Summary
Snelle myocardiale en cardiale ontspanning is essentieel voor een normale fysiologie. Van mechanische ontspanningsmechanismen is nu bekend dat ze afhankelijk zijn van de reksnelheid. Dit protocol geeft een overzicht van de verwerving en analyse van experimenten om de mechanische controle van ontspanning verder te bestuderen.
Abstract
Diastolische disfunctie is een veel voorkomend fenotype bij de presentatie van hart- en vaatziekten. Naast verhoogde hartstijfheid (verhoogde linkerventrikel einddiastolische druk), is verminderde hartontspanning een belangrijke diagnostische indicator van diastolische disfunctie. Hoewel ontspanning de verwijdering van cytosolisch calcium en deactivering van sarcomerische dunne filamenten vereist, moet het richten op dergelijke mechanismen nog effectieve behandelingen bieden. Mechanische mechanismen, zoals bloeddruk (d.w.z. afterload), zijn getheoretiseerd om ontspanning te wijzigen. Onlangs toonden we aan dat het wijzigen van de reksnelheid van een stretch, niet van afterload, zowel noodzakelijk als voldoende was om de daaropvolgende relaxatiesnelheid van myocardweefsel te wijzigen. De spanningssnelheidsafhankelijkheid van ontspanning, de mechanische controle van ontspanning (MCR), kan worden beoordeeld met behulp van intacte cardiale trabeculae. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van een klein diermodel, experimenteel systeem en kamer, isolatie van het hart en daaropvolgende isolatie van een trabecula, voorbereiding van de experimentele kamer en experimentele en analyseprotocollen. Bewijs voor het verlengen van stammen in het intacte hart suggereert dat MCR nieuwe arena's kan bieden voor een betere karakterisering van farmacologische behandelingen, samen met een methode om myofilamentkinetiek in intacte spieren te beoordelen. Daarom kan het bestuderen van de MCR een pad ophelderen naar nieuwe benaderingen en nieuwe grenzen in de behandeling van hartfalen.
Introduction
Cardiale ontspanning is verminderd bij bijna alle vormen van hartfalen (inclusief hartfalen met verminderde ejectiefractie) en bij veel hart- en vaatziekten. Naast tal van methoden om de hartfunctie in gepermeabiliseerde spieren te evalueren, wint de evaluatie van intacte hartspieren aan belangstelling. Dergelijke weefsels worden onbelast (uiteinden vrij samentrekkend) of belast (lengte of kracht gecontroleerd) beoordeeld. Historisch gezien zijn intacte geïsoleerde myocyten geëvalueerd in een onbelaste toestand, waarbij het cellichaam vrij is om te verkorten tijdens contractie. Intacte harttrabeculae worden vaak geëvalueerd in isometrische omstandigheden, waarbij de lengte niet mag veranderen, maar stress (kracht per dwarsdoorsnedegebied) wordt gegenereerd. Zowel intacte myocyten- als trabeculaemethoden beginnen te convergeren met wijzigingen van belasting 1,2.
Protocollen voor het klemmen van een spier (d.w.z. het beheersen van de ontwikkelde spanning van een spier bij een bepaalde waarde die fysiologische nabelastingen simuleert) zijn gedurende meerdere decennia ontwikkeld 3,4,5. In intacte hartweefsels stellen load-clamps onderzoekers in staat om de in vivo hartcyclus beter na te bootsen met behulp van isotone of Windkessel-achtige afterloads 6,7,8,9. Het doel van dit protocol is om gegevens te verkrijgen die worden gebruikt om de MCR te kwantificeren (d.w.z. de afhankelijkheid van de reksnelheid van de relaxatiesnelheid)8,9.
Hoewel het MCR-protocol is aangepast van eerder werk, ligt de focus van dit protocol (in vergelijking met vergelijkbare protocollen met intacte hartweefsels) op biomechanische mechanismen die ontspanning wijzigen. Er zijn verschillende protocollen die gebruik maken van load-clamping 3,4,5,7,10 en protocollen gericht op Windkessel-modellen 1,2,11, maar dit protocol beschrijft specifiek hoe stretch voorafgaand aan ontspanning de ontspanningssnelheid wijzigt. We hebben aangetoond dat deze controle plaatsvindt tijdens een proto-diastolische periode8, een fase die oorspronkelijk werd beschreven door Wiggers12. In normale gezonde harten ondergaat het myocard een verlengende spanning tijdens het uitwerpen voorafgaand aan het sluiten van de aortaklep (d.w.z. voorafgaand aan isovolumische ontspanning)13. Dit wordt nagebootst door de duur van de afterloadcontrole te verlengen totdat de spier begint uit te rekken. Klinisch bewijs suggereert dat deze verlenging kan worden verzwakt of verloren kan gaan in ziektetoestanden14, en de implicaties en mechanismen van veranderde eindsystolische stamsnelheden zijn niet volledig opgehelderd. Gezien de schaarse behandelingsopties voor diastolische ziekten en hartfalen met een geconserveerde ejectiefractie, stellen we dat MCR inzicht kan geven in nieuwe mechanismen die ten grondslag liggen aan verminderde ontspanning.
Hoewel de hier beschreven grove dissectie zich richt op knaagdieren, kan trabecula-isolatie worden uitgevoerd vanuit elk intact hart en is eerder gebruikt met een menselijk harttrabecula8. Evenzo kan de gegevensverzameling en -analyse ook worden toegepast op cardiomyocyten of andere geïsoleerde spiertypen 1,10. De discussie bevat commentaar op mogelijke wijzigingen en aanpassingen aan de methode, samen met beperkingen, zoals voorzichtigheid tegen het gebruik van papillaire spieren vanwege de mechanische eigenschappen van de chordae9.
Protocol
Het volgende protocol is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Wayne State University. Het protocol beschrijft hier stappen voor het gebruik van experimentele proefpersonen van knaagdieren, maar kan worden aangepast voor gebruik in andere modelorganismen.
1. Voorbereiding
- Verkrijg het proefpersoon en laat het wennen aan het lab.
- Bereid 250 ml perfusieoplossing en 250 ml gemodificeerde Tyrode-oplossing (tabel 1) door elk van zuurstof te voorzien tot 10-20 ppm O2, met een pH van 7,3.
- Bereid een spuit van 5 ml met een canule eraan. Vul de spuit met een perfusieoplossing. Gebruik canules van 23 G voor een muis en 18 of 16 G voor respectievelijk een kleine of grote rat. Schuif een 1 mm lange polyethyleen (PE) slang op het uiteinde van een stompe naald (Table of Materials), om te voorkomen dat de aorta van de canule glijdt nadat deze is vastgebonden.
- Volledige voorbereiding van het dissectie- en cannulatiegebied (figuur 1)
- Vul twee schone weegboten ten minste halverwege met perfusie-oplossing. Dompel de punt van de canule onder in een perfusieoplossing met ten minste één hechtdraad met dubbele lus die rond de canule is geplaatst. Houd de spuit op zijn plaats met een staafklem.
- Plaats een chirurgische schaar, een hemostat, iristang, een paar kleine gebogen scharen en twee # 3-tangen voor gemakkelijke toegang.
- Bereid het experimentele systeem voor (figuur 2) door de gemodificeerde Tyrode-oplossing door het experimentele systeem te primen en te laten circuleren. Zorg ervoor dat de kamer volledig vol en stabiel is.
- Schakel alle gegevensverzamelingsboxen in, inclusief de krachtopnemer, de lengtemotor, het pacingsysteem, het temperatuurregelsysteem en de gegevensacquisitiecomputer.
- Kopieer en hernoem een sjabloonmap met de vereiste *.dap- en aanwijzerbestanden om naar het huidige experiment te verwijzen. Open de software voor gegevensverzameling.
- Bereid de trabecula-isolatiegereedschappen (Vannas-schaar, # 5 of # 55 tang, glazen sonde) voor door hun uiteinden onder te dompelen in 10% (w / v) runderserumalbumine (BSA) in ultrapuur water of perfusieoplossing, om het metaal met eiwit te bedekken (figuur 2B).
OPMERKING: Het gehele experimentele systeem moet vóór de dissectie worden voorbereid.
2. Grove dissectie en cannulatie
- Noteer de identificatie, het lichaamsgewicht en andere relevante informatie van de proefpersoon van het dier.
- Injecteer optioneel 1.000 E/kg heparine in steriele zoutoplossing aan het knaagdier via intraperitoneale injectie ten minste 10 minuten vóór euthanasie, om het risico op stolling vóór coronaire perfusie te minimaliseren.
- Plaats het dier in een inductiekamer en induceer algemene anesthesie met behulp van 3% -5% isofluraan verdampt in 100% zuurstof, volgens de standaardprocedure.
OPMERKING: Schakel externe aaseters, diepgangstabellen of zuurkasten in die worden gebruikt om de blootstelling aan isofluraan te minimaliseren. - Zodra het knaagdier zijn rechtrichtreflex verliest en de ademhalingssnelheid is vertraagd:
- (Voor een rat) verwijder het dier uit de inductiekamer en plaats het liggend op een dissectiepad, met voortdurende anesthesie door een neuskegel.
- (Voor een muis) voer cervicale dislocatie uit onmiddellijk na het verwijderen van het dier uit de inductiekamer. De neuskegel is niet nodig. Zet de isofluraan vaporizer op 0%.
- Bevestig indien nodig de bovenste ledematen van het knaagdier op het dissectiekussen weg van de borstwand met tape ondersteund door pinnen, waarbij u ervoor zorgt dat u niet in het dier prikt. Controleer op de juiste anesthesiediepte (gebrek aan teen-knijpreactie) voordat u doorgaat met de dissectie.
- Met behulp van een chirurgische schaar (Mayo voor ratten, Metzenbaum voor muizen), net onder het xyfoïde proces, snijdt u de huid dwars over de volledige breedte van de buik van het knaagdier in de peritoneale ruimte.
- Maak met behulp van een chirurgische schaar twee verticale sneden parasagittaal (aan de zijkanten van de borstwand) aan zowel de linker- als rechterkant van de borstwand van de dwarssnede. Snijd vervolgens over het diafragma, verbind de parasagittale sneden en bevrijd de thoracale ruimte.
- Klem en til het xyfoïde proces op met behulp van een hemostat naar het hoofd van het knaagdier, om het borstbeen en de borstwand naar het hoofd van het knaagdier te bewegen, waardoor de thoracale ruimte en het hart worden blootgesteld. Indien nodig, verleng de parasagittale sneden snel tot in de buurt van de tweede wervelruimte, om het hart volledig bloot te leggen en / of het pericardiale membraan te breken.
- Til met behulp van een gebogen iristang het hart voorzichtig op om de grote bloedvaten te visualiseren. Plaats de tang tussen het myocardium en de wervelkolom van het knaagdier, klem de grotere bloedvaten vast en til het hart op, waarbij u ervoor zorgt dat u de boezems of ventriculaire segmenten niet klemt.
- Terwijl u het hart enigszins optilt, plaatst u snel de gebogen irisschaar (hol omhoog) tussen de gebogen iristang en de wervelkolom van het knaagdier en snijdt u de grote bloedvaten en longen weg van het hart. Beweeg het hart snel in een weegboot of bekerglas met verse perfusieoplossing en schud om het bloed van het hart te verwijderen.
- Zet de isofluraan vaporizer op 0%, als dit nog niet gedaan is. Als grote delen van long-, pericardiale of andere weefsels aan het hart blijven vastzitten, snijd ze dan voorzichtig weg en gooi ze op dit moment weg om interferentie met de cannulatie te minimaliseren.
- Gebruik de gebogen irispang en beweeg het hart in een schone weegboot of beker, met de voorbereide canule ondergedompeld. Kannuleer de aorta, zet de aorta vast door de lusvormige zijden hechtdraad aan te spannen en spoel met maximaal 5 ml perfusieoplossing.
- Verwijder het hart uit de canule en plaats het in een met siliconen elastomeer gecoate weegschaal om zich voor te bereiden op trabecula-isolatie.
3. Isolatie en evenwicht van trabecula
- Plaats het hart in de met siliconen elastomeer bedekte schaal onder een stereomicroscoop en verlicht het.
- Lokaliseer het rechterventrikeluitstroomkanaal. Pin het linkeratrium en de ventriculaire apex vast aan het siliconenelastomeer in de schaal.
- Knip met een lange Vannas-schaar uit het rechterventrikeluitstroomkanaal naar de top langs het septum. Snijd van het rechterventrikeluitstroomkanaal naar het rechteratrium bij de aorta en snijd vervolgens door het rechteratrium (figuur 3B).
- Trek met een tang voorzichtig de rechter ventriculaire (RV) vrije wand van het uitstroomkanaal open, waarbij u voorzichtig bent om het weefsel niet uit te rekken.
OPMERKING: Experimentatoren kunnen dunne, witte bindweefselstrengen vinden, die zonder zorgen kunnen worden gesneden. Grotere, roze (weefsel) gekleurde strengen moeten met zorg worden geëvalueerd, omdat het trabeculae kan zijn die kunnen worden geïsoleerd. - Pin de vrije wand van de rechterventrikeldriehoek vast aan de schotel, om de rechterkamer bloot te leggen (figuur 3C).
- Gebruik een glazen pipet die is gesmolten en gevormd met een dun (<500 μm diameter) maar geen scherp uiteinde, zoek het blootgestelde endocardium naar vrijstaande trabeculae (figuur 3C).
OPMERKING: Een vrijstaande trabecula is een strook spier die men er volledig onder kan onderzoeken. Gebruik trabeculae met parallelle zijden (constante breedte), vermijd driehoekige papillaire spieren. Wees voorzichtig tijdens dit proces en de daaropvolgende dissectie, omdat het toepassen van spanning op het trabecula schade kan veroorzaken, waardoor de ontwikkelde kracht wordt verminderd. - Ontleed de trabecula met een kleine Vannas-schaar. Laat een stuk weefsel van ≥1 mm aan elk uiteinde van het trabecula liggen om aanhechting mogelijk te maken. Rek de trabecula waar mogelijk niet uit en minimaliseer contact met metalen gereedschappen, omdat beide ook schade aan de spier kunnen veroorzaken. Verplaats de pinnen die het hart vasthouden indien nodig om de spanning op de spier in de buurt van de geïdentificeerde trabeculae te minimaliseren.
- Snijd ~ 2 inch van het uiteinde van een 7 ml transferpipet, trek de trabecula langzaam in de pipet en breng deze over in een nieuwe weegschaal met 50% perfusieoplossing en 50% gemodificeerde Tyrode-oplossing. Laat de spier gedurende enkele minuten in evenwicht komen met de toename van extracellulair calcium in de gemengde oplossing.
- Herhaal stap 3.7-3.8 om extra trabecula op dit moment te ontleden, om extra trabecula als back-up te verkrijgen.
- Schakel de pomp uit die superfusie en/of zuigkracht naar de experimentele kamer levert. Verplaats met behulp van de grote boring de pipette het trabecula in de experimentele kamer gevuld met de oplossing van Tyrode.
- Pin een kubus van >1 mm stuk weefsel aan het einde van het trabecula vast aan een haak op de krachtopnemer en pin vervolgens de tweede kubus vast aan de motor.
OPMERKING: Scheid de motor en de krachtopnemer bij het monteren van de eerste kant voor een betere toegang tot de transducer en beweeg de haken vervolgens zo dicht mogelijk bij elkaar bij het monteren van de tweede kubus weefsel terwijl de trabecula slap blijft. - Start de superfusie opnieuw en begin met het pacen van de spier om de drempelspanning te bepalen. Tempo op 20% boven de drempelspanning gedurende ongeveer 1 uur om het trabecula in evenwicht te brengen.
- Aan het einde van deze evenwichtsperiode rekt u de spier langzaam uit met behulp van de micrometer die op de motor is aangesloten totdat een optimaal ontwikkelde stressgeneratie is bereikt, door de ontwikkelde (minimale tot piek) spanning te observeren. Stop met het vergroten van de spierlengte wanneer de passieve diastolische spanning sneller stijgt dan de piekspanning, wat aangeeft dat de optimale lengte is gepasseerd.
- Schakel de uitgezonden microscoopverlichting uit en verlicht het trabecula met behulp van een zwanenhalsverlichting in een steile hoek. Met behulp van een camera die is aangesloten via de microscoopoptiek die eerder is gekalibreerd, legt u een beeld vast van het trabecula tijdens diastole in de experimentele map. Als het trabecula breder is dan het gezichtsveld van de camera, maak dan meerdere foto's over de spier.
- Open de afbeelding(en) in een beeldbewerkingssoftware die pixelafstanden rapporteert.
- Meet de pixelafstand van de spierdiameter vier keer over de lengte. Meet de lengte van de spier (trabecula) in pixels, met uitzondering van de grote kubus van weefsel.
- Als de spierlengte langer is dan het gezichtsveld, gebruik dan referentiepunten langs de spier om de volledige lengte te meten.
- Gebruik de sjabloon in de experimentele map om het gemiddelde van de diametermetingen te nemen en de diameter en lengtes om te zetten van pixels naar mm met behulp van een eerder verkregen kalibratie. Bereken de doorsnede als π*diameter 2/4 in mm2 en de spierlengte in μm.
4. Data-acquisitie
- Zodra de spier in evenwicht is, opent u de software voor gegevensverzameling en selecteert u Experimenten | Lengteregeling en voer de gekalibreerde trabeculalengte (FL) en de doorsnede (gebied [m2]) in het vak Kalibratie in.
- Controleer vanuit de sjabloonmap (stap 1.7) of de freeform_file.txt naar de juiste map verwijst en open het bestand freeform.dap in een teksteditor. Stel het isotone niveau (isoton) in op 32.000 in het *.dap-bestand.
- Selecteer in het vak Lengtebesturingselement het tabblad Vrije vorm en blader naar het juiste lijstbestand voor vrije vorm. Zorg ervoor dat het pad voor gegevensarchivering ook de juiste map is om gegevens op te slaan. Begin met het verkrijgen van gegevens van volledig isometrische twitches door op Run Experiment te drukken, voordat u load-clamp-gegevens verkrijgt met behulp van een feedbackregeling met proportionele en integratieversterkingsparameters.
- Verkrijg load-clamped data door de afterload (isoton) in het *.dap-bestand te definiëren en herhaal waarden van proportionele versterking (propgain) en integratie (Ki) parameters door het bestand op te slaan in de teksteditor. Druk op Experiment uitvoeren in de software-interface voor gegevensverzameling.
- Zorg ervoor dat de klem tijdens deze iteratie wordt teruggeschoven naar zijn oorspronkelijke lengte (soms aangeduid als ontspanningsbelasting5) om het maximale bereik van reksnelheden te bereiken, door de modus (flswitch) van één in te stellen en de drempel voor het beëindigen van de lastklem (flthreshold) van nul te verhogen.
- Bedien het uiteinde van de lastklem door de modus (flswitch) van één naar nul te veranderen. Herhaal de acquisitie terwijl u het uiteinde van de lastklem wijzigt van nul relengthening naar volledige relengthening terug naar de beginlengte.
- Om de lengte te vergroten, verhoogt u stapsgewijs de drempel voor het beëindigen van de lastklem (flthreshold) van nul totdat de spier bijna weer wordt verlengd tot zijn oorspronkelijke lengte.
- Reset de modus (flswitch = 1) en drempelwaarde (flthreshold = 0) en voer een laatste gegevensverzameling uit.
- Wijzig desgewenst de nabelasting in het onderzoek door stap 4.4-4.6 te herhalen. Deze overname kan onmiddellijk worden gedaan.
- Wijzig indien gewenst de voorspanning door de spier uit te rekken of in te korten, of behandel de spier door verbindingen toe te voegen aan de oplossing van de Tyrode. Als u de voorspanning wijzigt of verbindingen toevoegt, wacht dan minimaal 20 minuten om ervoor te zorgen dat de langzame krachtrespons 9,15 is gestabiliseerd en/of dat de verbinding volledig in de spier is doorgedrongen.
- Zodra de gegevensverzameling is voltooid, verwijdert u de trabecula. Bevries of fixeer indien nodig het trabecula voor biochemische of histologische analyse.
- Reinig de werkgebieden en het experimentele systeem, spoel alle slangen met water en schakel alle componenten uit.
5. Data-analyse
- Open de gegevensbestanden met behulp van een kwantitatief analyseprogramma door het programma naar het juiste bestandspad te leiden.
- Kwantificeer ontspanning door ervoor te zorgen dat het data-analyseprogramma de geklemde beat analyseert en dat het programma de start van de load-clamp correct verwerft.
- Zorg ervoor dat het uiteinde van de lastklem wordt geïdentificeerd, zodat de relaxatiesnelheid (1/τ) wordt gekwantificeerd uit de pieknegatieve afgeleide van spanning tijdens een isometrische relaxatie.
- Gebruik de Glantz-methode16 om deze exponentiële tijdconstante te bepalen, of een andere geschikte kwantificering van ontspanning (minimale afgeleide van stress, logistische tijdconstante 17 of kinematisch model18).
- Zorg ervoor dat het data-analyseprogramma de reksnelheid berekent door de tijdsderivaat van de spanning te nemen, waarbij spanning wordt berekend als de lengte als functie van de tijd gedeeld door de lengte bij optimale contractie.
- Herhaal de bovenstaande stappen voor alle sporen van een bepaalde aandoening.
- Plot de relatie tussen de relaxatiesnelheid en de reksnelheid, waarbij de maximale gegevens worden beperkt tot een fysiologische reksnelheid van minder dan 1 s-1. Sluit gegevens bij lage reksnelheden uit (figuur 4C), omdat de ontspanningsfase mogelijk niet het exponentiële vervalweerspiegelt 17,18.
- Behaal de helling van de lijn tussen de ontspanningssnelheid en de reksnelheid en noteer de helling als de index van MCR.
- Herhaal de bovenstaande analyse voor elke verhoorde aandoening.
Representative Results
Een representatieve dataset is weergegeven in figuur 4 en aanvullende resultaten zijn te vinden in eerdere publicaties 8,9. In het kort wordt de reksnelheid berekend op basis van de afgeleide van de stam, net voor isometrische ontspanning. Spanning is de lengte als functie van de tijd gedeeld door de lengte van de spier op optimale lengte. De relaxatiesnelheid wordt berekend als 1/τ, waarbij τ de exponentiële tijdconstante16 is. Meerdere reksnelheden en de daaruit voortvloeiende ontspanningssnelheden zijn vereist om de mechanische controle van ontspanning (MCR) te bepalen. Deze gegevens zijn uitgezet op een grafiek van de ontspanningssnelheid versus de reksnelheid. De helling van de lijn geeft de MCR-index.
Merk op dat de eindsystolische en diastolische reksnelheden waarschijnlijk niet hoger zijn dan 1 s-1. Daarom mag de helling alleen reksnelheden < 1 s-1 omvatten. De ontspanningssnelheid bij lage reksnelheden kan worden verstoord door veranderingen in de minimale tijdsderivaat van stress (dStress / dtmin), en in deze gevallen kunnen gegevens van stretches van minder dan ongeveer 0,15 s-1 worden genegeerd.
Figuur 1: Opstelling van grove dissectie en hartcannulatiegebied. Van rechts naar links: a. De anesthesie-inductiekamer voor het dier bevindt zich in de buurt van het dissectiegebied. b. Een snorkel voor optionele vluchtige gasvanger. c. Een dissectiekussen, waar het dier in rugligging wordt geplaatst, wordt geflankeerd door (met de klok mee) d. een neuskegel, om voortdurende anesthesie te bieden aan het knaagdier, e. hemostaten, f. chirurgische schaar, g. gebogen fijne schaar geplaatst voor gemakkelijke toegang met de dominante (snijdende) hand, h. gebogen iristang geplaatst voor gemakkelijke toegang met de niet-dominante hand. Bovenste ledematen van het knaagdier kunnen met tape op het dissectiekussen worden aangebracht en i. een dissectieschaal (of een klein bekerglas) met perfusieoplossing moet in de buurt worden geplaatst om het hart te spoelen. j. Een gebied dat is geënsceneerd voor cannulatie moet in de buurt worden geplaatst. Een spuit met een geschikte canule wordt op een ringstandaard gemonteerd. k. (Inzet) Een nadere afbeelding van een canule van 16 G, met 1 mm PE205-slang bevestigd en een hechtdraad losjes geknoopt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimenteel gebied en gereedschappen. (A) Experimenteel gebied. De experimentele kamer en het data-acquisitiesysteem worden voorbereid op een nabijgelegen omgekeerde microscoop (links). Trabecula-isolatie en montage vindt plaats onder een stereoscoop (rechts). (B) Uiteinden van twee tangen, grote en kleine Vannas-scharen en een aangepaste glazen sonde worden bereid door te weken in 10% BSA-oplossing. (C) Aanvullende dissectie-instrumenten. Een met siliconen elastomeer vergulde schaal maakt het mogelijk om het hart te monteren tijdens fijne dissectie. Een transferpipet van 7 ml met de eindsnede wordt onder de schaal en de glazen sonde weergegeven. De gesneden punt van de transferpipet wordt weggegooid en een vergrote boring wordt gebruikt om de spier over te brengen, met minimaal risico op uitrekken of uitdroging. (D) Vergrote afbeelding van het uiteinde van een glazen pipet, die ongeveer 2 mm lang en 0,25-0,5 mm in diameter is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gids voor dissectie . (A) Grove dissectie moet beginnen met een dwarse snede (1. groen) door de huid in de peritoneale holte onder het xyfoïde proces (onderste ribben en xyfoïde worden aangegeven door een dunne grijze lijn). Parasagittale sneden van de peritoneale holte naar de ribbenkast moeten volgen (2. groenblauwe en 3. blauwe lijnen), waarna het diafragma moet worden gesneden. Een hemostat kan dan worden gebruikt om het xyfoïde proces vast te klemmen en de borstwand naar het hoofd te tillen. (B) Een intact rattenhart vastgepind op een silicium-elastomeerschaal, georiënteerd met uitzicht op het rechterventrikeluitstroomkanaal (RVOT), rechteratrium (RA), aorta (Ao) en linkeratrium (LA). De eerste reeks sneden moet van de RVOT naar de top langs het septum zijn (1. Gele lijn). Een tweede reeks sneden moet van de RVOT langs de basis van het hart zijn en vervolgens over het rechteratrium (2. oranje lijn). (C) De RVOT kan voorzichtig van de aorta worden weggetrokken om het hart te openen en terug te pinnen. Gele en oranje lijnen komen overeen met sneden beschreven in B. Vrijstaande trabeculae worden vaak gevonden in de buurt van de basis van de RV-vrije muur en in de buurt van het septum, maar kunnen overal voorkomen (rode lijnen geven gemeenschappelijke locaties aan). (D) Vergrote weergave van de glazen sonde onder een trabecula (gele pijl geeft het snijpunt van trabecula en sonde aan). (E) Een trabecula (rode pijl) is gemonteerd op het experimentele systeem tussen een krachtopnemer (links) en motor (midden-rechts) en wordt geflankeerd door twee pacing-leads (horizontaal boven en onder de trabecula). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve sporen en resultaten . (A) Een enkele cardiale trabecula verlicht met behulp van een zwanenhals LED-licht in een steile (~ 75 °) hoek van de as van de microscooplens, die het contrast van de trabecula verbetert. In dit voorbeeld zijn twee afbeeldingen betegeld om de volledige lengte van de trabecula weer te geven. (B) Spanningstijd (boven) en rektijd (onder) curven voor dezelfde trabecula. Een isometrische twitch, samen met drie load-clamp twitches bij toenemende end systolische reksnelheden worden getoond. (C) Representatieve MCR-berekening. MCR wordt gedefinieerd als de helling van de lijn tussen de ontspanningssnelheid en de reksnelheid. Zoals opgemerkt in de discussie, kunnen reksnelheden worden beperkt om een kwantitatieve, reproduceerbare MCR te bieden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Oplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Mechanische controle van ontspanning (MCR) kwantificeert de afhankelijkheid van de myocardiale relaxatiesnelheid van de spanningssnelheid van de spier die voortschrijdtop ontspanning 8,9. Reksnelheid, in plaats van nabelasting, is zowel noodzakelijk als voldoende om de ontspanningssnelheid8 te wijzigen. Aangezien het niet bewezen is dat interventies om de calciumsnelheid te wijzigen de hartontspanning aanzienlijk verbeteren, kan mechanische interventie nieuwe inzichten in het mechanisme bieden en een nieuwe behandeling voor diastolische disfunctie bieden.
Het hier beschreven protocol om de myocardiale reksnelheid te wijzigen maakt gebruik van een isotone belastingsklem 8,9. Een sterkte van de isotone lastklem is de kwantitatieve regeling van de nabelastingsspanning. Windkessel-achtige protocollen kunnen worden gebruikt om veranderingen in afterload, preload en hartwerk verder te onderzoeken 2,6,7. Een helling die niet door de lastklem wordt geregeld, kan ook worden gebruikt om de verandering in spanning beter te isoleren van de reksnelheid. Hoe dan ook, de afterload zelf lijkt geen sterke modifier te zijn van de ontspanningssnelheid8.
Het protocol kan ook worden aangepast om meer fysiologische omstandigheden voor temperatuur en pacingsnelheid te benaderen. De huidige protocolgegevens zijn gebruikt om de aanwezigheid van de MCR aan te tonen. Het uitvoeren van experimenten in fysiologische omstandigheden wordt over het algemeen aanbevolen, afhankelijk van de experimentele vraag. Experimenten die worden uitgevoerd bij 37 ° C, of bij hoge pacingsnelheden, kunnen echter sneller rundown (schade) aan de spier veroorzaken. Een oplossing met een verbeterd zuurstoftransportvermogen kan nodig zijn. Verder moet de data-acquisitie in staat zijn om de lengte en kracht snel genoeg te bemonsteren om de snelle twitches op te lossen en feedbackcontrole te bieden.
Het huidige protocol beschrijft niet de meting van calcium of de meting en controle van sarcomeerlengtes. Calciummetingen zijn behandeld in andere protocollen11, terwijl sarcomeerlengtemeting kan worden toegevoegd met de juiste apparatuur. Sarcomeerlengtecontrole wordt niet gebruikt in de huidige MCR-studies, omdat spierlengte de meest correlatieve parameter is met de klinische aandoening19. Verdere controle van de sarcomeerlengte (vs. spierlengtecontrole) zou specifieke antwoorden op kinetische vragen bieden, maar het is onwaarschijnlijk dat deze zal bijdragen aan translationele kennis vanwege inter-sarcomeervariatie en het minimale begrip van sarcomeerlengteveranderingen in vivo.
Drie experimentele overwegingen worden hier belicht om de reproduceerbaarheid van de gegevens te vergroten.
Ten eerste kunnen vrijstaande harttrabeculae bij sommige dieren moeilijk te vinden zijn (ongepubliceerde resultaten en communicatie). Hoewel spiertrekkingen bij de meeste ratten te vinden zijn, is een redelijk slagingspercentage voor het verkrijgen van gegevens van trabecula bij ratten één op de drie. Trabecula-succes kan hoger zijn met Brown Norway x Lewis F1-ratten, die ook historisch20 zijn gebruikt en naar verluidt meer trabeculae (ongepubliceerde communicatie) hebben. Voor muizen zijn de slagingspercentages waarschijnlijk lager, met minder dan één op de 10 verwacht voor muizen met een BL / 6-achtergrond; er wordt echter een hoger percentage verwacht voor muizen met een FVBN-achtergrond (ongepubliceerde communicatie en observaties).
Ten tweede kan schade aan spieren de output verminderen. Als de ontwikkelde krachten minder dan 10 mN mm-2 zijn bij 25 °C en een tempo van 0,5 Hz, moeten onderzoekers mogelijk problemen oplossen om te beoordelen of onbedoeld uitrekken of contact tussen metalen tang en spieren optreedt, of oplossingen niet goed zijn voorbereid of dat pacing of experimentele apparatuur goed functioneert. Andere protocollen die intacte trabecula gebruiken, hebben voorgesteld Luer-lock spuiten te gebruiken als transfervaten11. Hoewel dit mogelijk is, vooral als de gebruiker een zeer langzame stroomsnelheid of een kleiner spiersegment regelt, maakt het huidige protocol gebruik van een veel grotere boringsoverdrachtpipet om mogelijke schade te minimaliseren. Een andere stap waarbij ischemische schade kan optreden, is tijdens dissectie. De aorta moet binnen 3 minuten na de eerste abdominale snede (rat) of cervicale dislocatie (muis) worden gecannuleerd en gespoeld met perfusieoplossing, vergelijkbaar met de limieten die worden vermeld in cardiomyocytenisolatieprotocollen21,22. Dit minimaliseert de tijd dat het hartweefsel niet wordt blootgesteld aan de cardioplegie-achtige perfusie-oplossing. Verder produceren dissecties die langer dan 30 minuten duren over het algemeen geen trillende trabecula. Daarom moeten operators een snelle maar zorgvuldige dissectie oefenen om schade te minimaliseren. Een doorsnede boven 0,2 mm 2 (2 x 10-7 m2) kan last hebben van kernischemie20.
Ten derde moet rekening worden gehouden met de manier waarop spieren aan de motor en krachtopnemer zijn bevestigd. Dit protocol richt zich momenteel op haken en vrijstaande trabeculae. De soms snelle belastingssnelheid van de stretch voorafgaand aan ontspanning kan ervoor zorgen dat een spier glijdt als deze niet goed is bevestigd, daarom gebruikt het huidige protocol geen "manden" om de trabecula23,24 vast te houden. Alternatieve montagemethoden (lijmen, clips, enz.25,26) kunnen ook worden overwogen en gevalideerd. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van trabeculae en niet van papillaire spieren. De chordae van de papillaire spier induceren een reekselasticiteit die veranderingen in de MCR9 kan remmen. Het is echter onwaarschijnlijk dat de exacte plaatsing van de aanhechtingen in de spier van invloed is op de metingen, omdat de lengte (en diameter) van het trabecula aanzienlijk variëren.
Een beperking van het doorboren van de spieruiteinden met haken is dat het bevestigingspunt zelf ook beschadigd kan raken. Mogelijk scheuren van het aangebrachte spierweefsel met frequente samentrekkingen (afhankelijk van hun sterkte) kan de lengte of serieelasticiteit veranderen. Deze snelheid van scheuren is moeilijk te beheersen. Evenzo kan schade aan het weefsel en de haak worden verergerd tijdens het strekken, wat mogelijk ook problemen kan veroorzaken. Visuele inspectie en de ontwikkelde krachtwaarden die >80% van de gebalanceerde isometrische kracht blijven, moeten worden gebruikt om te beoordelen of het preparaat beschadigd is en moeten worden uitgesloten.
Een andere beperking of overweging beïnvloedt welke experimentele vragen door de methode kunnen worden beantwoord. Denk bijvoorbeeld aan het gebruik van 2,3-butaandione monoxime (BDM) in de perfusieoplossing. BDM is een fosfatase, die de functie van de spier kan veranderen. Bovendien betekent de lange periode van lossen en het gebrek aan pacing dat de latente fosforyleringstoestand waarschijnlijk is veranderd. Voorzichtigheid is dus geboden als u probeert de spiercontractiliteit van een dier direct te beoordelen (versus verschillen tussen genotypen of behandelingen), omdat de contractiele toestand waarschijnlijk is veranderd. Het effect van fosforylering kan echter farmacologisch worden beoordeeld door een agonist of antagonist van de route toe te voegen.
Samenvattend geeft MCR inzicht in hoe ontspanning wordt gereguleerd door spierbewegingen (strain rate). MCR kan helpen om beter inzicht te geven in de diagnose en monitoring van diastolische ziekte, samen met doelen voor farmacologische interventie, zoals het modificeren van myosinekinetiek. Het protocol en advies dat hier wordt beschreven, bevatten kennis die is ontwikkeld gedurende meerdere jaren van onderzoeken en moet van toepassing zijn op andere systemen en modellen van hartaandoeningen.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health (1R01HL151738) en de American Heart Association (18TPA34170169).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 or 16 gauge blunted needle/canula | for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
| 23 gauge blunted needle/canula | for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop | ||
| 5 mL syringe | BD Luer-Lock | 309646 | |
| 95% Oxygen/5% CO2 | AirGas | Z02OX9522000043 | |
| Anethesia system | EZ Systems | EZ-SA800 | Can use any appropriate anethesia method/system |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP-1600 | to coat tips of fine forcepts, scissors |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Containers/dissection dishes | FisherBrand | 08-732-113 | Weigh dishes for creating dissection plates |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | for mouse gross dissection |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Data acquisition software | SLControl | ||
| Data acquisition system | MicrostarLabs | DAP5216a | Can use any DAQ. This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot |
| Data analysis software | Mathworks | Matlab | Custom Script |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x for cannulation of aorta |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x for trabecula isolation |
| Experimental system | Aurora Scientific | 801C | Can use any appropriate experimental chamber with force and length control |
| Fine Scissors, curved | Fine Science Tools | 14061-09 | for removal of heart |
| Gooseneck Piggyback Illuminator | AmScope | LED-6WA | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Imaging software | IrfanView | ||
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15915 | for removal of heart |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14110-15 | for rat gross dissection |
| Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14116-14 | for mouse gross dissection |
| Microscope connected camera | Flir | BFS-U3-27S5M-C | Includes acquisition software |
| Microscope/digital imaging system | Olympus | IX-73 | Can use any appropriate microscope. Needed to measure muscle length, cross sectional area |
| Mounting Pin/Needle | BD PrecisionGlide | 305136 | For holding heart to dish. 27 G x 1-1/4 |
| Mounting Pin/Needle | Fine Science Tools | 26000-40 | For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle) |
| Oxygen (O2) | AirGas | OX USP300 | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Rabbit | Can be any means to create flow in experimental chamber |
| pH and Oxygen sensor | Mettler Toledo | SevenGo pH and DO | |
| Potassium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
| Potassium Chloride | Fisher Chemical | P217-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
| Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | for rat gross dissection |
| Silk Suture, Size: 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1KG | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
| Stereomicroscope | AmScope | SM-1TX | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | for opening of the RV |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating dissection plates |
| Syringe Holder | Harbor Frieght | Helping Hands 60501 | Can be used as alternate for ring stand |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
| Transfer Pipette | FisherBrand | 13-711-7M | cut ~1" from tip to widen bore |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | for trabecula isolation |
References
- Iribe, G., Helmes, M., Kohl, P. Force-length relations in isolated intact cardiomyocytes subjected to dynamic changes in mechanical load. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 292 (3), 1487-1497 (2007).
- Dowrick, J. M., et al. Work-loop contractions reveal that the afterload-dependent time course of cardiac Ca(2+) transients is modulated by preload. Journal of Applied Physiology. 133 (3), 663-675 (2022).
- ter Keurs, H. E., Rijnsburger, W. H., van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
- Sonnenblick, E. H. Force-velocity relations in mammalian heart muscle. The American Journal of Physiology. 202, 931-939 (1962).
- Brutsaert, D. L., Rademakers, F. E., Sys, S. U. Triple control of relaxation: implications in cardiac disease. Circulation. 69 (1), 190-196 (1984).
- Taberner, A. J., Han, J. C., Loiselle, D. S., Nielsen, P. M. F. An innovative work-loop calorimeter for in vitro measurement of the mechanics and energetics of working cardiac trabeculae. Journal of Applied Physiology. 111 (6), 1798-1803 (2011).
- De Tombe, P. P., Little, W. C. Inotropic effects of ejection are myocardial properties. Am J Physiol. 266, 1202-1213 (1994).
- Chung, C. S., Hoopes, C. W., Campbell, K. S. Myocardial relaxation is accelerated by fast stretch, not reduced afterload. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 103, 65-73 (2017).
- Schick, B. M., et al. Reduced preload increases Mechanical Control (strain-rate dependence) of Relaxation by modifying myosin kinetics. Archives of Biochemistry and Biophysics. 707, 108909 (2021).
- Parikh, S. S., Zou, S. Z., Tung, L. Contraction and relaxation of isolated cardiac myocytes of the frog under varying mechanical loads. Circulation Research. 72 (2), 297-311 (1993).
- Dowrick, J. M., et al. Simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (176), e62799 (2021).
- Wiggers, C. J. Studies on the consecutive phases of the cardiac cycle I. The duration of the consecutive phases of the cardiac cycle and the criteria for their precise determination. American Journal of Physiology-Legacy Content. 56 (3), 415-438 (1921).
- Rosen, B. D., et al. Late systolic onset of regional LV relaxation demonstrated in three-dimensional space by MRI tissue tagging. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1740-1746 (2004).
- Saito, M., et al. The differences in left ventricular torsional behavior between patients with hypertrophic cardiomyopathy and hypertensive heart disease. International Journal of Cardiology. 150 (3), 301-306 (2011).
- Monasky, M. M., Biesiadecki, B. J., Janssen, P. M. L. Increased phosphorylation of tropomyosin, troponin I, and myosin light chain-2 after stretch in rabbit ventricular myocardium under physiological conditions. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (5), 1023-1028 (2010).
- Raff, G. L., Glantz, S. A. Volume loading slows left ventricular isovolumic relaxation rate. Evidence of load-dependent relaxation in the intact dog heart. Circulation Research. 48, 813-824 (1981).
- Matsubara, H., Takaki, M., Yasuhara, S., Araki, J., Suga, H. Logistic time constant of isovolumic relaxation pressure-time curve in the canine left ventricle. Better alternative to exponential time constant. Circulation. 92 (8), 2318-2326 (1995).
- Chung, C. S., Kovacs, S. J. Physical determinants of left ventricular isovolumic pressure decline: model prediction with in vivo validation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1589-1596 (2008).
- Campbell, K. B., Kirkpatrick, R. D., Tobias, A. H., Taheri, H., Shroff, S. G. Series coupled non-contractile elements are functionally unimportant in the isolated heart. Cardiovascular Research. 28 (2), 242-251 (1994).
- Raman, S., Kelley, M. A., Janssen, P. M. Effect of muscle dimensions on trabecular contractile performance under physiological conditions. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 451 (5), 625-630 (2006).
- Czeiszperger, T. L., Wang, M. P., Chung, C. S. Membrane stabilizer Poloxamer 188 improves yield of primary isolated rat cardiomyocytes without impairing function. Physiol Rep. 8 (4), 14382 (2020).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Loiselle, D. S., Johnston, C. M., Han, J. C., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Muscle heat: a window into the thermodynamics of a molecular machine. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 311-325 (2016).
- de Tombe, P. P., ter Keurs, H. E. Force and velocity of sarcomere shortening in trabeculae from rat heart. Effects of temperature. Circulation Research. 66 (5), 1239-1254 (1990).
- Palmer, B. M., Bell, S. P. Preparing excitable cardiac papillary muscle and cardiac slices for functional analyses. Frontiers in Physiology. 13, 817205 (2022).
- Brunello, E., et al. Myosin filament-based regulation of the dynamics of contraction in heart muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 8177-8186 (2020).
