Summary
Cet article explique comment utiliser l’apprentissage automatique supervisé par simulation pour analyser la morphologie des mitochondries dans des images de microscopie à fluorescence de cellules fixes.
Abstract
L’analyse quantitative d’organites subcellulaires tels que les mitochondries dans les images de microscopie à fluorescence cellulaire est une tâche exigeante en raison des défis inhérents à la segmentation de ces petites structures morphologiquement diverses. Dans cet article, nous démontrons l’utilisation d’un pipeline de segmentation et d’analyse assisté par l’apprentissage automatique pour la quantification de la morphologie mitochondriale dans des images de microscopie à fluorescence de cellules fixes. L’outil de segmentation basé sur l’apprentissage profond est formé sur des images simulées et élimine le besoin d’annotations de réalité de terrain pour l’apprentissage profond supervisé. Nous démontrons l’utilité de cet outil sur des images de microscopie à fluorescence de cardiomyoblastes fixes avec une expression stable de marqueurs mitochondriaux fluorescents et utilisons des conditions de culture cellulaire spécifiques pour induire des changements dans la morphologie mitochondriale.
Introduction
Dans cet article, nous démontrons l’utilité d’un outil d’apprentissage automatique basé sur la physique pour la segmentation subcellulaire1 dans des images de microscopie à fluorescence de cardiomyoblastes fixes exprimant des marqueurs mitochondriaux fluorescents.
Les mitochondries sont les principaux organites producteurs d’énergie dans les cellules de mammifères. Plus précisément, les mitochondries sont des organites très dynamiques et se trouvent souvent dans des réseaux dont la longueur et la ramification changent constamment. La forme des mitochondries impacte leur fonction, et les cellules peuvent rapidement changer leur morphologie mitochondriale pour s’adapter à un changement dans l’environnement2. Pour comprendre ce phénomène, la classification morphologique des mitochondries sous forme de points, de bâtonnets ou de réseaux est très informative3.
La segmentation des mitochondries est cruciale pour l’analyse de la morphologie mitochondriale dans les cellules. Les méthodes actuelles de segmentation et d’analyse des images de microscopie à fluorescence des mitochondries reposent sur la segmentation manuelle ou des approches conventionnelles de traitement d’images. Les approches basées sur le seuillage telles que Otsu4 sont moins précises en raison des niveaux de bruit élevés dans les images de microscopie. En règle générale, les images pour l’analyse morphologique des mitochondries présentent un grand nombre de mitochondries, ce qui rend la segmentation manuelle fastidieuse. Les approches mathématiques comme MorphoLibJ5 et les approches semi-supervisées d’apprentissage automatique comme Weka6 sont très exigeantes et nécessitent des connaissances spécialisées. Un examen des techniques d’analyse d’images pour les mitochondries7 a montré que les techniques basées sur l’apprentissage profond peuvent être utiles pour la tâche. En effet, la segmentation des images dans les images de la vie quotidienne pour des applications telles que la conduite autonome a été révolutionnée avec l’utilisation de modèles basés sur l’apprentissage profond.
L’apprentissage profond est un sous-ensemble de l’apprentissage automatique qui fournit des algorithmes qui apprennent à partir de grandes quantités de données. Les algorithmes d’apprentissage profond supervisés apprennent les relations à partir de grands ensembles d’images annotées avec leurs étiquettes de vérité terrain (GT). Les défis liés à l’utilisation de l’apprentissage profond supervisé pour segmenter les mitochondries dans les images de microscopie à fluorescence sont doubles. Tout d’abord, l’apprentissage profond supervisé nécessite un grand ensemble de données d’images d’apprentissage et, dans le cas de la microscopie à fluorescence, fournir ce grand ensemble de données serait une tâche considérable par rapport à l’utilisation d’images traditionnelles plus facilement disponibles basées sur des caméras. Deuxièmement, les images de microscopie à fluorescence nécessitent des annotations GT des objets d’intérêt dans les images d’apprentissage, ce qui est une tâche fastidieuse qui nécessite des connaissances spécialisées. Cette tâche peut facilement prendre des heures ou des jours du temps de l’expert pour une seule image de cellules avec des structures subcellulaires marquées par fluorescence. De plus, les variations entre les annotateurs posent problème. Pour éliminer le besoin d’annotation manuelle et pour pouvoir tirer parti des performances supérieures des techniques d’apprentissage en profondeur, un modèle de segmentation basé sur l’apprentissage profond a été utilisé ici qui a été formé sur des images simulées. Les simulateurs basés sur la physique fournissent un moyen d’imiter et de contrôler le processus de formation d’images dans un microscope, permettant la création d’images de formes connues. À l’aide d’un simulateur basé sur la physique, un grand ensemble de données d’images de microscopie à fluorescence simulées de mitochondries a été créé à cette fin.
La simulation commence par la génération de la géométrie à l’aide de courbes paramétriques pour la génération de formes. Les émetteurs sont placés au hasard sur la surface de la forme d’une manière uniformément répartie de sorte que la densité corresponde aux valeurs expérimentales. Une fonction d’étalement de point (PSF) 3D du microscope est calculée à l’aide d’une approximation efficacede calcul 8 du modèle Gibson-Lanni9. Pour faire correspondre étroitement les images simulées avec des images expérimentales, le courant d’obscurité et le bruit de prise de vue sont émulés pour obtenir le réalisme photo. Le GT physique est généré sous la forme d’une carte binaire. Le code pour générer le jeu de données et former le modèle de simulation est disponible10, et l’étape de création de ce jeu de données simulé est décrite à la figure 1.
Nous montrons l’utilité de la segmentation basée sur l’apprentissage profond entièrement entraînée sur un ensemble de données simulées en analysant des images de microscopie confocale de cardiomyoblastes fixes. Ces cardiomyoblastes exprimaient un marqueur fluorescent dans la membrane externe mitochondriale, permettant la visualisation des mitochondries dans les images de microscopie à fluorescence. Avant de mener l’expérience donnée en exemple ici, les cellules ont été privées de glucose et adaptées au galactose pendant 7 jours en culture. Le remplacement du glucose dans le milieu de croissance par du galactose oblige les cellules en culture à devenir plus oxydatives et, par conséquent, dépendantes de leurs mitochondries pour la production d’énergie11,12. De plus, cela rend les cellules plus sensibles aux dommages mitochondriaux. Les modifications de la morphologie mitochondriale peuvent être induites expérimentalement par l’ajout d’un agent de découplage mitochondrial tel que le cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP) au milieu de culture cellulaire13. Le PCCC entraîne une perte de potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) et, par conséquent, entraîne des changements dans les mitochondries d’une morphologie plus tubulaire (en forme de bâtonnet) à une morphologie plus globulaire (en forme de point)14. De plus, les mitochondries ont tendance à gonfler pendant le traitement CCCP15. Nous affichons la distribution morphologique des changements mitochondriaux lorsque les cardiomyoblastes adaptés au galactose ont été traités avec le découpleur mitochondrial CCCP. Les segmentations d’apprentissage profond des mitochondries nous ont permis de les classer sous forme de points, de bâtonnets ou de réseaux. Nous avons ensuite dérivé des métriques quantitatives pour évaluer la longueur des branches et l’abondance des différents phénotypes mitochondriaux. Les étapes de l’analyse sont décrites à la figure 2, et les détails de la culture cellulaire, de l’imagerie, de la création d’ensembles de données pour la segmentation basée sur l’apprentissage profond, ainsi que l’analyse quantitative des mitochondries, sont donnés ci-dessous.
Protocol
REMARQUE: Les sections 1 à 4 peuvent être omises si vous travaillez avec des images de microscopie existantes de mitochondries avec des conditions expérimentales connues.
1. Culture cellulaire
- Cultiver les cellules H9c2 dans du DMEM sans glucose supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de galactose, 10% FBS, 1% streptomycine / pénicilline et 1 μg / mL de puromycine. Laisser les cellules s’adapter au galactose pendant au moins 7 jours en culture avant les expériences.
REMARQUE: Les cellules H9c2 utilisées ici ont été génétiquement modifiées pour exprimer des mitochondries fluorescentes et ont également acquis un gène de résistance à la puromycine. L’ajout de cet antibiotique assure la croissance des cellules avec le gène de résistance et, par conséquent, des mitochondries fluorescentes. - Ensemencer les cellules H9c2 pour l’expérience lorsque la confluence cellulaire atteint environ 80% (flacon de culture T75, évalué par microscopie à fond clair). Préchauffer le milieu et la trypsine à 37°C pendant au moins 15 minutes avant de continuer.
NOTE: Il est possible d’effectuer l’expérience en parallèle avec deux ou plusieurs conditions de culture cellulaire différentes. La confluence des cellules H9c2 ne doit pas être supérieure à 80% pour éviter la perte de cellules myoblastiques. À 100% de confluence, les cellules forment des myotubes et commencent à se différencier. - Préparez-vous à l’ensemencement des cellules, fonctionnant dans une hotte à flux laminaire stérile, en plaçant une lame de verre #1.5 pour chaque condition expérimentale dans un puits d’une plaque de 12 puits. Étiquetez chaque condition et les détails expérimentaux sur la plaque de 12 puits.
- Déplacer le ballon de culture cellulaire de l’incubateur vers la surface de travail de la hotte. Aspirer le milieu à l’aide d’un système d’aspiration ou d’une pipette électronique, puis laver deux fois avec 5 ml de PBS (température ambiante).
- Déplacer la trypsine préchauffée sur la surface de travail et aspirer le lavage final du PBS; puis ajouter la trypsine préchauffée pour détacher les cellules (1 mL pour une fiole de culture T75). Replacer le ballon de culture dans l’incubateur pendant 2-3 min à 37°C.
- Déplacez le milieu préchauffé sur la surface de travail vers la fin de l’incubation. Vérifiez que les cellules se sont détachées à l’aide d’un microscope à fond clair.
- Si toutes les cellules ne se sont pas détachées, appliquer plusieurs tapotements prudents mais fermes sur le côté de la fiole pour détacher les cellules restantes.
- Remettre le ballon de culture sur la surface de travail. Ajouter 4 mL de milieu de culture cellulaire dans le ballon de culture à l’aide d’une pipette électronique pour arrêter l’action de la trypsine. Lors de l’ajout d’un milieu de culture dans la fiole, utiliser la pipette pour disperser à plusieurs reprises le milieu à travers la surface afin de détacher et de rassembler les cellules en une suspension cellulaire.
- Introduire à la pipette la suspension cellulaire (5 mL) du ballon dans un tube de 15 mL.
- Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Ouvrez le tube dans la hotte, retirez le surnageant par aspiration et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 5 ml de milieu de culture cellulaire.
- Évaluez le nombre de cellules en analysant un petit volume de suspension cellulaire dans un compteur de cellules automatisé. Notez le nombre de cellules vivantes par millilitre de milieu de culture.
- Déplacer le volume désiré (p. ex. 150 μL par puits) de la suspension cellulaire, calculé pour une densité d’ensemencement d’environ 2 x 104 cellules/cm2, dans un tube centrifuge prémarqué de 15 mL. Ajouter le milieu de culture cellulaire préchauffé au tube centrifuge de 15 mL à un volume précalculé en fonction du nombre de puits. Pour les plaques à 12 puits, utiliser un volume total de 1 mL pour chaque puits.
- S’assurer que la suspension cellulaire diluée est bien mélangée en pipetant le contenu du tube centrifuge de haut en bas plusieurs fois avant de distribuer le volume approprié à chaque puits. Une fois la suspension cellulaire distribuée dans le puits, agitez la plaque de manière soigneusement contrôlée dans chaque direction pour mieux répartir les cellules dans les puits. Placez la plaque de 12 puits dans l’incubateur à 37 °C jusqu’au lendemain.
- Vérifiez les cellules avec un microscope à fond clair pour évaluer la croissance. Si les cellules ont atteint une croissance suffisante jusqu’à environ 80% de confluence, passez aux étapes suivantes; Sinon, répétez l’évaluation quotidiennement jusqu’à ce que la croissance soit suffisante.
2. Procédure expérimentale
- Calculer les quantités nécessaires des matériaux pour l’expérience en fonction des concentrations de solution mère. Décongeler les matières congelées (solution mère CCCP de 30 mM) à 37 °C et préchauffer le milieu de culture cellulaire à 37 °C.
- Une fois décongelée, créer une solution de travail de 10 μM CCCP en diluant la solution mère (1:3 000) dans un milieu de culture cellulaire.
REMARQUE : Ne pipette pas des volumes inférieurs à 1 μL. - Commencez les traitements expérimentaux une fois que tous les matériaux nécessaires sont préparés et préchauffés. Aspirer le milieu de culture cellulaire des puits de la plaque de 12 puits, puis appliquer rapidement le milieu préchauffé frais sur les puits témoins et le milieu préchauffé avec une solution CCCP de 10 μM sur les puits en conditions d’essai.
- Incuber la plaque de 12 puits dans l’incubateur cellulaire à 37°C pendant 2 h. Pendant la période d’incubation, préparez la solution de fixation.
- Pour la préparation de la solution de fixation, utiliser du paraformaldéhyde (PFA) préfabriqué à 4 % pour diluer la solution mère de glutaraldéhyde (GA) à 25 % à 0,2 % (1:125). Réglez la solution pour préchauffer à 37°C. Pour une plaque de 12 puits, 500 μL suffisent par puits.
ATTENTION : Le PFA et le GA sont des produits chimiques toxiques. Travaillez dans une hotte chimique avec un équipement de protection. Voir leurs FDS respectives pour plus de détails. - Lorsque la période d’incubation est terminée, retirez la plaque de 12 puits de l’incubateur et placez-la sur la surface de travail.
REMARQUE : Le travail ne nécessite plus d’environnement stérile. - Aspirer le milieu de culture cellulaire des puits et appliquer la solution de fixation préchauffée. Remettre la plaque de 12 puits dans l’incubateur à 37°C pendant 20 min.
- Aspirer la solution de fixation à la fin de l’incubation et laver chaque puits deux fois avec du PBS à température ambiante. Il est possible de mettre l’expérience en pause à ce stade du protocole et de la poursuivre plus tard.
- Si l’expérience est interrompue, ajouter 1 mL de PBS par puits, sceller la plaque de 12 puits avec un film plastique (parafilm) et conserver à 4 °C.
3. Coloration et montage des cellules sur les lamelles de recouvrement
- Décongeler le stock DAPI (coloration nucléaire) et tourner vers le bas dans une mini-centrifugeuse avant ouverture. Préparer la solution de coloration DAPI en diluant le stock DAPI dans du PBS (1:1 000).
- Aspirer le PBS de la plaque de 12 puits et appliquer 1 mL de solution de coloration DAPI sur chaque puits. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 5 min.
- Aspirez la solution de coloration DAPI. Laver deux fois avec 2 ml de PBS par puits.
- Préparez les lames de microscope en verre dépoli (lames de verre) en les lavant dans de l’éthanol à 70%, suivies de trois lavages au PBS. Séchez soigneusement les lames à l’aide d’essuie-tout non pelucheux et dirigez-les vers la lumière pour vérifier s’il y a des signes de poussière ou de graisse.
REMARQUE: Des gants sont requis pour cette étape. - Étiquetez les lames de verre avec les détails expérimentaux. Transférer le support de montage dans un tube de microcentrifugation et tourner vers le bas dans une mini-centrifugeuse.
- Préparez-vous au montage des bordereaux de couverture en aménageant l’espace de travail. Gardez une plaque de 12 puits avec des lamelles de couverture, des lames de verre étiquetées, un support de montage, une pipette, des embouts de pipette de 10 μL, des serviettes en papier non pelucheuses et une pince à épiler à portée de main.
- Appliquez 10 μL de support de montage (ProLong Glass) sur une lame de verre préparée pour monter un couvercle.
- Ramassez le bordereau de couverture de la plaque de 12 puits à l’aide d’une pince à épiler et tamponnez l’humidité du couvercle en touchant brièvement le bord et l’arrière du couvercle à la serviette en papier non pelucheuse préparée. Abaissez doucement la glissière de couvercle sur la gouttelette du support de montage.
- Répétez les deux étapes ci-dessus pour chaque feuillet de couverture. Placez les gouttelettes de support de montage pour permettre entre un et quatre lamelles de couverture par lame de verre.
- Assurez-vous que les lames de verre sont sur une surface plane pour éviter que les lamelles de couverture montées ne bougent. Placez les lames de verre dans un endroit sombre à température ambiante pendant la nuit pour permettre au support de montage de prendre. Les échantillons sont maintenant prêts pour l’imagerie. L’expérience peut être interrompue à ce stade du protocole et poursuivie plus tard.
- Si l’expérience est interrompue à ce stade, après avoir laissé les échantillons prendre pendant la nuit à température ambiante, recouvrez-les d’une feuille d’aluminium pour les protéger de la lumière et stockez-les à 4 ° C.
4. Microscopie et imagerie
- Couvrir les échantillons dans du papier d’aluminium pour le transport (si ce n’est pas déjà fait).
- À votre arrivée à l’installation de microscopie, utilisez duH2O à double distillation avec du papier filtre pour microscope pour nettoyer les résidus de PBS des lames de couverture sur les lames de verre. Vérifiez qu’il n’y a pas de taches sur les lames de couverture en tenant les lames de verre vers une lumière vive.
- Suivez la procédure de démarrage du microscope. Sélectionnez l’objectif approprié (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27) et ajoutez le milieu d’immersion.
- Placez l’échantillon dans le porte-échantillon. Dans le logiciel du microscope, utilisez l’onglet « Localiser » pour activer l’éclairage de fluorescence EGFP et, à l’aide des oculaires, ajustez manuellement le niveau z pour que l’échantillon soit mis au point. Éteignez l’éclairage de fluorescence lorsque vous trouvez la mise au point.
- Passez à l’onglet « Acquérir » dans le logiciel de microscope. Utilisez la « Smart Setup » pour sélectionner les canaux de fluorescence à utiliser pour l’imagerie. Pour cette expérience, les préréglages de canaux EGFP et DAPI ont été sélectionnés.
- Ajustez l’intensité de chaque canal à partir des paramètres initiaux à l’aide de l’histogramme d’intensité comme guide pour optimiser la puissance du signal. L’imagerie peut maintenant commencer.
- Pour l’imagerie, utilisez l’option du logiciel pour placer les positions d’imagerie dans un tableau et centrez le tableau au milieu de la feuille de couverture avec 12 positions totales à imager. Vérifiez que chaque position du tableau contient des cellules. S’il n’y a pas de cellules, ajustez la position à une zone avec des cellules.
- Ajustez la mise au point de chaque position dans le réseau à l’aide de l’autofocus du logiciel de microscope, et suivez-le avec un réglage manuel fin pour vous assurer que le plus grand nombre possible de mitochondries sont mises au point.
REMARQUE: Le canal EGFP est utilisé pour ces ajustements manuels. - Obtenez les images à l’aide de cette méthode pour chaque bordereau de couverture. Enregistrez les fichiers image et passez aux étapes de l’analyse morphologique.
5. Génération de données d’entraînement simulées
- Téléchargez le code10 et décompressez le contenu. Suivez les instructions de la section README.md pour configurer l’environnement requis.
- Accédez au dossier nommé « src », qui est le dossier de base de ce projet. Les dossiers numérotés à l’intérieur contiennent des codes spécifiques aux différentes étapes de l’utilisation de l’outil.
Remarque : Utilisez la commande « cd <> » pour naviguer vers les sous-dossiers du code. Pour exécuter un fichier python, utilisez la commande « python < >.py ». La présentation nommée « Tutorial.pptx » contient un ensemble complet d’instructions pour l’utilisation du modèle de segmentation. - Faites une copie ou utilisez le dossier « 2. Mitochondria Simulation Airy », et renommez-le (Airy est utilisé ici car c’est la fonction PSF la plus proche d’un microscope confocal, qui a été utilisé comme microscope actuel). Allez dans le dossier nommé « simulateur ».
REMARQUE: Ce dossier contient tous les fichiers liés à la simulation des données d’entraînement. Il y a trois ensembles de paramètres à définir pour la simulation. - Tout d’abord, pour le simulateur dans le fichier de configuration du lot « simulator / batch / bxx.csv », définissez les paramètres pour environ l’échantillon, y compris le nombre de mitochondries, la gamme de diamètres et les longueurs des structures, la plage de l’axe z que la structure présente et la densité des fluorophores.
- Ensuite, définissez les paramètres liés au système optique.
- Cet ensemble comprend le type de microscope (qui détermine quel modèle PSF est sélectionné), l’ouverture numérique (N.A.), le grossissement (M), la taille des pixels (en μm), la longueur d’onde d’émission des fluorophores et le paramètre de bruit de fond, etc.
- Définissez les paramètres optiques de N.A., le grossissement et la longueur d’onde minimale de l’ensemble de données dans le fichier « simulateur/microscPSFmod.py ».
- Définissez la valeur souhaitée pour la taille des pixels et définissez la longueur d’onde d’émission de l’ensemble de données en tant que paramètre de la fonction « process_matrix_all_z » dans le fichier « simulateur/generate_batch_parallel.py ».
- Définissez les trois derniers paramètres de la fonction « save_physics_gt » dans le fichier « simulateur/generate_batch_parallel.py ». Les paramètres sont la taille en pixels (en nm), la taille de l’image de sortie et max_xy.
- Définissez le troisième ensemble de paramètres concernant le jeu de données de sortie, tels que la taille des images de sortie, le nombre de tuiles dans chaque image et le nombre total d’images, dans le fichier « simulateur/generate_batch_parallel.py ».
- Exécutez le fichier « simulateur/generate_batch_parallel.py » pour lancer la simulation.
- Pour obtenir l’image de taille finale, faites une copie du dossier nommé « 5. Préparation des données et formation/préparation des données » dans le dossier de base et naviguez jusqu’à celui-ci.
REMARQUE: Chaque image du jeu de données synthétiques est formée en créant un montage de quatre images simulées de 128 pixels x 128 pixels, ce qui donne une taille d’image finale de 256 pixels x 256 pixels. Cela génère d’abord de nombreuses tuiles individuelles (environ 12 000) pour les images du microscope (dans le dossier « sortie ») et les segmentations de vérité au sol (dans le dossier « sortie/physics_gt »).- Définissez les paramètres du numéro de lot, le nombre d’images par lot et la plage de bruit dans « data_generator.py ».
- Exécutez le fichier « data_generator.py » pour créer les images de montage.
- Copiez les dossiers nommés « image » et « segment » dans le « 5. Data Preparation and Training/datatrain/train » du dossier « 5. Préparation et formation des données/préparation des données/données ».
6. Segmentation basée sur le deep learning
- Entraînez le modèle de segmentation sur les images simulées comme suit :
- Pour entraîner le modèle de segmentation d’un nouveau microscope, accédez à la case « 5. Data Preparation and Training/train » et définissez les paramètres de la taille du lot, le modèle de base pour la segmentation, le nombre d’époques et le taux d’apprentissage pour la formation dans le fichier « train_UNet.py ».
- Exécutez « train_UNet.py » pour commencer la formation. Le processus d’apprentissage affiche la métrique pour la performance de la segmentation sur le jeu de validation simulé.
REMARQUE: Une fois la formation terminée, le modèle est enregistré sous « best_model.h5 » dans le « 5. Préparation des données et formation/formation ».
- Testez le modèle sur des images de microscope réelles qui sont divisées à une taille souhaitable pour le modèle entraîné en suivant les étapes suivantes.
- Naviguez jusqu’à « 6. Prepare Test Data », et copiez le fichier « . png » des fichiers de données dans le dossier « png ».
- Exécutez le fichier « split_1024_256.py » pour fractionner les images à une taille souhaitable pour le modèle formé. Cela crée des recadrages de 256 pixels x 256 pixels des images dans le dossier « données ».
- Copiez le dossier « data » créé dans le « 7. Test Segmentation » dossier.
- Accédez au dossier « 7. Test Segmentation », et définissez le nom du modèle enregistré à utiliser.
- Pour segmenter les cultures, exécutez le fichier « segment.py ». Les images segmentées sont enregistrées dans le dossier « sortie ».
7. Analyse morphologique : Analyse de la morphologie mitochondriale des deux groupes de données, « Glucose » et « CCCP »
- Organisez les données à analyser (un dossier pour chaque image, chaque dossier contenant les cultures de sortie segmentées d’une image).
- Téléchargez et placez le fichier supplémentaire nommé « make_montage.py » dans le dossier nommé « 7. Segmentation de test ».
- Exécutez le fichier « make_montage.py » pour assembler la sortie segmentée à la taille d’origine de l’image.
- Créez un nouveau dossier nommé « 9. Analyse morphologique » dans le dossier « src ».
- Installez les paquets Python Skan16 et Seaborn dans l’environnement à l’aide de la commande « pip install seaborn[stats] skan ».
REMARQUE: Les masques de segmentation sont squelettés à l’aide de la bibliothèque nommée Skan pour permettre l’analyse de la topologie de chaque mitochondrie individuelle. - Placez le fichier supplémentaire « analyze_mitochondria.py » dans le dossier « 9. Analyse morphologique ».
- Organisez les images des différents groupes de l’expérience dans différents dossiers à l’intérieur du dossier « 7. Segmentation de test ».
- Définissez les paramètres de « taille de pixel » et « chemin d’entrée » dans le fichier « analyze_mitochondria.py ».
- Exécutez le fichier « analyze_mitochondria.py » pour exécuter le code à squeletter et créer des tracés de l’analyse.
Representative Results
Les résultats des segmentations d’apprentissage profond des mitochondries dans des images confocales de cardiomyoblastes fixes exprimant des marqueurs fluorescents des mitochondries montrent l’utilité de cette méthode. Cette méthode est compatible avec d’autres types de cellules et systèmes de microscopie, ne nécessitant qu’un recyclage.
Des cardiomyoblastes H9c2 adaptés au galactose avec mitochondries fluorescentes ont été traités avec ou sans CCCP pendant 2 h. Les cellules ont ensuite été fixées, colorées avec un colorant nucléaire et montées sur des lames de verre pour l’analyse par microscopie à fluorescence. Un microscope confocal a été utilisé pour acquérir des images des cellules témoins et des cellules traitées par CCCP. Nous avons effectué notre analyse sur 12 images confocales, avec environ 60 cellules par condition. L’état morphologique des mitochondries dans chaque image a ensuite été déterminé et quantifié. Les masques de segmentation obtenus à partir du modèle entraîné ont été squelettés pour permettre l’analyse de la topologie de chaque mitochondrie individuelle pour cette expérience. La longueur de la branche des mitochondries individuelles a été utilisée comme paramètre pour la classification. Les mitochondries individuelles ont été classées en classes morphologiques selon la règle suivante. Plus précisément, tout squelette mitochondrial d’une longueur inférieure à 1 500 nm était considéré comme un point, et les mitochondries les plus longues étaient en réseau ou en bâtonnet. S’il y avait au moins une jonction où deux branches ou plus se croisaient, cela était défini comme un réseau; Sinon, la mitochondrie a été classée comme un bâtonnet. Un exemple d’image avec les squelettes mitochondriaux étiquetés avec les classes de morphologie est montré à la figure 3.
La catégorisation de la morphologie mitochondriale de la figure 4A montre qu’il est possible de détecter des changements significatifs lorsque CCCP est appliqué pendant 2 h; cela est démontré le plus clairement par l’augmentation des points pour les cellules traitées par CCCP.
La longueur moyenne des branches de la figure 4B est une autre façon d’illustrer les changements détectables et significatifs de la morphologie. Comme prévu, les bâtonnets et les réseaux ont été considérablement réduits par rapport au contrôle lorsque les cellules ont été traitées avec CCCP. L’augmentation significative de la longueur moyenne des branches des points était également attendue étant donné le gonflement que subissent les mitochondries lorsqu’elles sont exposées au PCCC.
Figure 1 : Pipeline pour la simulation d’images de microscopie à fluorescence. Le pipeline comprend (i) la génération de géométrie 3D, (ii) l’émulation des émetteurs et de la photocinétique, (iii) la convolution PSF 3D, (iv) l’ajout de bruit et (v) la binarisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Étapes de l’analyse de la morphologie mitochondriale basée sur l’apprentissage automatique. (1) Les images à segmenter sont d’abord recadrées dans des tailles acceptables pour le modèle de segmentation. (2) La segmentation basée sur l’apprentissage profond est appliquée aux cultures d’images. (3) Les cultures de production segmentées sont recousues à leur taille d’origine. (4) Les segmentations montées sont squelettées. (6) L’analyse morphologique est effectuée sur la base de la topologie des squelettisations. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Squelette mitochondrial superposé à la sortie de segmentation des images de microscopie. (A) La sortie de segmentation. (B) Le squelette rectiligne (distance euclidienne entre les points de départ et d’arrivée d’une branche) est superposé au-dessus de la sortie de segmentation. Le code couleur du squelette représente la classe des mitochondries. Les réseaux sont rouges, les bâtonnets sont verts et les points sont de couleur violette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de la morphologie mitochondriale. (A) Un aperçu du pourcentage relatif des différentes catégories morphologiques basé sur la longueur mitochondriale totale. (B) Comparaison de la longueur moyenne des branches mitochondriales entre les conditions expérimentales et entre les catégories morphologiques. L’axe des x affiche les catégorisations morphologiques et l’axe des y affiche la longueur moyenne des branches des mitochondries en nanomètres (nm). La signification statistique sous forme de valeurs p est indiquée comme suit : p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 et **** p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Cas d’échec de la segmentation. Une forte densité de mitochondries est un scénario difficile pour le modèle de segmentation. Le squelette coloré montre la plus longue mitochondrie unique détectée dans l’image. En parcourant les mesures de longueur, ces scénarios peuvent être détectés et travaillés pour améliorer les résultats de segmentation en utilisant l’opérateur morphologique érode (amincit le squelette détecté). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Nous discutons des précautions liées aux étapes critiques du protocole dans les paragraphes sur la « génération de géométrie » et les « paramètres du simulateur ». Le paragraphe intitulé « apprentissage par transfert » traite des modifications pour un débit plus élevé lors de l’adaptation à plusieurs microscopes. Les paragraphes sur « l’analyse des particules » et « la génération d’autres structures subcellulaires » font référence aux applications futures de cette méthode. Le paragraphe sur la « différence par rapport à la vérité biologique » discute des différentes raisons pour lesquelles les simulations pourraient différer des données réelles et si ces raisons ont un impact sur notre application. Enfin, nous discutons d’un scénario difficile pour notre méthode dans le paragraphe « structures densément emballées ».
Génération de géométrie
Pour générer la géométrie 3D des mitochondries, une structure 2D simple créée à partir de courbes b-splines en tant que squelettes fonctionne bien pour la création de l’ensemble de données synthétiques. Ces formes synthétiques imitent étroitement les formes des mitochondries observées dans les cultures cellulaires 2D. Cependant, dans le cas de tissus 3D tels que le tissu cardiaque, la forme et la disposition des mitochondries sont très différentes. Dans de tels cas, les performances du modèle de segmentation peuvent s’améliorer avec l’ajout de la directionnalité dans les images simulées.
Paramètres du simulateur
Des précautions doivent être prises lors de la définition des paramètres du simulateur pour s’assurer qu’ils correspondent à ceux des données sur lesquelles exécuter l’inférence, car ne pas le faire peut entraîner une baisse des performances lors de la segmentation. L’un de ces paramètres est la plage de rapport signal sur bruit (SNR). La plage du SNR des données à tester doit correspondre aux valeurs de l’ensemble de données simulé. De plus, le PSF utilisé doit correspondre à celui des données d’essai cibles. Par exemple, les images formées par modèle à partir d’une PSF confocale ne doivent pas être utilisées pour tester les images d’un microscope épifluorescent. Un autre paramètre à prendre en compte est l’utilisation d’un grossissement supplémentaire dans les données de test. Si un grossissement supplémentaire a été utilisé dans les données d’essai, le simulateur doit également être réglé de manière appropriée.
Apprentissage par transfert
L’apprentissage par transfert est le phénomène consistant à tirer parti d’un modèle appris entraîné sur une tâche pour une utilisation dans une autre tâche. Ce phénomène est également applicable à notre problème en ce qui concerne différents types de données de microscope. Les poids du modèle de segmentation (fourni avec le code source) qui est entraîné sur un type de données de microscopie peuvent être utilisés pour initialiser un modèle de segmentation à utiliser sur un autre type de données de microscope optique. Cela nous permet de nous entraîner sur un sous-ensemble beaucoup plus petit de l’ensemble de données d’apprentissage (3 000 images contre 10 000), réduisant ainsi les coûts de calcul de la simulation.
Analyse des particules
L’analyse des particules peut également être effectuée sur les masques segmentés. Cela peut fournir des informations sur la zone et la courbure, etc., des mitochondries individuelles. Ces informations peuvent également servir de métriques pour la comparaison quantitative des mitochondries (non utilisées pour cette expérience). Par exemple, à l’heure actuelle, nous définissons la morphologie des points à l’aide d’un seuil basé sur la longueur des mitochondries. Il peut être utile, dans certains cas, d’incorporer l’ellipticité pour mieux séparer les petites mitochondries en forme de bâtonnets des puncta ou des mitochondries en forme de points. Alternativement, si certaines conditions biologiques provoquent l’enroulement des mitochondries, la quantification de la courbure peut être intéressante pour analyser la population mitochondriale.
Génération d’autres structures sous-cellulaires
La segmentation physique des structures subcellulaires a été démontrée pour les mitochondries et les vésicules1. Bien que les vésicules présentent des formes variables, leurs tailles sont plus petites et elles apparaissent comme de simples sphères lorsqu’elles sont observées au microscope à fluorescence. Par conséquent, la géométrie des vésicules est simulée à l’aide de structures sphériques d’une gamme de diamètre appropriée. Cela implique un changement dans la fonction génère la géométrie (cylindres dans le cas des mitochondries et sphères dans le cas des vésicules) des structures et les paramètres respectifs (étape 5.4 dans la section protocole). Géométriquement, le réticulum endoplasmique et les microtubules ont également été simulés en tant que structures tubulaires17. La modélisation du réticulum endoplasmique avec un diamètre de 150 nm et des microtubules avec un diamètre extérieur moyen de 25 nm et un tube creux interne de 15 nm de diamètre fournit des approximations des formes de ces structures. Un autre paramètre qui variera pour chacune de ces structures sous-cellulaires est la densité fluorophore. Ceci est calculé en fonction de la distribution de la biomolécule à laquelle les fluorophores se lient et de la probabilité de liaison.
Différence par rapport à la réalité biologique du terrain
Les données simulées utilisées pour l’entraînement supervisé par simulation du modèle d’apprentissage profond diffèrent des données réelles à bien des égards. i) L’absence d’étiquetage non spécifique dans les données simulées diffère des données réelles, car il y a souvent des fluorophores flottant librement dans les données réelles. Cela entraîne une valeur d’arrière-plan moyenne plus élevée dans l’image réelle. Cette différence est atténuée en faisant correspondre le SNR et en définissant la valeur d’arrière-plan de telle sorte qu’elle corresponde aux valeurs réelles observées. (ii) Le mouvement des structures subcellulaires et la photocinétique sont deux sources de dynamique dans le système. Les structures en mouvement dans les cellules dynamiques (qui se déplacent dans la plage de quelques millisecondes) provoquent un flou de mouvement. Le temps d’exposition est réduit lors de l’acquisition de données réelles pour éviter l’effet de flou. D’autre part, nous ne simulons pas le timelapse et supposons des structures immobiles; Cette hypothèse est valable lorsque le temps d’exposition dans les données réelles est faible. Cependant, cette hypothèse peut produire une erreur dans la sortie si le temps d’exposition des données réelles est suffisamment important pour introduire un flou de mouvement. La photocinétique, d’autre part, est de l’ordre de nanosecondes à microsecondes et peut être omise dans la simulation, car les temps d’exposition habituels des expériences sont suffisamment longs (de l’ordre de la milliseconde) pour faire la moyenne des effets de la photocinétique. (iii) Le bruit dans les images au microscope a des sources différentes, et ces sources ont des fonctions de densité de probabilité différentes. Au lieu de modéliser ces sources de bruit individuelles, nous l’approximons comme un bruit gaussien sur un fond constant. Cette différence ne modifie pas de manière significative la distribution des données dans les conditions de faible rapport signal/bruit de fond (de l’ordre de 2 à 4) et lorsqu’il s’agit de la macrodensité des fluorophores1. (iv) Les artefacts en imagerie peuvent provenir d’aberrations, de dérives et de flous systématiques. Nous supposons que le microscope est bien aligné et que les régions choisies pour l’analyse dans les données réelles sont dépourvues de ces artefacts. Il est également possible de modéliser certains de ces artefacts dans le PSF18,19,20.
Structures densément tassées
Les difficultés liées à l’impossibilité de différencier les tiges qui se chevauchent des réseaux constituent un problème persistant dans la segmentation des données de microscopie 2D. Un scénario extrêmement difficile est présenté à la figure 5, où les mitochondries sont densément emballées, ce qui conduit à des résultats sous-optimaux dans le modèle de segmentation et l’analyse suivante. Malgré ce défi, l’utilisation d’opérateurs morphologiques dans de telles situations pour amincir le squelettage peut aider à briser ces réseaux trop connectés tout en permettant de détecter des changements significatifs dans toutes les catégories de morphologie mitochondriale. De plus, l’utilisation d’un microscope confocal plutôt que d’un microscope à grand champ pour l’imagerie est une méthode pour atténuer partiellement ce problème en éliminant la lumière floue. De plus, à l’avenir, il serait utile d’effectuer une segmentation 3D pour différencier les mitochondries qui se croisent (c’est-à-dire forment physiquement un réseau) des mitochondries en forme de bâtonnets dont les projections dans un seul plan se chevauchent.
La segmentation par apprentissage profond est un outil prometteur qui offre d’étendre les capacités d’analyse des utilisateurs de microscopie, ouvrant ainsi la possibilité d’une analyse automatisée de données complexes et de grands ensembles de données quantitatives, ce qui aurait été auparavant ingérable.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts liés à cet article.
Acknowledgments
Les auteurs prennent acte de la discussion avec Arif Ahmed Sekh. Zambarlal Bhujabal est reconnu pour avoir aidé à construire les cellules H9c2 stables. Nous reconnaissons le financement suivant : la subvention de démarrage du CER n° 804233 (à K.A.), la subvention n° 325741 (à D.K.P.), la subvention n° HNF1449-19 (Å.B.B.) et le projet de financement thématique de l’UIT VirtualStain avec Cristin Project ID 2061348 (D.K.P., Å.B.B., K.A. et A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | FALCON | 353043 | |
| Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16200 | |
| Axio Vert.A1 | Zeiss | Brightfield microscope | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Computer | n/a | n/a | Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory |
| Coverslips | VWR | 631-0150 | |
| DAPI (stain) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DMEM | gibco | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Glass Slides (frosted edge) | epredia | AA00000112E01MNZ10 | |
| H9c2 mCherry-EGFP-OMP25 | In-house stable cell line derived from purchased cell line | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51033557 | |
| LSM 800 | Zeiss | Confocal Microscope | |
| Mounting Media (Glass) | Thermo Fisher Scientific | P36980 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | J19943-K2 | |
| Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4 | Zeiss | 420782-9900-000 | |
| Sterile laminar flow hood | Labogene | SCANLAF MARS | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Vacusafe aspiration system | VACUUBRAND | 20727400 | |
| ZEN 2.6 | Zeiss |
References
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