Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en minimaal invasieve methode voor het transplanteren en afbeelden van NIT-1-cellen in niet-obese diabetische (NOD) -ernstige gecombineerde immunodeficiënte muizen die worden uitgedaagd met splenocyten gezuiverd van spontaan diabetische NOD-muizen.
Abstract
Type 1 diabetes wordt gekenmerkt door de auto-immuunvernietiging van de insulineproducerende bètacellen van de alvleesklier. Een veelbelovende behandeling voor deze ziekte is de transplantatie van van stamcellen afgeleide bètacellen. Genetische modificaties kunnen echter nodig zijn om de getransplanteerde cellen te beschermen tegen aanhoudende auto-immuniteit. Diabetische muismodellen zijn een nuttig hulpmiddel voor de voorlopige evaluatie van strategieën om getransplanteerde cellen te beschermen tegen auto-immuunaanvallen. Hier wordt een minimaal invasieve methode beschreven voor het transplanteren en afbeelden van celtransplantaten in een adoptief overdrachtsmodel van diabetes bij muizen. In dit protocol worden cellen van de murine pancreas bètacellijn NIT-1 die de vuurvlieg luciferase transgen luc2 tot expressie brengt, subcutaan getransplanteerd in immunodeficiënte niet-obese diabetische (NOD) -ernstige gecombineerde immunodeficiënte (scid) muizen. Deze muizen worden tegelijkertijd intraveneus geïnjecteerd met splenocyten van spontaan diabetische NOD-muizen om auto-immuniteit over te dragen. De grafts worden met regelmatige tussenpozen in beeld gebracht via niet-invasieve bioluminescente beeldvorming om de celoverleving te volgen. De overleving van gemuteerde cellen wordt vergeleken met die van controlecellen die in dezelfde muis zijn getransplanteerd.
Introduction
Type 1 diabetes (T1D) wordt veroorzaakt door de auto-immuunvernietiging van de insulineproducerende bètacellen van de alvleesklier. Het verlies van bètacelmassa resulteert in insulinedeficiëntie en hyperglycemie. T1D-patiënten vertrouwen op meerdere dagelijkse injecties met exogene insuline en ervaren episodes van ernstige hyperglykemie en hypoglykemie gedurende hun hele leven. De complicaties die verband houden met deze episodes omvatten diabetische retinopathie, verminderde nierfunctie en neuropathie1.
Insuline-injecties zijn een behandeling, maar geen remedie voor T1D. Het vervangen van de verloren bètacelmassa heeft echter het potentieel om de ziekte om te keren door patiënten in staat te stellen hun eigen insuline te produceren. Het aanbod van kadaverische donoreilandjes is echter beperkt2. Stamcel-afgeleide eilandjes (SC-eilandjes) kunnen een vrijwel onbeperkte voorraad bètacellen voor transplantatie bieden. Verschillende groepen hebben aangetoond dat menselijke embryonale stamcellen (SER's) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gedifferentieerd om functionele bèta-achtige cellen te genereren 3,4,5. Veelbelovende vroege klinische onderzoeksgegevens geven aan dat deze cellen hun functie behouden na transplantatie en patiënten in staat kunnen stellen insulineonafhankelijk te worden6. Chronische immunosuppressie is echter vereist, waardoor hun gevoeligheid voor kanker en infectie toeneemt. Bovendien kunnen immunosuppressiva op lange termijn cytotoxisch zijn voor grafts7. Om de noodzaak van immunosuppressie te elimineren, kunnen SC-eilandjes genetisch worden gemodificeerd om ze te beschermen tegen terugkerende auto-immuniteit en allo-immuniteit na transplantatie.
Stamcelonderzoek is zeer veeleisend in kosten en arbeid. Muiscellijnen en diermodellen zijn nuttige hulpmiddelen voor de initiële identificatie en experimentele validatie van strategieën om getransplanteerde cellen te beschermen tegen auto-immuniteit. De NOD-muis ontwikkelt spontane auto-immuundiabetes met veel overeenkomsten met menselijke T1D8, en de NIT-1 insulinoomcellijn deelt een genetische achtergrond met deze muizenstam9. Diabetes kan adoptief worden overgedragen op de gerelateerde immunodeficiënte NOD-scid muizenstam via de injectie van diabetische splenocyten van NOD-muizen om het begin van diabetes tijdelijk te synchroniseren bij replicerende experimentele muizen10. Dit model kan worden gebruikt om genetische doelen relatief snel en goedkoop te identificeren voor verdere validatie in SC-eilandjes. Onlangs werd de methode toegepast om RNLS te identificeren en te valideren, een doelwit dat primaire menselijke eilandjes bleek te beschermen tegen auto-immuniteit in vivo en iPSC-afgeleide eilandjes tegen bètacelstress in vitro11. Hier wordt een eenvoudig protocol beschreven om genetisch gemanipuleerde NIT-1-cellen te transplanteren en niet-invasief hun overleving te controleren in een adoptief overdrachtsmodel van auto-immuundiabetes bij muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figuur 1: De workflow voor transplantatie en beeldvorming van grafts in een adoptief transfermodel van diabetes bij muizen. NIT-1-cellen die het vuurvliegtransgen luciferase (luc2) tot expressie brengen, worden subcutaan getransplanteerd in NOD-scid-muizen. De muizen worden tegelijkertijd geïnjecteerd met autoreactieve splenocyten geïsoleerd uit een spontaan diabetische NOD-muis. De grafts worden met regelmatige tussenpozen in beeld gebracht door niet-invasieve bioluminescente beeldvorming. Figuur gemaakt door BioRender.com. Afkortingen: NOD = niet-obese diabeet; scid = ernstige gecombineerde immunodeficiëntie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Alle dierverzorgings- en studieprotocollen zijn goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in het Joslin Diabetes Center. NOD- en NOD-scid-muizen kunnen gemakkelijk worden verkregen uit commerciële bronnen. Alle muizen in deze studie worden onderhouden in een sentinal-monitored faciliteit. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, dieren, instrumenten en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Engineering en onderhoud van NIT-1 cellijnen
- Onderhoud NIT-1-cellijnen, die een genetische achtergrond delen met NOD-muizen, en 293FT-cellen in met weefselkweek behandelde schalen in DMEM met 4,5 g / L glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine in een 37 ° C-incubator met 5% CO2.
- Laat de 293FT-cellen groeien tot 70% -80% samenvloeiing voor transfectie.
- Combineer per schaal van 10 cm van 293FT-cellen 10 μg pLenti-luciferase-blast (zie aanvullend bestand 1), dat het firefly luciferasetransgen (luc2) tot expressie brengt onder controle van de constitutief actieve EF1α-promotor, 2 μg elk van de verpakkingsplasmiden pMD2.G, pMDLg / pRRE en pRSV-Rev, 4 μg van het enveloppe-eiwitplasmide pCMV-VSV-G en 60 μg lineair polyethylenimine (PEI) in 1 ml serumvrije DMEM. Pas de hoeveelheden aan op basis van het aantal cellen dat moet worden getransfecteerd.
- Laat het DNA, PEI en DMEM gedurende 20 minuten op kamertemperatuur (RT) staan en voeg ze vervolgens toe aan de 293FT-cellen.
- Verzamel het medium dat de lentivirale deeltjes bevat 48 h na transfectie.
- Transduceer de NIT-1-cellen met ~ 80% confluentie met 1 ml medium met lentivirale deeltjes per 106 cellen gedurende 48-72 uur.
- Selecteer de luciferase-tot expressie brengende cellen met 5 μg / ml blasticidine gedurende 48 uur.
- Verder genetisch modificeren van de luciferase-tot expressie brengende cellen om aan de experimentele vraag te voldoen. Neem een luciferase-expressing wild-type of niet-gerichte controlecellijn op ter vergelijking.
OPMERKING: Voorbeelden van doelgenmodificaties zijn CRISPR-knock-out, CRISPRa / i, shRNA-knockdown en overexpressie.
2. Voorbereiding van NIT-1-cellen voor transplantatie
- Laat de luciferase-tot expressie brengende cellen groeien totdat ze voor 80% -90% confluent zijn.
- Verwijder het groeimedium en was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 5 ml voor een schaal van 10 cm).
- Voeg 1 ml 0,05% trypsine-EDTA toe aan elk gerecht gedurende 2 minuten.
- Neutraliseer de trypsine met 5 ml groeimedium.
- Gebruik een pipet om de cellen van de schaal te wassen en over te brengen naar een conische buis.
OPMERKING: Cellen van meerdere schotels van dezelfde cellijn kunnen worden gecombineerd. - Tel de cellen met behulp van een vlek zoals trypan blauw handmatig met een hemocytometer of automatisch met een automatische celteller.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT bij 250 × g en verwijder het supernatant met een aanzuigende pipet.
- Resuspendie van de celkorrel in PBS in een concentratie van 5 × 10 7 cellen/ml (107 cellen per cellijn per muis worden getransplanteerd in een volume van 200 μL).
- Houd de cellen op ijs (tot 3 uur) tot transplantatie.
3. Transplantatie van NIT-1 cellen in NOD-scid muizen
- Verdoof de ontvangende muizen (8-10 weken oude NOD-scid muizen van hetzelfde geslacht als de muizen die worden gebruikt om de splenocyten te isoleren) door isofluraan inhalatie in een knockdown kamer. Lever 2,5% isofluraan in de kamer met een debiet van 1,5 l/min en een evacuatiesnelheid van 9 l/min.
- Smeer de ogen van het dier in met oogzalf om uitdroging te voorkomen.
- Gebruik een elektrisch scheerapparaat met een beschermkap en verwijder het haar van de achterkant (dorsale kant) van de muizen om de huid bloot te leggen. Het geschoren transplantatiegebied zal ongeveer 1 op x 2 in zijn. Breng de geschoren muizen terug naar de knockdown-kamer tot de transplantatie.
- Breng de muizen één voor één over op een schoon oppervlak met een isofluraan neuskegel. Leid de kop van de muis voorzichtig in de neuskegel. Gebruik een isofluraandebiet van 0,25 l/min om de anesthesie tijdens de transplantatie te behouden.
- Veeg het transplantatiegebied af met een isopropylalcoholvoorbereidingspad om los haar te verwijderen en de huid te desinfecteren.
- Zorg ervoor dat de cellen volledig zijn geresuspendeerd voordat u de spuit laadt. Zuig een teveel aan cellen (>300 μL) op in een steriele spuit van 1 ml met een naald van 26 G. Verwijder eventuele bubbels; breng vervolgens overtollige cellen terug naar de buis, zodat 300 μL celsuspensie in de spuit achterblijft.
- Gebruik een paar gebogen tangen die in de niet-dominante hand worden gehouden en til de huid aan één kant (links of rechts) van de rug van de muis voorzichtig op om gemakkelijker toegang te krijgen tot de onderhuidse ruimte.
- Plaats de spuit met de dominante hand parallel aan de coronale en sagittale vlakken van het lichaam van de muis. Met de naald naar de kop van de muis gericht, steekt u de naald in de huid bij de achterhand en leidt u deze voorzichtig naar de onderhuidse ruimte. Zorg ervoor dat de hele naald onder de huid blijft en niet doorprikt.
- Stel de tang zo in dat de huid voorzichtig rond de basis van de naald wordt gehouden. Doseer langzaam een kleine hoeveelheid celsuspensie (<50 μL) en bevestig dat zich een kleine uitstulping vormt onder de huid op de plaats van de injectie. Ga door met het injecteren van de celsuspensie totdat 200 μL in de onderhuidse ruimte is afgeleverd.
- Houd de tang op zijn plaats en houd de naald parallel aan het lichaam van de muis en trek de naald langzaam terug. Nadat de naald is verwijderd, houdt u de huid een paar seconden gesloten met een tang om te voorkomen dat de cellen uit de prikwond lekken.
- Als een genetische modificatie wordt geëvalueerd, herhaalt u de transplantatie aan de andere kant van de muis met een andere spuit, zodat zowel mutante als controlecellen in elke muis worden geïnjecteerd, met één cellijn aan de linkerkant en de andere aan de rechterkant. Als slechts één cellijn wordt getransplanteerd, injecteer de cellen dan slechts aan één kant.
- Breng na de transplantatie elke muis over naar een nieuwe kooi. Laat elke muis volledig herstellen van de anesthesie voordat u extra muizen aan de kooi toevoegt.
OPMERKING: Muizen worden hersteld wanneer ze de normale activiteiten hervatten en vertonen geen tekenen van lethargie of verminderde beweging. - Evalueer dagelijks de gezondheidstoestand van de muizen voor de duur van het experiment na de transplantatie. Als de grafts een grote uitstulping vormen of de muizen zwak en lusteloos worden, meet dan hun bloedglucose en geef 10% (w / w) sucrosewater ad libitum aan alle hypoglycemische muizen. Volg alle veterinaire aanbevelingen en euthanaseer alle muizen met een aanhoudende slechte lichaamsconditie volgens de institutionele richtlijnen. In deze studie werden muizen geëuthanaseerd door CO 2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie.
4. Isolatie en zuivering van autoreactieve splenocyten
- Identificeer 10-16 weken oude mannelijke of vrouwelijke NOD-muizen met recent beginnende (minder dan 10 dagen) diabetes door urine (of bloed) glucoseteststrips te gebruiken. NOD-muizen worden als diabetisch beschouwd wanneer ze urine / bloedglucose ≥ 250 mg / dL hebben op ten minste 2 opeenvolgende dagen.
OPMERKING: Voor elke NOD-scid muis zijn 10 miljoen splenocyten nodig; Eén milt levert doorgaans 50 miljoen tot 150 miljoen splenocyten op. De splenocyten werden geïsoleerd uit pathogeenvrije muizen die waren gehuisvest in een schildwacht-gecontroleerde faciliteit. - Euthanaseer het juiste aantal diabetische NOD-muizen.
OPMERKING: In deze studie werden de muizen geëuthanaseerd door CO 2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie om de dood te garanderen. - Maak met de muis op zijn rug een verticale incisie van ongeveer 2 inch lang in de huid met een chirurgische schaar. Open de rechterkant van de muis vanuit het oogpunt van de onderzoeker en lokaliseer de felrode milt. Snijd de milt voorzichtig weg van de roze alvleesklier en breng deze over in een steriele petrischaal van 10 cm met 5 ml steriele PBS. Herhaal de dissectie met zoveel muizen als nodig is.
OPMERKING: Milt van meerdere muizen kan in één schaal worden gecombineerd. Voer de volgende stappen uit met steriele reagentia en apparatuur in een steriele kap. - Pureer de milt(en) met de platte bovenkant van een steriele zuiger van de spuit.
- Plaats een zeef van 40 μm of 70 μm in een conische buis van 50 ml en was de zeef met 5 ml PBS om deze te primen. Breng de milt(en) suspensie over in de zeef en blijf zachtjes door de zeef stampen. Was de schaal met 10 ml PBS en breng de was over in de zeef. Ga door met pureren totdat de rode kleur uit de zeef is verdwenen.
- Gooi de zeef weg en draai de buis op 500 × g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatant met een aanzuigende pipet.
- Resuspendeer de celpellet in 5 ml (voor maximaal drie milten) van ACK-lysisbuffer voorverwarmd tot RT en lyseer de rode bloedcellen gedurende 4 minuten. Verhoog het volume met 1-2 ml per milt als extra milten nodig zijn.
- Stop de reactie met 5 ml NIT-1-celmedia (hierboven beschreven) per 5 ml lysisbuffer. Haal de celsuspensie door een verse zeef om klonten te verwijderen. Gooi de zeef weg en draai op 500 × g gedurende 5 minuten bij RT.
- Resuspendeerde de celkorrel in 20 ml PBS en telde de cellen. Draai op 500 × g gedurende 5 minuten bij RT. Resuspendeer de cellen in steriele PBS in een concentratie van 1 ×10 8 cellen/ml (het injectievolume is 0,1 ml/muis) in een 1,5 ml safe-lock reactiebuis.
- Bewaar de cellen op ijs (niet langer dan 1 uur) of houd de cellen op RT en ga onmiddellijk over tot de staartaderinjectie.
5. Intraveneuze injectie van diabetische splenocyten via de laterale staartader
- Warm het lichaam van de volwassen ontvangende NOD-scid-muizen op (bijvoorbeeld door een warmtelamp te gebruiken gedurende ~ 5-10 minuten) om de aderen te vaatdileren (dit helpt voor visualisatie en injectie in de ader).
OPMERKING: Om oververhitting van de muizen te voorkomen, mag u deze tijd niet overschrijden. Controleer altijd de gezondheidsstatus. Als de muizen uitgeput of onbeweeglijk lijken, schakel dan de warmtelamp onmiddellijk uit. - Warm de celsuspensie op. Bereid een steriele spuit (0,3-1,0 ml) voor met een steriele naald (27-30 g, 0,3 mm/0,5 inch of kleiner) of gebruik een steriele insulinespuit van 0,5 ml met een naald van 0,3 mm (0,5 inch). Houd de naald altijd steriel en gebruik een steriel bakje als de spuit tussen de injecties door moet worden neergezet.
- Resuspendeer de splenocytenoplossing voorafgaand aan elke injectie. Trek voor elke muis 100 μL van de voorverwarmde en gemengde splenocytensuspensie in de spuit. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de spuit of in de suspensie.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u alle apparatuur en benodigdheden bij de hand hebt (alcoholdoekjes voor desinfectie, een spuit gevuld met de te injecteren splenocyten en een nieuwe kooi voor het scheiden van geïnjecteerde muizen) voordat u de muis in het beveiligingsapparaat plaatst. - Plaats de muis in het beveiligingssysteem. Vang de staart met de niet-dominante hand en lokaliseer een van de twee laterale staartaders. Draai de staart indien nodig voorzichtig. Veeg de staart af met een desinfectiedoekje (70% isopropylalcohol) om de huid te reinigen en de zichtbaarheid van de ader te vergroten.
- Steek de naald onder een scherpe hoek in het centrale gebied van de staart met de dominante hand. Met de schuine kant van de naald naar boven gericht, schuif je de naald een paar millimeter door de huid.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de naald evenwijdig is aan de ader en net iets onder de huid wordt geplaatst. Wees voorbereid op plotselinge bewegingen van de muis/staart direct na het binnendringen van de huid/vaatwand. Een succesvolle inbrenging van de naald moet aanvoelen als een "gladde glijbaan" in de ader. Als een nieuwe poging nodig is, ga dan verder de staart op naar het lichaam. - Oefen zachte druk uit op de spuit om de splenocytensuspensie te injecteren. Laat de naald niet verder naar binnen of naar buiten bewegen tijdens het injecteren. Succesvolle injecties zijn soepel zonder enige tegendruk te voelen tijdens de injectie en worden aangegeven door een transparante / witte bloedstroom onmiddellijk na de injectie.
- Laat de naald voorzichtig uit de ader los en oefen lichte druk uit op de staart met een desinfectiedoekje totdat het bloeden stopt. Laat de muis los van het beveiligingsapparaat en breng deze voorzichtig over naar een vers bereide kooi.
OPMERKING: Injecteer twee tot drie controlemuizen die geen NIT-1-celtransplantatie met splenocyten ontvangen om het potentieel van de autoreactieve splenocyten om diabetes te induceren te bevestigen, wat ongeveer 2-4 weken na injectie duurt.
6. In vivo bioluminescente beeldvorming van NIT-1 grafts
OPMERKING: Beeld de grafts één tot twee keer per week. Wacht op de dag van de transplantatie ten minste 2 uur na de transplantatie om de grafts te laten bezinken en een stabiele luciferase-expressie te garanderen. Als tijd een beperkende factor is, kan de eerste meting in plaats daarvan op dag 1 worden uitgevoerd. Een aanbevolen eerste beeldvormingsschema is dag 0 of dag 1 na injectie, dag 5, dag 10, dag 14, dag 18 en dag 25. Pas het schema echter aan op basis van de voortgang van auto-immuniteit zoals beoordeeld door het verlies van bioluminescent signaal.
- Bereid een 15 mg/ml D-luciferine-oplossing in Dulbecco's PBS. Roer bij RT om op te lossen en steriel filter (0,22 μm). Bewaar 1 ml aliquots bij −20 °C en ontdooi indien nodig.
OPMERKING: De aliquots kunnen opnieuw worden ingevroren. - Injecteer de muizen ten minste 5 minuten vóór de beeldvorming intraperitoneaal met een spuit van 1 ml en een naald van 26 G met D-luciferine-oplossing in een dosis van 150 mg / kg.
OPMERKING: Gebruik een verse spuit en naald voor elke muis. - Verdoof de muizen door isofluraaninhalatie volgens institutionele richtlijnen. De aanbevolen omstandigheden zijn 2,5% isofluraan met een debiet van 1,5 L/min in de knockdown kamer en een evacuatiesnelheid van 9 L/min.
- Smeer de ogen van het dier in met oogzalf om uitdroging te voorkomen.
- Open de software die is gekoppeld aan het beeldvormingsinstrument. Maak een nieuwe gebruiker aan en/of log in. Selecteer op het bedieningspaneel rechtsonder de optie Initialiseren (Afbeelding 2A). Als u de afbeeldingsgegevens automatisch wilt opslaan , maakt u de juiste mappen op de computer en selecteert u Acquisitie | Automatisch opslaan in... (Figuur 2A). Zodra het instrument klaar is met initialiseren, stelt u de belichtingstijd in op 1 min.
OPMERKING: De volledige beeldparameters worden weergegeven in figuur 2B. - Breng de muizen één voor één over van de knockdown-kamer naar het beeldvormingsinstrument. Plaats de muis op zijn buik met zijn ledematen gespreid en leid zijn hoofd voorzichtig in de neuskegel. Een isofluraandebiet van 0,25 l/min dat via een neuskegel wordt afgegeven, is geschikt om de anesthesie tijdens de beeldvorming te handhaven. Druk de muis voorzichtig plat door met beide handen op het midden van de rug te drukken en vervolgens de handen naar buiten en uit elkaar te spreiden.
- Selecteer Acquire (Figuur 2B). Noteer alle relevante details van het experiment in het pop-upvenster (afbeelding 2C).
OPMERKING: Zie figuur 3A voor representatieve beelden van drie 8 weken oude vrouwelijke NOD-scid muizen getransplanteerd met twee grafts op verschillende tijdstippen.
Figuur 2: Screenshots van de softwarecommando's voor het afbeelden van bioluminescente grafts . (A) Selecteer voorafgaand aan de beeldvorming Initialiseren om het instrument voor te bereiden. De afbeeldingen kunnen automatisch worden opgeslagen in een map naar keuze door Acquisitie | Automatisch opslaan in... (B) Overzicht van de beeldvormingsparameters. Zodra de muis in het instrument is geplaatst, selecteert u Verwerven. (C) Schermafbeelding van het dialoogvenster dat tijdens de beeldvorming verschijnt. Details zoals het tijdstip en de muisbelasting kunnen hier worden ingevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Data-analyse
- Kwantificeer het bioluminescente signaal op elk moment na beeldvorming. Open de software die is gekoppeld aan het beeldvormingsinstrument. Selecteer Bestand | Open en selecteer het ClickInfo.txt-bestand dat is gekoppeld aan de muis die moet worden geanalyseerd.
- Selecteer in het gereedschapspalet de optie ROI-gereedschappen (afbeelding 3B, stap 1). Selecteer in het ovale vervolgkeuzemenu (figuur 3B, stap 1, rode pijl) het aantal grafts dat in de muis is getransplanteerd.
- Verplaats de ovalen zodat ze het bioluminescente signaal van elke graft bevatten en selecteer ROIs meten (Figuur 3B, stap 2).
- Noteer het totale aantal voor elke graft (figuur 3B, stap 3).
- Deel voor elke graft het bioluminescente signaal dat op elk tijdstip wordt gemeten door het signaal dat op het eerste tijdstip is gemeten. Rapporteer de transplantaatoverleving als het aandeel of percentage van het resterende bioluminescente signaal ten opzichte van het initiële bioluminescente signaal.
OPMERKING: Als de grafts na de transplantatie uitbreiden, zal de verhouding of het percentage van de overleving van het transplantaat groter zijn dan respectievelijk 1 of 100%. Alle muizen die transplantaties krijgen, moeten worden gecontroleerd op nadelige gezondheidseffecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. De overleving van twee cellijnen, zoals een mutant en een niet-gerichte controle, kan worden vergeleken, of de overleving van één cellijn kan worden gemeten in meerdere groepen muizen, zoals met geneesmiddelen behandelde muizen versus met voertuigen behandelde controles. Figuur 3A toont drie 8 weken oude vrouwelijke NOD-scid muizen getransplanteerd met een niet-gerichte controle (links) en een mutante (rechter) cellijn. De muizen werden ook intraveneus geïnjecteerd met autoreactieve splenocyten om diabetes over te dragen.
De muizen werden afgebeeld op dag 0, dag 5, dag 10, dag 14 en dag 18 na de injectie. Bij twee van de drie muizen werd het controletransplantaat op dag 18 vernietigd, zoals blijkt uit het verlies van bioluminescent signaal, terwijl het gemuteerde transplantaat werd beschermd. Bij één muis werd het gemuteerde transplantaat, maar niet het controletransplantaat, vernietigd, wat de biologische variatie tussen dieren benadrukte. Het bioluminescente signaal werd gekwantificeerd zoals beschreven in figuur 3B. De overleving van het transplantaat wordt gerapporteerd als het percentage resterend bioluminescent signaal ten opzichte van het eerste tijdstip (figuur 3C). Het is ook nuttig om de verhouding tussen mutant en luminescerende signalen voor elke muis te berekenen om de variatie tussen dieren te visualiseren (figuur 3D). Aan het einde van de periode van gegevensverzameling werden de muizen geëuthanaseerd door CO 2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie.
Voorafgaand aan de ziekteoverdracht kunnen de getransplanteerde cellen zich vermenigvuldigen, wat resulteert in uitgebreide grafts die zichtbaar zijn door de huid (figuur 4A). Deze grafts hebben verzadigde bioluminescente signalen wanneer ze worden afgebeeld (figuur 4B), die mogelijk niet nauwkeurig worden gekwantificeerd.
Figuur 3: Representatieve beelden en kwantificering van het bioluminescente signaal . (A) Drie 8 weken oude vrouwelijke NOD-scid muizen werden getransplanteerd met niet-gerichte controle (rechts) en mutante cellen (links) en intraveneus geïnjecteerd met autoreactieve splenocyten om diabetes te induceren. De muizen werden niet-invasief in beeld gebracht op dag 0, dag 5, dag 10, dag 14 en dag 18 na de injectie. Het bioluminescente signaal wordt geïllustreerd door een kleurenspectrum variërend van lage intensiteit (blauw) tot hoge intensiteit (rood). (B) Instructies voor het kwantificeren van het bioluminescente signaal. (C) Gemiddeld percentage van de transplantaatluminescentie dat in de loop van de tijd overblijft. (D) Verhouding van de percentages van transplantaatluminescentie in de tijd voor mutante versus niet-gerichte controletransplantaten voor elke muis. Ratio = 1 geeft tijdstippen aan waarop het percentage overgebleven signaal voor beide grafts gelijk is. Afkortingen: NOD = niet-obese diabeet; scid = ernstige gecombineerde immunodeficiëntie; NTC = niet-gerichte controle; Mut = mutant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeelden van grafts die overmatig zijn uitgebreid. (A) Geëxpandeerde grafts kunnen uitpuilen door de huid van de muis (aangegeven door de rode pijl). (B) Geëxpandeerde grafts kunnen verzadigde bioluminescente signalen opleveren. Het bioluminescente signaal wordt geïllustreerd door een kleurenspectrum variërend van lage intensiteit (blauw) tot hoge intensiteit (rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: pLenti-luciferase-blast sequentie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T1D is een verwoestende ziekte waarvoor momenteel geen remedie bestaat. Bètacelvervangingstherapie biedt een veelbelovende behandeling voor patiënten met deze ziekte, maar de kritieke barrière voor deze strategie is het potentieel voor terugkerende auto-immuunaanvallen tegen de getransplanteerde bètacellen. De genetische manipulatie van SC-bètacellen om hun immuunzichtbaarheid of gevoeligheid te verminderen, is een mogelijke oplossing voor dit probleem. Hier wordt een protocol beschreven voor niet-invasieve beeldvorming van getransplanteerde bètacellen om hun overleving te meten in een adoptief overdrachtsmodel van auto-immuundiabetes bij muizen.
Een belangrijk voordeel van deze methode is het aanpassingsvermogen van het protocol. De methode wordt hier toegepast om een mutante cellijn te vergelijken met een niet-gerichte controle (figuur 3), maar het protocol kan een verscheidenheid aan experimentele vragen bevatten. De beschermende effecten van een breed scala aan genetische modificaties, medicijnen of andere behandelingen tegen auto-immuunaanvallen kunnen worden onderzocht. Bij het evalueren van de werkzaamheid van een geneesmiddel of andere behandeling ter bescherming tegen auto-immuniteit, zijn alleen cellen nodig die luciferase tot expressie brengen zonder aanvullende genetische modificaties. Hoewel syngenetische transplantaties om auto-immuunbescherming te testen in dit artikel worden gebruikt, kan de methode ook worden aangepast om alloimmune afstoting te evalueren door een combinatie van een cellijn en een muizenstam te gebruiken die niet syngenetisch zijn, zoals NIT-1-cellen en C57BL / 6J-muizen. Het protocol kan ook worden aangepast om immuuninfiltratie in de grafts te onderzoeken. Extra muizen waaruit grafts op verschillende tijdstippen worden opgehaald, kunnen worden opgenomen en de infiltrerende immuuncellen kunnen worden geprofileerd door immunohistochemie of flowcytometrie.
Een belangrijke beperking van de toepassing van deze methode is het falen van de resultaten verkregen bij muizen om zich te vertalen naar menselijke cellen en patiënten. Meer dan 500 strategieën voor auto-immuunbescherming zijn met succes geïmplementeerd in diabetische muismodellen, maar de meerderheid heeft geen klinisch voordeel aangetoond7. Primaire menselijke eilandjes zijn echter een beperkte hulpbron en stamcelwerk heeft hoge financiële en arbeidskosten. Het hier beschreven protocol is een hulpmiddel voor de voorlopige identificatie van potentiële therapeutische doelen met behulp van een relatief goedkope en eenvoudige muistechniek. Volgende experimenten moeten worden uitgevoerd met primaire en/of SC-eilandjes, die meestal onder het nierkapsel bij muizen worden getransplanteerd. De hier beschreven methode kan worden aangepast om de werkzaamheid van therapeutische strategieën in menselijke cellen te evalueren. Zowel primaire als SC-eilandjes kunnen worden ontworpen om luciferase tot expressie te brengen, en hun overleving kan worden gemeten door bioluminescente beeldvorming na transplantatie onder de niercapsule in gehumaniseerde muismodellen12,13. Er zijn ook methoden gemeld voor niet-invasieve monitoring van de overleving van eilandjestransplantaten die met confocale microscopie op de iris van het oog zijn getransplanteerd14.
Een bijkomende beperking van de in dit artikel beschreven methode is de variatie in het autoreactief potentiaal van geïsoleerde splenocyten. Hoewel de snelheid van ziekteoverdracht hoog is10, kan de tijdlijn van diabetes na splenocyteninjectie variëren van 2 weken tot 4 weken. Gedurende deze tijd kunnen de getransplanteerde cellen uitzetten (figuur 4), wat resulteert in hyperinsulinemie en ernstige hypoglykemie. Het combineren van splenocyten van meerdere diabetische donormuizen kan de variatie tussen experimenten verminderen.
Ondanks deze beperkingen is de methode een eenvoudig en informatief hulpmiddel voor het testen van strategieën voor auto-immuunbescherming. Het protocol maakt gebruik van basistechnieken voor klonen en celkweek, een eenvoudige en minimaal invasieve muischirurgie en niet-invasieve beeldvorming, waardoor de gebruiker de gegevensverzameling kan maximaliseren en tegelijkertijd het aantal dieren dat per experiment nodig is, kan minimaliseren. Als alternatief voor in vivo bioluminescente beeldvorming kunnen grafts op verschillende tijdstippen worden teruggevonden, gewogen, gefotografeerd en verder verwerkt voor karakterisering van immuuncellen. Deze strategie vereist grotere aantallen muizen, omdat het herstel van het transplantaat euthanasie vereist en het wenselijk is om op elk tijdstip replicaties te hebben. Bovendien maakt de ent-retrieval-methode het mogelijk om slechts één maatmeting per graft uit te voeren. Omdat de tijdlijn van bètaceldoding door autoreactieve splenocyten varieert tussen individuen, kan het moeilijk zijn om het optimale tijdstip voor transplantaatherstel te bepalen. De aanpak die in dit artikel wordt beschreven, stelt de onderzoeker in staat om de voortgang van auto-immuniteit bij levende muizen te volgen en een volledige tijdlijn van transplantaatvernietiging te verkrijgen. Zolang muizen euglykemie behouden, kunnen beschermde grafts in de muizen worden achtergelaten en gedurende lange perioden in beeld worden gebracht om de mate van bescherming op te helderen.
Hier wordt een eenvoudig protocol beschreven voor het transplanteren en niet-invasief beeldvorming van bètaceltransplantaten in een adoptief transfermuismodel van auto-immuundiabetes. Deze methode maakt het mogelijk om een minimaal aantal dieren te gebruiken en biedt flexibiliteit in de timing van entanalyse, wat van cruciaal belang is gezien de variatie in de voortgang van auto-immuniteit. Het protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast om een breed scala aan experimentele vragen aan te pakken. Muismodellen zijn van cruciaal belang bij de ontdekking en validatie van nieuwe therapeutische strategieën, en deze methode is een waardevol hulpmiddel voor het bevorderen van het bètacelvervangingstherapieveld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Erica P. Cai en Dr. Yuki Ishikawa voor het ontwikkelen van de methode beschreven in dit protocol (zie ref. 11). Onderzoek in de laboratoria van S.K. en P.Y. wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, het Harvard Stem Cell Institute en de Beatson Foundation. T.S. werd ondersteund door een postdoctoraal fellowship van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), en K.B. werd gedeeltelijk ondersteund door een fellowship van de Mary K. Iacocca Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
References
- Katsarou, A., et al.
- Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C.
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire. , Available from: https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes (2021).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic β-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors. Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).
- Cai, E. P., et al. Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes. Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).
- Parent, A. V., et al. Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection. Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).
- Brehm, M. A., et al. Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression. FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).
- Abdulreda, M. H., et al. In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice. Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).
