Summary
El presente protocolo describe una operación detallada de imágenes de fluorescencia NIR-II en tiempo real de un ratón utilizando un dispositivo de imágenes ópticas NIR-II.
Abstract
Como tecnología de imagen emergente, las imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano II (NIR-II, 1000-1700 nm) tienen un potencial significativo en el campo biomédico, debido a su alta sensibilidad, penetración de tejido profundo e imágenes superiores con resolución espacial y temporal. Sin embargo, el método para facilitar la implementación de imágenes de fluorescencia NIR-II para algunos campos urgentemente necesarios, como la ciencia médica y la farmacia, ha desconcertado a los investigadores relevantes. Este protocolo describe en detalle la construcción y las aplicaciones de bioimagen de una sonda molecular de fluorescencia NIR-II, HLY1, con un esqueleto D-A-D (donante-aceptor-donante). HLY1 mostró buenas propiedades ópticas y biocompatibilidad. Además, las imágenes vasculares y tumorales NIR-II en ratones se realizaron utilizando un dispositivo de imágenes ópticas NIR-II. Se adquirieron imágenes de fluorescencia NIR-II de alta resolución en tiempo real para guiar la detección de tumores y enfermedades vasculares. Desde la preparación de la sonda hasta la adquisición de datos, la calidad de la imagen se mejora considerablemente y se garantiza la autenticidad de las sondas moleculares NIR-II para el registro de datos en imágenes intravitales.
Introduction
La imagen de fluorescencia es la herramienta de imagen molecular comúnmente utilizada en la investigación básica, y también se usa a menudo para guiar la resección quirúrgica del tumor en las clínicas1. El principio esencial de las imágenes de fluorescencia es emplear una cámara para recibir la fluorescencia emitida por un láser después de la irradiación de muestras (tejidos, órganos, etc.) 2. El proceso se completa en unos pocos milisegundos3. Las longitudes de onda de las imágenes de fluorescencia se pueden dividir en ultravioleta (200-400 nm), región visible (400-700 nm), infrarrojo cercano I (NIR-I, 700-900 nm) e infrarrojo cercano II (NIR-II, 1000-1700 nm)4,5,6. Debido a que las moléculas endógenas como la hemoglobina, la melanina, la desoxihemoglobina y la bilirrubina en los tejidos biológicos tienen una fuerte absorción y un efecto de dispersión sobre la luz en las regiones visibles, la penetración y la sensibilidad de la luz se reducen considerablemente, y la imagen de fluorescencia en longitudes de onda de luz visible se ve afectada negativamente 7,8,9.
Las imágenes de fluorescencia NIR-II tienen baja absorción y dispersión de fotones, alta velocidad de imagen y alto contraste (o sensibilidad) de imagen10,11. A medida que aumenta la longitud de onda de la fluorescencia, la absorción y dispersión de la fluorescencia en los tejidos biológicos disminuye gradualmente, y la autofluorescencia en la región NIR-II es extremadamente baja12. Así, la ventana NIR-II aumenta significativamente la profundidad de penetración de los tejidos y obtiene una mayor resolución y relación señal-ruido13,14,15. La ventana NIR-II se puede subdividir en las ventanas NIR-IIa (1300-1400 nm) y NIR-lIb (1500-1700 nm)16. Hasta la fecha, se han reportado varios materiales NIR-II importantes, incluidos nanotubos de carbono de pared simple de material inorgánico, nanopartículas de tierras raras, puntos cuánticos y nanopartículas de polímeros semiconductores de material orgánico, colorantes de moléculas pequeñas, materiales luminiscentes inducidos por agregación, etc. 1,17,18,19,20,21,22. Los nanomateriales inorgánicos se acumulan fácilmente en el hígado, el bazo, etc., y tienen una biotoxicidad potencial a largo plazo23. El fluoróforo orgánico de molécula pequeña tiene las ventajas de metabolismo rápido, baja toxicidad, fácil modificación y una estructura clara, que es la sonda más prometedora para uso clínico24.
El sistema de imágenes ópticas NIR-II también es un componente crítico de la bioimagen de fluorescencia porque puede recolectar eficazmente señales de fluorescencia NIR-II de la sonda NIR-II, lo que genera imágenes funcionales, anatómicas y moleculares precisas25,26. El sistema de imágenes NIR-II comprende principalmente cámaras infrarrojas de onda corta, filtros de paso largo (LP), láseres y procesadores de computadora. In vivo La imagen fluorescente NIR-II es considerada uno de los enfoques de imagen más factibles para dilucidar los mecanismos de las enfermedades y la naturaleza de la vida27,28,29. La tecnología de imagen NIR-II ha sido ampliamente utilizada en campos biomédicos como la detección de células cancerosas, imágenes dinámicas, rastreo dirigido in vivo y terapia dirigida, especialmente en investigación oncológica30,31. Sin embargo, teniendo en cuenta los altos requisitos técnicos de la tecnología de imágenes NIR-II en sondas e instrumentos de imágenes, también desconcierta y restringe el uso práctico de los investigadores en diferentes campos. Por lo tanto, la preparación de sondas de imagen NIR-II y las aplicaciones de imágenes NIR-II se presentan en detalle en este artículo.
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Protocol
Los experimentos con animales para estudios de imágenes NIR-II se llevaron a cabo en el Centro de Experimentos con Animales de la Universidad de Wuhan, que ha sido galardonado con la Asociación Internacional para el Cuidado de Animales Experimentales (AALAC). Todos los estudios en animales se realizaron siguiendo las Directrices de la Comisión de Bienestar Animal de China para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Experimental de Animales de la Universidad de Wuhan.
Para el presente estudio se utilizaron ratones desnudos BALB/c hembra (~20 g) a las 6 semanas de edad.
1. Preparación de imágenes NIR-II
- Coloque cartón negro disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en el centro del transportador. Luego, coloque la muestra encima del cartón negro, de modo que la muestra esté en el centro del portador (una etapa ubicada en el dispositivo de imágenes).
NOTA: En comparación con el cartón blanco, el cartón negro tiene menos interferencia de fondo durante las imágenes NIR-II. - Seleccione un filtro adecuado en función de la longitud de onda de la sonda NIR-II. Pulse long (>2 s) para controlar el área de la caja (como 900 LP) correspondiente al modelo de filtro en la interfaz de pantalla cuando el sistema mueve el filtro a la ruta de imagen óptica.
- Mantenga presionada la plataforma hacia arriba en la interfaz de la pantalla táctil del área de control de la consola del operador para que las consolas del portador se levanten; Mantenga presionada la plataforma hacia abajo para que el portador se consuele hacia abajo.
- Ajuste la altura de la plataforma a "0 mm" (ajuste de altura) y utilice el enfoque automático para que la imagen NIR-II sea clara.
2. Síntesis del colorante NIR-II (HLY1)
- Pesar las materias primas necesarias para el experimento de síntesis. Asegúrese de que no se deterioren.
- Añadir el compuesto 1 (200 mg, 0,18 mmol), PdCl 2(dppf)2 CH 2 Cl 2 (28 mg, 0,04 mmol), N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)naftalen-2-amina (170 mg, 0,4 mmol) y K 2 CO3 (46 mg, 0,34 mmol) a lasolución de tetrahidrofurano (THF) en un matraz de fondo redondo de 25 ml. Revuelva la mezcla durante 4 h a 75 °C bajo atmósfera deN2 (Figura 1A).
NOTA: Para el procedimiento de síntesis del compuesto 1 y N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)naftalen-2-amina, véase Li et al21. Las estructuras químicas se muestran en la Figura 1A. - Después de enfriar a temperatura ambiente, apagar la reacción con agua destilada (DI) (80 ml) y extraer la mezcla con DCM (diclorometano)/H2O(30 ml) (tres veces). Purificar el producto crudo mediante cromatografía en columna 16 (éter de petróleo: DCM =10 : 1) para hacer de HLY1 un sólido verde (78 mg, 30% de rendimiento).
- Coloque el tinte HLY1 bajo la protección de nitrógeno en el refrigerador para su uso posterior. Esto se puede almacenar hasta por 6 meses.
3. Preparación de nanosondas suspensibles al agua
- Pesar HLY1 (1 mg) y materiales de encapsulación anfipática, 1,2-distearoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2k (DSPE-PEG2k, 10 mg; ver Tabla de materiales).
- Prepare HLY1 puntos20 empleando DSPE-PEG2k como matriz de encapsulación (método de nanoprecipitación12) (Figura 1C). Disolver HLY1 en THF (1 ml) y añadir lentamente a un vaso de precipitados que contenga solución acuosa DSPE-PEG2k (9 ml) con sonicación a 25 °C. Posteriormente, retire el THF de la mezcla mediante diálisis20.
- Concentrar la solución anterior centrífugamente con ultrafiltración 18 (7100 x g durante10 min) y luego colocarla en un refrigerador a 4 °C para su uso futuro. Esto se puede almacenar hasta por 1 mes.
NOTA: La solución acuosa de nanosonda cargada por DSPE-PEG2k debe almacenarse por encima de 0 °C y utilizarse lo antes posible.
4. Construcción de ratones portadores de tumores
- Cultive células de cáncer de mama de ratón 4T1 (4T1) en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (v / v) y penicilina-estreptomicina al 1% (v / v) (consulte la Tabla de materiales), y manténgalo en una incubadora humidificada con 5% deCO2 a 37 ° C.
- Para el experimento de imágenes fluorescentes NIR-II, cultivar células 4T1 (5 x 107) durante 24 h, digerir con tripsina (1 ml) y lavar dos veces con DMEM sin suero (4 ml).
- Anestesiar a los ratones mediante el tratamiento con isoflurano (2%). Confirme la anestesia adecuada estimulando los dedos de los pies o las plantas de los pies de los ratones, y observe si los ratones responden. Si no hay respuesta, significa que la anestesia es suficiente32.
- Luego, usando una aguja de inyección de insulina, inyecte la mezcla de células 4T1 en los ratones a través de una inyección subcutánea (100 μL).
NOTA: Los estudios de imagen NIR-II se realizaron ~ 2 semanas después de la inoculación, cuando el tumor había crecido a un volumen de ~ 100 mm3. Antes de la toma de imágenes del tumor NIR-II, confirme el tamaño del tumor. El tamaño del tumor fue estimado por un calibrador vernier electrónico para el presente estudio11.
5. Imágenes de fluorescencia NIR-II in vivo
- Anestesiar a los ratones tratando con isoflurano (2%) y realizar imágenes NIR-II de todo el cuerpo de los ratones utilizando un sistema óptico de imágenes NIR-II (ver Tabla de materiales).
NOTA: Preste atención a la dosis de anestésico para evitar la muerte de los ratones. Generalmente, la anestesia dura de 5 a 10 minutos. Estimule los dedos de los pies o las plantas de los pies de los ratones y observe si los ratones responden. Si no hay respuesta, significa que la anestesia es suficiente. - Tome una solución de HLY1 puntos (0,8 mg/ml, 200 μl). Inyecte los puntos HLY1 por vía intravenosa en los ratones anestesiados, y 3 minutos más tarde, realice imágenes de fluorescencia NIR-II de los vasos sanguíneos de todo el cuerpo de ratones utilizando un sistema de imágenes NIR-II. Concéntrese más en la cabeza del ratón para recolectar imágenes vasculares cerebrales.
NOTA: Use guantes experimentales limpios durante la toma de imágenes, lo que ayudará a obtener imágenes NIR-II limpias. - Recopile las imágenes 5 minutos después de la inyección de puntos HLY1 en ratones y procese los datos utilizando el software ImageJ. Los parámetros del instrumento del sistema óptico de imágenes NIR-II son 90 mW/cm2 (láser de 808 nm).
- Al finalizar el experimento, sacrificar a los animales siguiendo protocolos aprobados institucionalmente.
NOTA: Para el presente estudio, los animales fueron sacrificados exponiéndolos a un exceso de isoflurano32.
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Representative Results
La intensidad fluorescente y el brillo de los puntos HLY1 suspensibles al agua se determinaron mediante un instrumento de imagen NIR-II. La intensidad fluorescente de HLY1 en la mezcla de 90%f w THF/H2Ofue cinco veces mayor que en la solución de THF, lo que indicó una característica prominente de AIE de HLY1 (Figura 1B). Además, los puntos HLY1 emitieron fuertes señales fluorescentes bajo un filtro LP de 1.500 nm, lo que demuestra que los puntos HLY1 se pueden usar para imágenes NIR-IIb (Figura 1D). La absorción máxima y la longitud de onda de emisión máxima de los puntos HLY1 fueron 740 nm y 1.040 nm, respectivamente (Figura 2A). Además, se determinó que el tamaño hidrodinámico de los puntos HLY1 era de 145 nm por dispersión dinámica de luz (DLS) (Figura 2B). Se administraron puntos HLY1 (0,2 ml, 0,8 mg/ml) en ratones Balb/c normales mediante inyección en venas de la cola para imágenes vasculares (Figura complementaria 1). Los microvasos en la extremidad posterior se identificaron claramente bajo un filtro LP de 1.500 nm (Figura 3B). Además, los vasos cerebrales también se identificaron claramente bajo un filtro LP de 1.500 nm (Figura 3A). El rendimiento de imagen NIR-II de los puntos HLY1 en ratones portadores de tumores 4T1 también se evaluó a través del sistema de imágenes NIR-II. Los puntos HLY1 (0,2 ml, 0,8 mg / ml) se inyectaron por vía intravenosa en ratones 4T1 a través de la vena de la cola. El tumor 4T1 de los ratones portadores de tumores fue claramente visible mediante imágenes NIR-II (Figura 3C), lo que indica el efecto EPR de los puntos HLY1. Todos estos resultados sugieren que los puntos HLY1 son una sonda de fluorescencia NIR-II brillante, que es aplicable para imágenes vasculares y tumorales.
Figura 1: Síntesis de moléculas de colorante y preparación de sondas suspensibles al agua. (A) La trayectoria sintética de HLY1 (a: Pd(dppf)Cl 2 CH 2 Cl 2, K 2 CO3, 75 °C). (B) Las imágenes NIR-II de HLY1 en THF y 90% f w THF/H 2 O (1.000 nm LP,2ms). (C) Un diagrama esquemático de la preparación de puntos HLY1. (D) La intensidad fluorescente NIR-IIb de los puntos HLY1 en solución acuosa (1.500 nm LP, 200 ms). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las propiedades ópticas y el tamaño hidrodinámico de los puntos HLY1. (A) Los espectros de absorción y emisión de puntos HLY1 en solución acuosa. (B) El DLS de los puntos HLY1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de fluorescencia NIR-II utilizando puntos HLY1. (A) Imágenes vasculares cerebrales en ratones (1,500 nm LP, tiempo de exposición de 300 ms). Barra de escala: 2 cm. (B) Imagen vascular de cuerpo entero en ratones (1.500 nm LP, 300 ms). (C) Imágenes tumorales 4T1 (LP de 1.250 nm, 30 ms). Barra de escala: 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Configuración de imágenes NIR-II. (A) Diagrama esquemático de inyección de puntos HLY1 en ratones. (B) La fotografía del dispositivo de imágenes NIR-II. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Las imágenes fluorescentes NIR-I se pueden usar hasta cierto punto para imágenes tumorales y vasculares, pero debido a la longitud de onda de emisión máxima limitada de los fluoróforos NIR-I (<900 nm), da como resultado una penetración tisular deficiente y una relación de fondo de señal tumoral33,34. La resolución de imágenes deficiente y baja puede causar una desviación entre el resultado del tratamiento de retroalimentación de imágenes y el efecto terapéutico real. Además, la mayoría de los fluoróforos NIR-I tienen poca estabilidad óptica y un metabolismo extremadamente rápido, lo que resulta en inestabilidad en el proceso de imagen. Debido a la baja penetración tisular y la inestabilidad de los fluoróforos NIR-I, la aplicación en imágenes tumorales y vasculares es muy limitada35. En comparación con la luz NIR-I, las imágenes de fluorescencia NIR-II tienen las ventajas de una dispersión y absorción de fotones significativamente reducida, una menor autofluorescencia tisular, una mayor penetración del tejido corporal y una mejor resolución de imágenes del espacio-tiempo36.
Este artículo describe un tinte AIE brillante basado en un esqueleto D-A-D, que tiene una excelente estabilidad. Se utilizó un método efectivo de nanoprecipitación para preparar una nanosonda para bioimágenes multipropósito, incluidas enfermedades vasculares e imágenes tumorales. El alto rendimiento cuántico en la solución acuosa se debe a las propiedades luminiscentes inducidas por la agregación, que pueden lograr imágenes NIR-II de alta definición con baja dosis y alta bioseguridad. El brillo de la sonda NIR-II y la solubilidad en agua determinan la calidad de la imagen. Además, al inyectar una sonda en un ratón, es necesario evitar que la sonda se filtre en la cola del ratón, lo que afecta a la precisión de los resultados de las imágenes. El método actual de administración solo se limita a la inyección intravenosa y no puede usar múltiples métodos de inyección, lo cual es una limitación del método actual. Además, la nanosonda NIR-II de este método solo se puede acumular al objetivo mediante orientación pasiva, y no puede identificar objetivos específicos mediante orientación activa.
En el proceso de implementación de imágenes NIR-II, el funcionamiento del dispositivo NIR-II también es importante para la adquisición de imágenes. Para obtener imágenes vasculares de alta resolución, la cámara InGaAs debe enfocarse en el ratón y colocarse cerca del ratón, lo que facilita la observación de los pequeños vasos sanguíneos. Para las imágenes del tumor, las sondas deben acumularse de manera efectiva en el tumor, y la fluorescencia NIR-II debe ser emitida por las sondas acumuladas en el tumor, distinguiendo efectivamente el límite entre el tumor y el tejido circundante. Debido a la alta sensibilidad de las imágenes de fluorescencia NIR-II, las imágenes se pueden observar dinámicamente durante las imágenes, lo que falta en muchas otras técnicas de imagen.
En este estudio, se introduce la preparación de una sonda fluorescente. Al mismo tiempo, las imágenes vasculares y tumorales de alta resolución se realizan mediante una nanosonda fluorescente NIR-II, que proporciona un método preciso y eficaz para la detección de enfermedades vasculares y cáncer.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente apoyado por subvenciones de NSFC (82273796, 82111530209), Fondos especiales para guiar el desarrollo local de ciencia y tecnología del gobierno central (XZ202202YD0021C, XZ202102YD0033C, XZ202001YD0028C), Proyecto clave de innovación científica y técnica de la provincia de Hubei (2020BAB058), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales y los Programas de Prevención y Control COVID-19 de la Región Autónoma del Tíbet para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous pyridine | Perimed | 110-86-1 | |
| Anhydrous sodium sulfate | China national medicines Co.,Ltd | SY006376 | |
| Black cardboard | Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd | AO00158 | |
| Column chromatography | Energy Chemical | E080498 | |
| Diphenylphosphine palladium dichloride | Sigma-Aldrich | B2161-1g | |
| DSPE-PEG2000 | Ponsure | PS-E1 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
| Isoflurane | GLPBIO | GC45487-1 | |
| K2CO3 | Macklin | P816305-5g | |
| N. N '- dimethylformamide | China national medicines Co.,Ltd | 02-12-1968 | |
| NIR-II imaging instrument | Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd | 16011109 | |
| N-sulfenanilide | Enerry chemical | 1250030-5g | |
| PdCl2(dppf)2CH2Cl2 | TCI | B2064-1g | |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Tetrahydrofuran | China national medicines Co.,Ltd | M005197 | |
| Tetratriphenylphosphine palladium | Immochem | 1021232-5g | |
| Tetratriphenylphosphine palladium | Sigma-Aldrich | 1021232-5g | |
| Tributyltin chloride | Immochem | QH004335 | |
| Trimethylchlorosilane | China national medicines Co.,Ltd | 40060560 |
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