Summary
Denne protokol beskriver en ligetil og minimalt invasiv metode til transplantation og billeddannelse af NIT-1-celler i ikke-overvægtige diabetiske (NOD) -alvorlige kombinerede immundeficiente mus udfordret med splenocytter oprenset fra spontant diabetiske NOD-mus.
Abstract
Type 1-diabetes er karakteriseret ved autoimmun ødelæggelse af de insulinproducerende betaceller i bugspytkirtlen. En lovende behandling for denne sygdom er transplantation af stamcelleafledte betaceller. Genetiske modifikationer kan dog være nødvendige for at beskytte de transplanterede celler mod vedvarende autoimmunitet. Diabetiske musemodeller er et nyttigt værktøj til foreløbig evaluering af strategier til beskyttelse af transplanterede celler mod autoimmune angreb. Her beskrives en minimalt invasiv metode til transplantation og billeddannelse af celletransplantater i en adoptiv overførselsmodel af diabetes hos mus. I denne protokol transplanteres celler fra den murin pancreas beta-cellelinje NIT-1, der udtrykker ildfluen luciferase transgen luc2 , subkutant i immunodeficiente ikke-overvægtige diabetiske (NOD) -alvorlige kombinerede immundeficiente (scid) mus. Disse mus injiceres samtidigt intravenøst med splenocytter fra spontant diabetiske NOD-mus for at overføre autoimmunitet. Transplantaterne afbildes med jævne mellemrum via ikke-invasiv bioluminescerende billeddannelse for at overvåge cellens overlevelse. Overlevelsen af mutante celler sammenlignes med overlevelsen af kontrolceller transplanteret i den samme mus.
Introduction
Type 1-diabetes (T1D) er forårsaget af autoimmun ødelæggelse af de insulinproducerende betaceller i bugspytkirtlen. Tabet af betacellemasse resulterer i insulinmangel og hyperglykæmi. T1D-patienter er afhængige af flere daglige injektioner af eksogent insulin og oplever episoder med alvorlig hyperglykæmi og hypoglykæmi gennem hele deres liv. Komplikationerne relateret til disse episoder omfatter diabetisk retinopati, nedsat nyrefunktion og neuropati1.
Insulininjektioner er en behandling, men ikke en kur mod T1D. Udskiftning af den tabte betacellemasse har imidlertid potentiale til at vende sygdommen ved at gøre det muligt for patienter at producere deres eget insulin. Udbuddet af kadaveriske donorøer er dog begrænset2. Stamcelleafledte øer (SC-øer) kan give en næsten ubegrænset forsyning af betaceller til transplantation. Flere grupper har vist, at humane embryonale stamceller (ESC'er) og inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) kan differentieres for at generere funktionelle beta-lignende celler 3,4,5. Lovende tidlige kliniske forsøgsdata indikerer, at disse celler bevarer deres funktion efter transplantation og kan gøre det muligt for patienter at blive insulinuafhængige6. Kronisk immunsuppression er imidlertid påkrævet, hvilket øger deres modtagelighed for kræft og infektion. Derudover kan immunsuppressive midler være cytotoksiske for transplantater på lang sigt7. For at eliminere behovet for immunsuppression kan SC-øer genetisk modificeres for at beskytte dem mod tilbagevendende autoimmunitet samt alloimmunitet efter transplantation.
