Summary
Il presente protocollo descrive un'operazione di imaging a fluorescenza NIR-II dettagliata e in tempo reale di un topo utilizzando un dispositivo di imaging ottico NIR-II.
Abstract
Come tecnologia di imaging emergente, l'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso II (NIR-II, 1000-1700 nm) ha un potenziale significativo nel campo biomedico, grazie alla sua elevata sensibilità, penetrazione dei tessuti profondi e imaging superiore con risoluzione spaziale e temporale. Tuttavia, il metodo per facilitare l'implementazione dell'imaging a fluorescenza NIR-II per alcuni campi urgentemente necessari, come la scienza medica e la farmacia, ha lasciato perplessi i ricercatori pertinenti. Questo protocollo descrive in dettaglio le applicazioni di costruzione e bioimaging di una sonda molecolare a fluorescenza NIR-II, HLY1, con uno scheletro D-A-D (donatore-accettore-donatore). HLY1 ha mostrato buone proprietà ottiche e biocompatibilità. Inoltre, l'imaging vascolare e tumorale NIR-II nei topi è stato eseguito utilizzando un dispositivo di imaging ottico NIR-II. Sono state acquisite immagini di fluorescenza NIR-II ad alta risoluzione in tempo reale per guidare l'individuazione di tumori e malattie vascolari. Dalla preparazione della sonda all'acquisizione dei dati, la qualità dell'imaging è notevolmente migliorata e viene garantita l'autenticità delle sonde molecolari NIR-II per la registrazione dei dati nell'imaging intravitale.
Introduction
L'imaging a fluorescenza è lo strumento di imaging molecolare comunemente usato nella ricerca di base ed è anche spesso usato per guidare la resezione chirurgica del tumore nelle cliniche1. Il principio essenziale dell'imaging a fluorescenza è quello di impiegare una telecamera per ricevere la fluorescenza emessa da un laser dopo l'irradiazione di campioni (tessuti, organi, ecc.) 2. Il processo è completato in pochi millisecondi3. Le lunghezze d'onda dell'imaging a fluorescenza possono essere suddivise in ultravioletto (200-400 nm), regione visibile (400-700 nm), vicino infrarosso I (NIR-I, 700-900 nm) e vicino infrarosso II (NIR-II, 1000-1700 nm)4,5,6. Poiché le molecole endogene come l'emoglobina, la melanina, la deossiemoglobina e la bilirubina nei tessuti biologici hanno un forte assorbimento e un effetto di diffusione sulla luce nelle regioni visibili, la penetrazione e la sensibilità della luce sono notevolmente ridotte e l'imaging a fluorescenza nelle lunghezze d'onda della luce visibile è influenzato negativamente 7,8,9.
L'imaging a fluorescenza NIR-II ha un basso assorbimento e diffusione dei fotoni, un'elevata velocità di imaging e un elevato contrasto (o sensibilità) dell'immagine10,11. All'aumentare della lunghezza d'onda della fluorescenza, l'assorbimento e la diffusione della fluorescenza nei tessuti biologici diminuiscono gradualmente e l'autofluorescenza nella regione NIR-II è estremamente bassa12. Pertanto, la finestra NIR-II aumenta significativamente la profondità di penetrazione dei tessuti e ottiene una risoluzione più elevata e un rapporto segnale-rumore 13,14,15. La finestra NIR-II può essere ulteriormente suddivisa in NIR-IIa (1300-1400 nm) e NIR-lIb (1500-1700 nm) windows16. Ad oggi, sono stati segnalati diversi materiali NIR-II fondamentali, tra cui nanotubi di carbonio a parete singola di materiale inorganico, nanoparticelle di terre rare, punti quantici e nanoparticelle polimeriche semiconduttrici di materiali organici, coloranti a piccole molecole, materiali luminescenti indotti dall'aggregazione, ecc. 1,17,18,19,20,21,22. I nanomateriali inorganici si accumulano facilmente nel fegato, nella milza, ecc. e hanno una potenziale biotossicità a lungo termine23. Il fluoroforo organico a piccole molecole ha i vantaggi di metabolismo rapido, bassa tossicità, facile modifica e una struttura chiara, che è la sonda più promettente per uso clinico24.
Il sistema di imaging ottico NIR-II è anche un componente critico del bioimaging a fluorescenza perché può raccogliere efficacemente i segnali di fluorescenza NIR-II dalla sonda NIR-II, rendendo così precise immagini funzionali, anatomiche e molecolari25,26. Il sistema di imaging NIR-II comprende principalmente telecamere a infrarossi a onde corte, filtri passa-lungo (LP), laser e processori per computer. In vivo L'imaging fluorescente NIR-II è considerato uno degli approcci di imaging più fattibili per chiarire i meccanismi delle malattie e la natura della vita27,28,29. La tecnologia di imaging NIR-II è stata ampiamente utilizzata in campi biomedici come il rilevamento delle cellule tumorali, l'imaging dinamico, il tracciamento mirato in vivo e la terapia mirata, specialmente nella ricerca oncologica30,31. Tuttavia, considerando gli elevati requisiti tecnici della tecnologia di imaging NIR-II su sonde e strumenti di imaging, lascia anche perplessi e limita l'uso pratico dei ricercatori in diversi campi. Pertanto, la preparazione delle sonde di imaging NIR-II e le applicazioni dell'imaging NIR-II sono introdotte in dettaglio in questo articolo.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali per gli studi di imaging NIR-II sono stati condotti presso l'Animal Experiment Center dell'Università di Wuhan, che è stato premiato con l'International Association for Experimental Animal Care (AALAC). Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti seguendo le linee guida della China Animal Welfare Commission per la cura e l'uso di animali da esperimento e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Centro sperimentale sugli animali dell'Università di Wuhan.
Per il presente studio sono stati utilizzati topi nudi femmina BALB/c (~20 g) a 6 settimane di età.
1. Preparazione dell'imaging NIR-II
- Posizionare il cartone nero disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) al centro del supporto. Quindi, posizionare il campione sopra il cartone nero, in modo che il campione si trovi al centro del supporto (uno stadio situato nel dispositivo di imaging).
NOTA: rispetto al cartone bianco, il cartoncino nero ha meno interferenze di fondo durante l'imaging NIR-II. - Selezionare un filtro adatto in base alla lunghezza d'onda della sonda NIR-II. Premere a lungo (>2 s) per controllare l'area della scatola (ad esempio 900 LP) corrispondente al modello di filtro nell'interfaccia dello schermo quando il sistema sposta il filtro nel percorso di imaging ottico.
- Premere a lungo la piattaforma sull'interfaccia touch screen dell'area di controllo della console carrier in modo che la console carrier si alzi; Premere a lungo la piattaforma verso il basso in modo che le console dell'operatore siano abbassate.
- Regolare l'altezza della piattaforma su "0 mm" (regolazione dell'altezza) e utilizzare la messa a fuoco automatica per rendere chiara l'immagine NIR-II.
2. Sintesi del colorante NIR-II (HLY1)
- Pesare le materie prime necessarie per l'esperimento di sintesi. Assicurati che non si deteriorino.
- Aggiungere il composto 1 (200 mg, 0,18 mmol), PdCl 2(dppf)2 CH 2 Cl 2 (28 mg, 0,04 mmol), N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-diossaborolan-2-il)fenil)naftalene-2-ammina (170 mg, 0,4 mmol) e K 2 CO3 (46 mg, 0,34 mmol) alla soluzione di tetraidrofurano (THF) in un matraccio a fondo tondo. Agitare la miscela per 4 ore a 75 °C in atmosfera N2 (figura 1A).
NOTA: Per la procedura di sintesi del composto 1 e N-fenil-N-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-diossaborolan-2-il)fenil)naftalene-2-ammina, fare riferimento a Li et al21. Le strutture chimiche sono mostrate nella Figura 1A. - Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, estinguere la reazione con acqua distillata (DI) (80 ml) ed estrarre la miscela con DCM (diclorometano)/H2O (30 ml) (tre volte). Purificare il prodotto grezzo mediante cromatografia su colonna16 (etere di petrolio:DCM = 10:1) per rendere HLY1 un solido verde (78 mg, resa 30%).
- Posizionare il colorante HLY1 sotto la protezione dell'azoto in frigorifero per un uso successivo. Questo può essere conservato per un massimo di 6 mesi.
3. Preparazione di nanosonda sospendibile in acqua
- Pesare HLY1 (1 mg) e materiali di incapsulamento anfipatico, 1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[ammino(polietilenglicole)-2k (DSPE-PEG2k, 10 mg; vedere tabella dei materiali).
- Preparare HLY1 punti20 utilizzando DSPE-PEG2k come matrice di incapsulamento (metodo di nanoprecipitazione12) (Figura 1C). Sciogliere HLY1 in THF (1 mL) e aggiungerlo lentamente in un becher contenente la soluzione acquosa DSPE-PEG2k (9 mL) con sonicazione a 25 °C. Successivamente, rimuovere THF dalla miscela mediante dialisi20.
- Concentrare centrifugamente la soluzione di cui sopra con ultrafiltrazione 18 (7100 x g per10 min) e quindi metterla in un frigorifero a 4 °C per un uso futuro. Questo può essere conservato per un massimo di 1 mese.
NOTA: La soluzione acquosa di nanosonda caricata da DSPE-PEG2k deve essere conservata a temperatura superiore a 0 °C e utilizzata il prima possibile.
4. Costruzione di topi portatori di tumore
- Coltura di cellule di carcinoma mammario di topo 4T1 (4T1) nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrate con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS) e l'1% (v/v) di penicillina-streptomicina (vedi tabella dei materiali), e conservate in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 a 37 °C.
- Per l'esperimento di imaging fluorescente NIR-II, coltura di cellule 4T1 (5 x 107) per 24 ore, digerire con tripsina (1 ml) e lavare due volte con DMEM senza siero (4 ml).
- Anestetizzare i topi trattando con isoflurano (2%). Confermare un'adeguata anestesia stimolando le dita dei piedi o le piante dei piedi dei topi e osservare se i topi rispondono. Se non c'è risposta, significa che l'anestesia è sufficiente32.
- Quindi, utilizzando un ago per iniezione di insulina, iniettare la miscela di cellule 4T1 nei topi attraverso iniezione sottocutanea (100 μL).
Nota: gli studi di imaging NIR-II sono stati eseguiti ~ 2 settimane dopo l'inoculazione, quando il tumore era cresciuto fino a un volume di ~ 100 mm3. Prima dell'imaging tumorale NIR-II, confermare la dimensione del tumore. La dimensione del tumore è stata stimata da un calibro vernier elettronico per il presente studio11.
5. Imaging a fluorescenza NIR-II in vivo
- Anestetizzare i topi trattandoli con isoflurano (2%) ed eseguire l'imaging NIR-II di tutto il corpo dei topi utilizzando un sistema di imaging ottico NIR-II (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Prestare attenzione al dosaggio dell'anestetico per evitare la morte dei topi. Generalmente, l'anestesia dura 5-10 minuti. Stimola le dita dei piedi o le piante dei piedi dei topi e osserva se i topi rispondono. Se non c'è risposta, significa che l'anestesia è sufficiente. - Prendi una soluzione di punti HLY1 (0,8 mg/ml, 200 μL). Iniettare i punti HLY1 per via endovenosa nei topi anestetizzati e, 3 minuti dopo, eseguire l'imaging a fluorescenza NIR-II dei vasi sanguigni di tutto il corpo dei topi utilizzando un sistema di imaging NIR-II. Concentrati ulteriormente sulla testa del topo per raccogliere l'imaging vascolare cerebrale.
NOTA: Utilizzare guanti sperimentali puliti durante l'imaging, che aiuteranno a ottenere immagini NIR-II pulite. - Raccogliere le immagini 5 minuti dopo l'iniezione di punti HLY1 nei topi ed elaborare i dati utilizzando il software ImageJ. I parametri dello strumento del sistema di imaging ottico NIR-II sono 90 mW/cm2 (laser 808 nm).
- Al termine dell'esperimento, eutanasia gli animali seguendo protocolli istituzionalmente approvati.
NOTA: Per il presente studio, gli animali sono stati eutanizzati esponendoli all'eccesso di isoflurano32.
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Representative Results
L'intensità fluorescente e la luminosità dei punti HLY1 sensibili all'acqua sono state determinate da uno strumento di imaging NIR-II. L'intensità fluorescente di HLY1 nella miscela 90% fwTHF/H2O era cinque volte superiore a quella della soluzione THF, il che indicava una caratteristica AIE prominente di HLY1 (Figura 1B). Inoltre, i punti HLY1 emettevano forti segnali fluorescenti sotto un filtro LP da 1.500 nm, dimostrando che i punti HLY1 possono essere utilizzati per l'imaging NIR-IIb (Figura 1D). La massima lunghezza d'onda di assorbimento e massima emissione dei punti HLY1 era rispettivamente di 740 nm e 1.040 nm (Figura 2A). Inoltre, la dimensione idrodinamica dei punti HLY1 è stata determinata essere di 145 nm mediante diffusione dinamica della luce (DLS) (Figura 2B). I punti HLY1 (0,2 ml, 0,8 mg/ml) sono stati somministrati a topi Balb/c normali tramite iniezione di vene caudali per imaging vascolare (Figura 1 supplementare). I micro-vasi nell'arto posteriore sono stati identificati chiaramente sotto un filtro LP da 1.500 nm (Figura 3B). Inoltre, i vasi cerebrali sono stati chiaramente identificati anche sotto un filtro LP da 1.500 nm (Figura 3A). Anche le prestazioni di imaging NIR-II dei punti HLY1 nei topi portatori di tumore 4T1 sono state valutate attraverso il sistema di imaging NIR-II. I punti HLY1 (0,2 ml, 0,8 mg/ml) sono stati iniettati per via endovenosa in topi 4T1 attraverso la vena caudale. Il tumore 4T1 dei topi portatori di tumore era chiaramente visibile dall'imaging NIR-II (Figura 3C), indicando l'effetto EPR dei punti HLY1. Tutti questi risultati suggeriscono che i punti HLY1 sono una sonda di fluorescenza NIR-II brillante, applicabile per l'imaging vascolare e tumorale.
Figura 1: Sintesi di molecole di colorante e preparazione di sonde sensibili all'acqua. (A) Il percorso sintetico di HLY1 (a: Pd(dppf)Cl 2 CH 2 Cl 2, K 2 CO3, 75°C). (B) Le immagini NIR-II di HLY1 in THF e 90% fw THF/H 2 O (1.000 nm LP,2ms). (C) Un diagramma schematico della preparazione dei punti HLY1. (D) L'intensità fluorescente NIR-IIb dei punti HLY1 in soluzione acquosa (1.500 nm LP, 200 ms). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Proprietà ottiche e dimensioni idrodinamiche dei punti HLY1. (A) Gli spettri di assorbimento ed emissione dei punti HLY1 in soluzione acquosa. (B) Il DLS dei punti HLY1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Imaging a fluorescenza NIR-II utilizzando punti HLY1 . (A) Imaging vascolare cerebrale nei topi (1.500 nm LP, tempo di esposizione 300 ms). Barra scala: 2 cm. (B) Imaging vascolare di tutto il corpo nei topi (1.500 nm LP, 300 ms). (C) Imaging tumorale 4T1 (1.250 nm LP, 30 ms). Barra scala: 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Configurazione dell'imaging NIR-II. (A) Diagramma schematico di iniezione di punti HLY1 nei topi. (B) La fotografia del dispositivo di imaging NIR-II. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'imaging fluorescente NIR-I può essere utilizzato in una certa misura per l'imaging tumorale e vascolare, ma a causa della limitata lunghezza d'onda massima di emissione dei fluorofori NIR-I (<900 nm), si traduce in una scarsa penetrazione tissutale e rapporto di fondo del segnale tumorale33,34. Una risoluzione di imaging scarsa e bassa può causare una deviazione tra l'esito del trattamento di feedback di imaging e l'effettivo effetto terapeutico. Inoltre, la maggior parte dei fluorofori NIR-I ha una scarsa stabilità ottica e un metabolismo estremamente veloce, con conseguente instabilità nel processo di imaging. A causa della bassa penetrazione tissutale e dell'instabilità dei fluorofori NIR-I, l'applicazione nell'imaging tumorale e vascolare è notevolmente limitata35. Rispetto alla luce NIR-I, l'imaging a fluorescenza NIR-II presenta i vantaggi di ridurre significativamente la diffusione e l'assorbimento dei fotoni, una minore autofluorescenza tissutale, una penetrazione più forte del tessuto corporeo e una migliore risoluzione dello spazio-tempo di imaging36.
Questo articolo descrive un colorante AIE brillante basato su uno scheletro D-A-D, che ha un'eccellente stabilità. Un efficace metodo di nanoprecipitazione è stato utilizzato per preparare una nanosonda per il bioimaging multiuso, comprese le malattie vascolari e l'imaging tumorale. L'elevata resa quantica nella soluzione acquosa è dovuta alle proprietà luminescenti indotte dall'aggregazione, che possono ottenere immagini NIR-II ad alta definizione con basse dosi e alta biosicurezza. La luminosità della sonda NIR-II e la solubilità in acqua determinano la qualità dell'imaging. Inoltre, quando si inietta una sonda in un mouse, è necessario evitare di fuoriuscire la sonda nella coda del mouse, che influisce sull'accuratezza dei risultati di imaging. L'attuale metodo di somministrazione è limitato solo all'iniezione endovenosa e non può utilizzare metodi di iniezione multipli, che è una limitazione del metodo attuale. Inoltre, la nanosonda NIR-II di questo metodo può essere accumulata solo sul bersaglio mediante targeting passivo e non può identificare bersagli specifici mediante targeting attivo.
Nel processo di implementazione dell'imaging NIR-II, il funzionamento del dispositivo NIR-II è importante anche per l'acquisizione di immagini. Per ottenere immagini vascolari ad alta risoluzione, la telecamera InGaAs deve essere focalizzata sul mouse e posizionata vicino al mouse, facilitando l'osservazione dei piccoli vasi sanguigni. Per l'imaging del tumore, le sonde devono essere efficacemente accumulate nel tumore e la fluorescenza NIR-II deve essere emessa dalle sonde accumulate nel tumore, distinguendo efficacemente il confine tra il tumore e il tessuto circostante. A causa dell'elevata sensibilità dell'imaging a fluorescenza NIR-II, le immagini possono essere osservate dinamicamente durante l'imaging, che manca in molte altre tecniche di imaging.
In questo studio viene introdotta la preparazione di una sonda fluorescente. Allo stesso tempo, l'imaging vascolare e tumorale ad alta risoluzione è realizzato da una nanosonda fluorescente NIR-II, che fornisce un metodo accurato ed efficace per la rilevazione di malattie vascolari e cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da sovvenzioni di NSFC (82273796, 82111530209), fondi speciali per guidare lo sviluppo scientifico e tecnologico locale del governo centrale (XZ202202YD0021C, XZ202102YD0033C, XZ202001YD0028C), Hubei Province Scientific and Technical Innovation Key Project (2020BAB058), i fondi di ricerca fondamentale per le università centrali e i programmi di prevenzione e controllo COVID-19 della regione autonoma del Tibet per lo sviluppo scientifico e tecnologico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous pyridine | Perimed | 110-86-1 | |
| Anhydrous sodium sulfate | China national medicines Co.,Ltd | SY006376 | |
| Black cardboard | Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd | AO00158 | |
| Column chromatography | Energy Chemical | E080498 | |
| Diphenylphosphine palladium dichloride | Sigma-Aldrich | B2161-1g | |
| DSPE-PEG2000 | Ponsure | PS-E1 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
| Isoflurane | GLPBIO | GC45487-1 | |
| K2CO3 | Macklin | P816305-5g | |
| N. N '- dimethylformamide | China national medicines Co.,Ltd | 02-12-1968 | |
| NIR-II imaging instrument | Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd | 16011109 | |
| N-sulfenanilide | Enerry chemical | 1250030-5g | |
| PdCl2(dppf)2CH2Cl2 | TCI | B2064-1g | |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Tetrahydrofuran | China national medicines Co.,Ltd | M005197 | |
| Tetratriphenylphosphine palladium | Immochem | 1021232-5g | |
| Tetratriphenylphosphine palladium | Sigma-Aldrich | 1021232-5g | |
| Tributyltin chloride | Immochem | QH004335 | |
| Trimethylchlorosilane | China national medicines Co.,Ltd | 40060560 |
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