Summary
Questo articolo spiega come utilizzare l'apprendimento automatico supervisionato dalla simulazione per analizzare la morfologia dei mitocondri nelle immagini al microscopio a fluorescenza di cellule fisse.
Abstract
L'analisi quantitativa di organelli subcellulari come i mitocondri nelle immagini di microscopia a fluorescenza cellulare è un compito impegnativo a causa delle sfide intrinseche nella segmentazione di queste strutture piccole e morfologicamente diverse. In questo articolo, dimostriamo l'uso di una pipeline di segmentazione e analisi assistita dall'apprendimento automatico per la quantificazione della morfologia mitocondriale nelle immagini di microscopia a fluorescenza di cellule fisse. Lo strumento di segmentazione basato sul deep learning viene addestrato su immagini simulate ed elimina la necessità di annotazioni di verità di base per l'apprendimento approfondito supervisionato. Dimostriamo l'utilità di questo strumento su immagini al microscopio a fluorescenza di cardiomioblasti fissi con un'espressione stabile di marcatori mitocondriali fluorescenti e impieghiamo specifiche condizioni di coltura cellulare per indurre cambiamenti nella morfologia mitocondriale.
Introduction
In questo articolo, dimostriamo l'utilità di uno strumento di apprendimento automatico basato sulla fisica per la segmentazione subcellulare1 nelle immagini di microscopia a fluorescenza di cardiomioblasti fissi che esprimono marcatori mitocondriali fluorescenti.
I mitocondri sono i principali organelli che producono energia nelle cellule di mammifero. In particolare, i mitocondri sono organelli altamente dinamici e si trovano spesso in reti che cambiano costantemente in lunghezza e ramificazione. La forma dei mitocondri influisce sulla loro funzione e le cellule possono cambiare rapidamente la loro morfologia mitocondriale per adattarsi a un cambiamento nell'ambiente2. Per comprendere questo fenomeno, la classificazione morfologica dei mitocondri come punti, bastoncelli o reti è altamente informativa3.
La segmentazione dei mitocondri è cruciale per l'analisi della morfologia mitocondriale nelle cellule. Gli attuali metodi per segmentare e analizzare le immagini al microscopio a fluorescenza dei mitocondri si basano sulla segmentazione manuale o su approcci convenzionali di elaborazione delle immagini. Gli approcci basati sulla soglia come Otsu4 sono meno accurati a causa degli elevati livelli di rumore nelle immagini al microscopio. Tipicamente, le immagini per l'analisi morfologica dei mitocondri presentano un gran numero di mitocondri, rendendo noiosa la segmentazione manuale. Gli approcci matematici come MorphoLibJ5 e gli approcci di apprendimento automatico semi-supervisionati come Weka6 sono molto esigenti e richiedono conoscenze specialistiche. Una revisione delle tecniche di analisi delle immagini per i mitocondri7 ha dimostrato che le tecniche basate sull'apprendimento profondo possono essere utili per il compito. In effetti, la segmentazione delle immagini nelle immagini della vita quotidiana per applicazioni come la guida autonoma è stata rivoluzionata con l'uso di modelli basati sul deep learning.
Il deep learning è un sottoinsieme dell'apprendimento automatico che fornisce algoritmi che apprendono da grandi quantità di dati. Gli algoritmi di deep learning supervisionati apprendono le relazioni da grandi insiemi di immagini annotate con le loro etichette di verità fondamentale (GT). Le sfide nell'utilizzo dell'apprendimento profondo supervisionato per segmentare i mitocondri nelle immagini al microscopio a fluorescenza sono duplici. In primo luogo, l'apprendimento approfondito supervisionato richiede un ampio set di dati di immagini di addestramento e, nel caso della microscopia a fluorescenza, fornire questo grande set di dati sarebbe un compito esteso rispetto a quando si utilizzano immagini tradizionali basate su telecamere più facilmente disponibili. In secondo luogo, le immagini di microscopia a fluorescenza richiedono annotazioni GT degli oggetti di interesse nelle immagini di addestramento, che è un compito noioso che richiede conoscenze specialistiche. Questo compito può facilmente richiedere ore o giorni del tempo dell'esperto per una singola immagine di cellule con strutture subcellulari etichettate in modo fluorescente. Inoltre, le variazioni tra gli annotatori rappresentano un problema. Per eliminare la necessità di annotazioni manuali e per poter sfruttare le prestazioni superiori delle tecniche di deep learning, è stato utilizzato un modello di segmentazione basato sul deep learning che è stato addestrato su immagini simulate. I simulatori basati sulla fisica forniscono un modo per imitare e controllare il processo di formazione delle immagini al microscopio, consentendo la creazione di immagini di forme note. Utilizzando un simulatore basato sulla fisica, è stato creato un ampio set di dati di immagini di microscopia a fluorescenza simulata dei mitocondri.
La simulazione inizia con la generazione della geometria utilizzando curve parametriche per la generazione di forme. Gli emettitori sono posizionati casualmente sulla superficie della forma in modo uniformemente distribuito in modo tale che la densità corrisponda ai valori sperimentali. Una funzione di diffusione del punto 3D (PSF) del microscopio viene calcolata utilizzando un'approssimazione computazionalmente efficiente8 del modello Gibson-Lanni9. Per abbinare fedelmente le immagini simulate con le immagini sperimentali, sia la corrente oscura che il rumore di ripresa vengono emulati per ottenere il realismo fotografico. Il GT fisico viene generato sotto forma di mappa binaria. Il codice per la generazione del dataset e il training del modello di simulazione è disponibile10 e il passaggio per la creazione di questo dataset simulato è descritto nella Figura 1.
Mostriamo l'utilità della segmentazione basata sul deep learning addestrata interamente su un set di dati simulato analizzando immagini al microscopio confocale di cardiomioblasti fissi. Questi cardiomioblasti esprimevano un marcatore fluorescente nella membrana esterna mitocondriale, consentendo la visualizzazione dei mitocondri nelle immagini di microscopia a fluorescenza. Prima di condurre l'esperimento fornito come esempio qui, le cellule sono state private del glucosio e adattate al galattosio per 7 giorni in coltura. La sostituzione del glucosio nei mezzi di crescita con galattosio costringe le cellule in coltura a diventare più ossidative e, quindi, dipendenti dai loro mitocondri per la produzione di energia11,12. Inoltre, questo rende le cellule più sensibili al danno mitocondriale. I cambiamenti della morfologia mitocondriale possono essere indotti sperimentalmente aggiungendo un agente di disaccoppiamento mitocondriale come il cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP) al terreno di coltura cellulare13. La CCCP porta ad una perdita del potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) e, quindi, provoca cambiamenti nei mitocondri da una morfologia più tubulare (simile a un bastoncello) a una più globulare (a punti)14. Inoltre, i mitocondri tendono a gonfiarsi durante il trattamento CCCP15. Mostriamo la distribuzione morfologica dei cambiamenti dei mitocondri quando i cardiomioblasti adattati al galattosio sono stati trattati con il disaccoppiatore mitocondriale CCCP. Le segmentazioni di deep learning dei mitocondri ci hanno permesso di classificarli come punti, bastoncelli o reti. Abbiamo quindi derivato metriche quantitative per valutare le lunghezze dei rami e l'abbondanza dei diversi fenotipi mitocondriali. Le fasi dell'analisi sono descritte nella Figura 2 e i dettagli della coltura cellulare, dell'imaging, della creazione di set di dati per la segmentazione basata sull'apprendimento profondo, nonché l'analisi quantitativa dei mitocondri, sono riportati di seguito.
Protocol
NOTA: Le sezioni 1-4 possono essere omesse se si lavora con immagini al microscopio esistenti di mitocondri con condizioni sperimentali note.
1. Coltura cellulare
- Coltivare le cellule H9c2 in DMEM senza glucosio integrato con 2 mM di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 10 mM di galattosio, 10% FBS, 1% di streptomicina / penicillina e 1 μg / mL di puromicina. Lasciare che le cellule si adattino al galattosio per almeno 7 giorni in coltura prima degli esperimenti.
NOTA: Le cellule H9c2 utilizzate qui sono state geneticamente modificate per esprimere mitocondri fluorescenti e hanno anche acquisito un gene di resistenza alla puromicina. L'aggiunta di questo antibiotico assicura la crescita delle cellule con il gene di resistenza e, quindi, i mitocondri fluorescenti. - Seminare le cellule H9c2 per l'esperimento quando la confluenza cellulare raggiunge circa l'80% (pallone di coltura T75, valutato mediante microscopia a campo chiaro). Preriscaldare il fluido e la tripsina a 37°C per almeno 15 minuti prima di procedere.
NOTA: È possibile eseguire l'esperimento in parallelo con due o più diverse condizioni di coltura cellulare. La confluenza delle cellule H9c2 non deve essere superiore all'80% per prevenire la perdita di cellule mioblastiche. Al 100% di confluenza, le cellule formano miotubi e iniziano a differenziarsi. - Prepararsi per la semina delle cellule, operando in una cappa a flusso laminare sterile, posizionando un coprivetro # 1.5 per ogni condizione sperimentale in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Etichettare ogni condizione e i dettagli sperimentali sulla piastra a 12 pozzetti.
- Spostare il pallone di coltura cellulare dall'incubatore al piano di lavoro nella cappa. Aspirare il fluido utilizzando un sistema di aspirazione o una pipetta elettronica, quindi lavare due volte con 5 ml di PBS (temperatura ambiente).
- Spostare la tripsina preriscaldata sul piano di lavoro e aspirare il lavaggio finale PBS; quindi, aggiungere la tripsina preriscaldata per staccare le cellule (1 mL per un matraccio di coltura T75). Riporre il matraccio di coltura nell'incubatore per 2-3 minuti a 37°C.
- Spostare il mezzo preriscaldato sul piano di lavoro verso la fine dell'incubazione. Verificare che le cellule si siano staccate utilizzando un microscopio a campo chiaro.
- Se tutte le celle non si sono staccate, applicare alcuni colpetti attenti ma fermi sul lato del pallone per staccare le celle rimanenti.
- Riportare il pallone di coltura sul piano di lavoro. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura cellulare al pallone di coltura utilizzando una pipetta elettronica per arrestare l'azione della tripsina. Quando si aggiunge terreno di coltura al pallone, utilizzare la pipetta per disperdere ripetutamente il terreno sulla superficie per staccare e raccogliere le cellule in una sospensione cellulare.
- Pipettare la sospensione cellulare (5 ml) dal matraccio in una provetta da 15 ml.
- Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti. Aprire il tubo nella cappa, rimuovere il surnatante mediante aspirazione e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 5 ml di terreno di coltura cellulare.
- Valutare il numero di celle analizzando un piccolo volume della sospensione cellulare in un contatore automatico delle celle. Si noti il numero di cellule vive per millilitro di terreno di coltura.
- Spostare il volume desiderato (ad esempio, 150 μL per pozzetto) della sospensione cellulare, calcolata per una densità di semina di circa 2 x 104 celle/cm2, in una provetta da centrifuga pre-marcata da 15 ml. Aggiungere il terreno di coltura cellulare preriscaldato alla provetta da centrifuga da 15 mL ad un volume precalcolato in base al numero di pozzetti. Per piastre a 12 pozzetti, utilizzare un volume totale di 1 mL per ciascun pozzetto.
- Assicurarsi che la sospensione della cella diluita sia correttamente miscelata pipettando il contenuto della provetta della centrifuga su e giù più volte prima di erogare il volume appropriato a ciascun pozzetto. Una volta erogata la sospensione cellulare nel pozzetto, agitare la piastra in modo attentamente controllato in ogni direzione per distribuire meglio le celle in tutti i pozzetti. Inserire la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore a 37°C fino al giorno successivo.
- Controllare le cellule con un microscopio a campo chiaro per valutare la crescita. Se le cellule hanno raggiunto una crescita sufficiente a circa l'80% di confluenza, procedere ai passaggi successivi; In caso contrario, ripetere la valutazione ogni giorno fino a raggiungere una crescita sufficiente.
2. Procedura sperimentale
- Calcolare le quantità necessarie dei materiali per l'esperimento in base alle concentrazioni della soluzione madre. Scongelare i materiali congelati (30 mM di soluzione madre CCCP) a 37 °C e impostare il terreno di coltura cellulare per preriscaldare a 37 °C.
- Una volta scongelata, creare una soluzione di lavoro di CCCP da 10 μM diluendo la soluzione madre (1:3.000) in terreno di coltura cellulare.
NOTA: non pipettare volumi inferiori a 1 μL. - Iniziare i trattamenti sperimentali una volta che tutti i materiali necessari sono stati preparati e preriscaldati. Aspirare il terreno di coltura cellulare dai pozzetti della piastra a 12 pozzetti, quindi applicare rapidamente il mezzo fresco preriscaldato ai pozzetti di controllo e il mezzo preriscaldato con soluzione CCCP da 10 μM ai pozzetti delle condizioni di prova.
- Incubare la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore cellulare a 37°C per 2 ore. Durante il periodo di incubazione, preparare la soluzione di fissazione.
- Per la preparazione della soluzione di fissazione, utilizzare paraformaldeide (PFA) prefabbricata al 4% per diluire la soluzione madre di glutaraldeide (GA) al 25% allo 0,2% (1:125). Preriscaldare la soluzione a 37°C. Per una piastra a 12 pozzetti, 500 μL sono sufficienti per pozzetto.
ATTENZIONE: PFA e GA sono sostanze chimiche tossiche. Lavora in un cappuccio chimico con equipaggiamento protettivo. Vedere le rispettive SDS per i dettagli. - Al termine del periodo di incubazione, rimuovere la piastra a 12 pozzetti dall'incubatore e posizionarla sul piano di lavoro.
NOTA: il lavoro non richiede più un ambiente sterile. - Aspirare il terreno di coltura cellulare dai pozzetti e applicare la soluzione di fissazione preriscaldata. Riportare la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore a 37°C per 20 minuti.
- Aspirare la soluzione di fissazione al termine dell'incubazione e lavare ogni pozzetto due volte con PBS a temperatura ambiente. È possibile mettere in pausa l'esperimento in questa fase del protocollo e continuare in seguito.
- Se l'esperimento è in pausa, aggiungere 1 mL di PBS per pozzetto, sigillare la piastra a 12 pozzetti con pellicola di plastica (parafilm) e conservare a 4°C.
3. Colorazione e montaggio delle celle sui vetrini
- Scongelare il materiale DAPI (macchia nucleare) e centrifugare in una mini centrifuga prima dell'apertura. Preparare la soluzione di colorazione DAPI diluendo il brodo DAPI in PBS (1:1.000).
- Aspirare il PBS dalla piastra a 12 pozzetti e applicare 1 mL di soluzione colorante DAPI a ciascun pozzetto. Incubare al buio a temperatura ambiente per 5 min.
- Aspirare la soluzione colorante DAPI. Lavare due volte con 2 ml di PBS per pozzetto.
- Preparare vetrini da microscopio in vetro smerigliato (vetrini) lavandoli in etanolo al 70%, seguiti da tre lavaggi in PBS. Asciugare accuratamente i vetrini con tovaglioli di carta privi di lanugine e dirigerli verso la luce per verificare la presenza di segni di polvere o grasso.
NOTA: I guanti sono necessari per questo passaggio. - Etichetta i vetrini con i dettagli sperimentali. Trasferire il mezzo di montaggio in un tubo di microcentrifuga e ruotare verso il basso in una mini centrifuga.
- Preparatevi al montaggio delle copertine organizzando lo spazio di lavoro. Tenere a portata di mano una piastra a 12 pozzetti con vetrini di copertura, vetrini etichettati, supporto di montaggio, una pipetta, punte per pipette da 10 μL, tovaglioli di carta privi di lanugine e pinzette.
- Applicare 10 μL di mezzo di montaggio (ProLong Glass) su un vetrino preparato per montare un vetrino.
- Raccogliere il coprislip dalla piastra a 12 pozzetti usando una pinzetta e tamponare l'umidità dal coprislip toccando brevemente il bordo e il retro del coprislip sul tovagliolo di carta privo di lanugine preparato. Abbassare delicatamente il coperchio sulla goccia del supporto di montaggio.
- Ripetere i due passaggi precedenti per ogni copertina. Posizionare le goccioline del mezzo di montaggio per consentire da uno a quattro vetrini per vetrino.
- Assicurarsi che i vetrini siano su una superficie piana per evitare che i vetrini montati si muovono. Posizionare i vetrini in un luogo buio a temperatura ambiente durante la notte per consentire al supporto di montaggio di fissarsi. I campioni sono ora pronti per l'imaging. L'esperimento può essere messo in pausa in questa fase del protocollo e continuato in seguito.
- Se l'esperimento viene messo in pausa in questa fase, dopo aver lasciato che i campioni si posino per una notte a temperatura ambiente, coprirli con un foglio di alluminio per proteggerli dalla luce e conservarli a 4°C.
4. Microscopia e imaging
- Coprire i campioni in un foglio di alluminio per il trasporto (se non già fatto).
- All'arrivo presso l'impianto di microscopia, utilizzare H2O a doppia distillazione con carta da filtro per microscopio per pulire i residui di PBS dai vetrini di copertura. Controllare che non ci siano macchie sui vetrini tenendo i vetrini verso una luce intensa.
- Passare attraverso la procedura di avvio per il microscopio. Selezionare l'obiettivo appropriato (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27) e aggiungere il mezzo di immersione.
- Posizionare il campione nel portacampioni. All'interno del software del microscopio, utilizzare la scheda "Localizza" per attivare l'illuminazione a fluorescenza EGFP e, utilizzando gli oculari, regolare manualmente il livello z per mettere a fuoco il campione. Spegnere l'illuminazione a fluorescenza quando si trova la messa a fuoco.
- Passare alla scheda "Acquisisci" all'interno del software del microscopio. Utilizzare "Smart Setup" per selezionare i canali di fluorescenza da utilizzare per l'imaging. Per questo esperimento, sono stati selezionati i preset di canale EGFP e DAPI.
- Regola l'intensità di ciascun canale dalle impostazioni iniziali utilizzando l'istogramma dell'intensità come guida per ottimizzare la potenza del segnale. L'imaging può ora iniziare.
- Per l'imaging, utilizzare l'opzione del software per posizionare le posizioni di imaging in un array e centrare l'array al centro della copertina con 12 posizioni totali da visualizzare. Verificare che ogni posizione nella matrice contenga celle. Se non sono presenti celle, regolare la posizione in un'area con celle.
- Regolare la messa a fuoco di ogni posizione nell'array utilizzando l'autofocus del software del microscopio e seguire questo con una regolazione fine manuale per garantire che il maggior numero possibile di mitocondri sia a fuoco.
NOTA: il canale EGFP viene utilizzato per queste regolazioni manuali. - Ottenere le immagini utilizzando questo metodo per ogni copertina. Salvare i file di immagine e procedere con i passaggi per l'analisi morfologica.
5. Generazione di dati di addestramento simulati
- Scarica il codice10 e decomprimi il contenuto. Seguire le istruzioni riportate in README.md per configurare l'ambiente richiesto.
- Passare alla cartella denominata "src", che è la home directory per questo progetto. Le cartelle numerate all'interno contengono codici specifici per i diversi passaggi dell'utilizzo dello strumento.
Nota : utilizzare il comando "cd <>" per passare a qualsiasi sottocartella del codice. Per eseguire qualsiasi file python, utilizzare il comando "python < >.py ". La presentazione denominata "Tutorial.pptx" contiene un set completo di istruzioni per l'utilizzo del modello di segmentazione. - Fai una copia o usa la cartella "2. Mitochondria Simulation Airy", e rinominarlo (Airy è usato qui in quanto è la funzione PSF più vicina a un microscopio confocale, che è stato usato come microscopio attuale). Vai nella cartella denominata "simulatore".
NOTA: questa cartella contiene tutti i file relativi alla simulazione dei dati di addestramento. Ci sono tre serie di parametri da impostare per la simulazione. - Innanzitutto, per il simulatore nel file di configurazione batch "simulator/batch/bxx.csv", impostare i parametri per circa il campione, incluso il numero di mitocondri, la gamma di diametri e lunghezze delle strutture, l'intervallo dell'asse z che la struttura mostra e la densità dei fluorofori.
- Quindi, impostare i parametri relativi al sistema ottico.
- Questo set include il tipo di microscopio (che determina quale modello di PSF è selezionato), l'apertura numerica (N.A.), l'ingrandimento (M), la dimensione dei pixel (in μm), la lunghezza d'onda di emissione dei fluorofori e il parametro del rumore di fondo, ecc.
- Impostare i parametri ottici di N.A., l'ingrandimento e la lunghezza d'onda minima del dataset nel file "simulator/microscPSFmod.py".
- Impostare il valore desiderato per la dimensione dei pixel e impostare la lunghezza d'onda di emissione del set di dati come parametro per la funzione "process_matrix_all_z" nel file "simulatore/generate_batch_parallel.py".
- Impostare gli ultimi tre parametri della funzione "save_physics_gt" nel file "simulatore/generate_batch_parallel.py". I parametri sono la dimensione dei pixel (in nm), la dimensione dell'immagine di output e max_xy.
- Impostare il terzo set di parametri relativi al set di dati di output, ad esempio la dimensione delle immagini di output, il numero di riquadri in ogni immagine e il numero di immagini totali, nel file "simulatore/generate_batch_parallel.py".
- Eseguire il file "simulatore/generate_batch_parallel.py" per avviare la simulazione.
- Per ottenere l'immagine finale, creare una copia della cartella denominata "5. Data Preparation and Training/data preparation" nella home directory, e navigare al suo interno.
NOTA: ogni immagine del set di dati sintetico è formata creando un montaggio di quattro immagini simulate di 128 pixel x 128 pixel, che fornisce una dimensione finale dell'immagine di 256 pixel x 256 pixel. Questo genera prima molte tessere singole (circa 12.000) sia per le immagini del microscopio (nella cartella "output") che per le segmentazioni della verità di base (nella cartella "output/physics_gt").- Impostare i parametri del numero di lotto, il numero di immagini per batch e l'intervallo di rumore in "data_generator.py".
- Eseguire il file "data_generator.py" per creare le immagini di montaggio.
- Copiare le cartelle denominate "image" e "segment" in "5. Data Preparation and Training/datatrain/train" dalla cartella "5. Preparazione e formazione dei dati/preparazione dei dati/dati".
6. Segmentazione basata sul deep learning
- Eseguire il training del modello di segmentazione sulle immagini simulate come segue:
- Per addestrare il modello di segmentazione per un nuovo microscopio, passare al "5. Data Preparation and Training/train" e impostare i parametri della dimensione del batch, il modello backbone per la segmentazione, il numero di epoche e il tasso di apprendimento per l'addestramento nel file "train_UNet.py".
- Esegui "train_UNet.py" per iniziare l'allenamento. Il processo di addestramento visualizza la metrica per le prestazioni della segmentazione sul set di convalida simulato.
NOTA: al termine dell'addestramento, il modello viene salvato come "best_model.h5" nella sezione "5. Preparazione dati e formazione/formazione".
- Testare il modello su immagini di microscopio reali suddivise in una dimensione desiderabile per il modello addestrato attraverso i seguenti passaggi.
- Passare a "6. Prepare Test Data" e copiare il file ". png" dei dati nella cartella "png".
- Eseguite il file "split_1024_256.py" per suddividere le immagini in una dimensione desiderabile per il modello sottoposto a training. Questo crea ritagli di dimensioni 256 pixel x 256 pixel delle immagini nella cartella "dati".
- Copiare la cartella "data" creata nella cartella "7. Test Segmentation".
- Passare alla cartella "7. Test Segmentation" e impostare il nome del modello salvato da utilizzare.
- Per segmentare le colture, eseguire il file "segment.py". Le immagini segmentate vengono salvate nella cartella "output".
7. Analisi morfologica: Analisi della morfologia mitocondriale dei due gruppi di dati, "Glucosio" e "CCCP"
- Disporre i dati da analizzare (una cartella per ogni immagine, con ogni cartella contenente i ritagli di output segmentati di un'immagine).
- Scaricare e inserire il file supplementare denominato "make_montage.py" nella cartella denominata "7. Segmentazione dei test".
- Eseguite il file "make_montage.py" per ricucire l'output segmentato alle dimensioni originali dell'immagine.
- Creare una nuova cartella denominata "9. Analisi morfologica" all'interno della cartella "src".
- Installare i pacchetti Skan16 e Seaborn Python nell'ambiente usando il comando "pip install seaborn[stats] skan".
NOTA: le maschere di segmentazione sono scheletrate utilizzando la libreria denominata Skan per consentire l'analisi della topologia di ogni singolo mitocondrio. - Inserire il file supplementare " analyze_mitochondria.py " nella cartella "9. Analisi morfologica".
- Disporre le immagini di diversi gruppi dell'esperimento in diverse cartelle all'interno della cartella "7. Segmentazione dei test".
- Imposta i parametri di "dimensione pixel" e "percorso di input" nel file "analyze_mitochondria.py".
- Eseguire il file " analyze_mitochondria.py" per eseguire il codice per eseguire l'ossatura e creare grafici dell'analisi.
Representative Results
I risultati delle segmentazioni di deep learning dei mitocondri in immagini confocali di cardiomioblasti fissi che esprimono marcatori mitocondriali fluorescenti mostrano l'utilità di questo metodo. Questo metodo è compatibile con altri tipi di cellule e sistemi di microscopia, che richiedono solo la riqualificazione.
I cardiomioblasti H9c2 adattati al galattosio con mitocondri fluorescenti sono stati trattati con o senza CCCP per 2 ore. Le cellule sono state quindi fissate, colorate con un colorante nucleare e montate su vetrini per l'analisi al microscopio a fluorescenza. Un microscopio confocale è stato utilizzato per acquisire immagini sia delle cellule di controllo che di quelle trattate con CCCP. Abbiamo eseguito la nostra analisi su 12 immagini confocali, con circa 60 cellule per condizione. Lo stato morfologico dei mitocondri in ciascuna immagine è stato quindi determinato e quantificato. Le maschere di segmentazione ottenute dal modello addestrato sono state scheletrate per consentire l'analisi della topologia di ogni singolo mitocondrio per questo esperimento. La lunghezza del ramo dei singoli mitocondri è stata utilizzata come parametro per la classificazione. I singoli mitocondri sono stati classificati in classi morfologiche dalla seguente regola. In particolare, qualsiasi scheletro mitocondriale con una lunghezza inferiore a 1.500 nm è stato considerato un punto, e i mitocondri più lunghi sono stati ulteriormente classificati in rete o bastoncello. Se c'era almeno un incrocio in cui due o più rami si intersecavano, questo era definito come una rete; Altrimenti, il mitocondrio è stato classificato come un'asta. Un'immagine di esempio con gli scheletri mitocondriali etichettati con le classi morfologiche è mostrata nella Figura 3.
La categorizzazione della morfologia mitocondriale nella Figura 4A mostra che è possibile rilevare cambiamenti significativi quando il CCCP viene applicato per 2 ore; ciò è dimostrato più chiaramente dall'aumento dei punti per le cellule trattate con CCCP.
La lunghezza media dei rami nella Figura 4B è un'altra via per illustrare cambiamenti rilevabili e significativi nella morfologia. Sia i bastoncelli che le reti erano, come previsto, significativamente ridotti rispetto al controllo quando le cellule sono state trattate con CCCP. Ci si aspettava anche un aumento significativo delle lunghezze medie dei rami dei punti, dato il gonfiore che i mitocondri subiscono quando esposti al CCCP.
Figura 1: Pipeline per la simulazione di immagini al microscopio a fluorescenza. La pipeline include (i) generazione di geometria 3D, (ii) emettitori ed emulazione fotocinetica, (iii) convoluzione PSF 3D, (iv) aggiunta di rumore e (v) binarizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Fasi dell'analisi della morfologia mitocondriale basata sull'apprendimento automatico . (1) Le immagini da segmentare vengono prima ritagliate in dimensioni accettabili per il modello di segmentazione. (2) La segmentazione basata sul deep learning viene applicata ai ritagli di immagini. (3) Le colture segmentate in uscita sono ricucite alla loro dimensione originale. (4) Le segmentazioni montate sono scheletrizzate. (6) L'analisi morfologica è condotta sulla base della topologia delle scheletrature. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Scheletro mitocondriale sovrapposto all'output di segmentazione delle immagini di microscopia. (A) L'output della segmentazione. (B) Lo scheletro rettilineo (distanza euclidea tra i punti iniziale e finale di un ramo) è sovrapposto all'output della segmentazione. La codifica a colori dello scheletro raffigura la classe dei mitocondri. Le reti sono rosse, le aste sono verdi e i punti sono di colore viola. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi della morfologia mitocondriale. (A) Una panoramica della percentuale relativa delle diverse categorie morfologiche basata sulla lunghezza mitocondriale totale. (B) Confronto della lunghezza media del ramo mitocondriale tra le condizioni sperimentali e tra le categorie morfologiche. L'asse x visualizza le categorizzazioni morfologiche e l'asse y visualizza la lunghezza media dei rami dei mitocondri in nanometri (nm). La significatività statistica sotto forma di valori p è indicata come * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Caso di fallimento della segmentazione. Un'alta densità di mitocondri è uno scenario impegnativo per il modello di segmentazione. Lo scheletro colorato mostra i mitocondri singoli più lunghi rilevati nell'immagine. Passando attraverso le misurazioni della lunghezza, questi scenari possono essere rilevati e lavorati per migliorare i risultati della segmentazione utilizzando l'erode dell'operatore morfologico (riduce lo scheletro rilevato). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
Discutiamo le precauzioni relative ai passaggi critici del protocollo nei paragrafi "generazione della geometria" e "parametri del simulatore". Il paragrafo intitolato "transfer learning" discute le modifiche per una maggiore produttività quando ci si adatta a più microscopi. I paragrafi su "analisi delle particelle" e "generazione di altre strutture subcellulari" si riferiscono alle future applicazioni di questo metodo. Il paragrafo sulla "differenza dalla verità biologica" discute le diverse ragioni per cui le simulazioni potrebbero differire dai dati reali e se queste ragioni influenzano la nostra applicazione. Infine, discutiamo uno scenario impegnativo per il nostro metodo nel paragrafo "strutture densamente imballate".
Generazione della geometria
Per generare la geometria 3D dei mitocondri, una semplice struttura 2D creata da curve b-spline come scheletri funziona bene per la creazione del set di dati sintetico. Queste forme sintetiche emulano da vicino le forme dei mitocondri osservate nelle colture cellulari 2D. Tuttavia, nel caso di tessuti 3D come il tessuto cardiaco, la forma e la disposizione dei mitocondri sono molto diverse. In tali casi, le prestazioni del modello di segmentazione possono migliorare con l'aggiunta di direzionalità nelle immagini simulate.
Parametri del simulatore
È necessario prestare attenzione quando si impostano i parametri del simulatore per assicurarsi che corrispondano a quelli dei dati su cui eseguire l'inferenza, poiché in caso contrario si possono ridurre le prestazioni sulla segmentazione. Uno di questi parametri è l'intervallo del rapporto segnale-rumore (SNR). L'intervallo dell'SNR dei dati da testare deve corrispondere ai valori del set di dati simulato. Inoltre, le FPF utilizzate devono corrispondere a quelle dei dati di prova di destinazione. Ad esempio, le immagini addestrate al modello da una PSF confocale non dovrebbero essere utilizzate per testare le immagini di un microscopio epi-fluorescente. Un altro parametro a cui prestare attenzione è l'uso di ingrandimenti aggiuntivi nei dati di test. Se è stato utilizzato un ingrandimento aggiuntivo nei dati di prova, anche il simulatore deve essere impostato in modo appropriato.
Trasferire l'apprendimento
Il transfer learning è il fenomeno di sfruttare un modello appreso addestrato su un'attività per l'uso in un'altra attività. Questo fenomeno è applicabile anche al nostro problema in relazione a diversi tipi di dati al microscopio. I pesi del modello di segmentazione (fornito con il codice sorgente) che viene addestrato su un tipo di dati di microscopia possono essere utilizzati per inizializzare un modello di segmentazione da utilizzare su un altro tipo di dati del microscopio ottico. Questo ci consente di allenarci su un sottoinsieme significativamente più piccolo del set di dati di addestramento (3.000 immagini rispetto a 10.000), riducendo così i costi computazionali della simulazione.
Analisi delle particelle
L'analisi delle particelle può essere eseguita anche sulle maschere segmentate. Questo può fornire informazioni sull'area e la curvatura, ecc., dei singoli mitocondri. Queste informazioni possono anche servire come metriche per il confronto quantitativo dei mitocondri (non utilizzati per questo esperimento). Ad esempio, al momento, definiamo la morfologia del punto utilizzando una soglia basata sulla lunghezza dei mitocondri. Può essere utile, in alcuni casi, incorporare l'ellitticità per separare meglio i piccoli mitocondri simili a bastoncelli dai mitocondri puncta o puntiformi. In alternativa, se determinate condizioni biologiche causano il raggomitolamento dei mitocondri, la quantificazione della curvatura può essere interessante per analizzare la popolazione mitocondriale.
Generazione di altre strutture subcellulari
La segmentazione fisica delle strutture subcellulari è stata dimostrata per i mitocondri e le vescicole1. Sebbene le vescicole mostrino forme diverse, le loro dimensioni sono più piccole e appaiono come semplici sfere se osservate attraverso un microscopio a fluorescenza. Quindi, la geometria delle vescicole viene simulata utilizzando strutture sferiche di un intervallo di diametri appropriato. Ciò implica un cambiamento nella funzione genera la geometria (cilindri nel caso dei mitocondri e sfere nel caso delle vescicole) delle strutture e dei rispettivi parametri (punto 5.4 nella sezione protocollo). Geometricamente, anche il reticolo endoplasmatico e i microtubuli sono stati simulati come strutture tubolari17. La modellazione del reticolo endoplasmatico con un diametro di 150 nm e microtubuli con un diametro esterno medio di 25 nm e un tubo cavo interno di 15 nm di diametro fornisce approssimazioni delle forme di queste strutture. Un altro parametro che varierà per ciascuna di queste strutture subcellulari è la densità del fluoroforo. Questo viene calcolato in base alla distribuzione della biomolecola a cui i fluorofori si legano e alla probabilità di legame.
Differenza dalla verità biologica di base
I dati simulati utilizzati per l'addestramento supervisionato dalla simulazione del modello di deep learning differiscono dai dati reali in molti modi. (i) L'assenza di etichettatura non specifica nei dati simulati differisce dai dati reali, in quanto vi sono spesso fluorofori fluttuanti nei dati reali. Ciò causa un valore medio di sfondo più elevato nell'immagine reale. Questa differenza viene mitigata abbinando l'SNR e impostando il valore di sfondo in modo che corrisponda ai valori reali osservati. (ii) Il movimento delle strutture subcellulari e la fotocinetica sono due fonti di dinamica nel sistema. Le strutture in movimento nelle cellule vive (che si muovono nell'intervallo di pochi millisecondi) causano la sfocatura del movimento. Il tempo di esposizione viene ridotto durante l'acquisizione dei dati reali per evitare l'effetto di sfocatura. D'altra parte, non simuliamo il timelapse e assumiamo strutture immobili; Questa ipotesi è valida quando il tempo di esposizione nei dati reali è piccolo. Tuttavia, questa ipotesi può produrre un errore nell'output se il tempo di esposizione dei dati reali è abbastanza grande da introdurre la sfocatura del movimento. La fotocinetica, d'altra parte, è nell'ordine dei nanosecondi ai microsecondi e può essere omessa nella simulazione, poiché i tempi di esposizione usuali degli esperimenti sono abbastanza lunghi (nell'ordine dei millisecondi) per calcolare la media degli effetti della fotocinetica. (iii) Il rumore nelle immagini del microscopio ha fonti diverse, e queste sorgenti hanno diverse funzioni di densità di probabilità. Invece di modellare queste singole fonti di rumore, lo approssimiamo come un rumore gaussiano su uno sfondo costante. Questa differenza non altera significativamente la distribuzione dei dati per le condizioni di basso rapporto segnale-fondo (nell'intervallo 2-4) e quando si tratta della macro densità dei fluorofori1. (iv) Gli artefatti nell'imaging possono derivare da aberrazioni, deriva e sfocature sistematiche. Supponiamo che il microscopio sia ben allineato e che le regioni scelte per l'analisi nei dati reali siano prive di questi artefatti. C'è anche la possibilità di modellare alcuni di questi artefatti nel PSF18,19,20.
Strutture densamente imballate
La difficoltà di non essere in grado di differenziare le barre sovrapposte dalle reti è un problema persistente nella segmentazione dei dati di microscopia 2D. Uno scenario estremamente impegnativo è presentato nella Figura 5, in cui i mitocondri sono densamente impacchettati, il che porta a risultati non ottimali nel modello di segmentazione e nella seguente analisi. Nonostante questa sfida, l'uso di operatori morfologici in tali situazioni per snellire la scheletrizzazione può aiutare a rompere queste reti eccessivamente connesse, consentendo al contempo di rilevare cambiamenti significativi in tutte le categorie di morfologia mitocondriale. Inoltre, l'uso di un microscopio confocale piuttosto che a campo largo per l'imaging è un metodo per mitigare parzialmente questo problema eliminando la luce fuori fuoco. Inoltre, in futuro, sarebbe utile eseguire la segmentazione 3D per differenziare i mitocondri che si intersecano (cioè formano fisicamente una rete) dai mitocondri simili a bastoncelli le cui proiezioni in un unico piano si sovrappongono l'una con l'altra.
La segmentazione del deep learning è uno strumento promettente che offre di espandere le capacità di analisi degli utenti di microscopia, aprendo così la possibilità di analisi automatizzata di dati complessi e grandi set di dati quantitativi, che in precedenza sarebbero stati ingestibili.
Disclosures
Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse relativi a questo articolo.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono la discussione con Arif Ahmed Sekh. Zambarlal Bhujabal è riconosciuto per aver aiutato a costruire le cellule stabili H9c2. Riconosciamo i seguenti finanziamenti: sovvenzione iniziale del CER n. 804233 (a K.A.), sovvenzione per il progetto di ricerca per il rinnovamento scientifico n. 325741 (a D.K.P.), sovvenzione dell'Autorità sanitaria regionale della Norvegia settentrionale n. HNF1449-19 (Å.B.B.) e progetto di finanziamento tematico di UiT VirtualStain con Cristin Project ID 2061348 (D.K.P., Å.B.B., K.A. e A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | FALCON | 353043 | |
| Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16200 | |
| Axio Vert.A1 | Zeiss | Brightfield microscope | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Computer | n/a | n/a | Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory |
| Coverslips | VWR | 631-0150 | |
| DAPI (stain) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DMEM | gibco | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Glass Slides (frosted edge) | epredia | AA00000112E01MNZ10 | |
| H9c2 mCherry-EGFP-OMP25 | In-house stable cell line derived from purchased cell line | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51033557 | |
| LSM 800 | Zeiss | Confocal Microscope | |
| Mounting Media (Glass) | Thermo Fisher Scientific | P36980 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | J19943-K2 | |
| Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4 | Zeiss | 420782-9900-000 | |
| Sterile laminar flow hood | Labogene | SCANLAF MARS | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Vacusafe aspiration system | VACUUBRAND | 20727400 | |
| ZEN 2.6 | Zeiss |
References
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