Stamcelleforskning er meget krævende i omkostninger og arbejdskraft. Musecellelinjer og dyremodeller er nyttige værktøjer til indledende identifikation og eksperimentel validering af strategier til beskyttelse af transplanterede celler mod autoimmunitet. NOD-musen udvikler spontan autoimmun diabetes med mange ligheder med human T1D8, og NIT-1-insulinomcellelinjen deler en genetisk baggrund med denne musestamme9. Diabetes kan adoptivt overføres til den relaterede immundeficiente NOD-scid musestamme via injektion af diabetiske splenocytter fra NOD-mus for midlertidigt at synkronisere begyndelsen af diabetes i replikate eksperimentelle mus10. Denne model kan bruges til at identificere genetiske mål relativt hurtigt og billigt til yderligere validering i SC-holme. For nylig blev metoden anvendt til at identificere og validere RNLS, et mål, der viste sig at beskytte primære humane øer mod autoimmunitet in vivo og iPSC-afledte øer fra betacellestress in vitro11. Beskrevet her er en ligetil protokol til transplantation af genetisk manipulerede NIT-1-celler og ikke-invasivt overvåge deres overlevelse i en adoptiv overførselsmodel af autoimmun diabetes hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1: Arbejdsprocessen for transplantation og billeddannelse af transplantater i en adoptiv overførselsmodel af diabetes hos mus. NIT-1-celler, der udtrykker ildfluetransgenet luciferase (luc2), transplanteres subkutant i NOD-scidmus. Musene injiceres samtidigt med autoreaktive splenocytter isoleret fra en spontant diabetisk NOD-mus. Transplantaterne afbildes med jævne mellemrum ved ikke-invasiv bioluminescerende billeddannelse. Figur skabt af BioRender.com. Forkortelser: NOD = ikke-overvægtig diabetiker; scid = svær kombineret immundefekt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Alle dyrepleje- og undersøgelsesprotokoller blev godkendt af og udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Joslin Diabetes Center. NOD- og NOD-scid-mus kan let fås fra kommercielle kilder. Alle mus i denne undersøgelse holdes i en sentinalovervåget facilitet. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, dyr, instrumenter og software, der anvendes i denne protokol.
1. Konstruktion og vedligeholdelse af NIT-1 cellelinjer
- Vedligehold NIT-1-cellelinjer, som deler genetisk baggrund med NOD-mus, og 293FT-celler i vævskulturbehandlede retter i DMEM indeholdende 4,5 g/L glucose suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin/streptomycin i en 37 °C inkubator med 5% CO2.
- Dyrk 293FT-cellerne til 70% -80% sammenløb til transfektion.
- Pr. 10 cm skål med 293FT-celler kombineres 10 μg pLenti-luciferase-blast (se supplerende fil 1), som udtrykker ildflue-luciferasetransgenet (luc2) under kontrol af den konstitutivt aktive EF1α-promotor, 2 μg hver af emballageplasmiderne pMD2.G, pMDLg/pRRE og pRSV-Rev, 4 μg af kuvertproteinplasmidet pCMV-VSV-G og 60 μg lineær polyethylenimin (PEI) i 1 ml serumfrit DMEM. Juster mængderne baseret på antallet af celler, der skal transfekteres.
- Lad DNA, PEI og DMEM stå ved stuetemperatur (RT) i 20 minutter, og tilsæt dem derefter til 293FT-cellerne.
- Mediet indeholdende lentivirale partikler opsamles 48 timer efter transfektion.
- Transduce NIT-1-cellerne ved ~ 80% sammenløb med 1 ml medium indeholdende lentivirale partikler pr. 106 celler i 48-72 timer.
- De luciferase-ekspressive celler vælges med 5 μg/ml blasticidin i 48 timer.
- Yderligere genetisk modificere luciferase-ekspressive celler, så de passer til det eksperimentelle spørgsmål. Medtag en luciferase-udtrykkende vildtype eller ikke-målrettet kontrolcellelinje til sammenligning.
BEMÆRK: Eksempler på målgenmodifikationer inkluderer CRISPR-knockout, CRISPRa / i, shRNA-knockdown og overekspression.
2. Forberedelse af NIT-1-celler til transplantation
- Dyrk luciferase-ekspressive celler, indtil de er 80% -90% sammenflydende.
- Fjern vækstmediet og vask cellerne med fosfatbufret saltvand (PBS, 5 ml til en 10 cm skål).
- Tilsæt 1 ml 0,05% trypsin-EDTA til hver skål i 2 min.
- Neutraliser trypsin med 5 ml vækstmedium.
- Brug en pipette til at vaske cellerne af skålen og overføre dem til et konisk rør.
BEMÆRK: Celler fra flere retter af samme cellelinje kan kombineres. - Tæl cellerne ved hjælp af en plet som trypanblå manuelt med et hæmocytometer eller automatisk med en automatisk celletæller.
- Der centrifugeres ved 250 × g i 5 minutter ved RT, og supernatanten fjernes med en sugepipette.
- Resuspender cellepillen i PBS i en koncentration på 5 ×10 7 celler/ml (10-7 celler pr. cellelinje pr. mus transplanteres i et volumen på 200 μL).
- Hold cellerne på is (i op til 3 timer) indtil transplantation.
3. Transplantation af NIT-1-celler til NOD-scid-mus
- Bedøv modtagermusene (8-10 uger gamle NOD-scid-mus af samme køn som de mus, der bruges til at isolere splenocytterne) ved indånding af isofluran i et knockdownkammer. Der hældes 2,5 % isofluran ind i kammeret med en gennemstrømningshastighed på 1,5 l/min og en evakueringshastighed på 9 l/min.
- Smør dyrets øjne med oftalmisk salve for at forhindre tørring.
- Brug en elektrisk barbermaskine med en beskyttelse til at fjerne håret fra musenes bagside (dorsale side) for at udsætte huden. Det barberede transplantationsområde vil være ca. 1 i x 2 tommer. Sæt de barberede mus tilbage i knockdown-kammeret indtil transplantationen.
- Overfør musene en ad gangen til en ren overflade med en isofluran næsekegle. Før forsigtigt musens hoved ind i næsekeglen. Brug en isofluran strømningshastighed på 0,25 l / min for at opretholde anæstesien under transplantationen.
- Tør transplantationsområdet af med en isopropylalkoholforberedelsespude for at fjerne løse hår og desinficere huden.
- Sørg for, at cellerne er helt resuspenderet, før sprøjten isættes. Træk et overskydende volumen (>300 μL) celler i en 1 ml steril sprøjte med en 26 G kanyle. Fjern eventuelle bobler; Sæt derefter overskydende celler tilbage i tuben, så der forbliver 300 μL cellesuspension i sprøjten.
- Brug en buet tang, der holdes i den ikke-dominerende hånd, løft forsigtigt huden på den ene side (venstre eller højre) af musens ryg for at give lettere adgang til det subkutane rum.
- Brug den dominerende hånd til at placere sprøjten parallelt med de koronale og sagittale planer i musens krop. Med nålen rettet mod musens hoved skal nålen indsættes i huden nær bagfjerdingerne, og den forsigtigt føres ind i det subkutane rum. Sørg for, at hele nålen forbliver under huden og ikke stikker igennem.
- Juster pincetten, så du forsigtigt holder huden omkring kanylens bund. Dispenser langsomt en lille mængde cellesuspension (<50 μL) og bekræft, at der dannes en lille bule under huden på injektionsstedet. Cellesuspensionen fortsættes, indtil der er indgivet 200 μL til det subkutane rum.
- Hold pincetten på plads og hold nålen parallelt med musens krop, træk langsomt nålen ud. Når nålen er fjernet, skal du holde huden lukket med pincet i et par sekunder for at forhindre, at cellerne lækker ud af punkteringssåret.
- Hvis en genetisk modifikation evalueres, gentages transplantationen på den modsatte side af musen ved hjælp af en anden sprøjte, så både mutant- og kontrolceller injiceres i hver mus med en cellelinje til venstre og den anden til højre. Hvis kun en cellelinje transplanteres, injiceres cellerne kun på den ene side.
- Efter transplantationen overføres hver mus til et nyt bur. Lad hver mus komme sig helt efter bedøvelsen, før du tilføjer yderligere mus til buret.
BEMÆRK: Mus genoprettes, når de genoptager normale aktiviteter og ikke viser tegn på sløvhed eller nedsat bevægelse. - Evaluer musenes sundhedsstatus dagligt i løbet af eksperimentet efter transplantationen. Hvis transplantaterne danner en stor bule, eller musene bliver svage og sløve, måles deres blodsukker og giver 10% (w / w) saccharosevand ad libitum til alle de hypoglykæmiske mus. Følg alle veterinære anbefalinger og aflive mus med fortsat dårlig kropstilstand i henhold til institutionelle retningslinjer. I denne undersøgelse blev mus aflivet ved CO2 -indånding efterfulgt af cervikal dislokation.
4. Isolering og oprensning af autoreaktive splenocytter
- Identificer 10-16 uger gamle mandlige eller kvindelige NOD-mus med nylig debut (mindre end 10 dage) diabetes ved hjælp af urin (eller blod) glukoseteststrimler. NOD-mus betragtes som diabetiker, når de har urin / blodsukker ≥ 250 mg / dL i mindst 2 på hinanden følgende dage.
BEMÆRK: For hver NOD-scid-mus er der brug for 10 millioner splenocytter; En milt giver typisk 50 millioner til 150 millioner splenocytter. Splenocytterne blev isoleret fra patogenfrie mus, der var anbragt i et sentinalovervåget anlæg. - Aflive det passende antal diabetiske NOD-mus.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev musene aflivet ved CO2 -indånding efterfulgt af cervikal dislokation for at sikre døden. - Med musen på ryggen skal du lave et lodret snit ca. 2 tommer i længden i huden med kirurgisk saks. Åbn højre side af musen fra forskerens synspunkt og find den lyse røde milt. Skær forsigtigt milten væk fra den lyserøde bugspytkirtel og overfør den til en steril 10 cm petriskål indeholdende 5 ml steril PBS. Gentag dissektionen med så mange mus som nødvendigt.
BEMÆRK: Milt fra flere mus kan kombineres i en skål. Udfør følgende trin ved hjælp af sterile reagenser og udstyr i en steril hætte. - Mos milten/milten med den flade top af et sterilt sprøjtestempel.
- Anbring en 40 μm eller 70 μm si i et 50 ml konisk rør og vask sien med 5 ml PBS for at klargøre den. Overfør miltopslæmningen til silen, og fortsæt forsigtig mashing gennem silen. Fadet vaskes med 10 ml PBS og overføres til sien. Fortsæt mashing, indtil den røde farve er væk fra silen.
- Sien kasseres, og røret drejes ved 500 × g i 5 minutter ved RT. Supernatanten fjernes med en sugepipette.
- Resuspender cellepillen i 5 ml (i op til tre milt) ACK-lysisbuffer forvarmet til RT og lysér de røde blodlegemer i 4 minutter. Forøg lydstyrken med 1-2 ml pr. Milt, hvis der er behov for yderligere milt.
- Stop reaktionen med 5 ml NIT-1-cellemedier (beskrevet ovenfor) pr. 5 ml lysisbuffer. Før cellesuspensionen gennem en frisk sil for at fjerne klumper. Kassér sien, og drej ved 500 × g i 5 minutter ved RT.
- Resuspender cellepillen i 20 ml PBS, og tæl cellerne. Spin ved 500 × g i 5 minutter ved RT. Resuspender cellerne i steril PBS i en koncentration på 1 × 108 celler/ml (injektionsvolumen er 0,1 ml/mus) i et 1,5 ml safe-lock reaktionsrør.
- Opbevar cellerne på is (i højst 1 time) eller hold cellerne ved RT, og fortsæt straks til haleveneinjektionen.
5. Intravenøs injektion af diabetiske splenocytter via den laterale halevene
- Opvarm kroppen af de voksne modtager NOD-scid mus (fx ved at bruge en varmelampe i ~ 5-10 min) for at vasodilate venerne (dette hjælper med visualisering og injektion i venen).
BEMÆRK: For at undgå overophedning af musene må du ikke overskride denne tid. Overvåg altid sundhedsstatus. Hvis musene virker udmattede eller immobile, skal du straks slukke for varmelampen. - Opvarm cellesuspensionen. Klargør en steril sprøjte (0,3-1,0 ml) med en steril kanyle (27-30 g, 0,3 mm/0,5 tommer eller mindre), eller brug en steril 0,5 ml insulinsprøjte med en 0,3 mm (0,5 tommer) kanyle. Hold altid kanylen steril og brug en steril bakke, hvis sprøjten skal lægges ned mellem injektionerne.
- Splenocytopløsningen resuspenderes før hver injektion. For hver mus trækkes 100 μL af den forvarmede og blandede splenocytsuspension ind i sprøjten. Sørg for, at der ikke er luftbobler i sprøjten eller suspensionen.
BEMÆRK: Sørg for at have alt udstyr og forsyninger klar (spritservietter til desinfektion, en sprøjte fyldt med splenocytterne, der skal injiceres, og et frisk bur til adskillelse af injicerede mus), før du placerer musen i fastholdelsesanordningen. - Anbring musen i fastholdelsesanordningen. Fang halen med den ikke-dominerende hånd, og find en af de to laterale haleårer. Drej forsigtigt halen, hvis det er nødvendigt. Tør halen af med en desinfektionsserviet (70% isopropylalkohol) for at rense huden og øge venens synlighed.
- Indsæt nålen i en spids vinkel i det centrale område af halen med den dominerende hånd. Med nålens skråning opad skubbes nålen et par millimeter gennem huden.
BEMÆRK: Sørg for, at nålen er parallel med venen og placeres lidt under huden. Vær forberedt på pludselige bevægelser af musen/halen direkte efter at være trængt ind i hudens/karvæggen. En vellykket indsættelse af nålen skal føles som et "glat glid" i venen. Hvis der er behov for et andet forsøg, skal du bevæge dig længere op ad halen mod kroppen. - Tryk let på sprøjten for at injicere splenocytsuspensionen. Lad ikke nålen bevæge sig længere ind eller ud, når du injicerer. Vellykkede injektioner er glatte uden at føle noget modtryk under injektionen og indikeres af en gennemsigtig/hvid blodgennemstrømning umiddelbart efter injektionen.
- Slip forsigtigt nålen ud af venen, og påfør let tryk på halen med en desinfektionsserviet, indtil blødningen stopper. Frigør musen fra fastholdelsesanordningen, og overfør den forsigtigt til et frisklavet bur.
BEMÆRK: Injicer to til tre kontrolmus, der ikke modtager en NIT-1-celletransplantation med splenocytter for at bekræfte potentialet for de autoreaktive splenocytter til at fremkalde diabetes, hvilket tager cirka 2-4 uger efter injektion.
6. In vivo bioluminescerende billeddannelse af NIT-1-transplantater
BEMÆRK: Afbild transplantaterne en til to gange om ugen. På transplantationsdagen skal du vente mindst 2 timer efter transplantationen for at lade transplantaterne sætte sig og sikre stabil luciferase-ekspression. Hvis tiden er en begrænsende faktor, kan den indledende måling foretages på dag 1 i stedet. En anbefalet indledende billeddannelsesplan er dag 0 eller dag 1 efter injektion, dag 5, dag 10, dag 14, dag 18 og dag 25. Juster tidsplanen baseret på udviklingen af autoimmunitet bedømt ud fra tabet af bioluminescerende signal.
- Forbered en 15 mg/ml D-luciferinopløsning i Dulbeccos PBS. Omrystes ved RT for at opløse og sterilfilter (0,22 μm). Opbevar 1 ml alikvoter ved -20 °C, og tø op efter behov.
BEMÆRK: Alikvoterne kan genfryses. - Mindst 5 minutter før billeddiagnostik injiceres musene intraperitonealt ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en 26 G kanyle med D-luciferinopløsning i en dosis på 150 mg/kg.
BEMÆRK: Brug en frisk sprøjte og nål til hver mus. - Bedøv musene ved indånding af isofluran i henhold til institutionelle retningslinjer. De anbefalede betingelser er 2,5 % isofluran med en gennemstrømningshastighed på 1,5 l/min ind i knockdownkammeret og en evakueringshastighed på 9 l/min.
- Smør dyrets øjne med oftalmisk salve for at forhindre tørring.
- Åbn den software, der er knyttet til billeddannelsesinstrumentet. Opret en ny bruger og/eller login. På kontrolpanelet nederst til højre skal du vælge Initialiser (figur 2A). Hvis du vil gemme billeddataene automatisk , skal du oprette de relevante mapper på computeren og derefter vælge Anskaffelse | Gem automatisk til... (Figur 2A). Når instrumentet er færdig med initialisering, skal du indstille eksponeringstiden til 1 min.
