Summary
Этот протокол описывает простой и минимально инвазивный метод трансплантации и визуализации клеток NIT-1 у мышей с комбинированным иммунодефицитом, не страдающих ожирением (NOD) и тяжелой формой иммунодефицита, которым подвергались воздействию спленоцитов, очищенных от мышей со спонтанным диабетом NOD.
Abstract
Сахарный диабет 1 типа характеризуется аутоиммунным разрушением инсулин-продуцирующих бета-клеток поджелудочной железы. Перспективным методом лечения этого заболевания является трансплантация бета-клеток, полученных из стволовых клеток. Однако генетические модификации могут быть необходимы для защиты трансплантированных клеток от стойкого аутоиммунитета. Модели мышей с диабетом являются полезным инструментом для предварительной оценки стратегий защиты трансплантированных клеток от аутоиммунной атаки. Здесь описан минимально инвазивный метод трансплантации и визуализации клеточных трансплантатов в адаптивной модели переноса диабета у мышей. В этом протоколе клетки из линии бета-клеток поджелудочной железы мыши NIT-1, экспрессирующие трансген люциферазы светлячка luc2 , подкожно трансплантируются иммунодефицитным мышам с диабетом (NOD) и тяжелым комбинированным иммунодефицитом (scid) без ожирения. Этим мышам одновременно вводят внутривенно спленоциты от спонтанно диабетических мышей NOD для передачи аутоиммунитета. Трансплантаты визуализируются через регулярные промежутки времени с помощью неинвазивной биолюминесцентной визуализации для мониторинга выживаемости клеток. Выживание мутантных клеток сравнивается с выживанием контрольных клеток, трансплантированных той же мыши.
Introduction
Диабет 1 типа (СД1) вызывается аутоиммунным разрушением инсулин-продуцирующих бета-клеток поджелудочной железы. Потеря бета-клеточной массы приводит к дефициту инсулина и гипергликемии. Пациенты с СД1 полагаются на многократные ежедневные инъекции экзогенного инсулина и испытывают эпизоды тяжелой гипергликемии и гипогликемии на протяжении всей своей жизни. Осложнения, связанные с этими эпизодами, включают диабетическую ретинопатию, снижение функции почек и невропатию1.
Инъекции инсулина являются лечением, но не лекарством от СД1. Однако замена потерянной бета-клеточной массы может обратить вспять болезнь, позволяя пациентам вырабатывать свой собственный инсулин. Тем не менее, предложение островков трупного донора ограничено2. Островки, полученные из стволовых клеток (SC-островки), могут обеспечить практически неограниченный запас бета-клеток для трансплантации. Несколько групп продемонстрировали, что эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть дифференцированы с образованием функциональных бета-подобных клеток 3,4,5. Многообещающие данные ранних клинических испытаний указывают на то, что эти клетки сохраняют свою функцию после трансплантации и могут позволить пациентам стать инсулинонезависимыми6. Однако требуется хроническая иммуносупрессия, что повышает их восприимчивость к раку и инфекциям. Кроме того, иммунодепрессанты могут быть цитотоксичными для трансплантатов в долгосрочной перспективе7. Чтобы устранить необходимость иммуносупрессии, SC-островки могут быть генетически модифицированы, чтобы защитить их от рецидивирующего аутоиммунитета, а также аллоиммунитета после трансплантации.
Исследования стволовых клеток очень требовательны к затратам и трудозатратам. Клеточные линии мышей и животные модели являются полезными инструментами для первоначальной идентификации и экспериментальной проверки стратегий защиты трансплантированных клеток от аутоиммунитета. У мыши NOD развивается спонтанный аутоиммунный диабет со многими сходствами с человеческим T1D8, а клеточная линия инсулиномы NIT-1 имеет общий генетический фон с этим мышиным штаммом9. Диабет может быть адоптивно перенесен на родственный иммунодефицитный штамм мыши NOD-scid посредством инъекции диабетических спленоцитов от мышей NOD с целью временной синхронизации начала диабета у реплицированных экспериментальных мышей10. Эта модель может быть использована для относительно быстрой и недорогой идентификации генетических мишеней для дальнейшей валидации в SC-островках. Недавно этот метод был применен для идентификации и проверки RNLS, мишени, которая, как было установлено, защищает первичные островки человека от аутоиммунитета in vivo и островки, полученные из iPSC, от стресса бета-клеток in vitro11. Здесь описан простой протокол трансплантации генетически модифицированных клеток NIT-1 и неинвазивного мониторинга их выживаемости в адаптивной модели переноса аутоиммунного диабета у мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Рисунок 1: Рабочий процесс трансплантации и визуализации трансплантатов в адаптивной модели переноса диабета у мышей. Клетки NIT-1, экспрессирующие трансген светлячка люциферазу (luc2), пересаживают подкожно мышам NOD-scid. Мышам одновременно вводят аутореактивные спленоциты, выделенные у мыши со спонтанным диабетом NOD. Трансплантаты визуализируются через равные промежутки времени с помощью неинвазивной биолюминесцентной визуализации. Рисунок создан BioRender.com. Сокращения: NOD = диабетик без ожирения; SCID = тяжелый комбинированный иммунодефицит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Все протоколы ухода за животными и исследований были одобрены и выполнены в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Диабетическом центре Джослина. Мыши NOD и NOD-scid могут быть легко получены из коммерческих источников. Все мыши, участвовавшие в этом исследовании, содержатся в учреждении под дозорным наблюдением. Подробную информацию обо всех материалах, животных, инструментах и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
1. Проектирование и обслуживание клеточных линий НИТ-1
- Поддерживайте клеточные линии NIT-1, которые имеют общий генетический фон с мышами NOD, и клетки 293FT в чашках, обработанных тканевой культурой, в DMEM, содержащих 4,5 г / л глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2.
- Увеличьте количество клеток 293FT до слияния 70-80% для трансфекции.
- На 10-сантиметровую чашку из 293FT-клеток объедините 10 мкг бласта pLenti-люциферазы (см. Дополнительный файл 1), который экспрессирует трансген люциферазы светлячка (luc2) под контролем конститутивно активного промотора EF1α, по 2 мкг каждой из упаковочных плазмид pMD2.G, pMDLg/pRRE и pRSV-Rev, 4 мкг плазмиды белка оболочки pCMV-VSV-G и 60 мкг линейного полиэтиленимина (PEI) в 1 мл ДМЭМ без сыворотки. Отрегулируйте количество в зависимости от количества клеток, подлежащих трансфицированию.
- Оставьте ДНК, PEI и DMEM при комнатной температуре (RT) на 20 минут, а затем добавьте их в клетки 293FT.
- Собирают среду, содержащую лентивирусные частицы, через 48 ч после трансфекции.
- Трансдуцируют клетки NIT-1 при ~80% слиянии с 1 мл среды, содержащей лентивирусные частицы, на 106 клеток в течение 48-72 ч.
- Выберите клетки, экспрессирующие люциферазу, с 5 мкг / мл бластицидина в течение 48 часов.
- Далее генетически модифицировать клетки, экспрессирующие люциферазу, в соответствии с экспериментальным вопросом. Включите экспрессирующую люциферазу контрольную клеточную линию дикого типа или нецелевую контрольную клеточную линию для сравнения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры модификаций генов-мишеней включают нокаут CRISPR, CRISPRa/i, нокдаун шРНК и сверхэкспрессию.
2. Подготовка клеток NIT-1 к трансплантации
- Выращивайте клетки, экспрессирующие люциферазу, до тех пор, пока они не будут сливаться на 80-90%.
- Удалите питательную среду и промойте клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, 5 мл для 10-сантиметровой чашки).
- Добавляйте 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в каждое блюдо в течение 2 минут.
- Нейтрализуют трипсин 5 мл питательной среды.
- С помощью пипетки смойте клетки с посуды и перенесите их в коническую трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки из нескольких блюд одной и той же клеточной линии могут быть объединены. - Подсчитайте клетки с помощью окрашивания, такого как трипановый синий, вручную с помощью гемоцитометра или автоматически с помощью автоматического счетчика клеток.
- Центрифугу при 250 × г в течение 5 мин при RT и удалить надосадочную жидкость с помощью аспирационной пипетки.
- Ресуспендировать клеточную гранулу в PBS в концентрации 5 ×10 7 клеток/мл (107 клеток на клеточную линию на мышь будут пересажены в объеме 200 мкл).
- Держите клетки на льду (до 3 часов) до трансплантации.
3. Трансплантация клеток NIT-1 мышам NOD-scid
- Анестезируйте мышей-реципиентов (8-10-недельные мыши NOD-scid того же пола, что и мыши, используемые для выделения спленоцитов) путем ингаляции изофлурана в нокдаун-камере. Подайте 2,5% изофлурана в камеру при расходе 1,5 л/мин и скорости откачки 9 л/мин.
- Смазывайте глаза животного офтальмологической мазью, чтобы предотвратить пересыхание.
- Используя электробритву с защитным кожухом, удалите волосы со спины (спинной стороны) мышей, чтобы обнажить кожу. Выбритая область трансплантата будет примерно 1 х 2 дюйма. Верните бритых мышей в нокдаун-камеру до пересадки.
- Переносите мышей по одной на чистую поверхность с изофлурановым носовым конусом. Аккуратно направьте голову мыши в носовой конус. Используйте скорость потока изофлурана 0,25 л/мин для поддержания анестезии во время трансплантации.
- Протрите область пересадки изопропиловым спиртом, чтобы удалить выпавшие волосы и продезинфицировать кожу.
- Перед загрузкой шприца убедитесь, что клетки полностью ресуспендированы. Наберите избыточный объем (>300 мкл) клеток в стерильный шприц объемом 1 мл иглой 26 г. Удалите все пузырьки; затем верните лишние клетки в пробирку так, чтобы в шприце оставалось 300 мкл клеточной суспензии.
- Используя пару изогнутых щипцов, удерживаемых в недоминантной руке, осторожно приподнимите кожу с одной стороны (слева или справа) спины мыши, чтобы облегчить доступ к подкожному пространству.
- Используя доминирующую руку, расположите шприц параллельно корональной и сагиттальной плоскостям тела мыши. Направив иглу к голове мыши, вставьте иглу в кожу возле задних конечностей и осторожно направьте ее в подкожное пространство. Следите за тем, чтобы вся игла оставалась под кожей и не протыкалась насквозь.
- Отрегулируйте щипцы, чтобы аккуратно удерживать кожу вокруг основания иглы. Медленно дозируйте небольшое количество клеточной суспензии (<50 мкл) и убедитесь, что в месте инъекции под кожей образуется небольшая выпуклость. Продолжайте вводить клеточную суспензию до тех пор, пока 200 мкл не будет доставлено в подкожное пространство.
- Удерживая щипцы на месте и удерживая иглу параллельно телу мыши, медленно извлеките иглу. После того, как игла была удалена, держите кожу закрытой щипцами в течение нескольких секунд, чтобы предотвратить утечку клеток из колотой раны.
- Если оценивается генетическая модификация, повторите трансплантацию на противоположную сторону мыши, используя другой шприц, чтобы каждой мыши вводили как мутантные, так и контрольные клетки, причем одна клеточная линия слева, а другая справа. Если пересаживается только одна клеточная линия, вводите клетки только с одной стороны.
- После пересадки пересадите каждую мышь в свежую клетку. Дайте каждой мыши полностью оправиться от анестезии, прежде чем добавлять дополнительных мышей в клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши выздоравливают, когда они возобновляют нормальную деятельность и не проявляют признаков летаргии или нарушения движения. - Оценивайте состояние здоровья мышей ежедневно в течение всего эксперимента после трансплантации. Если трансплантаты образуют большую выпуклость или мыши становятся слабыми и вялыми, измерьте уровень глюкозы в крови и обеспечьте 10% (мас. / мас.) сахарозной воды ad libitum всем мышам с гипогликемией. Следуйте всем ветеринарным рекомендациям и усыпляйте всех мышей с продолжающимся плохим состоянием тела в соответствии с руководящими принципами учреждения. В этом исследовании мышей усыпляли путем вдыхания CO2 с последующим вывихом шейки матки.
4. Выделение и очистка аутореактивных спленоцитов
- Определите 10-16-недельных мышей мужского или женского пола NOD с недавним (менее 10 дней) диабетом с помощью тест-полосок на глюкозу в моче (или крови). Мыши NOD считаются диабетиками, если у них уровень глюкозы в моче / крови ≥250 мг / дл в течение как минимум 2 дней подряд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши NOD-scid необходимо 10 миллионов спленоцитов; Одна селезенка обычно дает от 50 до 150 миллионов спленоцитов. Спленоциты были выделены от мышей, свободных от патогенов, размещенных в учреждении под дозорным наблюдением. - Усыпьте соответствующее количество мышей NOD с диабетом.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мышей усыпляли путем вдыхания CO2 с последующим вывихом шейки матки, чтобы обеспечить смерть. - Положив мышь на спину, сделайте хирургическими ножницами вертикальный разрез на коже длиной примерно 2 дюйма. Откройте правую сторону мыши с точки зрения исследователя и найдите ярко-красную селезенку. Аккуратно отрежьте селезенку от розовой поджелудочной железы и перенесите ее в стерильную 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую 5 мл стерильного PBS. Повторите вскрытие с таким количеством мышей, какое необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Селезенку от нескольких мышей можно комбинировать в одной посуде. Выполните следующие действия, используя стерильные реагенты и оборудование в стерильном колпаке. - Разомните селезенку (селезенки) с помощью плоской верхней части стерильного поршня шприца.
- Поместите сетчатый фильтр 40 мкм или 70 мкм в коническую трубку объемом 50 мл и промойте сетчатый фильтр 5 мл PBS, чтобы заправить его. Перенесите суспензию селезенки (суспензий) в сетчатый фильтр и продолжайте осторожное разминание через сетчатое фильтро. Вымойте посуду 10 мл PBS и переложите средство на ситечко. Продолжайте растирать до тех пор, пока красный цвет не исчезнет из ситечка.
- Выбросьте ситечко и раскрутите пробирку при 500 × г в течение 5 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость с помощью аспирационной пипетки.
- Ресуспендировать клеточную гранулу в 5 мл (до трех селезенок) буфера для лизиса ACK, предварительно нагретого до RT, и лизировать эритроциты в течение 4 мин. Увеличьте объем на 1-2 мл на селезенку, если необходимы дополнительные селезенки.
- Остановите реакцию с 5 мл клеточной среды NIT-1 (описанной выше) на 5 мл буфера для лизиса. Пропустите клеточную суспензию через свежее ситечко, чтобы удалить комки. Выбросьте ситечко и вращайте при 500 × г в течение 5 минут при RT.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 20 мл PBS и подсчитайте клетки. Отжим при 500 × г в течение 5 мин при ЛТ. Ресуспендируют клетки в стерильном PBS в концентрации 1 × 108 клеток/мл (объем инъекции 0,1 мл/мышь) в реакционной пробирке с безопасным замком 1,5 мл.
- Храните клетки на льду (не более 1 часа) или держите клетки в состоянии RT и немедленно приступайте к инъекции в хвостовую вену.
5. Внутривенное введение диабетических спленоцитов через боковую хвостовую вену
- Разогрейте тело взрослых мышей-реципиентов NOD-scid (например, с помощью тепловой лампы в течение ~ 5-10 минут) для вазодилатации вен (это помогает для визуализации и инъекции в вену).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать перегрева мышей, не превышайте это время. Всегда следите за состоянием здоровья. Если мыши кажутся истощенными или неподвижными, немедленно выключите нагревательную лампу. - Разогрейте клеточную суспензию. Подготовьте стерильный шприц (0,3–1,0 мл) со стерильной иглой (27–30 г, 0,3 мм/0,5 дюйма или меньше) или используйте стерильный инсулиновый шприц объемом 0,5 мл с иглой 0,3 мм (0,5 дюйма). Всегда держите иглу стерильной и используйте стерильный лоток, если шприц необходимо опустить между инъекциями.
- Ресуспендируйте раствор спленоцитов перед каждой инъекцией. Для каждой мыши наберите в шприц 100 мкл предварительно подогретой и смешанной суспензии спленоцитов. Убедитесь, что в шприце или в суспензии нет пузырьков воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все оборудование и расходные материалы подготовлены (спиртовые салфетки для дезинфекции, шприц, загруженный спленоцитами для инъекций, и свежая клетка для отделения инъецированных мышей), прежде чем помещать мышь в удерживающее устройство. - Поместите мышь в удерживающее устройство. Захватите хвост недоминантной рукой и найдите одну из двух боковых жилок хвоста. При необходимости аккуратно поверните хвост. Протрите хвост дезинфицирующей салфеткой (70% изопропиловый спирт), чтобы очистить кожу и увеличить видимость вены.
- Введите иглу под острым углом в центральную область хвоста доминирующей рукой. Скос иглы вверх проведите иглой на несколько миллиметров по коже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что игла параллельна вене и находится немного под кожей. Будьте готовы к резким движениям мыши/хвоста сразу после проникновения в кожу/стенку сосуда. Успешное введение иглы должно ощущаться как «плавное скольжение» в вену. Если необходима еще одна попытка, двигайтесь дальше вверх по хвосту к телу. - Слегка надавите на шприц, чтобы ввести суспензию спленоцитов. Не позволяйте игле двигаться дальше внутрь или наружу во время инъекции. Успешные инъекции проходят гладко, без ощущения противодавления во время инъекции и обозначаются прозрачным / белым кровотоком сразу после инъекции.
- Осторожно выпустите иглу из вены и слегка надавите на хвост дезинфицирующей салфеткой, пока кровотечение не остановится. Освободите мышь от удерживающего устройства и аккуратно перенесите ее в только что подготовленную клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Введите две-три контрольным мышам, которые не получают трансплантацию клеток NIT-1, спленоциты, чтобы подтвердить способность аутореактивных спленоцитов вызывать диабет, что занимает примерно 2-4 недели после инъекции.
6. Биолюминесцентная визуализация трансплантатов NIT-1 in vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализируйте трансплантаты один-два раза в неделю. В день трансплантации подождите не менее 2 ч после трансплантации, чтобы трансплантаты осядли и обеспечили стабильную экспрессию люциферазы. Если время является ограничивающим фактором, первоначальное измерение может быть проведено на 1-й день. Рекомендуемый начальный график визуализации: День 0 или День 1 после инъекции, День 5, День 10, День 14, День 18 и День 25. Однако скорректируйте график в зависимости от прогресса аутоиммунитета, если судить по потере биолюминесцентного сигнала.
- Приготовьте раствор D-люциферина 15 мг / мл в PBS Дульбекко. Перемешивают при ЛТ до растворения и стерильно фильтруют (0,22 мкм). Храните 1 мл аликвот при -20 ° C и размораживайте по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты могут быть повторно заморожены. - По крайней мере, за 5 минут до визуализации вводите мышам внутрибрюшинно с помощью шприца объемом 1 мл и иглы 26 г раствора D-люциферина в дозе 150 мг / кг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежий шприц и иглу для каждой мыши. - Анестезируйте мышей ингаляцией изофлурана в соответствии с руководящими принципами учреждения. Рекомендуемые условия - 2,5% изофлуран с расходом 1,5 л/мин в нокдаун-камеру и скоростью откачки 9 л/мин.
- Смазывайте глаза животного офтальмологической мазью, чтобы предотвратить пересыхание.
- Откройте программное обеспечение, связанное с прибором визуализации. Создайте нового пользователя и/или войдите в систему. На панели управления в правом нижнем углу выберите Initialize (рисунок 2A). Чтобы автоматически сохранить данные образа, создайте соответствующие папки на компьютере, а затем выберите Приобретение | Автосохранение в... (Рисунок 2А). После того, как прибор завершит инициализацию, установите время экспозиции на 1 минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полные параметры визуализации показаны на рисунке 2B. - Переносите мышей по одной из нокдаун-камеры в прибор визуализации. Положите мышь на живот с растопыренными конечностями и осторожно направьте ее голову в носовой конус. Скорость потока изофлурана 0,25 л/мин, доставляемая через носовой конус, подходит для поддержания анестезии во время визуализации. Аккуратно расплющите мышь, нажав обеими руками на центр ее спины, а затем раздвинув руки наружу и в стороны.
- Выберите Acquire (рисунок 2B). Запишите все соответствующие детали эксперимента во всплывающем окне (рис. 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3A представлены репрезентативные изображения трех 8-недельных самок мышей NOD-scid, которым пересадили два трансплантата в разные моменты времени.
Рисунок 2: Скриншоты программных команд для визуализации биолюминесцентных трансплантатов. (A) Перед визуализацией выберите «Инициализировать », чтобы подготовить прибор. Изображения можно автоматически сохранить в выбранную папку, выбрав «Приобретение » | Автосохранение в... (B) Обзор параметров визуализации. После того, как мышь будет помещена в прибор, выберите «Приобрести». (C) Снимок экрана: диалоговое окно, всплывающее во время создания изображения. Здесь могут быть введены такие детали, как момент времени и напряжение мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
7. Анализ данных
- Количественно оцените биолюминесцентный сигнал в любое время после получения изображения. Откройте программное обеспечение, связанное с прибором визуализации. Выберите Файл | Откройте и выберите файл ClickInfo.txt , связанный с анализируемой мышью.
- В палитре инструментов выберите ROI Tools (рисунок 3B, шаг 1). В выпадающем меню овального вида (рис. 3B, шаг 1, красная стрелка) выберите количество трансплантатов, которые были пересажены мыши.
- Переместите овалы так, чтобы они содержали биолюминесцентный сигнал от каждого трансплантата, и выберите «Измерить рентабельность инвестиций» (рис. 3B, шаг 2).
- Запишите общее количество для каждого трансплантата (рисунок 3B, шаг 3).
- Для каждого трансплантата разделите биолюминесцентный сигнал, измеренный в каждый момент времени, на сигнал, измеренный в первый момент времени. Сообщайте о выживаемости трансплантата как о доле или проценте остаточного биолюминесцентного сигнала по отношению к исходному биолюминесцентному сигналу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если трансплантаты расширяются после трансплантации, коэффициент или процент приживаемости трансплантата будет больше 1 или 100% соответственно. Все мыши, которые получают трансплантаты, должны контролироваться на предмет неблагоприятных последствий для здоровья.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор протокола приведен на рисунке 1. Выживаемость двух клеточных линий, таких как мутантный и нецелевой контроль, может быть сравнена, или выживаемость одной клеточной линии может быть измерена в нескольких группах мышей, таких как мыши, обработанные лекарственными препаратами, по сравнению с контрольной группой, обработанной носителем. На рисунке 3A показаны три 8-недельные самки мышей NOD-scid, которым пересадили контрольную (слева) и мутантную (справа) клеточную линию. Мышам также вводили внутривенно аутореактивные спленоциты для переноса диабета.
Мыши были изображены на 0-й, 5-й, 10-й, 14-й и 18-й день после инъекции. У двух из трех мышей контрольный трансплантат был разрушен к 18-му дню, о чем свидетельствует потеря биолюминесцентного сигнала, в то время как мутантный трансплантат был защищен. У одной мыши мутантный трансплантат, но не контрольный трансплантат, был разрушен, что подчеркивает биологические различия между животными. Биолюминесцентный сигнал был количественно определен, как описано на рисунке 3B. Приживаемость трансплантата сообщается как процент остаточного биолюминесцентного сигнала по сравнению с первым моментом времени (рис. 3C). Также полезно рассчитать соотношение мутантных и управляющих люминесцентных сигналов для каждой мыши, чтобы визуализировать различия между животными (рис. 3D). В конце периода сбора данных мышей усыпляли ингаляцией CO2 с последующим вывихом шейки матки.
Перед переносом заболевания трансплантированные клетки могут реплицироваться, в результате чего образуются расширенные трансплантаты, видимые через кожу (рис. 4А). Эти трансплантаты будут иметь насыщенные биолюминесцентные сигналы при изображении (рис. 4B), которые могут быть неточно определены.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения и количественная оценка биолюминесцентного сигнала . (A) Трем 8-недельным самкам мышей NOD-scid были пересажены нецелевые контрольные (справа) и мутантные клетки (слева) и внутривенно введены аутореактивные спленоциты, чтобы вызвать диабет. Мыши были неинвазивно визуализированы на 0-й, 5-й, 10-й, 14-й и 18-й день после инъекции. Биолюминесцентный сигнал иллюстрируется цветовым спектром от низкой интенсивности (синий) до высокой интенсивности (красный). (B) Инструкции по количественной оценке биолюминесцентного сигнала. (C) Средний процент люминесценции трансплантата, остающийся с течением времени. (D) Соотношение процентной доли люминесценции трансплантата с течением времени для мутантных и нецелевых контрольных трансплантатов для каждой мыши. Коэффициент = 1 указывает на моменты времени, в которые процент оставшегося сигнала равен для обоих трансплантатов. Сокращения: NOD = диабетик без ожирения; SCID = тяжелый комбинированный иммунодефицит; NTC = нецелевое управление; Mut = мутант. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Примеры трансплантатов, которые чрезмерно расширены. (A) Расширенные трансплантаты могут выпячиваться через кожу мыши (обозначена красной стрелкой). (B) Расширенные трансплантаты могут давать насыщенные биолюминесцентные сигналы. Биолюминесцентный сигнал иллюстрируется цветовым спектром от низкой интенсивности (синий) до высокой интенсивности (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: последовательность пленти-люциферазы-бласта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
СД1 является разрушительным заболеванием, от которого в настоящее время не существует лекарства. Заместительная терапия бета-клетками предлагает многообещающее лечение для пациентов с этим заболеванием, но критическим препятствием для этой стратегии является возможность рецидивирующей аутоиммунной атаки против трансплантированных бета-клеток. Генная инженерия SC-бета-клеток для снижения их иммунной видимости или восприимчивости является одним из потенциальных решений этой проблемы. Здесь описан протокол неинвазивной визуализации трансплантированных бета-клеток для измерения их выживаемости в адаптивной модели переноса аутоиммунного диабета у мышей.
Ключевым преимуществом этого метода является адаптивность протокола. Метод применяется здесь для сравнения мутантной клеточной линии с нецелевым контролем (рис. 3), но протокол может вместить множество экспериментальных вопросов. Защитные эффекты широкого спектра генетических модификаций, лекарств или других методов лечения против аутоиммунной атаки могут быть изучены. При оценке эффективности лекарственного средства или другого лечения в защите от аутоиммунитета необходимы только клетки, экспрессирующие люциферазу без дополнительных генетических модификаций. В то время как сингенные трансплантаты для проверки аутоиммунной защиты используются в этой статье, метод также может быть адаптирован для оценки аллоиммунного отторжения с использованием комбинации клеточной линии и штамма мыши, которые не являются сингенными, такими как клетки NIT-1 и мыши C57BL / 6J. Протокол также может быть изменен для изучения иммунной инфильтрации в трансплантаты. Дополнительные мыши, у которых трансплантаты извлекаются в различные моменты времени, могут быть включены, и проникающие иммунные клетки могут быть профилированы с помощью иммуногистохимии или проточной цитометрии.
Основным ограничением применения этого метода является неспособность результатов, полученных на мышах, быть переведенными на клетки человека и пациентов. Более 500 стратегий аутоиммунной защиты были успешно реализованы на моделях мышей с диабетом, но большинство из них не смогли продемонстрировать клиническую пользу7. Однако первичные островки человека являются ограниченным ресурсом, а работа со стволовыми клетками сопряжена с высокими финансовыми и трудовыми затратами. Описанный здесь протокол представляет собой инструмент для предварительной идентификации потенциальных терапевтических мишеней с использованием относительно недорогой и простой мышиной техники. Последующие эксперименты следует проводить с первичными и/или SC-островками, которые обычно пересаживают под капсулу почек у мышей. Описанный здесь метод может быть адаптирован для оценки эффективности терапевтических стратегий в клетках человека. Как первичные, так и SC-островки могут быть сконструированы для экспрессии люциферазы, и их выживание может быть измерено с помощью биолюминесцентной визуализации после трансплантации под капсулу почки в гуманизированные моделимышей 12,13. Также сообщалось о методах неинвазивного мониторинга выживаемости островковых трансплантатов, трансплантированных на радужную оболочку глаза с помощью конфокальной микроскопии14.
Дополнительным ограничением, связанным с методом, описанным в данной статье, является изменение аутореактивного потенциала изолированных спленоцитов. Несмотря на то, что скорость передачи заболевания высока10, сроки начала диабета после инъекции спленоцитов могут варьироваться от 2 до 4 недель. За это время трансплантированные клетки могут размножаться (рис. 4), что приводит к гиперинсулинемии и тяжелой гипогликемии. Объединение спленоцитов от нескольких мышей-доноров с диабетом может уменьшить различия между экспериментами.
Несмотря на эти ограничения, метод является простым и информативным инструментом для тестирования стратегий аутоиммунной защиты. В протоколе используются базовые методы клонирования и культивирования клеток, простая и минимально инвазивная хирургия мышей и неинвазивная визуализация, что позволяет пользователю максимизировать сбор данных при минимизации количества животных, необходимых для эксперимента. В качестве альтернативы биолюминесцентной визуализации in vivo трансплантаты могут быть извлечены в различные моменты времени, взвешены, сфотографированы и дополнительно обработаны для характеристики иммунных клеток. Эта стратегия требует большего количества мышей, так как восстановление трансплантата требует эвтаназии, и желательно иметь реплики в каждый момент времени. Кроме того, метод извлечения трансплантата позволяет проводить только одно измерение размера для каждого трансплантата. Поскольку сроки уничтожения бета-клеток аутореактивными спленоцитами варьируются у разных людей, может быть трудно определить оптимальный момент времени для восстановления трансплантата. Подход, описанный в этой статье, позволяет исследователю отслеживать прогресс аутоиммунитета у живых мышей и получить полную временную шкалу разрушения трансплантата. До тех пор, пока мыши поддерживают эугликемию, защищенные трансплантаты могут быть оставлены у мышей и визуализированы в течение длительных периодов времени, чтобы выяснить степень защиты.
Здесь описан простой протокол трансплантации и неинвазивной визуализации трансплантатов бета-клеток в адаптивной мышиной модели аутоиммунного диабета. Этот метод позволяет использовать минимальное количество животных и обеспечивает гибкость в сроках анализа трансплантата, что имеет решающее значение, учитывая различия в прогрессе аутоиммунитета. Протокол также может быть легко адаптирован для решения широкого круга экспериментальных вопросов. Мышиные модели имеют решающее значение для открытия и проверки новых терапевтических стратегий, и этот метод является ценным инструментом для развития области заместительной терапии бета-клетками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Эрику. Кай и д-ра Юки Исикаву за разработку метода, описанного в этом протоколе (см. ссылку 11). Исследования в лабораториях S.K. и P.Y. поддерживаются грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Гарвардского института стволовых клеток и Фонда Битсона. Т.С. был поддержан докторской стипендией Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек (NIDDK) (T32 DK007260-45), а К.Б. был частично поддержан стипендией Фонда Мэри К. Якокка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
References
- Katsarou, A., et al. Type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).
- Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire. , Available from: https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes (2021).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic β-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors. Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).
- Cai, E. P., et al. Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes. Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).
- Parent, A. V., et al. Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection. Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).
- Brehm, M. A., et al. Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression. FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).
- Abdulreda, M. H., et al. In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice. Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).
