Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מערכת מציאות מדומה בקוד פתוח למדידת למידה מרחבית בעכברים מרוסני ראש

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64863
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Division of Systems Neuroscience, New York State Psychiatric Institute, 2Department of Psychiatry, Columbia University

Summary

כאן, אנו מציגים הגדרת חומרה ותוכנה פשוטה בקוד פתוח לחקר למידה מרחבית של עכברים באמצעות מציאות מדומה (VR). מערכת זו מציגה מסלול ליניארי וירטואלי לעכבר מרוסן ראש הפועל על גלגל באמצעות רשת של מיקרו-בקרים ומחשב לוח יחיד המריץ חבילת תוכנה גרפית קלה לשימוש של Python.

Abstract

ניסויים התנהגותיים מרוסני ראש בעכברים מאפשרים למדעני מוח לצפות בפעילות המעגלים העצביים באמצעות כלי הדמיה אלקטרופיזיולוגיים ואופטיים ברזולוציה גבוהה, תוך מתן גירויים חושיים מדויקים לחיה המתנהגת. לאחרונה, מחקרים בבני אדם ובמכרסמים המשתמשים בסביבות מציאות מדומה (VR) הראו כי מציאות מדומה היא כלי חשוב לחשיפת המנגנונים העצביים העומדים בבסיס למידה מרחבית בהיפוקמפוס ובקליפת המוח, בשל השליטה המדויקת ביותר על פרמטרים כגון רמזים מרחביים והקשריים. עם זאת, הקמת סביבות וירטואליות להתנהגויות מרחביות של מכרסמים יכולה להיות יקרה ולדרוש רקע נרחב בהנדסה ובתכנות מחשבים. כאן, אנו מציגים מערכת פשוטה אך רבת עוצמה המבוססת על חומרה ותוכנה זולות, מודולריות, קוד פתוח, המאפשרת לחוקרים לחקור למידה מרחבית בעכברים מרוסנים באמצעות סביבת VR. מערכת זו משתמשת במיקרו-בקרים מצומדים כדי למדוד תנועה ולספק גירויים התנהגותיים בזמן שעכברים מרוסנים בראשם רצים על גלגל בתיאום עם סביבת מסלול ליניארית וירטואלית המעובדת על ידי חבילת תוכנה גרפית הפועלת על לוח יחיד. הדגש על עיבוד מבוזר מאפשר לחוקרים לתכנן מערכות גמישות ומודולריות שיעוררו וימדדו התנהגויות מרחביות מורכבות בעכברים כדי לקבוע את הקשר בין פעילות המעגלים העצביים לבין למידה מרחבית במוח היונקים.

Introduction

ניווט מרחבי הוא התנהגות חשובה מבחינה אתולוגית שבאמצעותה בעלי חיים מקודדים את התכונות של מיקומים חדשים למפה קוגניטיבית, המשמשת למציאת אזורי תגמול אפשריים והימנעות מאזורי סכנה פוטנציאליים. התהליכים הקוגניטיביים שבבסיס הניווט המרחבי, הקשורים קשר בל יינתק לזיכרון, חולקים מצע עצבי בהיפוקמפוס1 ובקליפת המוח, כאשר מעגלים עצביים באזורים אלה משלבים מידע נכנס ויוצרים מפות קוגניטיביות של סביבות ואירועים לצורך היזכרות מאוחרת יותר2. בעוד שהגילוי של תאי מקום בהיפוקמפוס3,4 ותאי רשת בקליפת המוח האנטורינלית5 שפך אור על האופן שבו המפה הקוגניטיבית בתוך ההיפוקמפוס נוצרת, שאלות רבות נותרו לגבי האופן שבו תת-סוגים עצביים ספציפיים, מיקרו-מעגלים ותת-אזורים בודדים של ההיפוקמפוס (הבליטה המשוננת, ואזורי האמוניס הקרניים, CA3-1) מתקשרים ומשתתפים בהיווצרות זיכרון מרחבי ובהיזכרות.

דימות דו-פוטוני In vivo היה כלי שימושי בחשיפת דינמיקה תאית ואוכלוסייה בנוירופיזיולוגיה חושית 6,7; עם זאת, הצורך האופייני בריסון ראש מגביל את התועלת של שיטה זו לבחינת התנהגות מרחבית של יונקים. הופעתה של מציאות מדומה (VR)8 טיפלה בחסרון זה על ידי הצגת סביבות חזותיות-מרחביות אימרסיביות ומציאותיות, בזמן שעכברים מרוסני ראש רצים על כדור או הליכון כדי לחקור קידוד מרחבי והקשרי בהיפוקמפוס 8,9,10 ובקליפת המוח 11. יתר על כן, השימוש בסביבות VR עם עכברים מתנהגים איפשר לחוקרי מדעי המוח לנתח את מרכיבי ההתנהגות המרחבית על ידי שליטה מדויקת באלמנטים של סביבת VR12 (למשל, זרימה חזותית, אפנון הקשרי) בדרכים שאינן אפשריות בניסויים בעולם האמיתי של למידה מרחבית, כגון מבוך המים מוריס, מבוך בארנס או משימות לוח חורים.

סביבות VR חזותיות מעובדות בדרך כלל על יחידת העיבוד הגרפי (GPU) של המחשב, אשר מטפלת בעומס של מחשוב מהיר של אלפי מצולעים הדרושים כדי למדל סביבה תלת-ממדית נעה על מסך בזמן אמת. דרישות העיבוד הגדולות דורשות בדרך כלל שימוש במחשב נפרד עם GPU שמעבד את הסביבה החזותית לצג, מסכיםמרובים 13 או מקרן14 כאשר התנועה נרשמת מהליכון, גלגל או כדור קצף מתחת לחיה. המנגנון המתקבל לשליטה, עיבוד והקרנה של סביבת VR הוא, אם כן, יקר יחסית, מגושם ומסורבל. יתר על כן, סביבות רבות כאלה בספרות יושמו באמצעות תוכנה קניינית שהיא גם יקרה וגם ניתנת להרצה רק על מחשב ייעודי.

מסיבות אלה, תכננו מערכת VR בקוד פתוח לחקר התנהגויות למידה מרחביות בעכברים מרוסנים באמצעות מחשב לוח יחיד Raspberry Pi. מחשב לינוקס זה הוא גם קטן וגם זול אך מכיל שבב GPU לעיבוד תלת מימד, המאפשר שילוב של סביבות VR עם התצוגה או המנגנון ההתנהגותי בתצורות אינדיבידואליות מגוונות. יתר על כן, פיתחנו חבילת תוכנה גרפית הכתובה בפייתון, "HallPassVR", המשתמשת במחשב לוח יחיד כדי לעבד סביבה חזותית מרחבית פשוטה, מסלול ליניארי וירטואלי או מסדרון, על ידי שילוב מחדש של תכונות חזותיות מותאמות אישית שנבחרו באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI). זה משולב עם תת-מערכות מיקרו-בקרים (למשל, ESP32 או Arduino) כדי למדוד תנועה ולתאם התנהגות, כגון על ידי מתן שיטות אחרות של גירויים חושיים או תגמולים כדי להקל על למידה חיזוק. מערכת זו מספקת שיטה חלופית זולה, גמישה וקלה לשימוש לאספקת סביבות VR חזותיות-מרחביות לעכברים מרוסני ראש במהלך דימות של שני פוטונים (או טכניקות אחרות הדורשות קיבוע ראש) לחקר המעגלים העצביים העומדים בבסיס התנהגות למידה מרחבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הפסיכיאטרי של מדינת ניו יורק.

הערה: מחשב לוח יחיד משמש להצגת סביבה חזותית של מציאות מדומה המתואמת עם הפעלת עכבר מרוסן ראש על גלגל. מידע התנועה מתקבל כקלט טורי ממיקרו-בקר ESP32 הקורא מקודד סיבובי המחובר לסרן הגלגלים. סביבת המציאות המדומה מעובדת באמצעות האצת חומרה OpenGL במעבד הגרפי Raspberry Pi, המשתמש בחבילת pi3d Python 3D עבור Raspberry Pi. לאחר מכן, הסביבה המעובדת מופקת באמצעות מקרן על גבי מסך פרבולי קומפקטי עוטף שבמרכזו שדה הראייה15,16 של העכבר מרוסן הראש, בעוד שההתנהגות (למשל, ליקוק בתגובה לתגמולים מרחביים) נמדדת על ידי מיקרו-בקר ESP32 בעל התנהגות שנייה. חבילת התוכנה הגרפית מאפשרת יצירת סביבות מסלול ליניאריות וירטואליות המורכבות מדפוסים חוזרים ונשנים של גירויים חזותיים לאורך מסדרון וירטואלי או מסדרון עם ממשק משתמש גרפי (GUI). עיצוב זה קל לפרמטרים ובכך מאפשר יצירת ניסויים מורכבים שמטרתם להבין כיצד המוח מקודד מקומות ורמזים חזותיים במהלך למידה מרחבית (ראו סעיף 4). עיצובים עבור רכיבי החומרה המותאמים אישית הדרושים למערכת זו (כלומר, גלגל הריצה, מסך ההקרנה ומנגנון ריסון הראש) מופקדים במאגר GitHub ציבורי (https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR). מומלץ לקרוא את התיעוד של אותו מאגר יחד עם פרוטוקול זה, שכן האתר יעודכן בשיפורים עתידיים של המערכת.

1. הגדרת חומרה: בניית גלגל הריצה, מסך ההקרנה ומנגנון קיבוע הראש

הערה: ניתן לייצר בקלות את הרכיבים המותאמים אישית עבור הגדרות אלה אם למשתמש יש גישה לציוד הדפסה בתלת-ממד וחיתוך לייזר, או אם ניתן להעביר אותם למיקור חוץ לייצור מקצועי או לשירותי אב טיפוס תלת-ממדיים (לדוגמה, eMachinehop). כל קבצי העיצוב מסופקים כ- . קבצי STL 3D או . קובצי DXF AutoCAD.

  1. גלגל ריצה ומערך התנהגותי (איור 1)
    הערה: הגלגל מורכב מצילינדר אקרילי שקוף (6 בקוטר, 3 ברוחב, 1/8 עובי) שבמרכזו סרן התלוי מתושבות אקריליות חתוכות לייזר באמצעות מיסבים כדוריים. לאחר מכן מכלול הגלגלים מורכב על מסגרת אלומיניום קלת משקל (חריץ t) ומהודק היטב ללוח לחם אופטי (איור 1C-E).
    1. חתכו בלייזר את דפנות תושבות הגלגל והסרן מ-1/4 יריעה אקרילית, וחברו את דפנות הגלגלים לגליל האקרילי במלט אקרילי. הברג את אוגן הסרן למרכז החלק הצדדי של הגלגל.
    2. הכנס את הסרן לאוגן מרכז הגלגל, הצמד את המסבים הכדוריים לתושבות הסרן וחבר אותם למוט התמיכה האנכי מאלומיניום.
    3. הכנס את סרן הגלגל למיסבים הכדוריים המותקנים והשאיר 0.5-1 אינץ 'של הסרן מעבר למיסבים לחיבור המקודד הסיבובי.
    4. חבר את תושבת המקודד הסיבובי לקצה הסרן מול הגלגל, והכנס את המקודד הסיבובי; לאחר מכן, השתמש במצמד הפיר כדי להצמיד את סרן הגלגל לפיר המקודד הסיבובי.
    5. חבר את יציאת הליקוק לזרוע הגמישה, ולאחר מכן הצמד למסגרת גלגל האלומיניום עם אומי חריץ t. השתמש בצינורות בגודל 1/16 אינץ 'כדי לחבר את יציאת הליקוק לשסתום הסולנואיד ואת השסתום למאגר המים.
      הערה: יציאת הליקוק חייבת להיות עשויה מתכת עם חוט מולחם כדי לחבר אותה לפינים קיבוליים של חישת מגע של ההתנהגות ESP32.
  2. מסך הקרנה
    הערה: מסך VR הוא מסך הקרנה אחורי פרבולי קטן (גודל קנבס: 54 ס"מ x 21.5 ס"מ) המבוסס על עיצוב שפותח במעבדה של כריסטופר הארווי15,16. זווית ההקרנה (אבן הטרפז) של מקרן ה-LED שבו נעשה שימוש שונה מזו של מקרן הלייזר ששימש בעבר; לכן, העיצוב המקורי משתנה מעט על-ידי הרכבת היחידה מתחת למסך ופישוט מערכת המראה (איור 1A, B). קריאת התיעוד של מעבדת הארווי יחד עם שלנו מומלצת מאוד כדי להתאים את סביבת המציאות המדומה לצרכי המשתמש15.
    1. חתכו בלייזר את דפנות מסך ההקרנה מ-1/4 ביריעות אקריליק שחורות מט. חתכו בלייזר את מראה ההקרנה האחורית מ-1/4 באקריליק משוקף.
    2. הרכיבו את מסגרת מסך ההקרנה עם פסי האלומיניום, וחתכו בלייזר את לוחות האקריל.
    3. הכנס את חומר מסך ההקרנה השקוף לחריץ הפרבולי במסגרת. הכנס את מראה ההקרנה האחורית לחריץ בחלק האחורי של מסגרת מסך ההקרנה.
    4. מקם מקרן LED בלוח ההרכבה התחתון בתוך מסגרת מסך ההקרנה. ישר את המקרן עם ברגי הרכבה כדי למטב את מיקום התמונה המוקרנת במסך ההקרנה הפרבולי האחורי.
    5. אטמו את יחידת קופסת המקרן כדי למנוע זיהום אור של החיישנים האופטיים במידת הצורך.
  3. מנגנון ריסון ראש
    הערה: עיצוב זה של מנגנון ריסון ראש מורכב משתי סעפות משולבות המודפסות בתלת-ממד לאבטחת עמוד ראש מתכת (איור 1E, F).
    1. באמצעות מדפסת תלת-ממד SLM ברזולוציה גבוהה, הדפס בתלת-ממד את עמוד הראש האוחז בזרועות.
      הערה: פלסטיק מודפס שרף מסוגל לספק קיבוע ראש יציב לניסויי התנהגות; עם זאת, כדי להשיג יציבות מרבית עבור יישומים רגישים כמו הקלטה של תא בודד או הדמיה של שני פוטונים, מומלץ להשתמש בחלקי מתכת מעובדים (למשל, eMachineShop).
    2. התקן את מחזיק עמוד הראש המודפס בתלת-ממד על גוניומטר דו-צירי עם עמודי הרכבה אופטיים, כך שניתן יהיה להטות את ראש החיה כדי ליישר את ההכנה.
      הערה: תכונה זו הכרחית לניסויי הדמיה ארוכי טווח in vivo כאשר נדרש למצוא את אותה אוכלוסיית תאים במפגשי הדמיה עוקבים. אחרת, ניתן להשמיט תכונה זו כדי להפחית את עלות ההתקנה.
    3. לייצר את עמודי הראש.
      הערה: שני סוגים של עמודי ראש בעלי מורכבות (ומחיר) שונים מופקדים בקישור המופיע בטבלת החומרים יחד עם הוראות אלה.
      1. בהתאם לסוג הניסוי, החליטו איזה עמוד ראש ליישם. מוטות הראש עשויים מפלדת אל-חלד והם בדרך כלל במיקור חוץ לכל חנות מכונות מקומית או שירות מקוון (למשל, eMachineShop) לייצור.

2. הגדרת חומרה/תוכנה אלקטרונית (מחשב לוח יחיד, מיקרו-בקרים ESP32, איור 2)

  1. הגדר את תצורת המחשב על לוח יחיד.
    הערה: המחשב על לוח יחיד הכלול בטבלת החומרים (Raspberry Pi 4B) הוא אופטימלי עבור הגדרה זו מכיוון שיש לו GPU מובנה כדי להקל על עיבוד סביבת VR ושתי יציאות HDMI לבקרה/ניטור ניסויים והקרנת VR. מחשבים אחרים בעלי לוח יחיד בעלי מאפיינים אלה עשויים להיות מוחלפים, אך חלק מההוראות הבאות עשויות להיות ספציפיות ל- Raspberry Pi.
    1. הורד את יישום ההדמיה של לוח יחיד למחשב והתקן את מערכת ההפעלה (כרגע Raspberry Pi OS r.2021-05-07) בכרטיס microSD (16+ GB). הכנס את הכרטיס ואתחל את המחשב על לוח יחיד.
    2. הגדר את המחשב על לוח יחיד עבור ספריית pi3d Python 3D: (שורת התפריטים) העדפות > תצורת Raspberry Pi.
      1. לחץ על הצג > מסך ריק > להשבית.
      2. לחץ על ממשקים > יציאה טורית > להפעיל.
      3. לחץ על Performance > GPU Memory > 256 (MB).
    3. שדרג את חבילת ספריית התמונות Python עבור pi3d: (טרמינל)> sudo pip3 התקן כרית --שדרוג.
    4. התקן את חבילת pi3d Python 3D עבור מחשב לוח יחיד: (מסוף)> sudo pip3 להתקין pi3d.
    5. הגדל את רמת פלט HDMI עבור המקרן: (טרמינל)> sudo nano /boot/config.txt, בטל תגובה config_hdmi_boost=4, שמור ואתחל מחדש.
    6. הורד והתקן את סביבת הפיתוח המשולבת (IDE) מ- arduino.cc/en/software (לדוגמה, arduino-1.8.19-linuxarm.tar.gz), הדרושה כדי לטעון את הקוד על המקודד הסיבובי ועל המיקרו-בקרים ESP32 של אופן הפעולה.
    7. התקן תמיכה במיקרו-בקר ESP32 ב- IDE:
      1. לחץ על File > Preferences > כתובות URL נוספות של מנהל הדירקטוריון = https://raw.githubusercontent.com/espressif/arduino-esp32/gh-pages/package_esp32_index.json
      2. לחץ על Tools > Boards > Boards Manager > ESP32 (by Espressif). התקן את v.2.0.0 (ההעלאה נכשלת כעת ב- v2.0.4).
    8. הורד והתקן את IDE עיבוד מ https://github.com/processing/processing4/releases (למשל, עיבוד-4.0.1-linux-arm32.tgz), אשר הכרחי עבור הקלטה ותכנון מקוון של התנהגות העכבר במהלך VR.
      הערה: ניתן להפעיל את סביבות הארדואינו והעיבוד במחשב נפרד מהמחשב בעל לוח VR יחיד, אם תרצה בכך.
  2. הגדר את חיבורי ESP32 של המקודד הסיבובי.
    הערה: המקודד הסיבובי המחובר לסרן הגלגל מודד את סיבוב הגלגל באמצעות תנועת עכבר, הנספרת באמצעות מיקרו-בקר ESP32. שינויי המיקום נשלחים לאחר מכן ליציאה הטורית GPIO של מחשב על לוח יחיד כדי לשלוט בתנועה בסביבה הווירטואלית באמצעות חבילת התוכנה הגרפית, כמו גם להתנהגות ESP32 כדי לשלוט באזורי התגמול (איור 2).
    1. חבר את החוטים בין רכיב המקודד הסיבובי לבין ESP32 הסיבובי. למקודדים סיבוביים יש בדרך כלל ארבעה חוטים: +, GND, A ו- B (שני קווים דיגיטליים למקודדים ריבועיים). חבר אותם באמצעות חוטי מגשר ל-ESP32 3.3 V, GND, 25, 26 (במקרה של הקוד המצורף).
    2. חבר את חוטי RX/TX הטוריים בין ESP32 הסיבובי לבין אופן הפעולה ESP32. צור חיבור פשוט של שני חוטים בין יציאת ESP32 Serial0 RX/TX סיבובית (קבלה/שידור) לבין יציאת Serial2 של אופן הפעולה ESP32 (TX/RX, פינים 17, 16; ראה יציאת Serial2 מימין ל- OMwSmall PCB). פעולה זו תישא מידע תנועתי מהמקודד הסיבובי למערך ההתנהגות עבור אזורים מרחביים כגון אזורי תגמול.
    3. חבר את חוטי RX/TX הטוריים בין ESP32 הסיבובי לבין GPIO של מחשב על לוח יחיד (או חיבור USB ישיר). צור חיבור דו-חוטי בין פיני GPIO 14, 15 (RX/TX) של המחשב על לוח יחיד לבין ESP32 Serial2 הסיבובי (TX/RX, פינים 17, 16). פעולה זו תישא מידע תנועה מהמקודד הסיבובי לחבילת התוכנה הגרפית הפועלת במחשב הלוח היחיד.
      הערה: שלב זה נחוץ רק אם ESP32 הסיבובי אינו מחובר באמצעות USB (כלומר, זהו חיבור טורי GPIO ב- "/dev/ttyS0"), אך אחרת יש לשנות את קוד HallPassVR_wired.py כדי להשתמש ב- "/dev/ttyUSB0". חיבור קווי זה יוחלף בחיבור Bluetooth אלחוטי בגרסאות עתידיות.
    4. חבר את ESP32 USB סיבובי למחשב על לוח יחיד, USB (או מחשב אחר שבו פועל ה- IDE) כדי להעלות את קוד המקודד הסיבובי הראשוני.
  3. הגדר את אופן הפעולה חיבורי ESP32 עם החומרה ההתנהגותית (באמצעות OpenMaze PCB).
    הערה: מיקרו-בקר ESP32 ישלוט בכל האינטראקציות של בעלי חיים שאינם VR (מתן גירויים ותגמולים שאינם VR, זיהוי ליקוקי עכברים), המחוברות באמצעות "לוח פריצה" כללי של PCB עבור ESP32, "OMwSmall", שעיצובים שלו זמינים דרך אתר OpenMaze (www.openmaze.org). ה- PCB מכיל את הרכיבים האלקטרוניים הדרושים להנעת הרכיבים האלקטרומכניים, כגון שסתומי הסולנואיד המשמשים למתן תגמולים נוזליים.
    1. חבר את שסתום הסולנואיד הנוזלי 12 V ליציאת המעגל-משולב ULN2803 בקצה השמאלי של לוח המעגלים המודפסים OMwSmall (סיכה 12 בהגדרה ובקוד לדוגמה). מעגל-משולב זה מחזיר הספק של 12 וולט לשסתום סולנואיד התגמול, הנשלט על ידי פלט GPIO במיקרו-בקר ESP32 ההתנהגותי.
    2. חבר את יציאת הליקוק לקלט המגע ESP32 (לדוגמה, T0, GPIO4 בקוד לדוגמה). ESP32 כולל חישת מגע קיבולית מובנית על פינים ספציפיים, שבה משתמש קוד ESP32 כדי לזהות ליקוק העכבר של יציאת ליקוק המתכת המחוברת במהלך התנהגות VR.
    3. חבר את חוטי RX/TX הטוריים בין אופן הפעולה ESP32 Serial2 (פינים 16, 17) לבין המקודד הסיבובי ESP32 Serial0 (ראה שלב 2.2.2).
    4. חבר את ה- USB ליציאת ה- USB של המחשב על לוח יחיד (או למחשב אחר) כדי להעלות תוכניות חדשות לאופן הפעולה ESP32 עבור פרדיגמות ניסוי שונות (לדוגמה, מספר/מיקום של אזורי תגמול) וללכוד נתוני התנהגות באמצעות סקיצה עיבוד כלולה.
    5. חבר את מתאם הקיר DC של 12 V למחבר שקע החבית בגודל 2.1 מ"מ ב- ESP32 OMwSmall PCB כדי לספק את הכוח לשסתום הסולנואיד המתגמל.
    6. חבר את יציאת HDMI #2 של המחשב על לוח יחיד ליציאת HDMI של המקרן; פעולה זו תישא את סביבת המציאות המדומה המעובדת על ידי המעבד הגרפי של המחשב על לוח יחיד למסך ההקרנה.
    7. (אופציונלי) חבר את חוט הסנכרון (פין 26) למערך הדמיה עצבית או הקלטה אלקטרופיזיולוגית. אות טרנזיסטור-טרנזיסטור-לוגיקה (TTL) של 3.3 וולט יישלח כל 5 שניות כדי ליישר את המערכות בדיוק של כמעט אלפית השנייה.
  4. הגדר את התוכנה: טען את הקושחה/התוכנה על המקודד הסיבובי ESP32 (איור 2B) ועל התנהגות ESP32 (איור 2E) באמצעות ה-IDE, והורד את תוכנת VR Python למחשב על לוח יחיד. ראה https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software.
    1. חבר תחילה את המקודד הסיבובי ESP32 ליציאת ה- USB של המחשב על לוח יחיד - זה ייקרא אוטומטית "/dev/ttyUSB0 " על ידי מערכת ההפעלה.
    2. טען את קוד המקודד הסיבובי: פתח את הקובץ RotaryEncoder_Esp32_VR.ino ב- IDE ולאחר מכן בחר את ESP32 תחת Tools > Boards > ESP32 Dev Module. בחר את יציאת ESP32 על-ידי לחיצה על כלים > יציאה > /dev/ttyUSB0 ולאחר מכן לחץ על העלה.
    3. חבר את אופן הפעולה ESP32 ליציאת ה- USB של המחשב על לוח יחיד הבא - זה ייקרא "/dev/ttyUSB1" על ידי מערכת ההפעלה.
    4. טען את קוד רצף ההתנהגות על ההתנהגות ESP32 (IDE, ESP32 Dev Module כבר נבחר), ולאחר מכן לחץ על Tools > Port > /dev/ttyUSB1, ולחץ על Upload: wheel_VR_behavior.ino.
    5. בדוק את החיבורים הטוריים על-ידי בחירת היציאה הטורית עבור כל ESP32 ב-IDE (Tools > Port > /dev/ttyUSB0 או /dev/ttyUSB1) ולאחר מכן לחיצה על Tools > Serial Monitor (קצב שידור: 115,200) כדי לצפות בפלט הטורי מהלוח הסיבובי (USB0) או מלוח ההתנהגות (USB1). סובב את הגלגל כדי לראות פלט תנועה גולמית מ- ESP32 הסיבובי ב- USB0 או פלט תנועה מעוצב מאופן הפעולה ESP32 ב- USB1.
    6. הורד את חבילת התוכנה הגרפית קוד Python מ- https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR/tree/master/software/HallPassVR (ל- /home/pi/Documents). תיקייה זו מכילה את כל הקבצים הדרושים להפעלת חבילת התוכנה הגרפית אם חבילת pi3d Python3 הותקנה כראוי קודם לכן (שלב 2.1).

3. הפעלה ובדיקה של חבילת התוכנה הגרפית

הערה: הפעל את ממשק המשתמש הגרפי של חבילת התוכנה הגרפית GUI כדי ליזום סביבת מסלול ליניארית של מציאות מדומה, לכייל את המרחקים בקוד ESP32 של תוכנת VR ואופן הפעולה שלה, ולבדוק את הרכישה והתוויית התכנון המקוונת של התנהגות הריצה והליקוק של העכבר באמצעות סקיצה שפת העיבוד הכלולה.

  1. פתח את חלון המסוף במחשב הלוח היחיד ונווט אל תיקיית HallPassVR (terminal:> cd /home/pi/Documents/HallPassVR/HallPassVR_Wired)
  2. הפעל את ממשק המשתמש הגרפי של מציאות מדומה: (טרמינל)> python3 HallPassVR_GUI.py (חלון ממשק המשתמש הגרפי ייפתח, איור 3A).
  3. תוכנה גרפית GUI
    1. בחר והוסף ארבעה אלמנטים (תמונות) מתיבת הרשימה (או בחר את התבנית המאוחסנת מראש למטה, ולאחר מכן לחץ על העלה) עבור כל אחת משלוש התבניות לאורך המסלול, ולאחר מכן לחץ על צור.
      הערה: ניתן למקם קובצי תמונה חדשים (.jpeg) בתיקייה HallPassVR/HallPassVR_wired/images/ELEMENTS לפני הפעלת ממשק המשתמש הגרפי.
    2. בחר תמונות רצפה ותקרה מהתפריטים הנפתחים, והגדר את אורך הרצועה כ- 2 מ' עבור קוד לדוגמה זה (עליו להיות שווה ל - trackLength במילימטרים [mm] בקוד ESP32 ובקוד העיבוד של אופן הפעולה).
    3. תן שם לתבנית זו אם תרצה (היא תאוחסן ב- HallPassVR_wired/images/PATH_HIST).
    4. לחץ על לחצן התחל (המתן עד שחלון המציאות המדומה יופעל לפני שתלחץ במקום אחר). סביבת המציאות המדומה תופיע במסך #2 (מסך הקרנה, איור 3B, C).
  4. הפעל את סקיצה עיבוד כדי לרכוש ולהתוות את הנתונים / התנועה ההתנהגותיים.
    1. פתח את VRwheel_RecGraphSerialTxt.pde ב - IDE העיבוד.
    2. שנה את החיה = "yourMouseNumber"; משתנה, ולהגדיר sessionMinutes שווה לאורך ההפעלה ההתנהגותית בדקות.
    3. לחץ על הפעל כפתור על עיבוד IDE.
    4. בדוק את חלון העלילה של עיבוד, שאמור להציג את מיקום העכבר הנוכחי על המסלול הליניארי הווירטואלי בזמן שהגלגל מסתובב, יחד עם אזורי התגמול והיסטוגרמות הריצה של הליקוקים, ההקפות והתגמולים המתעדכנים כל 30 שניות (איור 3D). קדם את גלגל הריצה ביד כדי לדמות את העכבר פועל לבדיקה, או השתמש בעכבר בדיקה להתקנה הראשונית.
    5. לחץ על חלון העלילה ולחץ על מקש q במקלדת כדי להפסיק לרכוש נתוני התנהגות. קובץ טקסט של האירועים והשעות ההתנהגותיים (בדרך כלל בגודל <2 MB לכל הפעלה) ותמונה של חלון העלילה הסופי (.png) נשמרים כאשר sessionMinutes חלף או כאשר המשתמש מקיש על מקש q כדי לצאת.
      הערה: בשל גודלם הקטן של קבצי .txt הפלט, ההערכה היא שניתן לאחסן לפחות כמה אלפי הקלטות התנהגות בכרטיס ה-SD של המחשב על לוח יחיד. ניתן לשמור קבצי נתונים בכונן אצבע לצורך ניתוח עוקב, או אם הם מחוברים לרשת מקומית, ניתן לנהל את הנתונים מרחוק.
  5. כייל את אורך מסלול ההתנהגות עם אורך מסלול VR.
    1. מקדמים את הגלגל ביד תוך התבוננות במסדרון המציאות המדומה ובמיקום העכבר (בחלקת העיבוד). אם מסדרון המציאות המדומה מסתיים לפני/אחרי שהעכבר מגיע לסוף תרשים ההתנהגות, הגדל/הקטן את אורך מסלול המציאות המדומה בהדרגה (HallPassVR_wired.py, corridor_length_default, בסנטימטרים [cm]) עד שהמסלול יתאפס בו זמנית בשתי המערכות.
      הערה: הקוד מכויל כעת עבור גלגל ריצה בקוטר 6 אינץ' באמצעות מקודד סיבובי ריבועי בעל 256 מצבים, כך שייתכן שהמשתמש יצטרך לשנות את קוד המציאות המדומה (HallPassVR_wired.py, corridor_length_default, בסנטימטרים [cm]) ואת קוד ההתנהגות (wheel_VR_behavior.ino, trackLength, במילימטרים [mm]) כדי להתחשב בתצורות אחרות. עם זאת, המיקום ההתנהגותי מתאפס בכל הקפה של מציאות מדומה כדי לשמור על התאמה בין המערכות.

4. אימון עכברים והתנהגות למידה מרחבית

הערה: העכברים מושתלים לקיבוע ראש, מורגלים לריסון ראש, ולאחר מכן מאומנים לרוץ על ההגה וללקק באופן עקבי לקבלת תגמולים נוזליים בהדרגה ("ליקוט אקראי"). עכברים שמשיגים ריצה וליקוק עקביים מאומנים לאחר מכן במשימת תגמול מרחבית נסתרת באמצעות סביבת VR, שבה אזור תגמול יחיד מוצג בעקבות רמז חזותי על המסלול הליניארי הווירטואלי. למידה מרחבית נמדדת אז כסלקטיביות ליקוק מוגברת לתנוחות שלפני אזור התגמול.

  1. ניתוח ראש לאחר השתלה: הליך זה מתואר בפירוט במקום אחר בכתב עת זה ובאחרים, לכן עיין בספרות זו לקבלת הוראות ספציפיות 7,17,18,19,20,21.
  2. לוח זמנים למים
    1. יש לבצע הגבלת מים 24 שעות לפני הטיפול הראשון (ראו להלן), ולאפשר צריכת מים לאחר כל מפגש של התרגלות או התנהגות מרוסנת של הראש. הפחיתו את זמן זמינות המים בהדרגה במשך שלושה ימים במהלך ההתרגלות לכ-5 דקות, והתאימו את הכמות לעכברים בודדים כך שמשקל גופם לא יירד מתחת ל-80% ממשקלם לפני ההגבלה. לפקח על המשקל של כל חיה מדי יום וגם לבחון את מצבו של כל עכבר עבור סימנים של התייבשות22. עכברים שאינם מסוגלים לשמור על 80% ממשקל גופם לפני ההגבלה או נראים מיובשים צריכים להיות מוסרים מהמחקר ולתת להם זמינות מים בחינם.
      הערה: הגבלת מים נחוצה כדי להניע את העכברים לרוץ על הגלגל באמצעות תגמולים נוזליים, כמו גם להשתמש בליקוק מרחבי כאינדיקציה למיקומים שנלמדו לאורך המסלול. ההנחיות המוסדיות עשויות להיות שונות בהוראות ספציפיות להליך זה, ולכן על המשתמש להתייעץ עם הוועדות המוסדיות האישיות שלו לטיפול בבעלי חיים כדי להבטיח את בריאותם ורווחתם של בעלי החיים במהלך הגבלת מים.
  3. טיפול: טפל בעכברים המושתלים מדי יום כדי להרגיל אותם למגע אנושי, ולאחר מכן ניתן לתת כמות מוגבלת של מים כחיזוק (1-5 דקות ביום, יומיים עד שבוע).
  4. התרגלות לריסון הראש
    1. הרגילו את העכברים לריסון הראש לפרקי זמן הולכים וגדלים על ידי הכנסתם למנגנון ריסון הראש תוך תגמול בטיפות מים מזדמנות כדי להפחית את הלחץ של קיבוע הראש.
    2. התחילו עם 5 דקות של קיבוע ראש, והגדילו את משך הזמן במרווחים של 5 דקות מדי יום עד שהעכברים מסוגלים לסבול קיבוע עד 30 דקות. הסר את העכברים ממנגנון הקיבוע אם נראה שהם נאבקים או זזים מעט מאוד. עם זאת, עכברים בדרך כלל מתחילים לרוץ על ההגה באופן ספונטני בתוך מספר מפגשים, מה שאומר שהם מוכנים לשלב הבא של האימון.
      הערה: עכברים שנאבקים שוב ושוב תחת ריסון ראש או שאינם רצים ומלקקים עבור תגמולים צריכים להיות נסוגים לשלבים מוקדמים יותר של אימון ולהיות מורחקים מהמחקר אם הם לא מצליחים להתקדם במשך שלושה מחזורים מתקנים כאלה (ראה טבלה 1).
  5. אימון ריצה/ליקוק (ליקוט אקראי)
    הערה: כדי לבצע את משימת הלמידה המרחבית בסביבת VR, על העכברים ללמוד תחילה לרוץ על ההגה וללקק באופן עקבי עבור תגמולים מזדמנים. ההתקדמות בפרמטרים ההתנהגותיים האופרנטיים נשלטת באמצעות מיקרו-בקר ESP32 התנהגותי.
    1. ליקוט אקראי עם תגמולים לא אופרנטיים
      1. הפעל את תוכנית ממשק המשתמש הגרפי של התוכנה הגרפית עם נתיב של רכיבים חזותיים שרירותיים (בחירת משתמש, ראה שלב 3.3).
      2. העלה את תוכנית ההתנהגות להתנהגות ESP32 עם תגמולים מרובים שאינם אופרנטיים (משתני קוד: isOperant=0, numRew=4, isRandRew=1) כדי להתנות את העכברים לרוץ וללקק. הריצו את העכברים בסשנים של 20-30 דקות עד שהעכברים רצו לפחות 20 הקפות בכל סשן וליקקו עבור פרסים המוצגים במקומות אקראיים (אחד עד ארבעה מפגשים).
    2. ליקוט אקראי עם תגמולים אופרנטיים בהקפות מתחלפות
      1. העלה את תוכנית ההתנהגות עם altOpt=1 (הקפות אופרנטיות/לא אופרנטיות לסירוגין), ואמן את העכברים עד שהם מלקקים עבור אזורי תגמול לא אופרנטיים ואופרנטיים (אחד עד ארבעה מפגשים).
    3. ליקוט אקראי אופרנטי לחלוטין
      1. העלה את תוכנית ההתנהגות עם ארבעה אזורי תגמול אקראיים אופרנטיים (משתני קוד ESP32 התנהגותיים: isOperant=1, numRew=4, isRandRew=1). בסוף שלב אימון זה, העכברים צריכים לרוץ באופן עקבי ולבצע ליקוקי מבחן לאורך כל המסלול (אימון אחד עד ארבעה מפגשים; איור 4A).
  6. למידה מרחבית
    הערה: בצע ניסוי למידה מרחבית עם אזור תגמול נסתר יחיד במרחק מה מרמז חזותי יחיד על-ידי בחירת מסדרון באורך 2 מ' עם לוחות כהים לאורך המסילה ולוח גירוי חזותי יחיד בעל ניגודיות גבוהה באמצע כרמז חזותי (מיקום של 0.9-1.1 מ'), בדומה לניסויים שנערכו לאחרונה עם רמזי ריח מרחביים20 . עכברים נדרשים ללקק באזור תגמול (במיקום של 1.5-1.8 מטר) הממוקם במרחק מהרמז החזותי בסביבת המסלול הליניארי הווירטואלי.
    1. הפעל את התוכנה הגרפית עם נתיב של מסדרון חשוך עם רמז חזותי יחיד במרכז (לדוגמה, לוח שחמט, ראה שלב 3.3, איור 3A).
    2. העלה את תוכנית ההתנהגות עם אזור תגמול מוסתר יחיד להתנהגות ESP32 (משתני קוד ESP32 של התנהגות: isOperant=1, isRandRew=0, numRew=1, rewPosArr[]= {1500}).
    3. הניחו את העכבר בעדינות במנגנון קיבוע הראש, התאימו את פיה הליקוק למיקום קדמי בלבד לפיו של העכבר ומקמו את גלגל העכבר במרכז אזור מסך ההקרנה. ודא שראש העכבר נמצא במרחק ~ 12-15 ס"מ מהמסך לאחר ההתאמות הסופיות.
    4. הגדר את שם בעל החיים בשרטוט העיבוד ולאחר מכן לחץ על הפעל במזהה העיבוד כדי להתחיל לרכוש ולהתוות את הנתונים ההתנהגותיים (ראה שלב 3.4).
    5. הפעל את העכבר במשך 30 דקות הפעלות עם אזור תגמול נסתר יחיד ומסדרון VR עם רמז חזותי יחיד.
    6. במצב לא מקוון: הורידו את קובץ הנתונים .txt מתיקיית השרטוטים של עיבוד ונתחו את התנהגות הליקוק המרחבי (למשל, ב-Matlab עם הקבצים הכלולים procVRbehav.m ו-vrLickByLap.m).
      הערה: העכברים צריכים בתחילה לבצע ליקוקי בדיקה לאורך כל המסלול הווירטואלי ("ליקוט אקראי") ואז להתחיל ללקק באופן סלקטיבי רק ליד מיקום התגמול בעקבות הרמז החזותי של מציאות מדומה (איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מערך התנהגותי זה של מציאות מדומה בקוד פתוח אפשר לנו לכמת התנהגות ליקוק כקריאה של למידה מרחבית בזמן שעכברים מרוסנים לראש ניווטו בסביבת מסלול ליניארי וירטואלי. שבעה עכברי C57BL/6 משני המינים בגיל 4 חודשים הוכנסו ללוח זמנים מוגבל במים ואומנו תחילה ללקק ברציפות ברמות נמוכות תוך כדי ריצה על הגלגל עבור תגמולים מרחביים אקראיים ("ליקוט אקראי") ללא VR. אף על פי שהביצועים שלהם הושפעו בתחילה כאשר הועברו למערך מסך הקרנת VR עם תבנית מסדרון אקראית של 2 מטרים, הם חזרו לרמות קודמות בתוך מספר הפעלות VR (איור 4A). העכברים שפיתחו את אסטרטגיית הליקוט האקראי עם VR (שישה מתוך שבעת העכברים, 86%; עכבר אחד לא הצליח לרוץ באופן עקבי ולא נכלל) נדרשו אז ללקק באזור תגמול אופרנטי לא מרומז בגובה 0.5 מ' בעקבות רמז מיקום חזותי יחיד באמצע מסלול וירטואלי חסר תכונות של 2 מ' כדי לקבל תגמולי מים ("משימת תגמול נסתרת"). על פי נתוני הפיילוט הנוכחיים עם מערכת זו, ארבעה מתוך שבעת העכברים (57%) הצליחו ללמוד את משימת התגמול החבויה עם רמז חזותי יחיד בשניים עד ארבעה מפגשים, כפי שמוצג על ידי ליקוק ליד אזור התגמול עם סלקטיביות גוברת (טבלה 1, איור 4B,C), אשר דומה לתוצאות הקודמות שלנו עם הליכון שאינו VR17 . עובדה זו חשובה בחקר למידה מרחבית, שכן היא מאפשרת ניטור ו / או מניפולציה של פעילות עצבית בתקופות קריטיות של למידה ללא הכשרה מקיפה. יתר על כן, העכברים הפגינו למידה משמעותית גם בתוך המפגש וגם בין המפגשים (איור 4C), מה שסיפק הזדמנות לצפות הן בהסתגלויות קצרות הטווח והן בהסתגלויות ארוכות הטווח של המעגלים העצביים שמלוות למידה מרחבית. לא בדקנו את קצב הלמידה של מטלה מקבילה שאינה מציאות מדומה, אך משימות מרחביות קלאסיות רבות התלויות בהיפוקמפוס בעולם האמיתי, כגון מבוך המים מוריס, דורשות הכשרה מקיפה עוד יותר ומציגות באופן דרמטי פחות ניסויים התנהגותיים, ולכן הן פחות מתאימות לניטור התנהגות למידה יחד עם שינויים בפעילות העצבית.

בעוד שרוב העכברים בקבוצת פיילוט זו (57%) הצליחו ללמוד את משימת התגמול הנסתרת במספר קטן של מפגשים, עכברים נוספים עשויים להפגין למידה מרחבית על פני טווחי זמן ארוכים יותר, ואימון פרטני אמור להגדיל חלק זה של עכברים. ואכן, שינויים בקצב הלמידה עשויים להיות שימושיים לניתוק הקשרים הספציפיים בין פעילות עצבית באזורים במוח כמו ההיפוקמפוס לבין למידה התנהגותית. עם זאת, ראינו שאחוז קטן מהעכברים לא למדו לרוץ על הגלגל או ללקק עבור תגמולים לא אופרנטיים ולא אופרנטיים (אחד משבעת העכברים, 14%), ולכן לא ניתן היה להשתמש בהם לניסויים הבאים. טיפול והתרגלות נוספים והפחתת מצב הלחץ הכללי של בעל החיים באמצעות חיזוקים נוספים, כגון שימוש בפינוקי מזון רצויים, עשויים להיות שימושיים לסיוע לבעלי חיים אלה לאמץ ריצה פעילה וליקוק במהלך התנהגות מרוסנת ראש על ההגה.

על ידי מניפולציה של הנוכחות והמיקום של אזורי הרמז והתגמול בהקפות לסירוגין במסלול הווירטואלי, נסיין עשוי להבחין עוד יותר בתלות של ליקוק סלקטיבי מרחבי בערוצי מידע ספציפיים במציאות מדומה כדי לקבוע, למשל, כיצד עכברים מסתמכים על רמזים מקומיים או רחוקים או מידע על תנועה עצמית כדי לקבוע את מיקומם בסביבה. סלקטיביות הליקוק של עכברים שלמדו את מיקום התגמול הנסתר צריכה להיות מושפעת משינוי או השמטה של הרמז החזותי לאורך המסלול אם הם משתמשים באופן פעיל ברמז המרחבי הזה כנקודת ציון, כפי שהראינו בעבודה שנערכה לאחרונה תוך שימוש ברמזי ריח מרחביים20. אולם אפילו עם הדוגמה הפשוטה שהצגנו כאן, הליקוק הסלקטיבי מאוד שהושג על-ידי העכברים (איור 4C, מימין) מצביע על כך שהם מקודדים את הסביבה החזותית של מציאות מדומה כדי ליידע את החלטותיהם לגבי היכן הם נמצאים, ולכן, מתי ללקק, שכן אזור התגמול ניכר רק ביחס לרמזים חזותיים בסביבת VR. מערכת VR זו מאפשרת גם הצגה של אופנים אחרים של רמזים מרחביים והקשריים בנוסף לסביבת המציאות המדומה החזותית, כגון רמזי ריח, מישוש ושמיעה, אשר יכולים לשמש לבדיקת הסלקטיביות של פעילות עצבית והתנהגות עבור שילובים מורכבים של רמזים חושיים ברורים. בנוסף, למרות שלא בדקנו את התלות של ביצועי משימה בפעילות ההיפוקמפוס, מחקר שנערך לאחרונה באמצעות מטלה דומה אך עם רמזי מישוש הראה הפרעה בלמידה מרחבית עם השבתת היפוקמפוס23, אשר אמורה להיות מאושרת עבור משימת תגמול נסתרת VR שבוצעה במחקר זה.

Figure 1
איור 1: הגדרת חומרת VR מרוסנת ראש: מסך הקרנה, גלגל ריצה ומנגנון קיבוע ראש. (A) סכמת תכנון תלת-ממדית של גלגל הריצה ומסך ההקרנה. (B) הושלמה ההגדרה ההתנהגותית של מציאות מדומה. סביבת המציאות המדומה מעובדת על (1) מחשב לוח יחיד ומוקרנת על מסך הקרנה אחורי פרבולי (2) (מבוסס על תכנון המעבדה של כריס הארווי15,16). (3) הרכבת גלגלים. (4) בעל תפקיד ראשי. (5) מאגר מים למסירת תמורה. (C) תצוגה עליונה של מסך ההקרנה וההגדרה ההתנהגותית. (1) מקרן LED. (2) שיקוף להקרנה אחורית של מסדרון המציאות המדומה על המסך הקעור. (3) גלגל ריצה. (D) מבט לאחור על מכלול הגלגלים. סיבובי גלגלים מתורגמים על ידי המקודד הסיבובי (1) ומועברים למחשב הלוח היחיד באמצעות מיקרו-בקר ESP32 (2). (3) גוניומטר דו-צירי משמש לכוונון עדין של מיקום הראש לצורך הדמיה אופטית. (E) הגדרה ברמת הכנסת העכבר, המציגה את (1) מנגנון קיבוע הראש ו-(2) מיקום יציאת הליקוק מעל משטח גלגל הריצה (3). (F) צילום של יציאת הליקוק (1) המחוברת לזרוע הגמישה (2) למיקום מדויק של פיה של הפרס ליד פי העכבר. התגמולים ניתנים באמצעות (3) שסתום סולנואיד הנשלט על ידי ההתנהגות ESP32 (באמצעות OpenMaze OMwSmall PCB). כמו כן ניתן לראות את המקודד הסיבובי המחובר לסרן הגלגלים (4) ו-(5) את הגוניומטר לכוונון זווית הראש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכמת התקנה של אלקטרוניקה במציאות מדומה. סכמה זו מתארת את הקשרים הרלוונטיים ביותר בין הרכיבים האלקטרוניים במערכת הקוד הפתוח של מציאות מדומה עבור עכברים. (A) עכברים מרוסנים על גבי מכשיר קיבוע ראש מותאם אישית המודפס בתלת-ממד מעל גלגל ריצה אקרילי. (B) סיבוב סרן הגלגל כאשר העכבר פועל מזוהה על-ידי מקודד סיבובי ברזולוציה גבוהה המחובר למיקרו-בקר (מפענח סיבובי ESP32). (C) מידע התנועה מועבר באמצעות חיבור טורי למחשב לוח יחיד המריץ את תוכנת HallPassVR GUI וסביבת תלת-ממד, המעדכן את המיקום בסביבת המסלול הליניארי הווירטואלי VR בהתבסס על תנועת העכבר. (D) סביבת המציאות המדומה המעובדת נשלחת למקרן/מסך באמצעות פלט הווידאו HDMI #2 של המחשב על לוח יחיד (VR video HDMI). (E) מידע תנועה מהמקודד הסיבובי ESP32 נשלח גם למיקרו-בקר אחר (התנהגות ESP32 עם OpenMaze OMwSmall PCB), המשתמש במיקום העכבר כדי לשלוט באירועים התנהגותיים מרחביים שאינם VR (כגון אזורי תגמול או גירויי ריח מרחביים, מישושיים או שמיעתיים) בתיאום עם סביבת VR ומודד את ליקוק העכבר של זרבובית התגמול באמצעות חישת מגע קיבולית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ממשק משתמש גרפי גרפי ואופן פעולה. (A) ממשק המשתמש הגרפי של HallPassVR: ארבע תמונות נבחרות לאריחים מעל כל תבנית מרחבית המכסה שליש מאורך המסלול (או שתבנית השילוב שנשמרה קודם לכן נטענה) לקבלת שלוש דוגמאות בכל נתיב השוות לאורך הרצועה. תמונות התקרה והרצפה נבחרות, ולאחר מכן נלחץ Start כדי לאתחל את סביבת VR בפלט HDMI (מסך הקרנה) של המחשב על לוח יחיד. (B) מסדרון וירטואלי לדוגמה שנוצר עם פרמטרי ממשק המשתמש הגרפי המוצגים ב-A ומשמש לניסוי תגמול נסתר לבדיקת למידה מרחבית. (C) תצלום של עכבר מרוסן ראש רץ על הגלגל בסביבה הווירטואלית המוצגת ב-B. (D) הפאנל העליון מציג את העלילה המקוונת של התנהגות בעלי חיים בסביבת VR משרטוט העיבוד המצורף כדי להקליט ולהתוות את הנתונים ההתנהגותיים. ליקוקים, הקפות ופרסים מתוכננים לכל סלי זמן של 30 שניות עבור המפגש בן 30 הדקות במהלך למידה מרחבית של תגמול נסתר. החלונית התחתונה מציגה את מיקום העכבר הנוכחי (שחור) ואת המיקום של אזורי תגמול (אפור) במהלך התנהגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: למידה מרחבית באמצעות סביבת התוכנה הגרפית. נתוני ליקוק מרחבי מייצג מחיה אחת (A) במהלך ליקוט אקראי עם רמזים אקראיים לאורך המסלול הליניארי הווירטואלי ו-(B-C) יומיים של אימונים עם אזור תגמול סטטי נסתר בגובה 1.5 מ' עם רמז חזותי יחיד באמצע המסלול. (A) יום 0 ליקוט אקראי עבור ארבעה אזורי תגמול בכל הקפה, שנבחרו באופן אקראי מתוך שמונה מיקומים במרווחים שווים לאורך המסלול הליניארי הווירטואלי באורך 2 מטרים. (משמאל) מספר הליקוקים הממוצע לסל מרחבי (5 ס"מ) במשך 30 דקות (למעלה: מסדרון VR עם לוחות גירוי חזותיים אקראיים). (ימין) מספר הליקוקים בכל סל מרחבי של 5 ס"מ בכל הקפה במהלך מפגש זה, המיוצג על ידי מפת חום. (B) יום 1, היום הראשון של האימון עם אזור תגמול יחיד בגובה 1.5 מ' (תיבה אדומה בתרשים המסלול, למעלה) באמצעות מסלול וירטואלי המכיל גירוי יחיד בעל ניגודיות גבוהה במיקום 0.8-1.2 מ'. (משמאל) ליקוק מרחבי ממוצע נספר במהלך האימון, ומראה ליקוקים הולכים וגדלים כאשר בעל החיים מתקרב לאזור התגמול. (ימין) ליקוקים מרחביים בכל הקפה מראים סלקטיביות מוגברת של ליקוק באזור שלפני התגמול. (C) יום 2, מאותה משימת תגמול נסתרת וממסדרון וירטואלי כמו יום 1 ומאותו עכבר. (משמאל) סה"כ ליקוקים לסל מרחבי, מראה ירידה בליקוקים מחוץ לאזור שלפני התגמול. (ימין) ליקוקים מרחביים בכל הקפה ביום השני, מראים ליקוק מוגבר לפני אזור התגמול וליקוק מופחת במקומות אחרים, מה שמעיד על התפתחות ליקוק ציפייה ספציפי מרחבי. זה מראה שהחיה הזו למדה את מיקום התגמול הנסתר (ללא רמז) ופיתחה אסטרטגיה למזעור מאמץ (ליקוק) באזורים שבהם הם לא מצפים לתגמול להיות נוכח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאה התנהגותית מספר עכברים אחוז העכברים
העכבר לא רץ/ליקק 1 14%
ליקוט אקראי בלבד 2 29%
תגמול נסתר נלמד 4 57%
סה"כ (N) 7

טבלה 1: תוצאות פיילוט התנהגותי של למידה מרחבית VR. שבעה עכברי C57BL/6 משני המינים בגיל 4 חודשים אומנו בהדרגה לבצע משימת תגמול מרחבית נסתרת במציאות מדומה. מבין עכברים אלה, עכבר אחד לא רץ/ליקק לאחר האימון הראשוני (אחד משבעת העכברים, 14%), בעוד שישה מהעכברים הנותרים למדו לרוץ על ההגה וללקק עבור תגמולים מרחביים אקראיים בשלב הליקוט האקראי של האימון (שישה מתוך שבעת העכברים, 86%). ארבעה מתוך ששת העכברים שהצליחו לבצע את התנהגות הליקוט האקראית למדו לאחר מכן ללקק באופן סלקטיבי בציפייה לתגמול הלא מרומז במשימת התגמול הנסתרת (ארבעה מתוך שבעת העכברים, 57% מהעכברים בסך הכל, ארבעה מתוך ששת העכברים, 66% מהעכברים האקראיים שחיפשו מזון), בעוד ששניים לא (שניים מתוך שבעת העכברים, 29%).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת VR בקוד פתוח זו לעכברים תפעל רק אם החיבורים הטוריים נעשים כראוי בין המיקרו-בקרים הסיבוביים וההתנהגות ESP32 לבין המחשב על לוח יחיד (שלב 2), אשר ניתן לאשר באמצעות הצג הטורי IDE (שלב 2.4.5). לקבלת תוצאות התנהגותיות מוצלחות מפרוטוקול זה (שלב 4), יש להרגיל את העכברים למכשיר ולהרגיש בנוח לרוץ על הגלגל לקבלת תגמולים נוזליים (שלבים 4.3-4.5). לשם כך נדרשת הגבלת מים מספקת (אך לא מוגזמת), שכן עכברים שקיבלו מים בכלוב הביתי לא ירוצו וילקקו תמורת תגמולים (כלומר, כדי לציין את מיקומם הנתפס), ועכברים מיובשים עלולים להיות רדומים ולא לרוץ על הגלגל. ראוי גם לציין כי ישנן שיטות חלופיות להנעת התנהגות העכבר ללא הגבלת מים24; עם זאת, לא בדקנו שיטות אלה כאן. עבור הליך האילוף, בעלי חיים שאינם רצים בתחילה עשויים לקבל תגמולי מים אד-הוק (כלומר, לא מרחביים) על ידי הנסיין באמצעות לחיצת כפתור אופציונלית מחוברת, או להזיז את הגלגל בעדינות כדי לעודד תנועה. כדי לפתח התנהגות אקראית של ליקוט מזון, עכברים שרצים אך אינם מלקקים צריכים לרוץ עם תגמולים לא אופרנטיים (קוד התנהגות ESP32: isOperant = 0;, שלב 4.5.1) עד שהם רצים ומלקקים עבור תגמולים, ואז ניתן להריץ אותם עם הקפות לסירוגין של אזורי תגמול לא אופרנטיים ואופרנטיים (altOpt=1; שלב 4.5.2) עד שהם מתחילים ללקק על הברכיים אופרנטיות לפני שהם עוברים לאזורי תגמול אקראיים אופרנטיים לחלוטין (שלב 4.5.3).

בעוד שסיפקנו הוראות מלאות ותוצאות לדוגמה עבור קבוצה בסיסית של ניסויים שמטרתם לעורר צורה אחת של למידה מרחבית (ליקוק מותנה במיקום תגמול נסתר בסביבת המסלול הליניארי הווירטואלי), ניתן לשנות את אותה הגדרת חומרה ותוכנה בסיסית גם עבור אספקת סביבות חזותיות-מרחביות מורכבות יותר באמצעות חבילת pi3d Python עבור Raspberry Pi. לדוגמה, מערכת זו יכולה לשלב מבוכים מורכבים יותר כגון מסדרונות באורכים משתנים, דפוסים מרובים ואובייקטים תלת-ממדיים, ונופי VR תלת-ממדיים נטורליסטיים. יתר על כן, התוכנה ההתנהגותית להעברת תגמולי מים וגירויים לא חזותיים אחרים ניתנת לשינוי עבור פרדיגמות אימון אחרות על ידי שינוי משתני מפתח (המוצגים בתחילת קוד ההתנהגות ESP32) או על ידי הכנסת סוגים חדשים של אירועים מרחביים לאותו קוד. אנו שמחים לייעץ למשתמשים לגבי שיטות ליישום סוגים אחרים של ניסויים התנהגותיים עם הגדרת VR זו או בפתרון בעיות.

סביבות VR אימרסיביות הוכיחו את עצמן ככלי רב-תכליתי לחקר המנגנונים העצביים הבסיסיים של ניווט מרחבי 6,7,8, התנהגויות תגמול-למידה9 ותפיסה חזותית25 הן במחקרים קליניים והן במחקרים בבעלי חיים. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שלנסיין יש שליטה הדוקה על אלמנטים הקשריים כגון רמזים חזותיים וגירויים מרחביים ספציפיים (למשל, תגמולים וגירויי ריח, שמיעה או מישוש), דבר שאינו מעשי בסביבות בעולם האמיתי עם בעלי חיים הנעים בחופשיות. יש לציין, עם זאת, כי הבדלים עשויים להתקיים באופן שבו סביבות VR מקודדות על ידי אזורי מוח כגון ההיפוקמפוס בהשוואה לשימוש בסביבות בעולם האמיתי26,27. עם אזהרה זו, השימוש בסביבות VR מאפשר לנסיינים לבצע מספר רב של ניסויים התנהגותיים עם גירויים מבוקרים בקפידה, המאפשר דיסוציאציה של התרומות של אלמנטים חושיים מובחנים לניווט מרחבי.

המורכבות של בניית מערכי VR מותאמים אישית דורשת לעתים קרובות רקע נרחב בהנדסה ובתכנות מחשבים, מה שעשוי להגדיל את זמן ההתקנה ולהגביל את מספר המכשירים שניתן לבנות כדי לאמן עכברים לניסויים. תצורות VR זמינות גם מספקים מסחריים; עם זאת, פתרונות אלה יכולים להיות יקרים ומוגבלים אם המשתמש רוצה להטמיע תכונות חדשות או להרחיב את יכולת ההדרכה/הקלטה ליותר מהתקנה אחת. טווח המחירים המשוער של מערך הקוד הפתוח VR המוצג כאן הוא <$1,000 (USD); עם זאת, ניתן לייצר גרסה פשוטה יותר לאימון (למשל, ללא גוניומטרים לכוונון זווית הראש) תמורת 500 דולר < (דולר), ובכך לאפשר בניית מערכים מרובים לאימון עכברים בקנה מידה גדול יותר. הסידור המודולרי של הרכיבים מאפשר גם שילוב של VR עם מערכות אחרות לבקרה התנהגותית, כגון מערכת ההליכון עם גירויי ריח מרחביים ומישוש בהם השתמשנו בעבר20, ולכן VR ושיטות גירוי אחרות אינן סותרות זו את זו.

מערכת VR בקוד פתוח זו עם החומרה הנלווית אליה (גלגל ריצה, מסך הקרנה ומנגנון קיבוע ראש), הגדרת אלקטרוניקה (מחשב לוח יחיד ומיקרו-בקרים ESP32) ותוכנה (ממשק משתמש גרפי VR וקוד התנהגות) מספקת הגדרה זולה, קומפקטית וקלה לשימוש לאספקת סביבות VR סוחפות עם פרמטרים לעכברים במהלך ניווט מרחבי מרוסן ראש. התנהגות זו עשויה להיות מסונכרנת עם הדמיה עצבית או רישום אלקטרופיזיולוגי כדי לבחון פעילות עצבית במהלך למידה מרחבית (שלב 2.3.7). ספקטרום הטכניקות הניסיוניות התואמות מציאות מדומה הוא רחב, החל מהתנהגות למידה מרחבית בלבד ועד שילוב עם פוטומטריית סיבים, דימות מיניסקופי, דימות פוטון בודד ורב-פוטון, וטכניקות אלקטרופיזיולוגיות (למשל, נוירופיקסלים או הקלטה תוך-תאית). בעוד ריסון ראש הכרחי עבור חלק מטכניקות הקלטה אלה, האופי המדויק ביותר של הצגת גירוי והאופי הסטריאוטיפי של ההתנהגות עשויים להיות שימושיים גם עבור טכניקות אחרות שאינן דורשות קיבוע ראש, כגון דימות מיניסקופ ופוטומטריית סיבים. יש לציין, עם זאת, כי הפתרון הקיבולי מבוסס החיישן שלנו לזיהוי ליקוקים עשוי להכניס רעש משמעותי על עקבות אלקטרופיזיולוגיים. כדי להימנע מממצאים כאלה, אופטיים או אחרים (למשל, מכניים), יש ליישם פתרונות מבוססי חיישנים לזיהוי ליקוקים.

שיפורים עתידיים במערכת VR יועלו לדף GitHub של הפרויקט (https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR), כך שמשתמשים צריכים לבדוק דף זה באופן קבוע עבור עדכונים. לדוגמה, אנו נמצאים בתהליך של החלפת החיבורים הטוריים הקשיחים בין המיקרו-בקרים למחשב הלוח היחיד בפונקציונליות Bluetooth, שמקורה במיקרו-בקרים ESP32 שכבר משמשים בעיצוב זה. בנוסף, אנו מתכננים לשדרג את ממשק המשתמש הגרפי של HallPassVR כדי לאפשר אפיון של נתיבים שונים בכל מפגש התנהגותי כך שיכיל מיקומים שונים עבור גירויים חזותיים מרכזיים בהקפות שונות. זה יאפשר גמישות רבה יותר לניתוק ההשפעה של תכונות חזותיות והקשריות ספציפיות על הקידוד העצבי של המרחב במהלך למידה מרחבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Clay Lacefield הוא המייסד והמתחזק של OpenMaze.org, המספקת עיצובים עבור OMwSmall PCB המשמש בפרוטוקול זה להורדה בחינם.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לנח פטיט ממעבדת הארווי על הדיון וההצעות בעת פיתוח הפרוטוקול בכתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי פרס החוקר הצעיר של BBRF ו- NIMH 1R21MH122965 (G.F.T.), בנוסף ל- NINDS R56NS128177 (R.H., C.L.) ו- NIMH R01MH068542 (R.H).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/4 " diam aluminum rod McMaster-Carr 9062K26 3" in length for wheel axle
1/4"-20 cap screws, 3/4" long (x2) Amazon.com B09ZNMR41V for affixing head post holders to optical posts
2"x7" T-slotted aluminum bar (x2) 8020.net 1020 wheel/animal mounting frame
6" diam, 3" wide acrylic cylinder (1/8" thick) Canal Plastics 33210090702 Running wheel (custom width cut at canalplastics.com)
8-32 x 1/2" socket head screws McMaster-Carr 92196A194 fastening head post holder to optical post 
Adjustable arm (14") Amazon.com B087BZGKSL to hold/adjust lick spout
Analysis code (MATLAB) custom written file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Analysis code
Axle mounting flange, 1/4" ID Pololu 1993 for mounting wheel to axle
Ball bearing (5/8" OD, 1/4" ID, x2) McMaster-Carr 57155K324 for mounting wheel axle to frame
Behavior ESP32 code custom written file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Arduino code/Behavior board
Black opaque matte acrylic sheets (1/4" thick) Canal Plastics 32918353422 laser cut file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR screen assembly
Clear acrylic sheet (1/4" thick) Canal Plastics 32920770574 laser cut file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR wheel assembly
ESP32 devKitC v4 (x2) Amazon.com B086YS4Z3F microcontroller for behavior and rotary encoder
ESP32 shield OpenMaze.org OMwSmall description at www.openmaze.org (https://claylacefield.wixsite.com/openmazehome/copy-of-om2shield). ZIP gerber files at: https://github.com/claylacefield/OpenMaze/tree/master/OM_PCBs
Fasteners and brackets  8020.net 4138, 3382,3280 for wheel frame mounts
goniometers Edmund Optics 66-526, 66-527 optional for behavior. Fine tuning head for imaging
HallPassVR python code custom written file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/HallPassVR
Head post holder custom design 3D design file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR head mount/Headpost Clamp
LED projector Texas Instruments DLPDLCR230NPEVM or other small LED projector
Lick spout VWR 20068-638 (or ~16 G metal hypodermic tubing)
M 2.5 x 6 set screws McMaster-Carr 92015A097 securing head post 
Matte white diffusion paper Amazon.com screen material
Metal headposts custom design 3D design file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR head mount/head post designs
Miscellenous tubing and tubing adapters (1/16" ID) for constructing the water line
Optical breadboard Thorlabs as per user's requirements
Optical posts, 1/2" diam (2x) Thorlabs TR4 for head fixation setup
Processing code custom written file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Processing code
Raspberry Pi 4B raspberry.com, adafruit.com Single-board computer for rendering of HallPassVR envir.
Right angle clamp Thorlabs RA90 for head fixation setup
Rotary encoder (quadrature, 256 step) DigiKey ENS1J-B28-L00256L to measure wheel rotation
Rotary encoder ESP32 code custom written file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Arduino code/Rotary encoder
SCIGRIP 10315 acrylic cement Amazon.com
Shaft coupler McMaster-Carr 9861T426 to couple rotary encoder shaft with axle
Silver mirror acrylic sheets Canal Plastics 32913817934 laser cut file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR screen assembly
Solenoid valve Parker 003-0137-900 to administer water rewards

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lisman, J., et al. Viewpoints: How the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
  2. Buzsaki, G., Moser, E. I. Memory, navigation and theta rhythm in the hippocampal-entorhinal system. Nature Neuroscience. 16 (2), 130-138 (2013).
  3. O'Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Research. 34 (1), 171-175 (1971).
  4. O'Keefe, J. Place units in the hippocampus of the freely moving rat. Experimental Neurology. 51 (1), 78-109 (1976).
  5. Fyhn, M., Molden, S., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Spatial representation in the entorhinal cortex. Science. 305 (5688), 1258-1264 (2004).
  6. Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480 (7377), 331-335 (2011).
  7. Lacefield, C. O., Pnevmatikakis, E. A., Paninski, L., Bruno, R. M. Reinforcement learning recruits somata and apical dendrites across layers of primary sensory cortex. Cell Reports. 26 (8), 2000-2008 (2019).
  8. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  9. Gauthier, J. L., Tank, D. W. A dedicated population for reward coding in the hippocampus. Neuron. 99 (1), 179-193 (2018).
  10. Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature Neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
  11. Yadav, N., et al. Prefrontal feature representations drive memory recall. Nature. 608 (7921), 153-160 (2022).
  12. Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
  13. Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
  14. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
  15. Pettit, N., et al. Harvey Lab Mouse VR. , Available from: https://github.com/Harvey/Lab/mouseVR (2021).
  16. Pettit, N. L., Yap, E. L., Greenberg, M. E., Harvey, C. D. Fos ensembles encode and shape stable spatial maps in the hippocampus. Nature. 609 (7926), 327-334 (2022).
  17. Turi, G. F., et al. Vasoactive intestinal polypeptide-expressing interneurons in the hippocampus support goal-oriented spatial learning. Neuron. 101 (6), 1150-1165 (2019).
  18. Ulivi, A. F., et al. Longitudinal two-photon imaging of dorsal hippocampal CA1 in live mice. Journal of Visual Experiments. (148), e59598 (2019).
  19. Wang, Y., Zhu, D., Liu, B., Piatkevich, K. D. Craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice. Journal of Visual Experiments. (173), e62266 (2021).
  20. Tuncdemir, S. N., et al. Parallel processing of sensory cue and spatial information in the dentate gyrus. Cell Reports. 38 (3), 110257 (2022).
  21. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  22. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
  23. Jordan, J. T., Gonçalves, J. T. Silencing of hippocampal synaptic transmission impairs spatial reward search on a head-fixed tactile treadmill task. bioRxiv. , (2021).
  24. Urai, A. E., et al. Citric acid water as an alternative to water restriction for high-yield mouse behavior. eNeuro. 8 (1), (2021).
  25. Saleem, A. B., Diamanti, E. M., Fournier, J., Harris, K. D., Carandini, M. Coherent encoding of subjective spatial position in visual cortex and hippocampus. Nature. 562 (7725), 124-127 (2018).
  26. Ravassard, P., et al. Multisensory control of hippocampal spatiotemporal selectivity. Science. 340 (6138), 1342-1346 (2013).
  27. Aghajan, Z. M., et al. Impaired spatial selectivity and intact phase precession in two-dimensional virtual reality. Nature Neuroscience. 18 (1), 121-128 (2015).

Tags

מדעי המוח גיליון 193
מערכת מציאות מדומה בקוד פתוח למדידת למידה מרחבית בעכברים מרוסני ראש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lacefield, C., Cai, H., Ho, H.,… More

Lacefield, C., Cai, H., Ho, H., Dias, C., Chung, H., Hen, R., Turi, G. F. An Open-Source Virtual Reality System for the Measurement of Spatial Learning in Head-Restrained Mice. J. Vis. Exp. (193), e64863, doi:10.3791/64863 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter