Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

नैनोकणों द्वारा प्रेरित डीएनए क्षति और मरम्मत गतिशीलता की जांच के लिए डीएनए फाइबर परख का प्रदर्शन

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64903
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

पद्धति नैनोकणों की उपस्थिति में डीएनए प्रतिकृति गतिशीलता में भिन्नता के विश्लेषण में सहायता करती है। रुचि की सामग्री के साइटोटॉक्सिसिटी स्तर के आधार पर विभिन्न पद्धतियों को अपनाया जा सकता है। इसके अलावा, डीएनए फाइबर विश्लेषण में मदद करने के लिए छवि विश्लेषण का विवरण प्रदान किया जाता है।

Abstract

नैनोमटेरियल एक्सपोजर कोशिकाओं में प्रतिकृति तनाव और जीनोमिक अस्थिरता पैदा कर सकता है। अस्थिरता की डिग्री नैनोमटेरियल्स के रसायन विज्ञान, आकार और एकाग्रता, एक्सपोजर के समय और उजागर सेल प्रकार पर निर्भर करती है। कई स्थापित तरीकों का उपयोग यह स्पष्ट करने के लिए किया गया है कि अंतर्जात / बहिर्जात एजेंट वैश्विक प्रतिकृति को कैसे प्रभावित करते हैं। हालांकि, डीएनए फाइबर परख जैसे रेप्लिकॉन-स्तरीय परख, यह समझने के लिए अनिवार्य हैं कि ये एजेंट प्रतिकृति दीक्षा, समाप्ति और प्रतिकृति फोर्क प्रगति को कैसे प्रभावित करते हैं। यह जानने से किसी को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति मिलती है कि नैनोमटेरियल्स उत्परिवर्तन निर्धारण और जीनोमिक अस्थिरता की संभावना को कैसे बढ़ाते हैं। हमने ग्राफीन ऑक्साइड नैनोपार्टिकल एक्सपोजर के तहत प्रतिकृति गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए मॉडल कोशिकाओं के रूप में रॉ 264.7 मैक्रोफेज का उपयोग किया। यहां, हम डीएनए फाइबर परख के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें न्यूक्लियोटाइड एनालॉग, सेल लाइसिस के साथ पल्स लेबलिंग, स्लाइड पर पल्स-लेबल डीएनए फाइबर फैलाना, डीएनए फाइबर के भीतर न्यूक्लियोटाइड एनालॉग का फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके डीएनए फाइबर के भीतर प्रतिकृति मध्यवर्ती की इमेजिंग, और कंप्यूटर-असिस्टेड स्कोरिंग और विश्लेषण (सीएएसए) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रतिकृति मध्यवर्ती विश्लेषण शामिल है।

Introduction

प्रत्येक सेल चक्र के दौरान, डीएनए प्रतिकृति सटीक जीनोम दोहरावसुनिश्चित करती है। यूकेरियोटिक क्रोमोसोमल प्रतिकृति अनिवार्य रूप से तीन कारकों पर निर्भर करती है: कई प्रतिकृति उत्पत्ति के फायरिंग का समय, फायर किए गए मूल से निकलने वाले कांटे की गति, और प्रतिकृति प्रक्रिया की समाप्ति जब आसन्न मूल से दो प्रतिकृति कांटेमिलते हैं। बेटी कोशिकाओं को आनुवंशिक जानकारी के उच्च-निष्ठा संचरण के लिए, साथ ही आनुवंशिक अखंडता के संरक्षण के लिए, सटीक डीएनए प्रतिकृति महत्वपूर्ण है। एजेंट जो नियमित चयापचय से विकसित होते हैं या कृत्रिम या प्राकृतिक पर्यावरणीय सामग्री के कारण होते हैं, लगातार जीनोम पर हमला कर रहे हैं। ये अंतर्जात और बहिर्जात एजेंट इन एजेंटों के कारण डीएनए क्षति का सामना करने के कारण प्रतिकृति कांटे को धीमा या बंद कर देते हैं, और इन कठिनाइयों के जवाब में कांटे अस्थायी रूप से धीमा या बंद हो जाते हैं जिसे प्रतिकृति तनाव3 कहा जाता है। प्रतिकृति तनाव के जवाब में, कोशिकाओं ने कई आणविक मार्ग विकसित किए हैं जो परेशान प्रतिकृति फोर्क्स की स्थिरता को बनाए रखते हैं और उन्हें फिरसे शुरू करने की अनुमति देते हैं। आनुवंशिक स्थिरता, कोशिका अस्तित्व और मानव रोग के संदर्भ में, ये प्रतिकृति तनाव प्रतिक्रिया तंत्र एक स्वस्थ जीनोम को बनाए रखने, सेल अस्तित्व सुनिश्चित करने और रोग के गठन की संभावना को कमकरने के लिए महत्वपूर्ण कारकों के रूप में उभरे हैं।

प्रतिकृति तनाव पैदा करने में सक्षम बहिर्जात एजेंटों में से एक नैनोकणों है। नैनोपार्टिकल्स ऐसे कण होते हैं जो आकार में 1 एनएम से 100 एनएम6 तक होते हैं। उनके उच्च सतह क्षेत्रों, विशिष्ट आकृतियों और अद्वितीय रासायनिक गुणों के कारण, नैनोकणों का उपयोग विभिन्न चिकित्सा, दवा, पर्यावरण औरऔद्योगिक अनुप्रयोगों में किया जाता है। जबकि नैनोकणों के बहुत सारे संभावित लाभ हैं, उनमें से कुछ (उनकी विरासत में मिली प्रकृति या दीर्घायु के कारण) विषाक्त हो सकते हैं। नैनोपार्टिकल्स चिकित्सा प्रत्यारोपण के प्राकृतिक टूट-फूट के कारण भी बन सकते हैं और पेरी-प्रोस्थेटिक क्षेत्र 9,10 में जारी किए जा सकते हैं।

विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उत्पादित नैनोकणों के असंख्य के लिए मनुष्यों के संपर्क के कारण, नैनोपार्टिकल विषाक्तता के क्षेत्र में अनुसंधान पिछले 10वर्षों में काफी बढ़ गया है। हालांकि इन शोध प्रयासों ने नैनोकणों द्वारा मानव स्वास्थ्य के लिए संभावित खतरे के बारे में बहुतायत में जानकारी का खुलासा किया है, नैनोकणों के जीनोटॉक्सिसिटी पैदा करने की क्षमता के बारे में ज्ञान अभी भी सीमित है। अब तक जो पता चला है वह यह है कि ये नैनोकण शारीरिक रूप से डीएनए के साथ बातचीत कर सकते हैं, डीएनए क्षति को बढ़ावा दे सकते हैं, और डीएनए12 की मरम्मत या प्रतिकृति के लिए जिम्मेदार प्रोटीन को नुकसान पहुंचा सकते हैं या हस्तक्षेप कर सकते हैं। यह पता लगाने के लिए कि वे डीएनए प्रतिकृति में कैसे हस्तक्षेप करते हैं, डीएनए फाइबर कॉम्बिंग, रेडियोरेसिस्टेंट डीएनए संश्लेषण (आरडीएस), और डीएनए फाइबर विश्लेषण आमतौर पर13,14,15,16 का उपयोग किया जाता है।

डीएनए फाइबर कॉम्बिंग विधि लचीली है और एकल-अणु स्तर17 पर प्रतिकृति फोर्क गतिशीलता के बारे में जानकारी देती है। संक्षेप में, एक सैलिनाइज्ड कवरस्लिप को डीएनए समाधान से धीरे-धीरे वापस ले लिया जाता है जब डीएनए समाप्त हो जाता है। डीएनए अणुओं को समाधान के मेनिस्कस द्वारा सीधा और संरेखित किया जाता है। डीएनए फाइबर की समरूपता, रिक्ति और संरेखण सटीक और भरोसेमंद फाइबर ट्रैक्ट लंबाई माप का समर्थन करते हैं। उपचार की लंबाई और अनुक्रम और तनाव या क्षति का कारण बनने के लिए उपयोग की जाने वाली दवाओं को समायोजित करके, इस एप्लिकेशन का उपयोग करके फोर्क उन्नति के कई पहलुओं की निगरानी की जा सकती है। इस विधि में, एक दोहरी लेबलिंग प्रणाली का उपयोग किया जाता है, जिसके माध्यम से प्रतिकृति कांटे की गति और प्रगति का आकलन17,18 किया जाता है। दूसरी ओर, 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन इस तथ्य का लाभ उठाता है कि, एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन में, ब्रांचिंग डीएनए संरचनाएं एक ही द्रव्यमान के रैखिक डीएनए अणुओं की तुलना में अधिक धीरे-धीरे यात्रा करती हैं, जिससे 2 डी रन में दोनों के स्वच्छ पृथक्करण की अनुमति मिलती है। वास्तव में, इस विधि की जांच डीएनए अणुओं को पहले रन में उनके द्रव्यमान के आधार पर और दूसरे ऑर्थोगोनल रन में उनके आकार के आधार पर अलग करने के लिए की जाती है। जीनोमिक डीएनए विखंडन के बाद, असामान्य प्रतिकृति और पुनर्संयोजन मध्यवर्ती एक शाखा रूप विकसित करते हैं, और उन्हें 2 डी जेल19 में अधिक सामान्य रैखिक अणुओं से अलग किया जा सकता है।

आरडीएस विधि का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि वैश्विक डीएनए संश्लेषण कैसे प्रभावित होता है। इस विधि में, वैश्विक प्रतिकृति के निषेध की डिग्री अनुपचारित बनाम उपचारित कोशिकाओं 14,20 में शामिल रेडियोधर्मी लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड्स की मात्रा की तुलना करके निर्धारित की जाती है, जैसे कि [14 सी] थाइमिडाइन। अनुपचारित और उपचारित कोशिकाओं के बीच रेडियोलेबलिंग में प्रतिशत अंतर उस डिग्री का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर डीएनए-हानिकारक एजेंट डीएनए संश्लेषण को प्रभावित करता है। इसके समान, एक अन्य विधि डीएनए संश्लेषण21,22 की समग्र दरों को मापने के लिए फ्लो साइटोमेट्री के लिए बीआरडीयू (5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन) जैसे न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स को एकीकृत करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का उपयोग करती है। हालांकि ये विधियां प्रदर्शित करती हैं कि डीएनए-हानिकारक एजेंट वैश्विक डीएनए संश्लेषण को कैसे प्रभावित करते हैं, वे यह नहीं दिखाते हैं कि व्यक्तिगत रिप्लिकॉन कैसे प्रभावित होते हैं। दरअसल, विषाक्त कण (नैनोमटेरियल) जोखिम की स्थिति में जीनोमिक अस्थिरता की दीक्षा और सीमा को बेहतर ढंग से समझने के लिए रेप्लिकॉन-स्तर के परीक्षण अनिवार्य हैं। डीएनए फाइबर ऑटोरेडियोग्राफी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इस23,24,25,26 को निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली कुछ विधियां हैं।

असमान रूप से अंतरिक्ष स्रोतों से प्रतिकृति बुलबुले और द्विदिश प्रतिकृति की अवधारणाओं को पहली बार इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और डीएनए फाइबर ऑटोरेडियोग्राफी27,28 जैसे एकल-अणु परीक्षणों का उपयोग करके विकसित किया गया था। कार्बन-लेपित ग्रिड में फैले विशिष्ट अणुओं पर ब्रांचिंग प्रतिकृति मध्यवर्ती का प्रत्यक्ष अवलोकन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा बहुत सुविधाजनक है। यह विधि, जो प्रतिकृति कांटे पर पैथोलॉजिकल बदलावों को ट्रैक करने के लिए आज भी उपयोग में है, का उपयोग डीएनए प्रतिकृति28 के पहले यूकेरियोटिक मूल का पता लगाने के लिए किया गया था। फाइबर ऑटोरेडियोग्राफी नए दोहराए गए क्षेत्रों की ऑटोरेडियोग्राफिक पहचान की अवधारणा और ट्रिटाइज्ड थाइमिडाइन के साथ गुणसूत्रों की पल्स टैगिंग की अवधारणा के आसपास केंद्रित है। मेटाज़ोन जीनोमिक अनुक्रमों में उत्पत्ति घनत्व और प्रतिकृति फोर्क दरों का पहला मात्रात्मक मूल्यांकन डीएनए फाइबर ऑटोरेडियोग्राफी29 द्वारा संभव बनाया गया था।

वर्तमान में, फाइबर फ्लोरोग्राफी विधियों ने ऑटोरेडियोग्राफी की जगह ले ली है, मुख्य रूप से क्योंकि फाइबर फ्लोरोग्राफी ऑटोरेडियोग्राफी की तुलना में बहुत तेज है। फाइबर फ्लोरोग्राफी में, दो हैलोजेनेटेड न्यूक्लियोटाइड डेरिवेटिव, जैसे ब्रोमो- (बीआर), क्लोरो- (सीएल), या आयोडोडोक्सीयूरिडीन (आईडीयू), क्रमिक रूप से ताजा प्रतिकृति डीएनए में शामिल किए जाते हैं और फिर एंटीबॉडी30 का उपयोग करके अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पहचाने जाते हैं। नवजात डीएनए का सूक्ष्म अवलोकन जिसने एक या दोनों एनालॉगों को शामिल किया है, एक रंग में एनालॉगों में से एक और दूसरे एनालॉग को एक अलग रंग में इम्यूनोस्टेनिंग करके संभव बनाया जाता है (उदाहरण के लिए, आईडीयू लाल और शामिल सीएलडीयू हरे रंग के साथ इम्यूनोस्टेनिंग नवजात डीएनए) (चित्रा 1)21)। डीएनए फाइबर विश्लेषण द्वारा कई अलग-अलग प्रकार के प्रतिकृति मध्यवर्ती की पहचान की जा सकती है। सबसे अधिक अध्ययन किए जाने वाले व्यक्तिगत एलॉन्गिंग फोर्क, दीक्षा और समाप्ति हैं। अलग-अलग एलॉन्गिंग फोर्क्स में लाल रंग का प्रतिकृति पैटर्न होता है, जिसके बाद हरा (लाल-हरा; चित्रा 2 ए)। इन मध्यवर्ती की लंबाई का उपयोग अक्सर कांटे की गति (यानी, कांटा लंबाई / पल्स समय) या ट्रैक शॉर्टनिंग (चित्रा 2 ई) 30,31,32 के माध्यम से नवजात डीएनए के एक्सोन्यूक्लियोलाइटिक क्षरण को मापने के लिए किया जाता है। मिमिटौ एट अल द्वारा किए गए एक अध्ययन में, यह पाया गया कि हाइड्रॉक्सीयूरिया के लंबे समय तक संपर्क में रहने पर, एक प्रतिकृति जहर जो डीएनए में डबल-स्ट्रैंड ब्रेक का कारण बनता है, आरई 11 को33 में भर्ती किया गया था। एमआरई 11 एक एक्सोन्यूक्लिज़ है जो अपनी 3'-5' एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि के लिए जाना जाता है, और यह मरम्मत के लिए डीएनए के सिरों को काटने में सक्षम है। इसलिए, विषाक्त एजेंटों के संपर्क में आने पर, कोई नवजात डीएनए के एक्सोन्यूक्लियोलाइटिक क्षरण का निरीक्षण कर सकता है, जो डीएनए-हानिकारक एजेंट34 के संपर्क में आने के कारण डीएनए स्ट्रैंड का छोटा होना है।

शारीरिक अवरोधों (डीएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स या डीएनए घावों), रासायनिक बाधाओं, या उत्परिवर्तन द्वारा लाए गए प्रतिकृति कांटा टूटना प्रतिकृति को रोक सकता है और इसे फिर से शुरू करने के लिए समरूप पुनर्संयोजन की आवश्यकता हो सकती है। इसे बिगड़ा हुआ कांटा प्रगति के रूप में जाना जाता है। कई इन विट्रो और विवो जांचों ने संकेत दिया है कि प्रतिलेखन, कभी-कभी,इस तरह से प्रतिकृति फोर्क प्रगति को रोक सकता है।

दीक्षा प्रतिकृति उत्पत्ति है जो पहली या दूसरी नाड़ी के दौरान शुरू और आग लगाती है। उत्पत्ति जो पहली नाड़ी के दौरान आग लगाती है और प्रतिकृति कांटे होते हैं जो सक्रिय होते रहते हैं, उनमें हरे-लाल-हरे रंग का पैटर्न होता है (चित्रा 2 बी, निचला)। दूसरी पल्स के दौरान शुरू होने वाली उत्पत्ति में एक हरा-केवल पैटर्न होता है (चित्रा 2 बी, ऊपरी) और कभी-कभी इसे नई शुरू की गई उत्पत्ति कहा जाता है, इसलिए उन मूलों को उन लोगों से अलग किया जा सकता है जो पहली नाड़ी के दौरान शुरू होते हैं। दो प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच नए निकाले गए मूल के सापेक्ष प्रतिशत की तुलना किसी को यह समझने की अनुमति देती है कि एक कोशिका डीएनए-हानिकारक एजेंट या प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का जवाब कैसे देती है। समाप्ति तब बनाई जाती है जब आसन्न रिप्लिकॉन से दो प्रतिकृति कांटे विलय हो जाते हैं, और उनके पास लाल-हरे-लाल पैटर्न (चित्रा 2 डी)30 होते हैं।

ऊपर वर्णित तथ्यों के आधार पर, डीएनए फाइबर विश्लेषण को वर्तमान में नैनोमटेरियल्स जैसे विषाक्त एजेंटों के कारण डीएनए प्रतिकृति गतिशीलता में भिन्नता का अध्ययन करने के लिए एक पसंदीदा तरीका माना जाता है। शोधकर्ताओं को अब यूकेरियोट्स में जीनोम-वाइड डीएनए प्रतिकृति की गतिशीलता की अच्छी समझ और ज्ञान है, मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से,इस तकनीक की खोज के कारण। परिणाम चर के आधार पर, कई पद्धतियों को अपनाया जा सकता है। नैनोकणों द्वारा प्रेरित डीएनए क्षति में भिन्नता का अध्ययन करने के तरीकों के कुछ उदाहरण चित्र 3 में दिखाए गए हैं। इस अध्ययन में वर्णित डीएनए फाइबर विश्लेषण विधि का समग्र लक्ष्य यह निर्धारित करना है कि नैनोकणों ने विट्रो में प्रतिकृति प्रक्रिया को कैसे प्रभावित किया और वे विभिन्न ऊतकों को अलग-अलग कैसे प्रभावित करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. एंटीबॉडी और बफर तैयार करना

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें, माउस एंटी-बीआरडीयू 5% बीएसए में 1:300 कमजोर पड़ने पर और चूहा एंटी-बीआरडीयू 5% बीएसए में 1:500 कमजोर पड़ने पर।
  2. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें, 5% बीएसए में 1:300 कमजोर पड़ने पर एलेक्साफ्लुर 594 खरगोश एंटी-माउस और 5% बीएसए में 1:500 कमजोर पड़ने पर एलेक्साफ्लुर 488 चिकन एंटी-चूहा।
  3. तृतीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें, एलेक्साफ्लुर 594 बकरी विरोधी खरगोश 5% बीएसए में 1: 1,000 कमजोर पड़ने पर और एलेक्साफ्लुर 488 बकरी विरोधी चिकन 5% बीएसए में 1: 1,000 कमजोर पड़ने पर।
  4. डीडीएच2ओ में 10 एमएल लाइसिस बफर तैयार करें, जिसमें 2 एमएल 1 एम ट्रिस (पीएच 7.4), 0.5 एम ईडीटीए का 1 एमएल और 10% एसडीएस का 0.5 एमएल हो।

2. फाइबर परख के लिए तैयारी

  1. दिन 1: फाइबर परख के लिए सेल कल्चर और नैनोमटेरियल उपचार
    1. प्लेट रॉ 264.5 मैक्रोफेज कोशिकाएं या रुचि की कोशिकाएं, ताकि प्रयोग के दिन कोशिकाएं अपने विकास के लॉग चरण में हों। रॉ कोशिकाओं के लिए, प्रत्येक स्थिति के लिए 24-वेल प्लेटों में 5 x 104 सेल / वेल जोड़ें। 5% सीओ2 और 98% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखें। तालिका 1 उपयोग किए गए मीडिया के घटकों का वर्णन करती है। कोशिकाओं को 75% -80% तक बढ़ने की अनुमति दें 17,37।
    2. कोशिकाओं के 75% -80% कंफ्लुएंसी के स्तर तक पहुंचने के बाद, माध्यम को प्लेटों से हटा दें, माध्यम का आधा हिस्सा लें और इसे CldU पल्स (CldU रिजर्व) के लिए आरक्षित करें, और 50 μM की अंतिम एकाग्रता पर दूसरे आधे हिस्से में 5 μL IDU जोड़ें। आईडीयू के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में 20 मिनट के लिए रखें।
    3. इसे पूर्व-गर्म रखने के लिए सीएलडीयू रिजर्व माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। CldU पल्स से ठीक पहले इस माध्यम में CldU जोड़ें।
    4. 20 मिनट के बाद, आईडीयू-मध्यम मिश्रण को एस्पिरेट करें, और प्लेट को धीरे से घुमाकर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस, पीएच 7.4) के 500 μL के साथ कोशिकाओं को धीरे से धोएं। पीबीएस को छोड़ दें।
    5. माध्यम के 500 μL में नैनोकणों की विभिन्न सांद्रता के साथ कोशिकाओं का इलाज करें, और एक और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस अध्ययन के लिए, 25 μg / mL एकाग्रता पर उपचारित ग्राफीन ऑक्साइड नैनोकणों का उपयोग करें।
    6. उपचार-मध्यम मिश्रण को एस्पिरेट करें, और प्लेट को धीरे से घुमाकर पीबीएस के 500 μL के साथ कोशिकाओं को धीरे से धोएं। पीबीएस को छोड़ दें। CldU के 5 μL जोड़ें (100 μM फाइनल)
    7. एकाग्रता) सीएलडीयू आरक्षित माध्यम में, और सीएलडीयू रिजर्व माध्यम के साथ कोशिकाओं को कवर करें। 20 मिनट के लिए सीएलडीयू पल्स की अवधि के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रखें।
    8. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, 3-4 मिनट के लिए खुरच ें या ट्रिप्सिनाइज करें, और फिर प्लेट में 5 एमएल माध्यम जोड़ें, और कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    9. 4 मिनट के लिए 264 x g पर स्पिन करें। माध्यम को हटा दें, और 1 एमएल बर्फ-ठंडे पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। ट्राइपैन ब्लू परख (हेमोसाइटोमीटर गिनती) का उपयोग करके सेल संख्या निर्धारित करें, और फिर कोशिकाओं को ~ 200-400 कोशिकाओं / μL तक पतला करें। सेल काउंटिंग के दौरान सेल सस्पेंशन को बर्फ पर रखें।
      नोट: यदि संभव हो, तो कोशिकाओं के बर्फ पर बैठने के समय को सीमित करें। यह स्लाइड के शीर्ष के साथ सेल समाधान का एक मोती प्राप्त करने में मदद कर सकता है। यदि उन्हें बर्फ पर रखा जाता है, तो उन्हें 30 मिनट से कम समय तक रखें।
  2. दिन 1: डीएनए फाइबर की तैयारी
    1. एक पेंसिल का उपयोग करके, प्रयोगात्मक स्थिति और तारीख के साथ स्लाइड (ग्लास स्लाइड, 75 मिमी x 25 मिमी) लेबल करें।
    2. एक पिपेट में 2 μL कोशिकाओं को लें, पिपेट को ~ 45 ° कोण पर पकड़ें, पिपेट को स्लाइड लेबल से लगभग 1 सेमी नीचे रखें, और पिपेट को स्लाइड लेबल पर क्षैतिज रूप से ले जाएं। जैसे ही पिपेट स्लाइड के पार चलता है, एक समय में सेल समाधान का थोड़ा सा हिस्सा छोड़ दें। प्रत्येक स्लाइड (महत्वपूर्ण चरण) पर कक्षों की कई पंक्तियाँ बनाएँ.
      नोट: स्लाइड में सेल निलंबन की एक क्षैतिज रेखा होनी चाहिए। यदि सेल सस्पेंशन मोती ऊपर है, तो सेल निलंबन वाले कंटेनर में सेल माध्यम के 5-10 μL जोड़ें, क्योंकि इससे समाधान को फिर से लागू होने पर स्लाइड का पालन करने में मदद मिल सकती है।
    3. कोशिकाओं के साथ समाधान को वाष्पित होने दें जब तक कि समाधान चिपचिपा और चिकना न दिखे। इस बिंदु पर, कुछ तरल कोशिकाओं से जुड़ा होता है, लेकिन ज्यादा नहीं। यह चरण 8-20 मिनट से लेता है और हवा में कितनी आर्द्रता है, इसके आधार पर भिन्न होता है।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सभी समाधान वाष्पित नहीं हुए हैं, क्योंकि इससे सीधे और संरेखित डीएनए फाइबर प्राप्त करना बहुत कठिन हो जाता है क्योंकि अधिकांश, यदि सभी नहीं, तो डीएनए एक साथ फंस जाएंगे और अलग होने में असमर्थ होंगे।
    4. जब घोल टैकी हो जाता है, तो कोशिकाओं की प्रत्येक पंक्ति के प्रति 15 μL फैलाव (लाइसिस) बफर के साथ कोशिकाओं को ओवरले करें, इस बात का ध्यान रखें कि पिपेट टिप स्लाइड को छूने न दें। 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें। स्लाइड को 25 ° कोण पर झुकाएं, और स्लाइड के लेबल को एक ट्यूब रैक के किनारे के खिलाफ क्षैतिज रूप से रखें (लेबल का निचला हिस्सा ट्यूब रैक के किनारे के साथ पंक्तिबद्ध होना चाहिए)।
    5. डीएनए को अंतिम स्लाइड किए जाने के समय से कम से कम 4 घंटे तक हवा में सूखने दें।
      नोट: 4 घंटे से 12 घंटे की अवधि सुखाने के लिए अच्छी है। हालांकि, उन्हें रात भर सूखने न दें। यदि रात भर सूखने की अनुमति दी जाती है, तो बहुत सारे आराम से डीएनए होंगे लेकिन बहुत कम सीधे और संरेखित डीएनए फाइबर होंगे।
  3. दिन 1: डीएनए फाइबर को ठीक करना और ठंड
    1. एक बार स्लाइड सूख जाने के बाद, स्लाइड को मेथनॉल: एसिटिक एसिड (3: 1) के साथ 2 मिनट के लिए स्लाइड ्स को डुबोकर ठीक करें। इस चरण को एक हुड के नीचे करें, और स्लाइड्स को सीमित प्रकाश जोखिम वाले क्षेत्र में रात भर सूखने दें, या स्लाइड्स को टिन पन्नी तम्बू के साथ कवर करें।
  4. दिन 2
    1. स्लाइड्स को ग्लास स्लाइड कैरियर में रखें। स्लाइड्स को न्यूनतम 24 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। यह चरण छवि के रिज़ॉल्यूशन या कुरकुरापन में सुधार करता है।

3. डीएनए फाइबर परख का प्रदर्शन

  1. डीएनए का विकृतीकरण।
    1. ढक्कन के साथ छोटे पिपेट टिप बॉक्स का उपयोग करके एक ह्यूमिडिफायर कक्ष तैयार करें। पानी के साथ कंटेनरों को आधा भरें, और उन्हें कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
    2. स्लाइड्स को -20 डिग्री सेल्सियस से बाहर निकालें, और उन्हें कुछ सेकंड के लिए डीफ्रॉस्ट करें। स्लाइड्स को सावधानीपूर्वक विआयनीकृत (डीआई) पानी युक्त कोप्लिन जार में रखें ताकि लेपित सतह जार की दीवारों को न छुए। स्लाइड को 20 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर सावधानी से पानी डालें।
    3. कोप्लिन जार में 2.5 एम एचसीएल जोड़ें ताकि यह सभी स्लाइडों को कवर करे। 80 मिनट तक प्रतीक्षा करें। प्रोटोकॉल में यह एक महत्वपूर्ण कदम है। समय में बदलाव छवि के परिणाम को बदल सकता है।
    4. स्लाइड ्स को पीबीएस प्लस ट्वीन (पीबीएस + 0.1% ट्वीन [अंतिम एकाग्रता]) के साथ धोएं और फिर कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रत्येक 3 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 2x धोएं।
  2. इम्यूनोस्टेनिंग।
    1. निम्नलिखित चरणों के लिए स्लाइड्स को ह्यूमिडिफायर चैंबर में रखें। आरटी पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 5% बीएसए में स्लाइड को ब्लॉक करें, और उन्हें कवरलिप्स, वेस्टर्न ब्लॉट बैग से बने कवरलिप्स, या पारदर्शी प्लास्टिक शीट के साथ कवर करें।
    2. ब्लॉक करने के बाद, कवरस्लिप को ध्यान से हटा दें, ब्लॉकिंग समाधान को हटा दें, और अतिरिक्त ब्लॉकिंग समाधान को हटाने के लिए एक पेपर टॉवल पर स्लाइड को ब्लॉट करें (तौलिया पर स्लाइड टैप करें)।
    3. स्लाइड की लंबाई के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μL जोड़ें। एक नया प्लास्टिक कवरस्लिप जोड़ें, और 2 घंटे तक प्रतीक्षा करें। कवरस्लिप जोड़ते समय, सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले नहीं बनते हैं।
    4. 2 घंटे के बाद, एंटीबॉडी समाधान को बंद कर दें, और आरटी पर पीबीएस से भरे कोप्लिन जार 2 एक्स में स्लाइड को कुल्ला करें।
    5. प्रत्येक स्लाइड के साथ 5% बीएसए के 200 μL (तीन से चार बूंदें) जोड़कर स्लाइड को फिर से ब्लॉक करें, और एक प्लास्टिक कवरस्लिप जोड़ें। 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    6. कवरस्लिप को उतारें, एक पेपर टॉवल पर अतिरिक्त बीएसए को खटखटाएं, और स्लाइड की लंबाई के साथ द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 100 μL जोड़ें। एक नया प्लास्टिक कवरस्लिप जोड़ें, और 1 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
    7. कवरस्लिप को उतारें, एक पेपर टॉवल पर अतिरिक्त बीएसए को खटखटाएं, और आरटी पर पीबीएस में स्लाइड 2 x धो लें।
    8. प्रत्येक स्लाइड के साथ 5% बीएसए के 200 μL (तीन से चार बूंदें) जोड़कर स्लाइड को फिर से ब्लॉक करें, और एक प्लास्टिक कवरस्लिप जोड़ें। 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    9. यदि आवश्यक हो, तो कवरस्लिप को हटा दें, एक पेपर तौलिया पर अतिरिक्त बीएसए को हटा दें, और स्लाइड की लंबाई के साथ तृतीयक एंटीबॉडी समाधान के 100 μL जोड़ें। नए प्लास्टिक कवरलिप जोड़ें, और 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    10. स्लाइड्स को PBS 3x से धोएं। अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें, और उन्हें पूरी तरह से सूखने दें।
    11. एक बार सूखने के बाद, माउंटिंग माध्यम जोड़ें, और माउंटिंग माध्यम के ऊपर ग्लास कवरलिप्स (24 मिमी x 60 मिमी) को ध्यान से रखें ताकि बुलबुले से बचा जा सके। स्लाइड्स को फिर से लेबल करें, और उन्हें रात भर अंधेरे में छोड़ दें।

4. छवि अधिग्रहण

  1. एलेक्साफ्लुर 488 और 594 रंगों का पता लगाने के लिए कैमरे, 60x उद्देश्य और उपयुक्त फिल्टर सेट से लैस इम्यूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इम्यूनोस्टेन्ड डीएनए फाइबर की कल्पना करें।
  2. उन क्षेत्रों में विश्लेषण के लिए चित्र लें जहां फाइबर अच्छी तरह से अलग होते हैं और उलझे हुए नहीं होते हैं। स्लाइड के साथ विभिन्न क्षेत्रों में छवियों को कैप्चर करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि स्लाइड के केवल एक हिस्से में चित्र लेने से स्लाइड पर पाए जाने वाले सभी प्रतिकृति मध्यवर्ती के बारे में प्रतिनिधि डेटा प्रदान नहीं किया जा सकता है।
  3. यदि संभव हो, तो स्लाइड पर 20 अलग-अलग क्षेत्रों से फाइबर चित्र प्राप्त करें। पूर्वाग्रह से बचने के लिए चित्र लेने के लिए क्षेत्रों का चयन करने के लिए केवल एक चैनल का उपयोग करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पर्याप्त चित्र प्राप्त करने के बाद (प्रति स्थिति 20-100 छवियों से), प्रतिकृति मध्यवर्ती को पहचानने, मापने और गिनने की आवश्यकता होती है। चाहे प्रोग्राम38 के माध्यम से फाइबर का मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से विश्लेषण करना, यह स्पष्ट रूप से परिभाषित करना आवश्यक है कि फाइबर को गिनने या स्कोर करने (या गिना या मापा नहीं) के लिए क्या विशेषताएं होनी चाहिए। उदाहरण के लिए, निम्नलिखित प्रश्नों पर विचार किया जा सकता है। (1) क्या किसी को पूरे फाइबर में 100% इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ केवल फाइबर को मापना और गिनना चाहिए, या क्या उनमें इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बिना कुछ क्षेत्र हो सकते हैं (उदाहरण के लिए, क्या चित्रा 4एआई, ii, iii में सभी मध्यवर्ती का विश्लेषण किया जाना चाहिए या उनमें से सिर्फ एक उप-समूह होना चाहिए?)? यदि सिग्नल हानि के साथ फाइबर का विश्लेषण किया जाता है, तो फाइबर के भीतर स्वीकार्य अधिकतम सिग्नल हानि क्या है, और फाइबर में निरंतर पिक्सेल की अधिकतम संख्या क्या है जो किसी भी संकेत से रहित हो सकती है (उदाहरण के लिए, क्या चित्रा 3एव को लाल-हरा या लाल-केवल मध्यवर्ती माना जाएगा?)? (2) न्यूनतम और अधिकतम फाइबर चौड़ाई / लंबाई क्या होनी चाहिए? (3) यह तय करते समय सिग्नल-टू-शोर (एस: एन) अनुपात क्या होना चाहिए कि किसी को फाइबर को मापना चाहिए या नहीं (उदाहरण के लिए, विश्लेषण करने के लिए चित्रा 4 बी में कितने फाइबर चुने जाने चाहिए?)? (4) एक फाइबर को गिनने या मापने से पहले छवि किनारे के कितने करीब होना चाहिए? (5) यदि एक फ्लोरोसेंट सिग्नल पीला है, तो क्या कोई इसे लाल या हरे रंग के रूप में गिनता है (उदाहरण के लिए, क्या चित्रा 4 सी में प्रतिकृति मध्यवर्ती के पीले हिस्से को लाल या हरे रंग के रूप में गिना जाना चाहिए?)? (6) एक रंग खंड को एक सच्चे संकेत की गणना करने में कितना समय लगता है (उदाहरण के लिए, क्या चित्रा 4 डी में प्रतिकृति मध्यवर्ती एक हरे रंग का ट्रैक है, एक हरा-लाल-हरा ट्रैक, या एक हरा-लाल ट्रैक?)? (7) यदि एक स्वचालित फाइबर विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग कर रहे हैं, तो माप / गिनती में कार्यक्रम कितना आश्वस्त है जो उसने अभी किया है? (8) यदि तंतुओं का मैन्युअल रूप से विश्लेषण किया जा रहा है, तो समय के साथ और व्यक्तियों के बीच विश्लेषण कितना सुसंगत होना चाहिए?

आमतौर पर, डीएनए फाइबर विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर निम्नलिखित हैं:
सिग्नल-टू-शोर अनुपात: 3 (फाइबर तीव्रता पृष्ठभूमि तीव्रता से तीन गुना अधिक है)
फाइबर मोटाई: चौड़ाई में ≤8 पिक्सेल
न्यूनतम आकार: केवल लाल या हरा और 10 पिक्सेल; प्रत्येक खंड ≥10 पिक्सेल के साथ लाल-हरे ट्रैक; प्रत्येक खंड ≥10 पिक्सेल के साथ लाल-हरे-लाल या हरे-लाल-हरे रंग के ट्रैक।
फ्लोरोसेंट सिग्नल की निरंतरता: कम से कम 80% और 6 पिक्सेल से अधिक सिग्नल में कोई अंतराल नहीं।
मूल्यांकन में विश्वास: आत्मविश्वास मूल्य एक छवि में और छवियों के बीच एक दूसरे के समान होना चाहिए।

ऊपर उल्लिखित मापदंडों के अलावा, एक और महत्वपूर्ण मानदंड एक स्पष्ट फाइबर का चयन है जो इमेजिंग और विश्लेषण के दौरान अन्य फाइबर के साथ ओवरलैप नहीं होता है।

चित्रा 5 ए नियंत्रण (चित्रा 5एआई) और ग्राफीन ऑक्साइड नैनोपार्टिकल-उपचारित मैक्रोफेज डीएनए (चित्रा 5एआईआई, iii) की प्रतिनिधि छवियां दिखाता है। छवि नियंत्रण की तुलना में ग्राफीन ऑक्साइड-उपचारित कोशिकाओं में रीड-ओनली ट्रैक (समाप्ति) में वृद्धि और नए निकाले गए मूल में कमी दिखाती है (चित्रा 5 सी)। छवियों की संख्या और स्लाइड की स्थिति पर विचार करना भी महत्वपूर्ण है जहां से चित्र लिए गए हैं। जैसा कि चित्र 5Aiii,C में दिखाया गया है, प्रतिकृति मध्यवर्ती (नियंत्रण की तुलना में नई उत्पत्ति में वृद्धि) के पैटर्न में भिन्नता एक ही स्थिति के एक अलग क्षेत्र पर देखी गई थी। भले ही ऐसे कुछ अवलोकन समग्र परिणाम को प्रभावित नहीं कर सकते हैं, लेकिन सभी प्रतिनिधि क्षेत्रों को शामिल करके स्लाइड को चित्रित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। स्लाइड के कुल क्षेत्र को पांच से छह क्षेत्रों में विभाजित करना और प्रत्येक स्लाइड के लिए निर्णायक फाइबर डेटा खोजने के लिए प्रत्येक क्षेत्र (उदाहरण: 10 छवियां) से कई छवियां लेना आदर्श होगा। कई स्लाइड / शर्तों से लगभग 500 मध्यवर्ती (चित्रा 5 बी) का चयन करना आदर्श है। प्रतिकृति में इन भिन्नताओं के साथ, डीएनए फाइबर विश्लेषण से मध्यवर्ती परिमाणीकरण का उपयोग ग्राफीन ऑक्साइड नैनोकणों या अन्य नैनोमटेरियल्स के जीनोटॉक्सिसिटी के कारण डीएनए प्रतिकृति गतिशीलता में भिन्नता की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इसलिए, परिचय में उल्लिखित अन्य विश्लेषणों की तुलना में इस नई पद्धति के माध्यम से जीनोम-वाइड डीएनए प्रतिकृति की गतिशीलता की गुणात्मक और मात्रात्मक समझ दोनों प्राप्त की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: डीएनए फाइबर परख। डीएनए फाइबर विश्लेषण में प्रमुख चरणों के अवलोकन के साथ परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। स्केल: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डीएनए प्रतिकृति मध्यवर्ती का इम्यूनोस्टेनिंग। आईडीयू (लाल) और सीएलडीयू (हरे) के साथ अनुक्रमिक पल्स लेबलिंग द्वारा पहचाने गए विभिन्न प्रतिकृति मध्यवर्ती का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। स्केल: 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नैनोपार्टिकल एक्सपोजर। नैनोपार्टिकल-प्रेरित डीएनए क्षति में भिन्नताओं का अध्ययन करने के लिए विभिन्न पद्धतियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: डीएनए फाइबर की विशेषताओं को स्कोर किया जाना है। एक छवि में प्रतिकृति मध्यवर्ती के उदाहरण। (ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस में अंतराल; (i) प्रतिकृति मध्यवर्ती में 0% इम्यूनोफ्लोरेसेंस सिग्नल हानि; (ii) ~ 7% सिग्नल हानि; (iii) 50% सिग्नल हानि; और (iv) >90% सिग्नल हानि। (बी) कई अतिव्यापी प्रतिकृति मध्यवर्ती वाला एक क्षेत्र (तीर स्पष्ट फाइबर ओवरलैप वाले क्षेत्र को इंगित करता है)। (सी) पीले क्षेत्र के साथ एक डीएनए फाइबर। (डी) व्याख्या के लिए खुला एक प्रतिकृति मध्यवर्ती (तीर फाइबर में अंतराल को इंगित करता है)। स्केल: 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: डीएनए फाइबर विश्लेषण और व्याख्या। (ए) प्रतिनिधि डीएनए फाइबर छवियां (i) मैक्रोफेज कोशिकाओं को नियंत्रित करती हैं और (ii, iii) मैक्रोफेज कोशिकाओं को 25 μg / mL एकाग्रता पर 20 मिनट के लिए नैनोकणों के साथ इलाज किया जाता है। चित्र II और iii स्लाइड के विभिन्न क्षेत्रों से लिए गए थे। (बी) नियंत्रण और नैनोपार्टिकल-उपचारित स्थितियों का प्रतिनिधि स्वचालित सॉफ्टवेयर विश्लेषण। इस विश्लेषण के लिए, हमने वांग एट अल .38 द्वारा विकसित स्वचालित डीएनए फाइबर ट्रैकिंग और माप कार्यक्रम का उपयोग किया। आंकड़े में संख्याविश्लेषण किए गए डीएनए ट्रैक की संख्या दिखाती है। (सी) नियंत्रण और नैनोपार्टिकल-उपचारित स्थितियों के सॉफ्टवेयर विश्लेषण का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। एनपी नैनोकणों का प्रतिनिधित्व करता है। मध्यवर्ती आबादी का सापेक्ष प्रतिशत (उदाहरण के लिए, केवल लाल के लिए) विश्लेषण किए गए कुल मध्यवर्ती से गणना की जाती है। एनपी-उपचारित छवि 1 से छवि 2 की तुलना में, दो छवियों के बीच बड़े अंतर हैं। इस प्रकार, यह समझने के लिए स्लाइड में कई छवियों को प्राप्त करना महत्वपूर्ण है कि एक प्रयोगात्मक स्थिति प्रतिकृति प्रक्रिया को कैसे प्रभावित करती है। संक्षेप: आर = लाल; G = हरा। स्केल: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मीडिया संरचना
10% भ्रूण गोजातीय सीरम
1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (10000 यूनिट /
1% एल ग्लूटामाइन (200 mM)
डलबेकको के संशोधित ईगल का मध्यम-उच्च ग्लूकोज

तालिका 1: मैक्रोफेज सेल संस्कृति के लिए उपयोग की जाने वाली मीडिया संरचना।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम यहां डीएनए फाइबर परख के माध्यम से नैनोकणों की उपस्थिति में डीएनए प्रतिकृति गतिशीलता में भिन्नता के विश्लेषण में सहायता करने के लिए एक विधि पर चर्चा करते हैं। मानक परख में शामिल प्रमुख महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल (चरण 2.2.2 और चरण 3.1.3) में वर्णित हैं। स्लाइड्स में प्रकाश-प्रेरित डीएनए ब्रेक को रोकने के साथ-साथ प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए हमेशा सीमित ओवरहेड लाइट एक्सपोजर और निरंतर एयरफ्लो वाले क्षेत्र का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। स्लाइड्स पर सेल लाइसेट के सूखने के लिए समय अवधि पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता है। ओवरड्राईंग फाइबर प्रसार को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा। दूसरा महत्वपूर्ण कदम एसिड समाधान का उपयोग करके फाइबर विकृतीकरण है। एसिड धोने की अवधि एक ही प्रयोग में सभी स्लाइडों के लिए बराबर रखी जानी चाहिए। इष्टतम स्थितियों (लाइसिस समय, स्लाइड पर लाइसेट की मात्रा, सुखाने का समय, और एसिड धोने का समय) खोजने के लिए इन दो चरणों के लिए समस्या निवारण विभिन्न सेल प्रकारों और प्रयोगशाला वातावरण के लिए अनुशंसित है।

जैसा कि चित्रा 3 में चर्चा की गई है, नैनोकणों द्वारा प्रेरित डीएनए प्रतिकृति गतिशीलता में परिवर्तन के मात्रात्मक निर्धारण के लिए नैनोकणों की एक्सपोजर अवधि भिन्न हो सकती है। प्रतिकृति गतिशीलता के प्रारंभिक प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, विभिन्न खुराक के साथ 1 मिनट, 20 मिनट या 30 मिनट जैसे अल्पकालिक जोखिम उपयुक्त होगा। नैनोमैटेरियल्स के लिए कोशिकाओं के दीर्घकालिक संपर्क के बाद प्रतिकृति पैटर्न (जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है) में अंतर नैनोपार्टिकल उपचार से पहले और बाद में आईडीयू और सीआईडीयू एक्सपोजर (प्रत्येक 20 मिनट) के पैटर्न की तुलना करके निर्धारित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग एक्सपोजर के अलग-अलग समय पर फोर्क स्टालिंग, फोर्क स्लोिंग और मूल फायरिंग में अंतर को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जिसे नैनोमैटेरियल्स39,40 के तीव्र और पुराने जोखिम के प्रभावों के रूप में व्याख्या किया जा सकता है।

डीएनए प्रतिकृति में भिन्नता का पता लगाने के लिए कई आशाजनक तकनीकें उपलब्ध हैं, जैसे कि डीएनए कॉम्बिंग और आरडीएस विधि; हालांकि, उन तरीकों की तुलना में, डीएनए फाइबरपरख विश्लेषण के लिए महंगे उपकरणों की आवश्यकता के बिना सुविधाजनक और लागत प्रभावी है। इस विधि की सीमाएं प्रयोगात्मक अवधि, परिमाणीकरण के लिए पर्याप्त चित्र लेने के लिए आवश्यक समय, साथ ही सॉफ्टवेयर विश्लेषण हैं। हालांकि, निश्चित रूप से, यह दृष्टिकोण सेल लाइनों में कणों के कारण जीनोमिक अस्थिरता को निर्धारित करने में नैनोटॉक्सिकोलॉजी अनुसंधान का समर्थन करेगा, साथ ही विभिन्न ऊतक नमूनों में और विभिन्न प्रजातियों के बीच।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक ब्लेज़र फाउंडेशन, बायोमेडिकल साइंसेज में मेडिकल बायोटेक्नोलॉजी प्रोग्राम, यूआईसी रॉकफोर्ड और स्वास्थ्य विज्ञान शिक्षा विभाग, यूआईसी रॉकफोर्ड से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं। लेखक ों ने परियोजना में उनके योगदान के लिए अनन्या संगिनेनी और जेम्स ब्रैडली को धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
  2. Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
  3. Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
  4. Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
  5. Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
  6. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
  7. Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
  8. Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
  9. Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
  10. Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
  11. Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
  12. Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
  13. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  14. Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
  15. Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
  16. Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
  17. Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
  18. Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
  19. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
  20. Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
  21. Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
  22. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  23. Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
  24. Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
  25. Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
  27. Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
  28. Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
  29. Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
  30. Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
  31. Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
  32. Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
  33. Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
  34. Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
  35. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  36. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  37. Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
  38. Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
  39. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  40. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  41. Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).

Tags

जीव विज्ञान अंक 193
नैनोकणों द्वारा प्रेरित डीएनए क्षति और मरम्मत गतिशीलता की जांच के लिए डीएनए फाइबर परख का प्रदर्शन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar,… More

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter