Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדגמה של בדיקת סיבי DNA לחקר נזק לדנ"א ודינמיקת תיקון הנגרמת על ידי ננו-חלקיקים

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64903
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

המתודולוגיה מסייעת בניתוח השונות בדינמיקה של שכפול DNA בנוכחות ננו-חלקיקים. ניתן לאמץ מתודולוגיות שונות המבוססות על רמת ציטוטוקסיות של החומר המעניין. בנוסף, תיאור של ניתוח התמונה מסופק כדי לסייע בניתוח סיבי DNA.

Abstract

חשיפה לננו-חומרים עלולה לגרום לעקה של שכפול ולחוסר יציבות גנומית בתאים. מידת חוסר היציבות תלויה בכימיה, בגודל ובריכוז של הננו-חומרים, בזמן החשיפה ובסוג התא החשוף. מספר שיטות מבוססות שימשו כדי להבהיר כיצד סוכנים אנדוגניים/אקסוגניים משפיעים על שכפול גלובלי. עם זאת, בדיקות ברמת הרפליקון, כגון בדיקת סיבי DNA, הכרחיות כדי להבין כיצד סוכנים אלה משפיעים על התחלת השכפול, הסיומות והתקדמות מזלג השכפול. ידיעה זו מאפשרת להבין טוב יותר כיצד ננו-חומרים מגדילים את הסיכויים לקיבוע מוטציות ולחוסר יציבות גנומית. השתמשנו במקרופאגים RAW 264.7 כתאי מודל כדי לחקור את דינמיקת השכפול תחת חשיפה לננו-חלקיקים של תחמוצת גרפן. כאן, אנו מדגימים את הפרוטוקול הבסיסי לבדיקת סיבי DNA, הכולל תיוג פולסים עם אנלוגים של נוקלאוטידים, ליזה של תאים, פיזור סיבי הדנ"א המסומנים בדופק על שקופיות, אימונוסטיישן פלואורסצנטי של אנלוגים לנוקלאוטידים בתוך סיבי הדנ"א, הדמיה של מתווכי השכפול בתוך סיבי הדנ"א באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח ביניים של שכפול באמצעות תוכנת ניקוד וניתוח בסיוע מחשב (CASA).

Introduction

במהלך כל מחזור תא, שכפול DNA מבטיח שכפול גנום מדויק1. שכפול כרומוזומלי אאוקריוטי תלוי למעשה בשלושה גורמים: עיתוי הירי של מקורות שכפול מרובים, מהירות המזלגות היוצאים ממקורות השכפול, וסיום תהליך השכפול כאשר שני מזלגות שכפול ממקורות סמוכים נפגשים2. להעברה בנאמנות גבוהה של מידע גנטי לתאי בת, כמו גם לשמירה על שלמות גנטית, שכפול DNA מדויק הוא חיוני. סוכנים המתפתחים מחילוף חומרים רגיל או נובעים מחומרים סביבתיים מלאכותיים או טבעיים תוקפים ללא הרף את הגנום. חומרים אנדוגניים ואקסוגניים אלה גורמים למזלגות השכפול להאט או לעצור עקב מפגש עם נזק לדנ"א שנגרם על ידי סוכנים אלה, והמזלגות המאטים או נעצרים באופן זמני בתגובה לקשיים אלה נקראים לחץ שכפול3. בתגובה לעקת השכפול, התאים פיתחו מספר מסלולים מולקולריים השומרים על יציבות מזלגות השכפול המופרעים ומאפשרים להם להפעיל מחדש4. במונחים של יציבות גנטית, הישרדות תאים ומחלות אנושיות, מנגנוני תגובת עקה אלה התגלו כגורמי המפתח לשמירה על גנום בריא, הבטחת הישרדות התא והפחתת הסבירות להיווצרות מחלות5.

אחד הסוכנים האקסוגניים המסוגלים לייצר לחץ שכפול הוא ננו-חלקיקים. ננו-חלקיקים הם חלקיקים שגודלם נע בין 1 ננומטר ל-100 ננומטר6. בשל שטחי הפנים הגבוהים שלהם, צורותיהם הייחודיות ותכונותיהם הכימיות הייחודיות, ננו-חלקיקים משמשים במגוון יישומים רפואיים, פרמצבטיים, סביבתיים ותעשייתיים 7,8. בעוד שלננו-חלקיקים יש יתרונות פוטנציאליים רבים, חלקם (בשל טבעם התורשתי או אריכות ימיהם) יכולים להפוך רעילים. ננו-חלקיקים יכולים להיווצר גם עקב הבלאי הטבעי של שתלים רפואיים ולהשתחרר לאזור הפרי-תותב 9,10.

בשל חשיפת בני האדם למספר עצום של ננו-חלקיקים המיוצרים עבור יישומים שונים, המחקר בתחום רעילות ננו-חלקיקים גדל מאוד במהלך 10 השנים האחרונות11. בעוד מאמצי מחקר אלה חשפו מידע בשפע על האיום הפוטנציאלי שננו-חלקיקים מהווים לבריאות האדם, הידע על הפוטנציאל של ננו-חלקיקים לגרום לגנוטוקסיות עדיין מוגבל. מה שהתגלה עד כה הוא שננו-חלקיקים אלה יכולים לקיים אינטראקציה פיזית עם הדנ"א, לקדם נזק לדנ"א ולפגוע או להפריע לחלבונים האחראים לתיקון או שכפול דנ"א12. כדי לזהות כיצד הם מפריעים לשכפול DNA, משתמשים בדרך כלל בסירוק סיבי DNA, סינתזת DNA עמיד לרדיו (RDS) וניתוח סיבי DNA 13,14,15,16.

שיטת סירוק סיבי הדנ"א גמישה ומספקת מידע על דינמיקת מזלג השכפול ברמת המולקולה הבודדת17. בעיקרו של דבר, כיסוי מומלח נשלף בעדינות מתמיסת הדנ"א ברגע שקצה הדנ"א נקשר אליו. מולקולות הדנ"א מיושרות ומיושרות על ידי המניסקוס של התמיסה. ההומוגניות, הריווח והיישור של סיבי הדנ"א תומכים במדידות מדויקות ומהימנות של אורך מערכת הסיבים. על ידי התאמת אורך ורצף הטיפולים והתרופות המשמשות לגרימת מתח או נזק, ניתן לעקוב אחר היבטים רבים של התקדמות המזלג באמצעות יישום זה. בשיטה זו נעשה שימוש במערכת תיוג כפולה, שבאמצעותה מעריכים את המהירות וההתקדמות של מזלג השכפול17,18. מצד שני, אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי מנצלת את העובדה שבאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, מבני דנ"א מסתעפים נעים לאט יותר מאשר מולקולות דנ"א ליניאריות בעלות אותה מסה, מה שמאפשר הפרדה נקייה בין השניים בריצה דו-ממדית. למעשה, שיטה זו נחקרת כדי להפריד מולקולות DNA בהתבסס על המסה שלהם בסיבוב הראשון ועל בסיס צורתן בריצה האורתוגונלית השנייה. לאחר פיצול הדנ"א הגנומי, מתווכי השכפול והרקומבינציה הנדירים מפתחים צורת הסתעפות, וניתן להבדיל בינם לבין המולקולות הליניאריות הנפוצות יותר בג'ל הדו-ממדי19.

שיטת RDS משמשת לקביעת האופן שבו סינתזת DNA גלובלית מושפעת. בשיטה זו, מידת העיכוב של שכפול גלובלי נקבעת על ידי השוואת כמות הנוקלאוטידים המסומנים רדיואקטיבית, כגון [14C] תימידין, בתאים לא מטופלים לעומת14,20. ההבדל באחוזים בתיוג הרדיו בין התאים הלא מטופלים למטופלים מייצג את המידה שבה הגורם המזיק לדנ"א משפיע על סינתזת הדנ"א. בדומה לכך, שיטה אחרת משתמשת ביכולתם של תאים לשלב אנלוגים של נוקלאוטידים כמו BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) עבור ציטומטריית זרימה כדי למדוד את השיעורים הכוללים של סינתזת DNA21,22. בעוד ששיטות אלה מדגימות כיצד גורמים הפוגעים בדנ"א משפיעים על סינתזת דנ"א גלובלית, הן אינן מראות כיצד מגיבים בודדים מושפעים. אכן, בדיקות ברמת הרפליקון הכרחיות כדי להבין טוב יותר את ההתחלה וההיקף של חוסר יציבות גנומית במקרה של חשיפה לחלקיקים רעילים (ננו-חומר). אוטורדיוגרפיה של סיבי DNA ומיקרוסקופ אלקטרונים הן כמה שיטות המשמשות כדי לקבוע אתזה 23,24,25,26.

המושגים של בועות שכפול ושכפול דו-כיווני ממקורות במרווחים לא שווים פותחו לראשונה באמצעות בדיקות של מולקולות בודדות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים ואוטורדיוגרפיה של סיבי DNA27,28. התצפית הישירה של מתווכי שכפול מסתעפים על מולקולות ספציפיות המפוזרות על פני רשת מצופה פחמן מתאפשרת במידה רבה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה זו, המשמשת עד היום למעקב אחר שינויים פתולוגיים במזלגות שכפול, שימשה לאיתור המקור האיקריוטי הראשון של שכפול דנ"א28. אוטורדיוגרפיה של סיבים מתרכזת סביב הרעיון של זיהוי אוטורדיוגרפי של אזורים משוכפלים חדשים ותיוג הדופק של כרומוזומים עם תימידין טריטי. ההערכה הכמותית הראשונה של צפיפות המקור ושיעורי פיצול השכפול ברצפים גנומיים מטזואיים התאפשרה על ידי אוטורדיוגרפיה של סיבי DNA29.

נכון לעכשיו, שיטות פלואורוגרפיה סיבים תפסו את מקומה של אוטורדיוגרפיה, בעיקר משום שפלואורוגרפיית סיבים מהירה בהרבה מאוטורדיוגרפיה. בפלואורוגרפיה של סיבים, שתי נגזרות נוקלאוטידים הלוגניות, כגון ברומו- (Br), כלורו- (Cl), או יודאודוקסיורידין (IdU), משולבות ברצף בדנ"א משוכפל טרי ולאחר מכן מזוהות על ידי אימונופלואורסנציה עקיפה באמצעות נוגדנים30. צפייה מיקרוסקופית של הדנ"א המתהווה ששילב אנלוגים אחד או שניהם מתאפשרת על-ידי צביעה חיסונית של אחד האנלוגים בצבע אחד ושל האנלוגים האחרים בצבע אחר (למשל, צביעה חיסונית של דנ"א מתהווה עם אדום IdU משולב וירוק CldU משולב) (איור 1)21. ניתן לזהות סוגים רבים ושונים של מתווכי שכפול על ידי ניתוח סיבי DNA. הנפוצים ביותר הם מזלגות התארכות בודדים, חניכות וסיומות. למזלגות מתארכים בודדים יש תבנית שכפול של אדום ואחריו ירוק (אדום-ירוק; איור 2A). 13 אורכי המתווכים האלה משמשים לעתים קרובות למדידת מהירות המזלג (כלומר, אורך המזלג/זמן הדופק) או הפירוק האקסונוקלאוליטי של דנ"א מתהווה באמצעות קיצור מסלול (איור 2E)30,31,32. במחקר של Mimitou et al., נמצא כי בחשיפה ארוכת טווח להידרוקסיוריאה, רעל שכפול הגורם לשברים דו-גדיליים בדנ"א, RE11 גויס33. MRE11 הוא אקסונוקלאז הידוע בפעילות האקסונוקלאז 3'-5' שלו, והוא מסוגל לחתוך את קצות הדנ"א לתיקון. לכן, כאשר נחשפים לחומרים רעילים, ניתן להבחין בהתפרקות אקסונוקלאוליטית של דנ"א מתהווה, שהיא קיצור גדיל הדנ"א עקב חשיפה לחומר הפוגע בדנ"א34.

שבירת מזלג השכפול הנגרמת על ידי חסימות פיזיות (קומפלקסים של חלבוני DNA או נגעים בדנ"א), מכשולים כימיים או מוטציות עשויות לעצור את השכפול ולחייב רקומבינציה הומולוגית כדי להפעיל אותו מחדש. תופעה זו ידועה בשם התקדמות מזלג לקויה. מחקרים רבים במבחנה ו-in vivo הצביעו על כך שתמלול עשוי, לעיתים, למנוע התקדמות מזלג שכפול באופן זה35 .

חניכות הן מקורות שכפול היוזמים ויורים במהלך הפעימה הראשונה או השנייה. למקורות שיורים במהלך הפעימה הראשונה ויש להם מזלגות שכפול שממשיכים להיות פעילים יש תבנית ירוקה-אדומה-ירוקה (איור 2B, נמוך יותר). למקורות שמתחילים במהלך הפעימה השנייה יש תבנית ירוקה בלבד (איור 2B, עליון) ולפעמים הם נקראים מקורות שהתחילו לאחרונה, כך שאפשר להבדיל בין המקורות האלה לאלה שמתחילים במהלך הפעימה הראשונה. השוואת האחוזים היחסיים של מקורות חדשים שנורו בין שני תנאי ניסוי מאפשרת להבין כיצד תא מגיב לחומר המזיק לדנ"א או לנוכחות או היעדר חלבון. סיומות נוצרות כאשר שני מזלגות שכפול מרפליקונים סמוכים מתמזגים, ויש להם תבנית אדומה-ירוקה-אדומה (איור 2D)30.

בהתבסס על העובדות שתוארו לעיל, ניתוח סיבי דנ"א נחשב כיום לשיטה מועדפת לחקר השונות בדינמיקת שכפול הדנ"א הנגרמת על ידי חומרים רעילים כגון ננו-חומרים. לחוקרים יש כיום הבנה טובה וידע על הדינמיקה של שכפול דנ"א כלל גנומי באיקריוטים, הן מבחינה כמותית והן מבחינה איכותית, הודות לגילוי טכנולוגיה זו36. בהתבסס על משתני התוצאה, ניתן לאמץ מספר מתודולוגיות. כמה דוגמאות לשיטות לחקור את השינויים בנזק לדנ"א שנגרם על-ידי סוכנים חיצוניים/ננו-חלקיקים מוצגות באיור 3. המטרה הכוללת של שיטת ניתוח סיבי הדנ"א המתוארת במחקר זה היא לקבוע כיצד ננו-חלקיקים משפיעים על תהליך השכפול במבחנה וכיצד הם משפיעים באופן דיפרנציאלי על רקמות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת נוגדנים וחיץ

  1. הכינו את תמיסת הנוגדנים העיקרית, אנטי-BrdU עכברי בדילול 1:300 ב-5% BSA ואנטי-BrdU חולדה בדילול 1:500 ב-5% BSA.
  2. הכינו את תמיסת הנוגדנים המשנית, alexafluor 594 ארנב נגד עכבר בדילול 1:300 ב-5% BSA ו-alexafluor 488 עוף נגד חולדה בדילול 1:500 ב-5% BSA.
  3. הכינו את תמיסת הנוגדנים השלישונית, alexafluor 594 עז נגד ארנב בדילול 1:1,000 ב-5% BSA ו-alexafluor 488 עז נגד עוף בדילול 1:1,000 ב-5% BSA.
  4. הכן 10 מ"ל של חיץ ליזיס ב- ddH 2 O עם2מ"ל של 1M Tris (pH 7.4), 1 מ"ל של 0.5 M EDTA ו- 0.5 מ"ל של 10% SDS.

2. הכנה לבדיקת סיבים

  1. יום 1: תרבית תאים וטיפול ננו-חומרי לבדיקת סיבים
    1. צלחת RAW 264.5 מקרופאגים תאים או התאים המעניינים, כך התאים נמצאים בשלב היומן של הצמיחה שלהם ביום הניסוי. עבור תאי RAW, הוסף 5 x 104 תאים/באר ללוחות של 24 בארות עבור כל מצב. שמור על התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ו 98% לחות. טבלה 1 מתארת את מרכיבי המדיה שבה נעשה שימוש. לאפשר לתאים לגדול למפגש של 75%-80%17,37.
    2. לאחר שהתאים מגיעים לרמה של 75%-80% מפגש, מוציאים את התווך מהלוחות, לוקחים חצי מהתווך ושומרים אותו לפולס CldU (שמורת CldU), ומוסיפים 5 μL IdU לחצי השני בריכוז סופי של 50 מיקרומטר. מערבבים ומוסיפים את התווך המכיל IdU בחזרה לצלחות. מניחים את התאים עם IdU באינקובטור למשך 20 דקות.
    3. מניחים את מדיום הרזרבה CldU על 37 °C כדי לשמור אותו מחומם מראש. הוסף CldU למדיום זה ממש לפני דופק CldU.
    4. לאחר 20 דקות, שאפו את תערובת IdU-medium, ושטפו בעדינות את התאים עם 500 μL של מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 7.4) על ידי סיבוב עדין של הצלחת. השליכו את ה-PBS.
    5. לטפל בתאים בריכוזים שונים של ננו-חלקיקים ב-500 מיקרוליטר של התווך, ולדגור במשך 30 דקות נוספות. במחקר זה, השתמש בננו-חלקיקים של תחמוצת גרפן מטופלים בריכוז של 25 מיקרוגרם/מ"ל.
    6. שאפו את התערובת הטיפולית-בינונית, ושטפו בעדינות את התאים עם 500 מיקרוליטר PBS על ידי סיבוב עדין של הצלחת. השליכו את ה-PBS. הוסף 5 μL של CldU (100 מיקרומטר סופי
    7. ריכוז) למדיום הרזרבה CldU, ולכסות את התאים בתווך הרזרבה CldU. מניחים תאים באינקובטור למשך פעימת CldU למשך 20 דקות.
    8. לשטוף את התאים עם PBS, לגרד או tripsinize במשך 3-4 דקות, ולאחר מכן להוסיף 5 מ"ל של בינוני לצלחת, ולאסוף את התאים.
    9. סבבו במהירות של 264 x גרם במשך 4 דקות. הסר את המדיום, ולהשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של PBS קר כקרח. קבע את מספרי התאים באמצעות בדיקת טריפאן כחול (ספירת המוציטומטר), ולאחר מכן דלל את התאים ל~200-400 תאים / μL. שמור את תרחיף התא על קרח במהלך ספירת התא.
      הערה: במידת האפשר, הגבל את הזמן שבו התאים יושבים על הקרח. זה עשוי לעזור להשיג חרוז של תמיסת תאים לאורך החלק העליון של השקופית. אם הם נשמרים על קרח, לשמור אותם על פחות מ -30 דקות.
  2. יום 1: הכנת סיבי הדנ"א
    1. בעזרת עיפרון, תייג את השקופיות (שקופית זכוכית, 75 מ"מ x 25 מ"מ) עם תנאי הניסוי והתאריך.
    2. קח 2 μL של תאים בפיפטה, החזק את פיפטה בזווית ~ 45°, מקם את פיפטה כ -1 ס"מ מתחת לתווית השקופית, והזז את פיפטה אופקית לתווית השקופית. כאשר פיפטה נעה על פני השקופית, שחררו מעט מתמיסת התא בכל פעם. צור שורות מרובות של תאים בכל שקופית (שלב קריטי).
      הערה: אמור להיות קו אופקי של השעיית תאים לאורך השקופית. אם תרחיף התא מתחרז, הוסף 5-10 μL של תווך התא למיכל שבו יש את השעיית התא, מכיוון שהדבר עשוי לעזור לפתרון להיצמד לשקופית כאשר מוחל שוב.
    3. תנו לתמיסה עם התאים להתאדות עד שהתמיסה נראית דביקה ודביקה. בשלב זה, נוזל מסוים קשור לתאים, אבל לא הרבה. שלב זה אורך בין 8-20 דקות ומשתנה בהתאם לכמות הלחות באוויר.
      הערה: ודא שכל התמיסה לא התאדה, מכיוון שהדבר מקשה מאוד על השגת סיבי דנ"א ישרים ומיושרים מכיוון שרוב, אם לא כל, הדנ"א יהיה דבוק זה לזה ולא יוכל להיפרד.
    4. כאשר התמיסה דביקה, כיסו את התאים ב-15 מיקרוליטר של חיץ מתפשט (ליזה) לכל שורה של תאים, תוך הקפדה לא לתת לקצה הפיפטה לגעת בשקופית. המתן 10 דקות. הטה את השקופית בזווית של 25° והנח את תווית השקופית אופקית על קצה מדף צינורות (החלק התחתון של התווית צריך להתיישר עם קצה מדף הצינורות).
    5. הניחו להתפשטות הדנ"א להתייבש באוויר למשך 4 שעות לפחות מרגע ביצוע השקופיות האחרונות.
      הערה: פרק זמן של 4 שעות עד 12 שעות טוב לייבוש. עם זאת, אל תתנו להם להתייבש בן לילה. אם יניחו לו להתייבש בן לילה, יהיה הרבה דנ"א רגוע אבל מעט מאוד סיבי דנ"א ישרים ומיושרים.
  3. יום 1: תיקון סיבי הדנ"א והקפאה
    1. לאחר שהשקופיות התייבשו, תקן את המגלשות עם מתנול:חומצה אצטית (3:1) על ידי טבילת המגלשות למשך 2 דקות. בצעו שלב זה מתחת למכסה מנוע, ותנו למגלשות להתייבש למשך הלילה באזור עם חשיפה מוגבלת לאור, או כסו את המגלשות באוהל נייר כסף.
  4. יום 2
    1. מקם את השקופיות במנשא שקופיות זכוכית. מקם את המגלשות ב -20 ° C למשך מינימום של 24 שעות. שלב זה משפר את הרזולוציה או החדות של התמונה.

3. ביצוע בדיקת סיבי DNA

  1. דנטורציה של הדנ"א
    1. הכינו תא לח באמצעות קופסאות פיפטה קטנות עם מכסים. חצי למלא את המיכלים עם מים, ומניחים אותם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפחות 1 שעה.
    2. הוציאו את המגלשות מ-20°C, והפשירו אותן למשך מספר שניות. הניחו את המגלשות בזהירות בצנצנת קופלין המכילה מים שעברו דה-יוניזציה (DI) כדי שהמשטחים המצופים לא ייגעו בדפנות הצנצנת. לדגור על המגלשה במשך 20 שניות, ולאחר מכן בזהירות לשפוך את המים.
    3. הוסיפו לצנצנת קופלין 2.5 מ' HCL כך שתכסה את כל המגלשות. המתן 80 דקות. זהו שלב קריטי בפרוטוקול. שינוי בזמן יכול לשנות את התוצאה של התמונה.
    4. שטפו את המגלשות פעם אחת עם PBS בתוספת טווין (PBS + 0.1% טווין [ריכוז סופי]) ולאחר מכן פעמיים עם PBS למשך 3 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר (RT).
  2. אימונוסטיין
    1. שמור את השקופיות בתא הלח עבור השלבים הבאים. חסום את המגלשות ב- 5% BSA ב- PBS למשך 30 דקות ב- RT, וכסה אותן בכיסויים, כיסויים עשויים משקית כתם מערבית, או יריעות פלסטיק שקופות.
    2. לאחר החסימה, הסירו בזהירות את הכיסוי, הסירו את תמיסת החסימה והניחו את השקופית על מגבת נייר (הקישו על המגבת) כדי להסיר את תמיסת החסימה העודפת.
    3. הוסף 100 μL של תמיסת הנוגדנים הראשונית לאורך השקופית. הוסיפו מכסה פלסטיק חדש והמתינו שעתיים. בעת הוספת הכיסוי, יש לוודא שלא נוצרות בועות.
    4. לאחר שעתיים, הסר את תמיסת הנוגדנים, ושטוף את המגלשות בצנצנת קופלין מלאה PBS 2x ב- RT. השתמש PBS טרי בכל פעם כדי לשטוף את המגלשות.
    5. חסום שוב את השקופיות על ידי הוספת 200 μL (שלוש עד ארבע טיפות) של 5% BSA לאורך כל שקופית, והוסף כיסוי פלסטיק. המתן 15 דקות.
    6. הסירו את הכיסוי, הורידו את עודפי ה-BSA על מגבת נייר והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים המשנית לאורך המגלשה. הוסיפו מכסה פלסטיק חדש והמתינו שעה.
    7. הסירו את הכיסוי, הורידו את עודפי ה-BSA על מגבת נייר וכבסו את המגלשות 2x ב-PBS ב-RT.
    8. חסום שוב את השקופיות על ידי הוספת 200 μL (שלוש עד ארבע טיפות) של 5% BSA לאורך כל שקופית, והוסף כיסוי פלסטיק. המתן 15 דקות.
    9. במידת הצורך, הסירו את הכיסוי, הסירו את עודפי ה-BSA על מגבת נייר והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים שלישוניים לאורך המגלשה. הוסיפו כיסויי פלסטיק חדשים והמתינו 30 דקות.
    10. שטפו את המגלשות עם PBS 3x. הסר את עודפי PBS, ולאפשר להם להתייבש לחלוטין.
    11. לאחר הייבוש, הוסיפו את אמצעי ההרכבה והניחו בזהירות כיסויי זכוכית (24 מ"מ x 60 מ"מ) מעל אמצעי ההרכבה, כך שיימנעו בועות. תייגו מחדש את השקפים, והשאירו אותם בחושך למשך הלילה.

4. רכישת תמונות

  1. דמיינו את סיבי הדנ"א המוכתמים במערכת החיסון באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי המצויד במצלמה, מטרה של פי 60 וערכות סינון מתאימות לזיהוי צבעי Alexafluor 488 ו-594.
  2. צלם תמונות לניתוח באזורים שבהם הסיבים מופרדים היטב ואינם שזורים. חשוב ללכוד תמונות באזורים שונים לאורך השקופית, מכיוון שצילום תמונות רק בחלק אחד של השקופית עלול שלא לספק נתונים מייצגים לגבי כל מתווכי השכפול הנמצאים בשקופית.
  3. במידת האפשר, השג תמונות סיבים מ- 20 אזורים שונים בשקופית. השתמש בערוץ אחד בלבד כדי לבחור את האזורים לצילום תמונות כדי למנוע הטיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר קבלת מספיק תמונות (מ 20-100 תמונות לכל תנאי), יש לזהות, למדוד ולספור את מתווכי השכפול. בין אם מנתחים את הסיבים באופן ידני או אוטומטי באמצעות תוכנית38, יש צורך להגדיר בבירור אילו מאפיינים חייבים להיות לסיב כדי שהוא ייספר או יקבל ניקוד (או לא ייספר או יימדד)39. לדוגמה, ניתן לשקול את השאלות הבאות. (1) האם יש למדוד ולספור רק סיבים עם 100% אימונופלואורסצנטיות לאורך הסיבים, או שהם יכולים להכיל אזורים מסוימים ללא אימונופלואורסצנטיות (למשל, האם יש לנתח את כל חומרי הביניים באיור 4Ai,ii,iii או רק תת-קבוצה שלהם?)? אם מנתחים סיבים עם אובדן אות, מהו אובדן האות המרבי המקובל בתוך סיב, ומהו המספר המרבי של פיקסלים רציפים בסיב שיכולים להיות נטולי אות כלשהו (למשל, האם איור 3Aiv ייחשב לאדום-ירוק או אדום בלבד ביניים?)? (2) מה צריך להיות רוחב/אורך הסיב המינימלי והמקסימלי? (3) מה צריך להיות יחס האות לרעש (S:N) כאשר מחליטים אם למדוד סיב או לא (למשל, כמה סיבים יש לבחור באיור 4B לניתוח?)? (4) כמה קרוב לקצה התמונה צריך להיות סיב לפני שהוא לא נספר או נמדד? (5) אם אות פלואורסצנטי הוא צהוב, האם סופרים אותו כאדום או ירוק (למשל, האם החלק הצהוב של ביניים השכפול באיור 4C צריך להיספר כאדום או ירוק?)? (6) כמה זמן צריך להיות קטע צבע כדי להיספר אות אמיתי (למשל, האם השכפול באיור 4D הוא מסלול ירוק בלבד, מסלול ירוק-אדום-ירוק או מסלול ירוק-אדום?)? (7) אם משתמשים בתוכנית אוטומטית לניתוח סיבים, עד כמה התוכנית בטוחה במדידה/ספירה שזה עתה ביצעה? (8) אם הסיבים מנותחים ידנית, עד כמה הניתוח צריך להיות עקבי לאורך זמן ובין אנשים?

בדרך כלל, הפרמטרים המשמשים לניתוח סיבי DNA הם:
יחס אות לרעש: 3 (עוצמת הסיבים גדולה פי שלושה מעוצמת הרקע)
עובי סיבים: רוחב ≤8 פיקסלים
גודל מינימלי: אדום או ירוק בלבד ו- 10 פיקסלים; מסלולים אדומים-ירוקים עם כל קטע ≥10 פיקסלים; מסלולים אדומים-ירוקים-אדומים או ירוקים-אדומים-ירוקים עם כל קטע ≥10 פיקסלים.
רציפות האות הפלואורסצנטי: לפחות 80% וללא רווחים באות הגדולים מ-6 פיקסלים.
ביטחון בהערכה: ערכי הביטחון צריכים להיות דומים זה לזה בתמונה ובין תמונות.

בנוסף לפרמטרים שהוזכרו לעיל, קריטריון חשוב נוסף הוא בחירת סיב שקוף שאינו חופף לסיבים אחרים במהלך ההדמיה והניתוח.

איור 5A מראה תמונות מייצגות של בקרה (איור 5Ai) ודנ"א של מקרופאגים המטופלים בננו-חלקיקים של תחמוצת גרפן (איור 5Aii,iii). התמונה מראה עלייה במסלולים לקריאה בלבד (סיומות) וירידה במקורות החדשים שנורו בתאים שטופלו בתחמוצת גרפן בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 5C). חשוב גם לקחת בחשבון את מספר התמונות ואת המיקום של השקופית מהמקום שבו התמונות מצולמות. כפי שניתן לראות באיור 5Aiii,C, נצפתה שונות בתבנית של מתווכי השכפול (עלייה במקורות חדשים בהשוואה לביקורת) באזור אחר באותו מצב. למרות שכמה תצפיות כאלה עשויות שלא להשפיע על התוצאה הכוללת, יש להקפיד לצלם את השקף על ידי הכללת כל האזורים המייצגים. יהיה זה אידיאלי לחלק את השטח הכולל של השקופית לחמישה עד שישה אזורים ולצלם תמונות מרובות מכל אזור (לדוגמה: 10 תמונות) כדי למצוא נתוני סיבים חד-משמעיים עבור כל שקופית. אידיאלי לבחור כ-500 רכיבי ביניים (איור 5B) מתוך מספר שקופיות/תנאים. עם וריאציות אלה בשכפול, ניתן להשתמש בכימות ביניים מניתוח סיבי DNA כדי לחקור את השונות בדינמיקה של שכפול DNA הנגרמת על ידי ננו-חלקיקים של תחמוצת גרפן או את הגנוטוקסיות של ננו-חומרים אחרים. לפיכך, ניתן להשיג הבנה איכותית וכמותית של הדינמיקה של שכפול DNA כלל גנומי באמצעות מתודולוגיה חדשה זו בהשוואה לניתוחים אחרים שהוזכרו במבוא.

Figure 1
איור 1: בדיקת סיבי דנ"א. ייצוג סכמטי של הבדיקה עם סקירה כללית של השלבים העיקריים בניתוח סיבי DNA. קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צביעה חיסונית של מתווכי שכפול דנ"א. ייצוג סכמטי של מתווכי שכפול שונים המזוהים על ידי תיוג פולסים רציפים עם IdU (אדום) ו- CldU (ירוק). קנה מידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: חשיפה לננו-חלקיקים. מתודולוגיות שונות לחקר וריאציות בנזק לדנ"א הנגרם על ידי ננו-חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: המאפיינים של סיבי דנ"א שיש להבקיע. דוגמאות למתווכי שכפול בתמונה. (א) פערים באימונופלואורסנציה; (i) אובדן אות אימונופלואורסצנטי 0% על פני ביניים השכפול; (ii) ~7% אובדן אות; (3) אובדן אות של 50%; ו-(iv) אובדן אות של >90%. (B) אזור עם מתווכי שכפול חופפים רבים (החץ מציין את האזור עם חפיפת סיבים ברורה). (C) סיב דנ"א עם אזור צהוב. (D) שכפול ביניים פתוח לפרשנות (החץ מציין את הרווחים בסיב). קנה מידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח ופירוש סיבי דנ"א. (A) תמונות מייצגות של סיבי דנ"א מ-(i) תאי מקרופאגים בקרה, ו-(ii,iii) תאי מקרופאגים שטופלו בננו-חלקיקים במשך 20 דקות בריכוז של 25 מיקרוגרם/מ"ל. תמונות ii ו- iii נלקחו מאזורים שונים של השקופית. (B) ניתוח תוכנה אוטומטי מייצג של תנאי הבקרה והטיפול בננו-חלקיקים. לצורך ניתוח זה, השתמשנו בתוכנית האוטומטית למעקב ומדידה של סיבי דנ"א שפותחה על-ידי Wang et al.38. המספרים באיור מראים את מספר עקבות הדנ"א שנותחו. (C) ייצוג גרפי של ניתוח התוכנה של תנאי הבקרה והטיפול בננו-חלקיקים. NP מייצג ננו-חלקיקים. האחוז היחסי של אוכלוסיית הביניים (לדוגמה, עבור אדום בלבד) מחושב מתוך סך כל הביניים שנותחו. בהשוואה בין תמונה 1 שטופלה ב-NP לתמונה 2, ישנם הבדלים גדולים בין שתי התמונות. לכן, חשוב להשיג תמונות רבות לאורך השקופית כדי להבין כיצד תנאי ניסוי משפיע על תהליך השכפול. קיצורים: R = אדום; G = ירוק. קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הרכב מדיה
10% סרום בקר עוברי
1% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יחידות/מ"ל)
1% ליטר גלוטמין (200 מילימול)
גלוקוז בינוני-גבוה של Dulbecco

טבלה 1: הרכב המדיה המשמש לתרבית תאי מקרופאגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו דנים כאן בשיטה שתסייע בניתוח השונות בדינמיקת שכפול הדנ"א בנוכחות ננו-חלקיקים באמצעות בדיקת סיבי הדנ"א. השלבים הקריטיים העיקריים המעורבים בבדיקה הסטנדרטית מתוארים בפרוטוקול (שלב 2.2.2 ושלב 3.1.3). מומלץ תמיד להשתמש באזור עם חשיפה מוגבלת לאור עילי וזרימת אוויר קבועה כדי למנוע הפסקות DNA המושרות על ידי אור בשקופיות, כמו גם כדי לשפר את יכולת השחזור. תשומת לב קפדנית נדרשת על משך הזמן לייבוש התא lysate על שקופיות. ייבוש יתר ישפיע לרעה על התפשטות הסיבים. השלב הקריטי השני הוא דנטורציה של סיבים באמצעות תמיסת חומצה. משך שטיפת החומצה צריך להישמר שווה לכל השקופיות באותו ניסוי. פתרון בעיות עבור שני שלבים אלה כדי למצוא תנאים אופטימליים (זמן ליזיס, נפח הליזט במגלשה, זמן הייבוש וזמן שטיפת החומצה) מומלץ עבור סוגי תאים שונים וסביבות מעבדה שונות.

כפי שנדון באיור 3, ניתן לשנות את משך החשיפה של ננו-חלקיקים לצורך קביעה כמותית של שינוי בדינמיקת שכפול הדנ"א המושרה על-ידי הננו-חלקיקים. כדי לקבוע את ההשפעה הראשונית של דינמיקת השכפול, חשיפה לטווח קצר כגון דקה, 20 דקות או 30 דקות עם מינונים שונים תהיה מתאימה. ההבדל בדפוסי השכפול (כפי שמוצג באיור 2) לאחר חשיפה ארוכת טווח של התאים לננו-חומרים יכול להיקבע על-ידי השוואת דפוסי החשיפה ל-IdU ול-CIdU (20 דקות כל אחד) לפני ואחרי הטיפול בננו-חלקיקים. ניתן להשתמש בגישה זו כדי לקבוע את השתהות המזלג, האטת המזלג וההבדל בירי המקור בזמני חשיפה שונים, אשר יכולים להתפרש כהשפעות של חשיפה חריפה וכרונית לננו-חומרים39,40.

ישנן מספר טכניקות מבטיחות זמינות כדי לזהות את השונות בשכפול DNA, כגון סריקת DNA ושיטת RDS; עם זאת, בהשוואה לשיטות אלה, בדיקת סיבי הדנ"א נוחה וחסכונית ללא צורך במכשירים יקרים לניתוח41. המגבלות של שיטה זו הן משך הניסוי, הזמן הדרוש כדי לצלם מספיק תמונות לכימות, כמו גם ניתוח התוכנה. עם זאת, אין ספק שגישה זו תתמוך במחקר הננוטוקסיקולוגיה בקביעת חוסר היציבות הגנומית הנגרמת על ידי חלקיקים בשורות תאים, כמו גם בדגימות רקמה שונות ובין מינים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים על תמיכה כספית מקרן בלייזר, התוכנית לביוטכנולוגיה רפואית במדעים ביו-רפואיים, UIC רוקפורד והמחלקה לחינוך למדעי הבריאות, UIC Rockford. המחברים מודים לאנאניה סנגיניני וג'יימס בראדלי על תרומתם לפרויקט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
  2. Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
  3. Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
  4. Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
  5. Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
  6. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
  7. Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
  8. Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
  9. Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
  10. Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
  11. Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
  12. Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
  13. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  14. Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
  15. Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
  16. Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
  17. Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
  18. Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
  19. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
  20. Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
  21. Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
  22. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  23. Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
  24. Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
  25. Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
  27. Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
  28. Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
  29. Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
  30. Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
  31. Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
  32. Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
  33. Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
  34. Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
  35. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  36. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  37. Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
  38. Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
  39. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  40. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  41. Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).

Tags

ביולוגיה גיליון 193
הדגמה של בדיקת סיבי DNA לחקר נזק לדנ"א ודינמיקת תיקון הנגרמת על ידי ננו-חלקיקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar,… More

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter