Summary
Detta protokoll beskriver en enkel och minimalt invasiv metod för transplantation och avbildning av NIT-1-celler i icke-överviktiga diabetiska (NOD)-svåra kombinerade immunbristfälliga möss som utmanas med splenaocyter renade från spontant diabetiska NOD-möss.
Abstract
Typ 1-diabetes kännetecknas av den autoimmuna förstörelsen av de insulinproducerande betacellerna i bukspottkörteln. En lovande behandling för denna sjukdom är transplantation av stamcellshärledda betaceller. Genetiska modifieringar kan dock vara nödvändiga för att skydda de transplanterade cellerna från ihållande autoimmunitet. Diabetiska musmodeller är ett användbart verktyg för den preliminära utvärderingen av strategier för att skydda transplanterade celler från autoimmuna attacker. Här beskrivs en minimalt invasiv metod för transplantation och avbildning av celltransplantat i en adoptiv överföringsmodell av diabetes hos möss. I detta protokoll transplanteras celler från den murina betacellinjen NIT-1 som uttrycker eldflugans luciferastransgen luc2 subkutant till immunbristfälliga icke-överviktiga diabetiker (NOD)-svåra kombinerade immunbristfälliga (scid) möss. Dessa möss injiceras samtidigt intravenöst med splenocyter från spontant diabetiska NOD-möss för att överföra autoimmunitet. Transplantaten avbildas med jämna mellanrum via icke-invasiv bioluminescerande avbildning för att övervaka cellöverlevnaden. Överlevnaden av muterade celler jämförs med kontrollceller transplanterade i samma mus.
Introduction
Typ 1-diabetes (T1D) orsakas av den autoimmuna förstörelsen av de insulinproducerande betacellerna i bukspottkörteln. Förlusten av betacellmassa resulterar i insulinbrist och hyperglykemi. T1D-patienter förlitar sig på flera dagliga injektioner av exogent insulin och upplever episoder av svår hyperglykemi och hypoglykemi under hela livet. Komplikationerna relaterade till dessa episoder inkluderar diabetisk retinopati, nedsatt njurfunktion och neuropati1.
Insulininjektioner är en behandling men inte ett botemedel mot T1D. Att ersätta den förlorade betacellmassan har dock potential att vända sjukdomen genom att göra det möjligt för patienter att producera sitt eget insulin. Tillgången på kadaveriska donatoröar är dock begränsad2. Stamcellshärledda öar (SC-öar) kan ge ett praktiskt taget obegränsat utbud av betaceller för transplantation. Flera grupper har visat att mänskliga embryonala stamceller (ESC) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) kan differentieras för att generera funktionella beta-liknande celler 3,4,5. Lovande tidiga data från kliniska prövningar tyder på att dessa celler bibehåller sin funktion efter transplantation och kan göra det möjligt för patienter att bli insulinoberoende6. Kronisk immunsuppression krävs dock, vilket ökar deras mottaglighet för cancer och infektion. Dessutom kan immunsuppressiva medel vara cytotoxiska för transplantat på lång sikt7. För att eliminera behovet av immunsuppression kan SC-öar modifieras genetiskt för att skydda dem från återkommande autoimmunitet samt alloimmunitet efter transplantation.
Stamcellsforskning är mycket krävande i kostnader och arbetskraft. Muscellinjer och djurmodeller är användbara verktyg för initial identifiering och experimentell validering av strategier för att skydda transplanterade celler från autoimmunitet. NOD-musen utvecklar spontan autoimmun diabetes med många likheter med human T1D8, och NIT-1-insulinomcellinjen delar en genetisk bakgrund med denna musstam9. Diabetes kan adoptivt överföras till den relaterade immunbristfälliga NOD-scid musstammen via injektion av diabetiska splenocyter från NOD-möss för att temporärt synkronisera uppkomsten av diabetes i replikerade experimentella möss10. Denna modell kan användas för att identifiera genetiska mål relativt snabbt och billigt för vidare validering i SC-öar. Nyligen tillämpades metoden för att identifiera och validera RNLS, ett mål som visade sig skydda primära humana öar från autoimmunitet in vivo och iPSC-härledda öar från betacellstress in vitro11. Här beskrivs ett enkelt protokoll för att transplantera genetiskt modifierade NIT-1-celler och icke-invasivt övervaka deras överlevnad i en adoptiv överföringsmodell av autoimmun diabetes hos möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1: Arbetsflödet för transplantation och avbildning av transplantat i en adoptiv överföringsmodell av diabetes hos möss. NIT-1-celler som uttrycker eldflugans transgen luciferas (luc2) transplanteras subkutant till NOD-scid-möss. Mössen injiceras samtidigt med autoreaktiva splenocyter isolerade från en spontant diabetisk NOD-mus. Transplantaten avbildas med jämna mellanrum genom icke-invasiv bioluminescerande avbildning. Figur skapad av BioRender.com. Förkortningar: NOD = icke-fet diabetiker; scid = svår kombinerad immunbrist. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Alla djurvårds- och studieprotokoll godkändes av och utfördes i enlighet med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Joslin Diabetes Center. NOD- och NOD-scid-möss kan lätt erhållas från kommersiella källor. Alla möss i denna studie underhålls i en sentinalövervakad anläggning. Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, djur, instrument och programvara som används i detta protokoll.
1. Konstruktion och underhåll av NIT-1-cellinjer
- Underhålla NIT-1-cellinjer, som delar en genetisk bakgrund med NOD-möss, och 293FT-celler i vävnadsodlingsbehandlade rätter i DMEM innehållande 4,5 g / L glukos kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Odla 293FT-cellerna till 70% -80% sammanflöde för transfektion.
- Per 10 cm skål med 293FT-celler, kombinera 10 μg pLenti-luciferas-blast (se kompletterande fil 1), som uttrycker eldflugans luciferastransgen (luc2) under kontroll av den konstitutivt aktiva EF1α-promotorn, 2 μg vardera av förpackningsplasmiderna pMD2.G, pMDLg/pRRE och pRSV-Rev, 4 μg av höljeproteinplasmiden pCMV-VSV-G och 60 μg linjär polyetylenimin (PEI) i 1 ml serumfritt DMEM. Justera mängderna baserat på antalet celler som ska transfekteras.
- Lämna DNA, PEI och DMEM vid rumstemperatur (RT) i 20 minuter och lägg sedan till dem i 293FT-cellerna.
- Samla upp mediet som innehåller lentivirala partiklar 48 timmar efter transfektion.
- Transducera NIT-1-cellerna vid ~ 80% sammanflöde med 1 ml medium innehållande lentivirala partiklar per 106 celler i 48-72 timmar.
- Välj luciferasuttryckande celler med 5 μg/ml blasticidin i 48 timmar.
- Vidare modifieras de luciferasuttryckande cellerna genetiskt för att passa den experimentella frågan. Inkludera en luciferasuttryckande vildtyp eller icke-målkontrollcellinje för jämförelse.
OBS: Exempel på målgenmodifieringar inkluderar CRISPR-knockout, CRISPRa / i, shRNA-knockdown och överuttryck.
2. Beredning av NIT-1-celler för transplantation
- Odla luciferasuttryckande celler tills de är 80% -90% sammanflytande.
- Ta bort odlingsmediet och tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 5 ml för en 10 cm skål).
- Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin-EDTA till varje maträtt i 2 minuter.
- Neutralisera trypsinet med 5 ml tillväxtmedium.
- Använd en pipett för att tvätta cellerna från skålen och överför dem till ett koniskt rör.
OBS: Celler från flera rätter av samma cellinje kan kombineras. - Räkna cellerna med en fläck som trypanblå manuellt med en hemocytometer eller automatiskt med en automatisk cellräknare.
- Centrifugera vid 250 × g i 5 min vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten med en aspirerande pipett.
- Resuspendera cellpelleten i PBS vid en koncentration av 5 × 10 7 celler/ml (107 celler per cellinje per mus kommer att transplanteras i en volym av 200 μl).
- Håll cellerna på is (i upp till 3 timmar) tills transplantation.
3. Transplantation av NIT-1-celler till NOD-scid-möss
- Bedöva mottagarmössen (8-10 veckor gamla NOD-scid-möss av samma kön som mössen som används för att isolera splenocyterna) genom isofluraninhalation i en knockdownkammare. Leverera 2,5% isofluran in i kammaren med en flödeshastighet på 1,5 l/min och en evakueringshastighet på 9 l/min.
- Smörj djurets ögon med oftalmisk salva för att förhindra torkning.
- Använd en elektrisk rakapparat med ett skydd, ta bort håret från baksidan (dorsala sidan) av mössen för att exponera huden. Det rakade transplantationsområdet kommer att vara ungefär 1 i x 2 tum. Sätt tillbaka de rakade mössen i knockdown-kammaren tills transplantationen.
- Överför mössen en i taget till en ren yta med en isoflurannoskon. Led försiktigt musens huvud in i näskonen. Använd ett isofluranflöde på 0,25 l/min för att bibehålla anestesin under transplantationen.
- Torka av transplantationsområdet med en isopropylalkoholberedningsdyna för att ta bort löst hår och desinficera huden.
- Se till att cellerna är helt resuspenderade innan sprutan fylls på. Dra upp en överflödig volym (>300 μl) celler i en 1 ml steril spruta med en 26 G nål. Ta bort eventuella bubblor; Sätt sedan tillbaka överflödiga celler i röret så att 300 μL cellsuspension finns kvar i sprutan.
- Använd ett par böjda pincett som hålls i den icke-dominerande handen, lyft försiktigt huden på ena sidan (vänster eller höger) av musens rygg för att möjliggöra enklare åtkomst till det subkutana utrymmet.
- Använd den dominerande handen och placera sprutan parallellt med koronala och sagittala plan i musens kropp. Med nålen riktad mot musens huvud, sätt in nålen i huden nära bakkvarteren och led den försiktigt in i det subkutana utrymmet. Se till att hela nålen förblir under huden och inte sticker igenom.
- Justera pincetten för att försiktigt hålla huden runt nålens bas. Dosera långsamt en liten mängd cellsuspension (<50 μl) och bekräfta att en liten utbuktning bildas under huden vid injektionsstället. Fortsätt att injicera cellsuspensionen tills 200 μl har tillförts det subkutana utrymmet.
- Håll pincetten på plats och håll nålen parallell med musens kropp, dra långsamt ut nålen. När nålen har tagits bort, håll huden stängd med pincett i några sekunder för att förhindra att cellerna läcker ut ur punkteringssåret.
- Om en genetisk modifiering utvärderas, upprepa transplantationen på motsatt sida av musen med en annan spruta så att både mutant- och kontrollceller injiceras i varje mus, med en cellinje till vänster och den andra till höger. Om endast en cellinje transplanteras, injicera cellerna endast på ena sidan.
- Efter transplantationen, överför varje mus till en ny bur. Låt varje mus återhämta sig helt från anestesin innan du lägger till ytterligare möss i buret.
OBS: Möss återvinns när de återupptar normala aktiviteter och visar inte tecken på slöhet eller nedsatt rörelse. - Utvärdera hälsotillståndet hos mössen dagligen under experimentet efter transplantationen. Om transplantaten bildar en stor utbuktning eller mössen blir svaga och slöa, mäta deras blodsocker och ge 10% (w / w) sackarosvatten ad libitum till alla hypoglykemiska möss. Följ alla veterinärrekommendationer och avliva alla möss med fortsatt dåligt kroppstillstånd enligt institutionens riktlinjer. I denna studie avlivades möss genom CO2-inhalation följt av cervikal dislokation.
4. Isolering och rening av autoreaktiva splenocyter
- Identifiera 10-16 veckor gamla manliga eller kvinnliga NOD-möss med nyligen debuterande (mindre än 10 dagar) diabetes genom att använda urin (eller blod) glukostestremsor. NOD-möss anses vara diabetiker när de har urin / blodsocker ≥ 250 mg / dL på minst 2 på varandra följande dagar.
OBS: För varje NOD-scid mus behövs 10 miljoner splenocyter; En mjälte ger vanligtvis 50 miljoner till 150 miljoner splenocyter. Splenocyterna isolerades från patogenfria möss inrymda i en sentinalövervakad anläggning. - Avliva lämpligt antal diabetiska NOD-möss.
OBS: I denna studie avlivades mössen genom CO 2-inandning följt av cervikal dislokation för att säkerställa döden. - Med musen på ryggen, gör ett vertikalt snitt ungefär 2 tum långt i huden med kirurgisk sax. Öppna musens högra sida ur forskarens synvinkel och leta reda på den ljusröda mjälten. Skär försiktigt bort mjälten från den rosa bukspottkörteln och överför den till en steril 10 cm petriskål som innehåller 5 ml steril PBS. Upprepa dissektionen med så många möss som behövs.
OBS: Mjälte från flera möss kan kombineras i en maträtt. Utför följande steg med sterila reagens och utrustning i en steril huva. - Mosa mjälten/mjältarna med den platta toppen av en steril sprutkolv.
- Placera en sil på 40 μm eller 70 μm i ett 50 ml koniskt rör och tvätta silen med 5 ml PBS för att fylla på den. För över mjälten/mjältupphängningen till silen och fortsätt försiktigt mosa genom silen. Tvätta disken med 10 ml PBS och överför tvätten till silen. Fortsätt mosa tills den röda färgen är borta från silen.
- Kasta silen och snurra röret vid 500 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten med en aspirerande pipett.
- Återsuspendera cellpelleten i 5 ml (för upp till tre mjälte) ACK-lysbuffert förvärmd till RT och lysera de röda blodkropparna i 4 minuter. Öka volymen med 1-2 ml per mjälte om ytterligare mjälte behövs.
- Avbryt reaktionen med 5 ml NIT-1-cellmedia (beskrivet ovan) per 5 ml lysbuffert. För cellsuspensionen genom en ny sil för att avlägsna klumpar. Kasta silen och snurra vid 500 × g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Resuspendera cellpelleten i 20 ml PBS och räkna cellerna. Snurra vid 500 × g i 5 min vid rumstemperatur. Resuspendera cellerna i steril PBS i en koncentration av 1 × 108 celler/ml (injektionsvolymen är 0,1 ml/mus) i ett 1,5 ml säkert låsrör.
- Förvara cellerna på is (i högst 1 timme) eller håll cellerna vid RT och fortsätt omedelbart till injektionen av svansvenen.
5. Intravenös injektion av diabetiska splenocyter via den laterala svansvenen
- Värm upp kroppen hos de vuxna mottagarnas NOD-scid-möss (t.ex. genom att använda en värmelampa i ~ 5-10 min) för att vasodilera venerna (detta hjälper till visualisering och injektion i venen).
OBS: För att undvika överhettning av mössen, överskrid inte denna tid. Övervaka alltid hälsostatusen. Om mössen verkar utmattade eller orörliga, stäng av värmelampan omedelbart. - Värm upp cellsuspensionen. Förbered en steril spruta (0,3-1,0 ml) med en steril nål (27-30 G, 0,3 mm/0,5 tum eller mindre), eller använd en steril 0,5 ml insulinspruta med en 0,3 mm (0,5 tum) nål. Håll alltid nålen steril och använd en steril bricka om sprutan måste läggas ner mellan injektionerna.
- Återsuspendera splenocytlösningen före varje injektion. Dra upp 100 μl av den förvärmda och blandade splenocytsuspensionen i sprutan för varje mus. Se till att inga luftbubblor finns i sprutan eller i suspensionen.
OBS: Se till att ha all utrustning och förnödenheter förberedda (spritservetter för desinfektion, en spruta laddad med de splenocyter som ska injiceras och en ny bur för separering av injicerade möss) innan du placerar musen i fasthållningsanordningen. - Placera musen i fasthållningsanordningen. Fånga svansen med den icke-dominerande handen och lokalisera en av de två laterala svansvenerna. Rotera försiktigt svansen om det behövs. Torka av svansen med en desinfektionsduk (70% isopropylalkohol) för att rengöra huden och öka venens synlighet.
- Sätt in nålen i en spetsig vinkel i svansens centrala region med den dominerande handen. Med nålens avfasning uppåt skjuter du nålen några millimeter genom huden.
OBS: Se till att nålen är parallell med venen och placerad bara något under huden. Var beredd på plötsliga rörelser av musen/svansen direkt efter att ha trängt in i huden/kärlväggen. En lyckad insättning av nålen ska kännas som en "smidig glidning" i venen. Om ett nytt försök behövs, flytta längre upp svansen mot kroppen. - Tryck försiktigt på sprutan för att injicera splenocytsuspensionen. Låt inte nålen röra sig längre in eller ut när du injicerar. Lyckade injektioner är släta utan att känna något mottryck under injektionen och indikeras av ett transparent/vitt blodflöde omedelbart efter injektionen.
- Släpp försiktigt nålen ur venen och applicera lätt tryck på svansen med en desinfektionsduk tills blödningen slutar. Släpp musen från fasthållningsanordningen och överför den försiktigt till en nyberedd bur.
OBS: Injicera två till tre kontrollmöss som inte får en NIT-1-celltransplantation med splenocyter för att bekräfta potentialen hos de autoreaktiva splenocyterna att inducera diabetes, vilket tar ungefär 2-4 veckor efter injektionen.
6. Bioluminescerande avbildning in vivo av NIT-1-transplantat
OBS: Avbilda transplantaten en till två gånger per vecka. På transplantationsdagen, vänta minst 2 timmar efter transplantationen så att transplantaten kan sätta sig och säkerställa stabilt luciferasuttryck. Om tiden är en begränsande faktor kan den initiala mätningen göras på dag 1 istället. Ett rekommenderat initialt bildschema är dag 0 eller dag 1 efter injektion, dag 5, dag 10, dag 14, dag 18 och dag 25. Justera schemat, dock baserat på utvecklingen av autoimmunitet bedömd av förlusten av bioluminescerande signal.
- Bered en 15 mg/ml D-luciferinlösning i Dulbeccos PBS. Skaka vid rumstemperatur för att lösa upp och sterilfiltrera (0,22 μm). Förvara 1 ml alikvoter vid −20 °C och tina vid behov.
OBS: Alikvoterna kan frysas om. - Minst 5 minuter före avbildning, injicera mössen intraperitonealt med en 1 ml spruta och en 26 G nål med D-luciferin lösning i en dos av 150 mg/kg.
OBS: Använd en ny spruta och nål för varje mus. - Bedöva mössen genom inandning av isofluran enligt institutionella riktlinjer. De rekommenderade förhållandena är 2,5 % isofluran med en flödeshastighet på 1,5 l/min in i utslagningskammaren och en evakueringshastighet på 9 l/min.
- Smörj djurets ögon med oftalmisk salva för att förhindra torkning.
- Öppna programvaran som är associerad med bildinstrumentet. Skapa en ny användare och/eller logga in. På kontrollpanelen längst ned till höger väljer du Initiera (bild 2A). Om du vill spara bilddata automatiskt skapar du lämpliga mappar på datorn och väljer sedan Förvärv | Spara automatiskt till... (Figur 2A). När instrumentet har initierats ställer du in exponeringstiden på 1 min.
De fullständiga bildparametrarna visas i figur 2B. - Överför mössen en i taget från knockdown-kammaren till bildinstrumentet. Placera musen på magen med benen utspridda och led försiktigt huvudet in i näskonen. Ett isofluranflöde på 0,25 l/min som levereras via en noskon är lämpligt för att bibehålla anestesi under avbildning. Platta försiktigt musen genom att trycka på mitten av ryggen med båda händerna och sedan sprida händerna utåt och isär.
- Välj Hämta (bild 2B). Registrera alla relevanta detaljer om experimentet i popup-fönstret (bild 2C).
OBS: Se figur 3A för representativa bilder av tre 8 veckor gamla kvinnliga NOD-scid-möss transplanterade med två transplantat vid olika tidpunkter.
Bild 2: Skärmbilder av programvarukommandon för avbildning av bioluminescerande transplantat . (A) Innan du avbildar väljer du Initiera för att förbereda instrumentet. Bilderna kan sparas automatiskt i en valfri mapp genom att välja Förvärv | Spara automatiskt till... (B) Översikt över bildparametrarna. När musen har placerats i instrumentet väljer du Anskaffa. (C) Skärmbild av dialogrutan som dyker upp under bildbehandling. Detaljer som tidpunkt och musstam kan anges här. Klicka här för att se en större version av denna figur.
7. Analys av data
- Kvantifiera den bioluminescerande signalen när som helst efter avbildning. Öppna programvaran som är associerad med bildinstrumentet. Välj Arkiv | Öppna och välj filen ClickInfo.txt som är associerad med musen som ska analyseras.
- I verktygspaletten väljer du ROI-verktyg (bild 3B, steg 1). Från den ovala rullgardinsmenyn (figur 3B, steg 1, röd pil) väljer du antalet transplantat som transplanterades i musen.
- Flytta ovalerna så att de innehåller den bioluminescerande signalen från varje transplantat och välj Mät ROI (figur 3B, steg 2).
- Registrera det totala antalet för varje transplantat (figur 3B, steg 3).
- För varje transplantat, dela den bioluminescerande signalen uppmätt vid varje tidpunkt med signalen uppmätt vid den första tidpunkten. Rapportera transplantatöverlevnaden som andelen eller procentandelen kvarvarande bioluminescerande signal i förhållande till den ursprungliga bioluminescerande signalen.
OBS: Om transplantaten expanderar efter transplantationen kommer förhållandet eller procentandelen av transplantatöverlevnad att vara större än 1 respektive 100%. Alla möss som får transplantationer bör övervakas för negativa hälsoeffekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt över protokollet beskrivs i figur 1. Överlevnaden av två cellinjer, såsom en mutant och en icke-målsökande kontroll, kan jämföras, eller överlevnaden av en cellinje kan mätas i flera grupper av möss, såsom läkemedelsbehandlade möss kontra vehikelbehandlade kontroller. Figur 3A visar tre 8 veckor gamla kvinnliga NOD-scid-möss transplanterade med en icke-målsökande kontroll (vänster) och en mutant (höger) cellinje. Mössen injicerades också intravenöst med autoreaktiva splenocyter för att överföra diabetes.
Mössen avbildades dag 0, dag 5, dag 10, dag 14 och dag 18 efter injektionen. I två av de tre mössen förstördes kontrolltransplantatet dag 18, vilket framgår av förlusten av bioluminescerande signal, medan mutanttransplantatet skyddades. I en mus förstördes mutanttransplantatet men inte kontrolltransplantatet, vilket belyser den biologiska variationen mellan djur. Den bioluminescerande signalen kvantifierades enligt beskrivningen i figur 3B. Transplantatöverlevnaden rapporteras som procentandelen kvarvarande bioluminescerande signal jämfört med den första tidpunkten (figur 3C). Det är också användbart att beräkna förhållandet mellan mutant för att kontrollera luminescerande signaler för varje mus för att visualisera variationen mellan djur (figur 3D). I slutet av datainsamlingsperioden avlivades mössen genom CO2-inhalation följt av cervikal dislokation.
Före sjukdomsöverföring kan de transplanterade cellerna replikeras, vilket resulterar i expanderade transplantat som är synliga genom huden (figur 4A). Dessa transplantat kommer att ha mättade bioluminescerande signaler när de avbildas (figur 4B), vilket kanske inte kvantifieras exakt.
Figur 3: Representativa bilder och kvantifiering av den bioluminescerande signalen . (A) Tre 8 veckor gamla kvinnliga NOD-scid-möss transplanterades med icke-målsökande kontroll (höger) och mutanta celler (vänster) och injicerades intravenöst med autoreaktiva splenocyter för att inducera diabetes. Mössen avbildades icke-invasivt dag 0, dag 5, dag 10, dag 14 och dag 18 efter injektion. Den bioluminescerande signalen illustreras av ett färgspektrum som sträcker sig från låg intensitet (blå) till hög intensitet (röd). b) Anvisningar för kvantifiering av den självlysande signalen. (C) Genomsnittlig procentandel av transplantatluminiscens som återstår över tiden. d) Förhållandet mellan procentandelen transplantatluminiscens över tid för kontrolltransplantat med mutanter respektive icke-målsökande kontrolltransplantat för varje mus. Ratio = 1 anger tidpunkter vid vilka procentandelen återstående signal är lika för båda transplantaten. Förkortningar: NOD = icke-fet diabetiker; scid = svår kombinerad immunbrist; NTC = icke-målinriktad kontroll; Mut = mutant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på transplantat som är alltför expanderade. (A) Expanderade transplantat kan bukta ut genom musens hud (indikeras av den röda pilen). (B) Expanderade transplantat kan ge mättade bioluminescerande signaler. Den bioluminescerande signalen illustreras av ett färgspektrum som sträcker sig från låg intensitet (blå) till hög intensitet (röd). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: pLenti-luciferas-blastsekvens. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T1D är en förödande sjukdom för vilken det för närvarande inte finns något botemedel. Betacellsersättningsterapi erbjuder en lovande behandling för patienter med denna sjukdom, men det kritiska hindret för denna strategi är potentialen för återkommande autoimmuna attacker mot de transplanterade betacellerna. Gentekniken av SC-beta-celler för att minska deras immunsynlighet eller mottaglighet är en potentiell lösning på detta problem. Här beskrivs ett protokoll för icke-invasiv avbildning av transplanterade betaceller för att mäta deras överlevnad i en adoptiv överföringsmodell av autoimmun diabetes hos möss.
En viktig fördel med denna metod är protokollets anpassningsförmåga. Metoden används här för att jämföra en mutant cellinje med en icke-målsökande kontroll (figur 3), men protokollet kan rymma en mängd olika experimentella frågor. De skyddande effekterna av ett brett spektrum av genetiska modifieringar, läkemedel eller andra behandlingar mot autoimmun attack kan undersökas. Vid utvärdering av effekten av ett läkemedel eller annan behandling för att skydda mot autoimmunitet behövs endast celler som uttrycker luciferas utan ytterligare genetiska modifieringar. Medan syngena transplantationer för att testa autoimmunt skydd används i denna artikel, kan metoden också anpassas för att utvärdera alloimmun avstötning genom att använda en kombination av en cellinje och en musstam som inte är syngen, såsom NIT-1-celler och C57BL / 6J-möss. Protokollet kan också modifieras för att utforska immuninfiltration i transplantaten. Ytterligare möss från vilka transplantat hämtas vid olika tidpunkter kan inkluderas, och de infiltrerande immuncellerna kan profileras med immunhistokemi eller flödescytometri.
En stor begränsning av tillämpningen av denna metod är misslyckandet av de resultat som erhållits hos möss att översätta till mänskliga celler och patienter. Över 500 strategier för autoimmunt skydd har implementerats med framgång i diabetesmusmodeller, men majoriteten har misslyckats med att visa klinisk nytta7. Primära mänskliga öar är dock en begränsad resurs, och stamcellsarbete har höga ekonomiska och arbetskraftskostnader. Protokollet som beskrivs här är ett verktyg för preliminär identifiering av potentiella terapeutiska mål med hjälp av en relativt billig och enkel musteknik. Efterföljande experiment bör utföras med primära och/eller SC-öar, som vanligtvis transplanteras under njurkapseln hos möss. Metoden som beskrivs här kan anpassas för att utvärdera effekten av terapeutiska strategier i humana celler. Både primära och SC-öar kan konstrueras för att uttrycka luciferas, och deras överlevnad kan mätas genom bioluminescerande avbildning efter transplantation under njurkapseln till humaniserade musmodeller12,13. Metoder för icke-invasiv övervakning av överlevnaden av ötransplantat transplanterade på ögats iris genom konfokalmikroskopi har också rapporterats14.
En ytterligare begränsning associerad med metoden som beskrivs i denna uppsats är variationen i den autoreaktiva potentialen hos isolerade splenocyter. Även om graden av sjukdomsöverföring är hög10, kan tidslinjen för diabetesdebut efter splenocytinjektion variera från 2 veckor till 4 veckor. Under denna tid kan de transplanterade cellerna expandera (figur 4), vilket resulterar i hyperinsulinemi och svår hypoglykemi. Att kombinera splenocyter från flera diabetiska donatormöss kan minska variationen mellan experiment.
Trots dessa begränsningar är metoden ett enkelt och informativt verktyg för att testa strategier för autoimmunt skydd. Protokollet använder grundläggande klonings- och cellodlingstekniker, en enkel och minimalt invasiv muskirurgi och icke-invasiv avbildning, vilket gör det möjligt för användaren att maximera datainsamlingen samtidigt som antalet djur som behövs per experiment minimeras. Som ett alternativ till in vivo bioluminescerande avbildning kan transplantat återvinnas vid olika tidpunkter, vägas, fotograferas och bearbetas vidare för immuncellkarakterisering. Denna strategi kräver ett större antal möss, eftersom transplantatåtervinning kräver eutanasi, och det är önskvärt att ha repliker vid varje tidpunkt. Dessutom tillåter grafthämtningsmetoden att endast en storleksmätning görs per transplantat. Eftersom tidslinjen för betacelldödande av autoreaktiva splenocyter varierar mellan individer kan det vara svårt att bestämma den optimala tidpunkten för transplantatåterhämtning. Tillvägagångssättet som beskrivs i detta dokument gör det möjligt för forskaren att övervaka utvecklingen av autoimmunitet hos levande möss och få en fullständig tidslinje för transplantatförstörelse. Så länge möss upprätthåller euglykemi kan skyddade transplantat lämnas i mössen och avbildas under långa perioder för att belysa graden av skydd.
Här beskrivs ett enkelt protokoll för transplantation och icke-invasiv avbildning av betacelltransplantat i en adoptiv överföringsmusmodell av autoimmun diabetes. Denna metod möjliggör ett minimalt antal djur som ska användas och möjliggör flexibilitet i tidpunkten för transplantatanalys, vilket är kritiskt med tanke på variationen i utvecklingen av autoimmunitet. Protokollet kan också lätt anpassas för att ta itu med ett brett spektrum av experimentella frågor. Musmodeller är avgörande för upptäckten och valideringen av nya terapeutiska strategier, och denna metod är ett värdefullt verktyg för att främja betacellersättningsterapifältet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Erica P. Cai och Dr. Yuki Ishikawa för att ha utvecklat metoden som beskrivs i detta protokoll (se ref. 11). Forskning i SK och PY: s laboratorier stöds av bidrag från National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Stem Cell Institute och Beatson Foundation. T.S. stöddes av ett postdoktoralt stipendium från National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), och K.B. stöddes delvis av ett stipendium från Mary K. Iacocca Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
References
- Katsarou, A., et al.
- Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C.
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire. , Available from: https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes (2021).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic β-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors. Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).
- Cai, E. P., et al. Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes. Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).
- Parent, A. V., et al. Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection. Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).
- Brehm, M. A., et al. Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression. FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).
- Abdulreda, M. H., et al. In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice. Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).