BEMÆRK: De komplette billeddannelsesparametre er vist i figur 2B. - Overfør musene en ad gangen fra knockdown-kammeret til billeddannelsesinstrumentet. Placer musen på maven med lemmerne spilede, og før forsigtigt hovedet ind i næsekeglen. En isofluran strømningshastighed på 0,25 l / min leveret via en næsekegle er passende for at opretholde anæstesi under billeddannelse. Flad forsigtigt musen ud ved at trykke midt på ryggen med begge hænder og derefter sprede hænderne udad og fra hinanden.
- Vælg Hent (figur 2B). Registrer alle relevante oplysninger om eksperimentet i pop op-vinduet (figur 2C).
BEMÆRK: Se figur 3A for repræsentative billeder af tre 8 uger gamle kvindelige NOD-scid-mus, der transplanteres med to transplantater på forskellige tidspunkter.
Figur 2: Skærmbilleder af softwarekommandoerne til billeddannelse af bioluminescerende transplantater . (A) Før billeddannelse skal du vælge Initialiser for at forberede instrumentet. Billederne gemmes muligvis automatisk i en valgt mappe ved at vælge Anskaffelse | Gem automatisk til... B) Oversigt over billeddannelsesparametrene. Når musen er placeret i instrumentet, skal du vælge Ansk. (C) Skærmbillede af dialogboksen, der dukker op under billeddannelse. Detaljer såsom tidspunkt og musestamme kan indtastes her. Klik her for at se en større version af denne figur.
7. Analyse af data
- Kvantificer det bioluminescerende signal når som helst efter billeddannelse. Åbn den software, der er knyttet til billeddannelsesinstrumentet. Vælg fil | Åbn, og vælg ClickInfo.txt fil , der er knyttet til musen, der skal analyseres.
- I værktøjspaletten skal du vælge ROI-værktøjer (figur 3B, trin 1). Fra den ovale rullemenu (figur 3B, trin 1, rød pil) skal du vælge antallet af transplantater, der blev transplanteret i musen.
- Flyt ovalerne, så de indeholder det bioluminescerende signal fra hvert transplantat, og vælg Mål ROI'er (figur 3B, trin 2).
- Registrer det samlede antal for hvert transplantat (figur 3B, trin 3).
- For hvert transplantat divideres det bioluminescerende signal, der måles på hvert tidspunkt, med det signal, der måles på det første tidspunkt. Rapportér transplantatoverlevelsen som andelen eller procentdelen af det resterende bioluminescerende signal i forhold til det oprindelige bioluminescerende signal.
BEMÆRK: Hvis transplantaterne udvides efter transplantation, vil forholdet eller procentdelen af transplantatoverlevelse være større end henholdsvis 1 eller 100%. Alle mus, der modtager transplantationer, bør overvåges for sundhedsskadelige virkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversigt over protokollen er skitseret i figur 1. Overlevelsen af to cellelinjer, såsom en mutant og en ikke-målrettet kontrol, kan sammenlignes, eller overlevelsen af en cellelinje kan måles i flere grupper af mus, såsom lægemiddelbehandlede mus versus køretøjsbehandlede kontroller. Figur 3A viser tre 8 uger gamle kvindelige NOD-scid mus transplanteret med en ikke-målrettet kontrol (venstre) og en mutant (højre) cellelinje. Musene blev også injiceret intravenøst med autoreaktive splenocytter for at overføre diabetes.
Musene blev afbildet på dag 0, dag 5, dag 10, dag 14 og dag 18 efter injektion. I to ud af de tre mus blev kontroltransplantatet ødelagt på dag 18, hvilket fremgår af tabet af bioluminescerende signal, mens det mutante transplantat blev beskyttet. I en mus blev det mutante transplantat, men ikke kontroltransplantatet, ødelagt, hvilket fremhævede den biologiske variation mellem dyr. Det bioluminescerende signal blev kvantificeret som beskrevet i figur 3B. Transplantatoverlevelsen rapporteres som procentdelen af resterende bioluminescerende signal sammenlignet med det første tidspunkt (figur 3C). Det er også nyttigt at beregne forholdet mellem mutant til styring af selvlysende signaler for hver mus for at visualisere variationen mellem dyr (figur 3D). I slutningen af dataindsamlingsperioden blev musene aflivet ved CO2 -indånding efterfulgt af cervikal dislokation.
Før sygdomsoverførsel kan de transplanterede celler replikere, hvilket resulterer i udvidede transplantater, der er synlige gennem huden (figur 4A). Disse transplantater vil have mættede bioluminescerende signaler, når de afbildes (figur 4B), som muligvis ikke er nøjagtigt kvantificeret.
Figur 3: Repræsentative billeder og kvantificering af det bioluminescerende signal . (A) Tre 8 uger gamle kvindelige NOD-scid mus blev transplanteret med ikke-målrettet kontrol (højre) og mutante celler (venstre) og intravenøst injiceret med autoreaktive splenocytter for at fremkalde diabetes. Musene blev ikke-invasivt afbildet på dag 0, dag 5, dag 10, dag 14 og dag 18 efter injektion. Det bioluminescerende signal er illustreret af et farvespektrum, der spænder fra lav intensitet (blå) til høj intensitet (rød). B) Instruktioner til kvantificering af bioluminescerende signal. (C) Gennemsnitlig procentdel af transplantatluminescens, der er tilbage over tid. D) Forholdet mellem procentdelen af transplantatluminescens over tid for mutante versus ikke-målretningskontroltransplantater for hver mus. Ratio = 1 angiver tidspunkter, hvor procentdelen af det resterende signal er ens for begge transplantater. Forkortelser: NOD = ikke-overvægtig diabetiker; scid = svær kombineret immundefekt; NTC = ikke-målrettet kontrol Mut = mutant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempler på transplantater, der er for udvidede. (A) Udvidede transplantater kan bule ud gennem musens hud (angivet med den røde pil). (B) Udvidede transplantater kan give mættede bioluminescerende signaler. Det bioluminescerende signal er illustreret af et farvespektrum, der spænder fra lav intensitet (blå) til høj intensitet (rød). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: pLenti-luciferase-blast sekvens. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T1D er en ødelæggende sygdom, som der i øjeblikket ikke findes nogen kur mod. Betacellesubstitutionsterapi tilbyder en lovende behandling for patienter med denne sygdom, men den kritiske barriere for denne strategi er potentialet for tilbagevendende autoimmune angreb mod de transplanterede betaceller. Gensplejsning af SC-beta-celler for at reducere deres immunsynlighed eller modtagelighed er en potentiel løsning på dette problem. Beskrevet her er en protokol for ikke-invasivt billeddannelse transplanterede betaceller til at måle deres overlevelse i en adoptiv overførselsmodel af autoimmun diabetes hos mus.
En vigtig fordel ved denne metode er protokollens tilpasningsevne. Metoden anvendes her til at sammenligne en mutant cellelinje med en ikke-målrettet kontrol (figur 3), men protokollen kan rumme en række eksperimentelle spørgsmål. De beskyttende virkninger af en lang række genetiske modifikationer, lægemidler eller andre behandlinger mod autoimmune angreb kunne undersøges. Ved evaluering af effektiviteten af et lægemiddel eller anden behandling til beskyttelse mod autoimmunitet er kun celler, der udtrykker luciferase uden yderligere genetiske modifikationer, nødvendige. Mens syngeneiske transplantationer til test af autoimmun beskyttelse anvendes i dette papir, kan metoden også tilpasses til at evaluere alloimmun afstødning ved hjælp af en kombination af en cellelinje og en musestamme, der ikke er syngeneisk, såsom NIT-1-celler og C57BL/6J-mus. Protokollen kan også ændres for at udforske immuninfiltration i transplantaterne. Yderligere mus, hvorfra transplantater udtages på forskellige tidspunkter, kan inkluderes, og de infiltrerende immunceller kan profileres ved immunhistokemi eller flowcytometri.
En væsentlig begrænsning ved anvendelsen af denne metode er, at resultaterne opnået i mus ikke oversættes til humane celler og patienter. Over 500 strategier for autoimmun beskyttelse er blevet implementeret med succes i diabetiske musemodeller, men flertallet har undladt at demonstrere klinisk fordel7. Primære menneskelige øer er imidlertid en begrænset ressource, og stamcellearbejde har høje økonomiske og lønomkostninger. Protokollen beskrevet her er et værktøj til foreløbig identifikation af potentielle terapeutiske mål ved hjælp af en relativt billig og enkel museteknik. Efterfølgende forsøg bør udføres med primære og/eller SC-øer, som typisk transplanteres under nyrekapslen hos mus. Metoden beskrevet her kan tilpasses til at evaluere effekten af terapeutiske strategier i humane celler. Både primære øer og SC-øer kan konstrueres til at udtrykke luciferase, og deres overlevelse kan måles ved bioluminescerende billeddannelse efter transplantation under nyrekapslen i humaniserede musemodeller12,13. Metoder til ikke-invasiv overvågning af overlevelsen af øtransplantater, der transplanteres på iris i øjet ved konfokalmikroskopi, er også blevet rapporteret14.
En yderligere begrænsning forbundet med metoden beskrevet i dette papir er variationen i det autoreaktive potentiale af isolerede splenocytter. Selvom hastigheden af sygdomsoverførsel er høj10, kan tidslinjen for diabetesdebut efter splenocytinjektion variere fra 2 uger til 4 uger. I løbet af denne tid kan de transplanterede celler udvide sig (figur 4), hvilket resulterer i hyperinsulinæmi og alvorlig hypoglykæmi. Kombination af splenocytter fra flere diabetiske donormus kan reducere variationen mellem eksperimenter.
På trods af disse begrænsninger er metoden et ligetil og informativt værktøj til test af strategier for autoimmun beskyttelse. Protokollen anvender grundlæggende klonings- og cellekulturteknikker, en simpel og minimalt invasiv musekirurgi og ikke-invasiv billeddannelse, så brugeren kan maksimere dataindsamlingen, samtidig med at antallet af dyr, der er nødvendige pr. Forsøg, minimeres. Som et alternativ til in vivo bioluminescerende billeddannelse kan transplantater genvindes på forskellige tidspunkter, vejes, fotograferes og viderebehandles til immuncellekarakterisering. Denne strategi kræver et større antal mus, da transplantatgendannelse kræver eutanasi, og det er ønskeligt at have replikater på hvert tidspunkt. Derudover tillader transplantathentningsmetoden, at der kun tages en størrelsesmåling pr. Transplantat. Da tidslinjen for betacelledrab ved autoreaktive splenocytter varierer på tværs af individer, kan det være svært at bestemme det optimale tidspunkt for transplantatgendannelse. Den tilgang, der er beskrevet i dette papir, gør det muligt for forskeren at overvåge udviklingen af autoimmunitet hos levende mus og opnå en komplet tidslinje for transplantatdestruktion. Så længe mus opretholder euglykæmi, kan beskyttede transplantater efterlades i musene og afbildes over lange perioder for at belyse graden af beskyttelse.
Beskrevet her er en ligetil protokol til transplantation og ikke-invasivt billeddannelse betacelletransplantater i en adoptiv overførselsmusemodel af autoimmun diabetes. Denne metode gør det muligt at anvende et minimalt antal dyr og giver fleksibilitet i timingen af transplantatanalyse, hvilket er kritisk i betragtning af variationen i udviklingen af autoimmunitet. Protokollen kan også let tilpasses til at behandle en lang række eksperimentelle spørgsmål. Musemodeller er afgørende for opdagelsen og valideringen af nye terapeutiske strategier, og denne metode er et værdifuldt værktøj til at fremme betacelleerstatningsterapifeltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Erica P. Cai og Dr. Yuki Ishikawa for at udvikle metoden beskrevet i denne protokol (se ref. 11). Forskning i S.K. og P.Y.'s laboratorier støttes af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Stem Cell Institute og Beatson Foundation. T.S. blev støttet af et postdoc-stipendium fra National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), og K.B. blev delvist støttet af et stipendium fra Mary K. Iacocca Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
References
- Katsarou, A., et al.
- Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C.
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire. , Available from: https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes (2021).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic β-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors. Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).
- Cai, E. P., et al. Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes. Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).
- Parent, A. V., et al. Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection. Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).
- Brehm, M. A., et al. Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression. FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).
- Abdulreda, M. H., et al. In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice. Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).
