4070 Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size
CellDrop automated cell counter Denovix CellDrop BF-PAYG Or use similar cell counter device
Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL VWR 414004-265 Or use similar aspirating pipette
D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% Goldbio LUCK-100
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine Gibco 10313039
Falcon BD tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-959-49A
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028
Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel Fisher Scientific 13-820-074
Glucose urine test strip California Pet Pharmacy u-tsg100 Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood
GlutaMAX–1 (100x) Gibco 35050-061
Infrared heating lamp Cole Parmer 03057-00 Or use similar infrared lamp 
Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in Becton Dickinson 309306
Isoflurane, USP Piramal Critical Care 6679401725
IVIS Spectrum in vivo imaging system Perkin Elmer 124262 Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells
Living Image Analysis Software Perkin Elmer 128113 Software for collecting and quantifying bioluminescent signal
Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL USA Scientific 1615-5510 Or use similar sterile microcentrifuge tubes
NIT-1 ATCC CRL-2055 Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice
NOD.Cg-Prkdcscid/J The Jackson Laboratory 001303 Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment.
NOD/ShiLtJ The Jackson Laboratory 001976 The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010031 No calcium, no magnesium, no phenol red
pCMV-VSV-G Addgene 8454
pLenti-luciferase-blast Made in-house Plasmid available upon request See Supplemental File 1
pMD2.G Addgene 12259
pMDLg/pRRE Addgene 12251
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) Fisher Scientific NC1014320
pRSV-Rev Addgene 12253
Restrainer for rodents, broome-style round 1 in Fisher Scientific 01-288-32A
Scissors, sharp-pointed Fisher Scientific 08-940 Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel
Tissue-culture treated culture dishes Millipore Sigma CLS430167-20EA Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes
Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped Fisher Scientific 12-000-157

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References

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जीव विज्ञान अंक 189
चूहों में ऑटोइम्यून मधुमेह के दत्तक स्थानांतरण मॉडल में ग्राफ्ट सर्वाइवल की बायोल्यूमिनेसेंट निगरानी
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Stewart, T., Bode, K., Kissler, S.,… More

Stewart, T., Bode, K., Kissler, S., Yi, P. Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice. J. Vis. Exp. (189), e64836, doi:10.3791/64836 (2022).

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