Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Демонстрация анализа ДНК-волокна для исследования повреждений ДНК и динамики репарации, индуцированной наночастицами

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64903
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

Методология помогает в анализе вариаций динамики репликации ДНК в присутствии наночастиц. Различные методологии могут быть приняты в зависимости от уровня цитотоксичности интересующего материала. Кроме того, предоставляется описание анализа изображений, чтобы помочь в анализе волокон ДНК.

Abstract

Воздействие наноматериала может вызвать репликационный стресс и геномную нестабильность в клетках. Степень нестабильности зависит от химического состава, размера и концентрации наноматериалов, времени воздействия и типа подвергшихся воздействию клеток. Несколько установленных методов были использованы для выяснения того, как эндогенные/экзогенные агенты влияют на глобальную репликацию. Тем не менее, анализы на уровне репликонов, такие как анализ ДНК-волокна, необходимы для понимания того, как эти агенты влияют на инициацию, прекращение и прогрессирование репликационной вилки. Знание этого позволяет лучше понять, как наноматериалы увеличивают шансы на фиксацию мутаций и геномную нестабильность. Мы использовали макрофаги RAW 264.7 в качестве модельных клеток для изучения динамики репликации под воздействием наночастиц оксида графена. Здесь мы демонстрируем базовый протокол анализа ДНК-волокна, который включает в себя импульсную маркировку нуклеотидными аналогами, лизис клеток, распространение меченных импульсом волокон ДНК на предметные стекла, флуоресцентное иммуноокрашивание нуклеотидных аналогов в волокнах ДНК, визуализацию репликационных промежуточных продуктов в волокнах ДНК с использованием конфокальной микроскопии и промежуточный анализ репликации с использованием программного обеспечения для компьютерной оценки и анализа (CASA).

Introduction

Во время каждого клеточного цикла репликация ДНК обеспечивает точную дупликациюгенома 1. Эукариотическая хромосомная репликация по существу зависит от трех факторов: времени запуска нескольких источников репликации, скорости разветвлений, возникающих из запущенных источников, и завершения процесса репликации, когда встречаются две репликационные вилки из соседних источников2. Для высокоточной передачи генетической информации дочерним клеткам, а также для сохранения генетической целостности точная репликация ДНК имеет решающее значение. Агенты, которые развиваются в результате регулярного метаболизма или из-за искусственных или естественных материалов окружающей среды, постоянно атакуют геном. Эти эндогенные и экзогенные агенты заставляют репликационные вилки замедляться или останавливаться из-за столкновения с повреждением ДНК, вызванным этими агентами, и вилки, временно замедляющиеся или останавливающиеся в ответ на эти трудности, называются репликационным стрессом3. В ответ на репликационный стресс клетки разработали несколько молекулярных путей, которые поддерживают стабильность нарушенных репликационных вилок и позволяют им перезапуститься4. С точки зрения генетической стабильности, выживаемости клеток и болезней человека эти механизмы реакции на репликацию на стресс стали ключевыми факторами для поддержания здорового генома, обеспечения выживания клеток и снижения вероятности образования заболевания5.

Одним из экзогенных агентов, способных вызывать репликационный стресс, являются наночастицы. Наночастицы — это частицы размером от 1 нм до 100нм6. Благодаря большой площади поверхности, отличительным формам и уникальным химическим свойствам наночастицы используются в различных медицинских, фармацевтических, экологических и промышленных применениях 7,8. Хотя наночастицы имеют много потенциальных преимуществ, некоторые из них (из-за их унаследованной природы или долговечности) могут стать токсичными. Наночастицы также могут образовываться из-за естественного износа медицинских имплантатов и высвобождаться в перипротезную область 9,10.

Из-за воздействия на людей множества наночастиц, производимых для различных применений, исследования в области токсичности наночастиц значительно возросли за последние 10 лет11. Несмотря на то, что эти исследовательские усилия выявили множество информации о потенциальной угрозе, которую наночастицы представляют для здоровья человека, знания о том, что наночастицы могут вызывать генотоксичность, все еще ограничены. До сих пор было обнаружено, что эти наночастицы могут физически взаимодействовать с ДНК, способствовать повреждению ДНК и повреждать или мешать белкам, ответственным за восстановление или репликацию ДНК12. Чтобы определить, как они влияют на репликацию ДНК, обычно используют расчесывание ДНК-волокон, радиорезистентный синтез ДНК (RDS) и анализ ДНК-волокон13,14,15,16.

Метод расчесывания ДНК-волокон является гибким и дает информацию о динамике репликационной вилки на уровне одной молекулы17. По сути, засоленное покровное стекло осторожно извлекается из раствора ДНК, как только концы ДНК связываются с ним. Молекулы ДНК выпрямляются и выравниваются мениском раствора. Однородность, расстояние и выравнивание волокон ДНК поддерживают точные и надежные измерения длины волоконного тракта. Регулируя продолжительность и последовательность процедур и лекарств, используемых для вызова стресса или повреждения, с помощью этого приложения можно контролировать многие аспекты продвижения вилки. В этом методе используется система двойной маркировки, с помощью которой оценивается скорость и прогрессия репликационной вилки17,18. С другой стороны, 2D-гель-электрофорез использует тот факт, что при электрофорезе в агарозном геле ветвящиеся структуры ДНК движутся медленнее, чем линейные молекулы ДНК той же массы, что позволяет полностью разделить их в 2D-прогоне. Фактически, этот метод исследуется для разделения молекул ДНК на основе их массы в первом прогоне и на основе их формы во втором ортогональном прогоне. После фрагментации геномной ДНК необычные промежуточные продукты репликации и рекомбинации развивают ветвящуюся форму, и их можно отличить от более распространенных линейных молекул в 2D-геле19.

Метод RDS используется для определения того, как это влияет на глобальный синтез ДНК. В этом методе степень ингибирования глобальной репликации определяют путем сравнения количества включенных радиоактивно меченных нуклеотидов, таких как [14C]тимидин, в необработанных клетках и обработанныхклетках 14,20. Процентная разница в радиоактивной мечке между необработанными и обработанными клетками представляет собой степень, в которой повреждающий ДНК агент влияет на синтез ДНК. Подобно этому, другой метод использует способность клеток интегрировать нуклеотидные аналоги, такие как BrdU (5-бром-2'-дезоксиуридин) для проточной цитометрии для измерения общих скоростей синтеза ДНК21,22. Хотя эти методы демонстрируют, как агенты, повреждающие ДНК, влияют на глобальный синтез ДНК, они не показывают, как это влияет на отдельные репликоны. Действительно, анализы на уровне репликонов необходимы для лучшего понимания инициации и степени геномной нестабильности в случае воздействия токсичных частиц (наноматериалов). Авторадиография ДНК-волокна и электронная микроскопия - вот некоторые методы, используемые для определения этого23,24,25,26.

Концепции репликационных пузырьков и двунаправленной репликации из неравномерно расположенных источников были впервые разработаны с использованием одномолекулярных тестов, таких как электронная микроскопия и авторадиография ДНК-волокна27,28. Прямое наблюдение ветвящихся репликационных промежуточных продуктов на конкретных молекулах, диспергированных по сетке с углеродным покрытием, значительно облегчается электронной микроскопией. Этот метод, который до сих пор используется для отслеживания патологических сдвигов в репликационных вилках, был использован для определения первого эукариотического происхождения репликации ДНК28. Волоконная авторадиография сосредоточена вокруг концепции авторадиографической идентификации вновь реплицированных участков и импульсного мечения хромосом тритированным тимидином. Первая количественная оценка плотности происхождения и скорости репликационных вилок в геномных последовательностях многоклеточных стало возможным благодаря авторадиографии ДНК-волокна29.

В настоящее время методы волоконной флюорографии заняли место ауторадиографии, главным образом потому, что волоконная флюорография намного быстрее, чем авторентгенография. При волоконной флюорографии два галогенированных производных нуклеотидов, такие как бром- (Br), хлор- (Cl) или йоддезоксиуридин (IdU), последовательно включаются в свежереплицированную ДНК, а затем идентифицируются путем непрямой иммунофлюоресценции с использованием антител30. Микроскопическое наблюдение зарождающейся ДНК, которая включает один или оба аналога, стало возможным благодаря иммуноокрашиванию одного из аналогов в один цвет, а другого аналога в другой цвет (например, иммуноокрашивание зарождающейся ДНК с включенным красным IdU и включенным зеленым CldU) (рис. 1)21. Многие различные типы репликационных промежуточных продуктов могут быть идентифицированы с помощью анализа волокон ДНК. Наиболее часто изучаются отдельные удлиняющиеся вилки, инициации и окончания. Отдельные удлиняющиеся вилки имеют узор репликации красного цвета, за которым следует зеленый (красно-зеленый; Рисунок 2А). 13 Длины этих промежуточных продуктов часто используются для измерения скорости вилки (т.е. длины вилки/времени импульса) или экзонуклеолитической деградации зарождающейся ДНК за счет укорочения трека (рис. 2E)30,31,32. В исследовании, проведенном Mimitou et al., было обнаружено, что при длительном воздействии гидроксимочевины, репликационного яда, вызывающего двухцепочечные разрывы в ДНК, RE11 был набран33. MRE11 представляет собой экзонуклеазу, известную своей экзонуклеазной активностью 3'-5', и она способна разрезать концы ДНК для репарации. Следовательно, при воздействии токсических агентов можно наблюдать экзонуклеолитическую деградацию зарождающейся ДНК, которая представляет собой укорочение цепи ДНК из-за воздействия повреждающего ДНК агента34.

Разрывы репликационной вилки, вызванные физическими препятствиями (ДНК-белковые комплексы или повреждения ДНК), химическими препятствиями или мутациями, могут остановить репликацию и потребовать гомологичной рекомбинации для ее возобновления. Это известно как нарушение прогрессирования вилки. Многочисленные исследования in vitro и in vivo показали, что транскрипция может иногда предотвращать развитие репликационной вилки таким образом35.

Инициации - это источники репликации, которые инициируются и срабатывают во время первого или второго импульса. Источники, которые срабатывают во время первого импульса и имеют репликационные вилки, которые продолжают быть активными, имеют зелено-красно-зеленый паттерн (рис. 2B, ниже). Источники, которые инициируются во время второго импульса, имеют только зеленый паттерн (рис. 2B, вверху) и иногда называются вновь инициированными источниками, поэтому эти источники можно отличить от тех, которые инициируются во время первого импульса. Сравнение относительного процента новых источников между двумя экспериментальными условиями позволяет понять, как клетка реагирует на агент, повреждающий ДНК, или наличие или отсутствие белка. Терминации создаются, когда две репликационные вилки из соседних репликонов сливаются, и они имеют красно-зелено-красный паттерн (рис. 2D)30.

Основываясь на фактах, описанных выше, анализ ДНК-волокна в настоящее время считается предпочтительным методом изучения изменений в динамике репликации ДНК, вызванных токсичными агентами, такими как наноматериалы. Исследователи теперь хорошо понимают и знают динамику полногеномной репликации ДНК у эукариот, как количественно, так и качественно, благодаря открытию этой технологии36. На основе переменных результатов может быть принято несколько методологий. Некоторые примеры методов изучения вариаций повреждений ДНК, вызванных внешними агентами/наночастицами, показаны на рисунке 3. Общая цель метода анализа ДНК-волокна, описанного в этом исследовании, состоит в том, чтобы определить, как наночастицы влияют на процесс репликации in vitro и как они по-разному влияют на различные ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка антител и буфера

  1. Приготовьте первичный раствор антител, мышиный анти-BrdU в разведении 1:300 в 5% BSA и анти-BrdU крысы в разведении 1:500 в 5% BSA.
  2. Приготовьте вторичный раствор антител, alexafluor 594 rabbit anti-mouse в разведении 1:300 в 5% BSA и alexafluor 488 chicken anti-rat в разведении 1:500 в 5% BSA.
  3. Приготовьте третичный раствор антител, alexafluor 594 козий анти-кролик в разведении 1:1,000 в 5% BSA и alexafluor 488 козий анти-куриный препарат в разведении 1:1,000 в 5% BSA.
  4. Приготовьте 10 мл буфера для лизиса в ddH 2 O с2мл 1M Tris (pH 7,4), 1 мл 0,5 М ЭДТА и 0,5 мл 10% SDS.

2. Подготовка к анализу клетчатки

  1. День 1: Клеточная культура и обработка наноматериалов для анализа волокон
    1. Планшет RAW 264.5 макрофагальных клеток или интересующих клеток, таким образом, чтобы клетки находились в логарифмической фазе своего роста в день эксперимента. Для ячеек RAW добавьте 5 x 104 ячеек/лунок к 24-луночным планшетам для каждого условия. Храните клетки в инкубаторе с температурой 37 °C при 5% CO2 и влажности 98%. В таблице 1 описаны составляющие используемых сред. Позвольте клеткам вырасти до 75%-80% слияния17,37.
    2. После того, как клетки достигнут уровня слияния 75%-80%, удалите среду из пластин, возьмите половину среды и зарезервируйте ее для импульса CldU (резерв CldU) и добавьте 5 мкл IdU к другой половине при конечной концентрации 50 мкМ. Смешайте и добавьте среду, содержащую IdU, обратно в пластины. Поместите клетки с IdU в инкубатор на 20 мин.
    3. Поместите резервную среду CldU при температуре 37 °C, чтобы она оставалась предварительно нагретой. Добавьте CldU в эту среду непосредственно перед импульсом CldU.
    4. Через 20 мин аспирируйте смесь IdU-среды и осторожно промойте клетки 500 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, pH 7,4), осторожно вращая пластину. Откажитесь от PBS.
    5. Обработайте клетки различными концентрациями наночастиц в 500 мкл среды и инкубируйте еще 30 мин. Для этого исследования используйте обработанные наночастицы оксида графена в концентрации 25 мкг / мл.
    6. Аспирируйте смесь лечебной среды и аккуратно промойте ячейки 500 мкл PBS, осторожно вращая пластину. Откажитесь от PBS. Добавьте 5 мкл CldU (100 мкМ в конечном итоге
    7. концентрацию) в резервную среду CldU, и накрыть клетки резервной средой CldU. Поместите клетки в инкубатор на время импульса CldU в течение 20 мин.
    8. Промойте клетки PBS, соскребите или трипсинизируйте в течение 3-4 минут, а затем добавьте 5 мл среды в пластину и соберите клетки.
    9. Отжим при 264 x g в течение 4 мин. Удалите среду и ресуспендируйте клетки в 1 мл ледяного PBS. Определите количество клеток с помощью анализа трипанового синего (подсчет гемоцитометра), а затем разбавьте клетки до ~ 200-400 клеток / мкл. Держите клеточную суспензию на льду во время подсчета клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, ограничьте время, в течение которого клетки находятся на льду. Это может помочь получить шарик клеточного раствора вдоль верхней части предметного стекла. Если они хранятся на льду, держите их менее 30 минут.
  2. День 1: Подготовка волокон ДНК
    1. Карандашом пометьте предметные стекла (предметное стекло, 75 мм x 25 мм) с указанием условия эксперимента и даты.
    2. Возьмите 2 мкл клеток в пипетку, держите пипетку под углом ~45 °, поместите пипетку примерно на 1 см ниже скользящей этикетки и переместите пипетку горизонтально к скользящей этикетке. По мере того, как пипетка перемещается по предметному стеклу, выпускайте немного клеточного раствора за раз. Сделайте несколько строк ячеек на каждом слайде (критический шаг).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поперек предметного стекла должна быть горизонтальная линия суспензии ячеек. Если клеточная суспензия поднимается вверх, добавьте 5-10 мкл клеточной среды в контейнер с клеточной суспензией, так как это может помочь раствору прилипнуть к предметному стеклу при повторном применении.
    3. Дайте раствору с клетками испариться, пока раствор не станет липким и липким. В этот момент некоторое количество жидкости связано с клетками, но немного. Этот шаг занимает от 8 до 20 минут и варьируется в зависимости от влажности воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что весь раствор не испарился, так как это очень затрудняет получение прямых и выровненных волокон ДНК, поскольку большинство, если не все, ДНК будут склеены вместе и не смогут разделиться.
    4. Когда раствор станет липким, наложите на клетки 15 мкл буфера для растекания (лизиса) на каждую линию клеток, стараясь не позволять кончику пипетки касаться предметного стекла. Подождите 10 минут. Наклоните слайд под углом 25° и поместите этикетку предметного стекла горизонтально к краю стойки для труб (нижняя часть этикетки должна совпадать с краем стойки для труб).
    5. Дайте спредам ДНК высохнуть на воздухе в течение как минимум 4 часов с момента изготовления последних слайдов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Период от 4 до 12 часов хорош для сушки. Однако не давайте им высохнуть в течение ночи. Если дать высохнуть в течение ночи, будет много расслабленной ДНК, но очень мало прямых и выровненных волокон ДНК.
  3. День 1: Фиксация волокон ДНК и замораживание
    1. После высыхания предметных стекол закрепите предметные стекла метанолом: уксусной кислотой (3:1), погрузив предметные стекла на 2 минуты. Выполните этот шаг под капюшоном и дайте горкам высохнуть в течение ночи в месте с ограниченным освещением или накройте горки палаткой из оловянной фольги.
  4. День 2
    1. Поместите слайды в стеклянный держатель для предметного стекла. Поместите предметные стекла при температуре -20 °C минимум на 24 часа. Этот шаг улучшает разрешение или четкость изображения.

3. Выполнение анализа ДНК-волокна

  1. Денатурация ДНК
    1. Подготовьте увлажненную камеру, используя небольшие коробки с наконечниками для пипеток с крышками. Наполовину наполните емкости водой и поставьте их на водяную баню с температурой 37 °C не менее чем на 1 час.
    2. Выньте предметные стекла с температурой -20 °C и разморозьте их в течение нескольких секунд. Осторожно поместите предметные стекла в банку Coplin с деионизированной (DI) водой так, чтобы покрытые поверхности не касались стенок банки. Инкубируйте горку в течение 20 с, а затем аккуратно вылейте воду.
    3. Добавьте 2,5 м HCL в банку Coplin так, чтобы она покрывала все горки. Подождите 80 мин. Это важный шаг в протоколе. Изменение времени может изменить результат изображения.
    4. Промойте предметные стекла 1 раз с помощью PBS плюс Tween (PBS + 0,1% Tween [конечная концентрация]), а затем 2 раза с PBS в течение 3 минут каждое при комнатной температуре (RT).
  2. Иммуноокрашивание
    1. Держите слайды в увлажненной камере для следующих шагов. Заблокируйте предметные стекла в 5% BSA в PBS в течение 30 минут при RT и накройте их покровными стеклами, покровными стеклами, изготовленными из вестерн-блоттинга, или прозрачными пластиковыми листами.
    2. После блокировки осторожно снимите покровное стекло, удалите блокирующий раствор и промокните предметное стекло на бумажном полотенце (постучите предметным стеклом по полотенцу), чтобы удалить излишки блокирующего раствора.
    3. Добавьте 100 мкл раствора первичного антитела по длине предметного стекла. Добавьте новое пластиковое покровное стекло и подождите 2 часа. При добавлении покровного стекла следите за тем, чтобы не образовывались пузырьки.
    4. Через 2 часа сбивайте раствор антител и промойте предметные стекла в банке Coplin, заполненной PBS, 2 раза при ЛТ. Каждый раз используйте свежий PBS для мытья предметных стекол.
    5. Снова заблокируйте предметные стекла, добавив 200 мкл (три-четыре капли) 5% BSA вдоль каждого предметного стекла и добавьте пластиковое покровное стекло. Подождите 15 минут.
    6. Снимите покровное стекло, сбейте излишки BSA на бумажное полотенце и добавьте 100 мкл раствора вторичных антител по длине предметного стекла. Добавьте новое пластиковое покровное стекло и подождите 1 час.
    7. Снимите покровное стекло, сбейте излишки BSA на бумажное полотенце и вымойте предметные стекла 2 раза в PBS при RT.
    8. Снова заблокируйте предметные стекла, добавив 200 мкл (три-четыре капли) 5% BSA вдоль каждого предметного стекла и добавьте пластиковое покровное стекло. Подождите 15 минут.
    9. При необходимости снимите покровное стекло, удалите излишки BSA на бумажном полотенце и добавьте 100 мкл раствора третичных антител по всей длине предметного стекла. Добавьте новые пластиковые покровные стекла и подождите 30 минут.
    10. Вымойте предметные стекла с помощью PBS 3x. Удалите излишки PBS и дайте им полностью высохнуть.
    11. После высыхания добавьте монтажную среду и аккуратно наложите на монтажную среду стеклянные покровные стекла (24 мм x 60 мм), чтобы избежать образования пузырьков. Заново пометьте слайды и оставьте их в темноте на ночь.

4. Получение изображения

  1. Визуализируйте иммуноокрашенные волокна ДНК с помощью иммунофлуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой, 60-кратным объективом и соответствующими наборами фильтров для обнаружения красителей алексафтора 488 и 594.
  2. Сделайте снимки для анализа в областях, где волокна хорошо разделены и не запутаны. Важно захватывать изображения в разных областях вдоль слайда, так как съемка изображений только в одной части слайда может не дать репрезентативных данных обо всех промежуточных продуктах репликации, обнаруженных на слайде.
  3. Если возможно, получите изображения волокна из 20 различных областей на слайде. Используйте только один канал для выбора областей для съемки изображений, чтобы избежать смещения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После получения достаточного количества изображений (от 20 до 100 изображений на условие) необходимо идентифицировать, измерить и подсчитать промежуточные продукты репликации. Независимо от того, анализируете ли волокна вручную или автоматически с помощью программы38, необходимо четко определить, какими характеристиками должно обладать волокно, чтобы его можно было подсчитать или оценить (или не подсчитать или измерить)39. Например, можно рассмотреть следующие вопросы. (1) Следует ли измерять и подсчитывать только волокна со 100% иммунофлуоресценцией по всему волокну, или они могут содержать некоторые области без иммунофлуоресценции (например, следует ли анализировать все промежуточные продукты на рисунке 4Ai, ii, iii или только их подмножество?)? При анализе волокон с потерей сигнала, каковы максимальные потери сигнала, допустимые в волокне, и каково максимальное количество непрерывных пикселей в волокне, которое может быть лишено какого-либо сигнала (например, будет ли рисунок 3Aiv считаться промежуточным продуктом с красным или только красным цветом?)? (2) Какой должна быть минимальная и максимальная ширина / длина волокна? (3) Каким должно быть отношение сигнал/шум (S:N) при принятии решения о том, следует ли измерять волокно или нет (например, сколько волокон следует выбрать на рисунке 4B для анализа?)? (4) Насколько близко к краю изображения должно быть волокно, прежде чем оно не будет подсчитано или измерено? (5) Если флуоресцентный сигнал желтый, считается ли он красным или зеленым (например, должна ли желтая часть промежуточного звена репликации на рисунке 4C считаться красной или зеленой?)? (6) Какой длины должен быть цветной сегмент, чтобы считаться истинным сигналом (например, является ли промежуточный звен репликации на рисунке 4D только зеленым треком, зелено-красно-зеленым или зелено-красным треком?)? (7) Если вы используете автоматизированную программу анализа волокон, насколько программа уверена в измерении/подсчете, который она только что выполнила? (8) Если волокна анализируются вручную, насколько последовательным должен быть анализ с течением времени и между людьми?

Как правило, параметры, используемые для анализа ДНК-волокна, следующие:
Отношение сигнал/шум: 3 (интенсивность волокна в три раза превышает интенсивность фона)
Толщина волокна: ширина ≤8 пикселей
Минимальный размер: только красный или зеленый и 10 пикселей; красно-зеленые дорожки с каждым сегментом ≥10 пикселей; красные-зелено-красные или зелено-красно-зеленые дорожки с каждым сегментом ≥10 пикселей.
Непрерывность флуоресцентного сигнала: не менее 80% и отсутствие промежутков в сигнале более 6 пикселей.
Уверенность в оценке: значения достоверности должны быть похожи друг на друга на изображении и между изображениями.

В дополнение к параметрам, упомянутым выше, еще одним важным критерием является выбор прозрачного волокна, которое не перекрывается с другими волокнами во время визуализации и анализа.

На рисунке 5A показаны репрезентативные изображения контроля (рис. 5Ai) и ДНК макрофагов, обработанных наночастицами оксида графена (рис. 5Aii, iii). На изображении показано увеличение количества треков только для чтения (окончаний) и уменьшение новых источников в клетках, обработанных оксидом графена, по сравнению с контролем (рис. 5C). Также важно учитывать количество изображений и положение слайда, с которого сделаны изображения. Как показано на рисунке 5Aiii,C, изменение структуры репликационных промежуточных продуктов (увеличение новых источников по сравнению с контролем) наблюдалось в другой области того же состояния. Несмотря на то, что некоторые из таких наблюдений могут не повлиять на общий результат, необходимо позаботиться о том, чтобы изобразить слайд, включив в него все репрезентативные области. Было бы идеально разделить общую площадь слайда на пять-шесть областей и взять несколько изображений из каждой области (например, 10 изображений), чтобы найти убедительные данные о волокнах для каждого слайда. Идеально выбрать около 500 промежуточных продуктов (рис. 5B) из нескольких слайдов/условий. С этими вариациями репликации промежуточное количественное определение из анализа волокна ДНК может быть использовано для исследования вариаций в динамике репликации ДНК, вызванных наночастицами оксида графена или генотоксичностью других наноматериалов. Следовательно, с помощью этой новой методологии можно получить как качественное, так и количественное понимание динамики репликации ДНК в масштабах всего генома по сравнению с другими анализами, упомянутыми во введении.

Figure 1
Рисунок 1: Анализ ДНК-волокна. Схематическое изображение анализа с обзором основных этапов анализа ДНК-волокна. Масштаб: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Иммуноокрашивание промежуточных продуктов репликации ДНК. Схематическое изображение различных репликационных промежуточных продуктов, идентифицированных последовательной импульсной маркировкой с помощью IdU (красный) и CldU (зеленый). Масштаб: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Воздействие наночастиц. Различные методологии для изучения вариаций повреждения ДНК, вызванного наночастицами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Характеристики волокон ДНК, подлежащих оценке. Примеры промежуточных продуктов репликации в образе. а) пробелы в иммунофлюоресценции; (i) 0% потери сигнала иммунофлуоресценции через промежуточный продукт репликации; (ii) ~ 7% потерь сигнала; (iii) 50% потери сигнала; и (iv) потери сигнала >90%. (B) Область с большим количеством перекрывающихся репликационных промежуточных продуктов (стрелка указывает область с четким перекрытием волокон). (C) Волокно ДНК с желтой областью. (D) Промежуточный продукт репликации, открытый для интерпретации (стрелка указывает пробелы в волокне). Масштаб: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ и интерпретация волокон ДНК . (A) Репрезентативные изображения волокон ДНК из (i) контрольных клеток макрофагов и (ii, iii) клеток макрофагов, обработанных наночастицами в течение 20 минут при концентрации 25 мкг / мл. Изображения ii и iii были взяты из разных областей слайда. (B) Репрезентативный автоматизированный программный анализ условий управления и обработки наночастицами. Для этого анализа мы использовали автоматизированную программу отслеживания и измерения волокон ДНК, разработанную Wang et al.38. Цифры на рисунке показывают количество проанализированных треков ДНК. (C) Графическое представление программного анализа контрольных и обработанных наночастицами условий. NP представляет собой наночастицы. Относительный процент промежуточной популяции (например, только для красного цвета) рассчитывается на основе общего количества проанализированных промежуточных продуктов. Сравнивая изображение 1, обработанное NP, с изображением 2, между двумя изображениями есть большие различия. Таким образом, важно получить много изображений по всему слайду, чтобы понять, как экспериментальное условие влияет на процесс репликации. Сокращения: R = красный; G = зеленый. Масштаб: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Состав СМИ
10% фетальная бычья сыворотка
1% раствор пенициллина-стрептомицина (10000 ед/мл)
1% л глютамина (200 мМ)
Модифицированный орл Дульбекко со средним и высоким уровнем глюкозы

Таблица 1: Состав среды, используемой для культивирования клеток макрофагов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы обсуждаем метод, помогающий в анализе вариаций динамики репликации ДНК в присутствии наночастиц с помощью анализа волокна ДНК. Основные критические этапы, связанные со стандартным анализом, описаны в протоколе (этап 2.2.2 и этап 3.1.3). Всегда рекомендуется использовать область с ограниченным воздействием верхнего света и постоянным потоком воздуха, чтобы предотвратить вызванные светом разрывы ДНК на предметных стеклах, а также повысить воспроизводимость. Требуется пристальное внимание к продолжительности высыхания лизата клеток на предметных стеклах. Пересушивание отрицательно скажется на распределении волокон. Вторым важным этапом является денатурация волокон с использованием раствора кислоты. Продолжительность кислотной промывки должна быть одинаковой для всех предметных стекол в одном эксперименте. Поиск и устранение неисправностей для этих двух шагов для поиска оптимальных условий (время лизиса, объем лизата на предметном стекле, время сушки и время кислотной промывки) рекомендуется для различных типов клеток и лабораторных условий.

Как обсуждалось на рисунке 3, продолжительность воздействия наночастиц может варьироваться для количественного определения изменения в динамике репликации ДНК, индуцированного наночастицами. Для определения начального влияния динамики репликации было бы целесообразно кратковременное воздействие, такое как 1 мин, 20 мин или 30 мин с различными дозировками. Разница в паттернах репликации (как показано на рисунке 2) после длительного воздействия наноматериалов на клетки может быть определена путем сравнения паттернов воздействия IdU и CIdU (по 20 мин каждый) до и после обработки наночастицами. Этот подход может быть использован для определения срыва вилки, замедления вилки и разницы в происхождении стрельбы в разное время воздействия, что можно интерпретировать как эффекты острого и хронического воздействия наноматериалов39,40.

Существует несколько многообещающих методов обнаружения вариаций репликации ДНК, таких как расчесывание ДНК и метод RDS; однако, по сравнению с этими методами, анализ ДНК-волокна удобен и экономичен без необходимости использования дорогостоящих инструментов для анализа41. Ограничениями этого метода являются продолжительность эксперимента, время, необходимое для получения достаточного количества изображений для количественной оценки, а также анализ программного обеспечения. Однако, безусловно, этот подход будет поддерживать исследования нанотоксикологии в определении геномной нестабильности, вызванной частицами в клеточных линиях, а также в разных образцах тканей и между разными видами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Acknowledgments

Авторы выражают признательность за финансовую поддержку со стороны Фонда Блейзера, Программы медицинской биотехнологии в Биомедицинских науках, UIC Rockford, и Департамента образования в области медицинских наук, UIC Rockford. Авторы благодарят Ананью Сангинени и Джеймса Брэдли за их вклад в проект.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
  2. Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
  3. Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
  4. Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
  5. Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
  6. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
  7. Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
  8. Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
  9. Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
  10. Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
  11. Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
  12. Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
  13. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  14. Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
  15. Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
  16. Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
  17. Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
  18. Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
  19. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
  20. Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
  21. Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
  22. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  23. Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
  24. Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
  25. Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
  27. Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
  28. Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
  29. Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
  30. Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
  31. Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
  32. Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
  33. Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
  34. Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
  35. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  36. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  37. Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
  38. Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
  39. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  40. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  41. Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).

Tags

Биология выпуск 193
Демонстрация анализа ДНК-волокна для исследования повреждений ДНК и динамики репарации, индуцированной наночастицами
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar,… More

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter