Summary
이 방법론은 나노 입자가 있는 상태에서 DNA 복제 역학의 변화를 분석하는 데 도움이 됩니다. 관심 물질의 세포독성 수준에 따라 다양한 방법론을 채택할 수 있습니다. 또한, DNA 섬유 분석에 도움을 주기 위해 이미지 분석에 대한 설명이 제공된다.
Abstract
나노 물질 노출은 세포에서 복제 스트레스와 게놈 불안정성을 유발할 수 있습니다. 불안정성의 정도는 나노 물질의 화학, 크기 및 농도, 노출 시간 및 노출 된 세포 유형에 따라 다릅니다. 내인성/외인성 물질이 글로벌 복제에 미치는 영향을 설명하기 위해 몇 가지 확립된 방법이 사용되었습니다. 그러나 DNA 섬유 분석과 같은 레플리콘 수준 분석은 이러한 에이전트가 복제 시작, 종료 및 복제 포크 진행에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다. 이것을 알면 나노 물질이 돌연변이 고정 및 게놈 불안정성의 가능성을 증가시키는 방법을 더 잘 이해할 수 있습니다. RAW 264.7 대식세포를 모델 세포로 사용하여 그래핀 옥사이드 나노입자 노출 하에서 복제 역학을 연구했습니다. 여기에서는 뉴클레오티드 유사체를 사용한 펄스 라벨링, 세포 용해, 펄스 라벨링된 DNA 섬유를 슬라이드에 확산, DNA 섬유 내 뉴클레오티드 유사체의 형광 면역염색, 컨포칼 현미경을 사용한 DNA 섬유 내 복제 중간체 이미징, 컴퓨터 지원 스코어링 및 분석(CASA) 소프트웨어를 사용한 복제 중간 분석을 포함하는 DNA 섬유 분석의 기본 프로토콜을 시연합니다.
Introduction
각 세포 주기 동안 DNA 복제는 정확한 게놈 복제를 보장합니다1. 진핵 염색체 복제는 본질적으로 세 가지 요인, 즉 다중 복제 기원의 발사 시기, 발사된 기원에서 나오는 포크의 속도, 인접한 기원의 두 복제 분기점이2를 충족할 때 복제 프로세스의 종료에 따라 달라집니다. 딸 세포에 대한 유전 정보의 충실도 높은 전송과 유전적 무결성의 보존을 위해서는 정확한 DNA 복제가 중요합니다. 규칙적인 신진 대사에서 발생하거나 인공 또는 자연 환경 물질로 인한 약제는 지속적으로 게놈을 공격합니다. 이러한 내인성 및 외인성 인자는 이러한 인자에 의한 DNA 손상으로 인해 복제 포크가 느려지거나 멈추게 하며, 이러한 어려움에 대응하여 일시적으로 속도를 늦추거나 멈추는 포크를복제 스트레스3라고 한다. 복제 스트레스에 대한 반응으로, 세포는 교란된 복제 포크의 안정성을 유지하고 다시 시작할 수 있도록 하는 몇 가지 분자 경로를 개발했다4. 유전적 안정성, 세포 생존 및 인간 질병 측면에서 이러한 복제 스트레스 반응 메커니즘은 건강한 게놈을 유지하고 세포 생존을 보장하며 질병 형성 가능성을 감소시키는 핵심 요소로 부상했습니다5.
복제 스트레스를 생성할 수 있는 외인성 제제 중 하나는 나노입자입니다. 나노 입자는 크기가 1 nm 내지 100 nm6 범위인 입자이다. 높은 표면적, 독특한 모양 및 독특한 화학적 특성으로 인해 나노 입자는 다양한 의료, 제약, 환경 및 산업 응용 분야에서 활용됩니다 7,8. 나노 입자는 많은 잠재적 이점을 가지고 있지만, 그 중 일부는 (유전 적 성질이나 수명으로 인해) 독성을 가질 수 있습니다. 나노 입자는 또한 의료용 임플란트의 자연적인 마모로 인해 형성 될 수 있으며 보철 주위 영역(9,10)으로 방출 될 수 있습니다.
다양한 응용 분야를 위해 생산된 무수한 나노입자에 인간이 노출됨에 따라 지난 10년 동안 나노입자 독성 분야의 연구가 엄청나게 증가했다11. 이러한 연구 노력으로 나노 입자가 인체 건강에 미치는 잠재적 위협에 대한 정보가 풍부하게 밝혀졌지만 나노 입자가 유전 독성을 유발할 가능성에 대한 지식은 여전히 제한적입니다. 지금까지 밝혀진 것은 이러한 나노 입자가 DNA와 물리적으로 상호 작용하고 DNA 손상을 촉진하며 DNA 복구 또는 복제를 담당하는 단백질을 손상 시키거나 방해 할 수 있다는 것입니다12. 이들이 DNA 복제를 어떻게 방해하는지 검출하기 위해, DNA 섬유 빗질, 방사선 내성 DNA 합성 (RDS) 및 DNA 섬유 분석이 전형적으로 사용된다13,14,15,16.
DNA 섬유 빗질 방법은 유연하며 단일 분자 수준17에서 복제 포크 역학에 대한 정보를 제공합니다. 본질적으로, 염분화된 커버슬립은 DNA 말단이 결합하면 DNA 용액에서 부드럽게 빼냅니다. DNA 분자는 용액의 반월판에 의해 곧게 펴지고 정렬됩니다. DNA 섬유의 균질성, 간격 및 정렬은 정확하고 신뢰할 수 있는 섬유관 길이 측정을 지원합니다. 스트레스나 손상을 유발하는 데 사용되는 치료 및 약물의 길이와 순서를 조정함으로써 이 응용 프로그램을 사용하여 포크 발전의 여러 측면을 모니터링할 수 있습니다. 이 방법에서, 이중 라벨링 시스템이 사용되며, 이를 통해 복제 포크의 속도 및 진행이 평가된다(17,18). 반면에, 2D 겔 전기영동은 아가로스 겔 전기영동에서 분지 DNA 구조가 동일한 질량의 선형 DNA 분자보다 더 느리게 이동하여 2D 실행에서 둘을 깨끗하게 분리할 수 있다는 사실을 이용합니다. 사실, 이 방법은 첫 번째 실행에서 질량을 기반으로 DNA 분자를 분리하고 두 번째 직교 실행에서 모양을 기반으로 DNA 분자를 분리하는 것으로 조사됩니다. 게놈 DNA 단편화 후, 흔하지 않은 복제 및 재조합 중간체는 분지 형태를 발달시키고, 이들은 2D 겔19에서 보다 일반적인 선형 분자와 구별될 수 있다.
RDS 방법은 글로벌 DNA 합성이 어떻게 영향을 받는지 결정하는 데 사용됩니다. 이 방법에서, 글로벌 복제의 억제 정도는 처리되지 않은 세포와 처리된 세포에서 [14C] 티미딘과 같은 방사성 표지된 뉴클레오티드의 혼입된 양을 비교하여 결정됩니다14,20. 처리되지 않은 세포와 처리 된 세포 사이의 방사성 표지의 백분율 차이는 DNA 손상 물질이 DNA 합성에 영향을 미치는 정도를 나타냅니다. 이와 유사하게, 또 다른 방법은 DNA 합성의 전체 속도를 측정하기 위해 유세포 분석을 위해 BrdU(5-브로모-2′-데옥시우리딘)와 같은 뉴클레오티드 유사체를 통합하는 세포의 능력을 사용합니다21,22. 이러한 방법은 DNA 손상 물질이 글로벌 DNA 합성에 어떤 영향을 미치는지 보여주지만 개별 레플리콘이 어떻게 영향을 받는지는 보여주지 않습니다. 실제로, 레플리콘 수준의 분석은 독성 입자(나노 물질) 노출 시 게놈 불안정성의 시작과 정도를 더 잘 이해하는 데 필수적입니다. DNA 섬유 자가방사선 촬영 및 전자 현미경은 이23,24,25,26을 결정하는 데 사용되는 몇 가지 방법입니다.
불균일한 간격의 소스에서 복제 기포 및 양방향 복제의 개념은 전자 현미경 및 DNA 섬유 자가방사선 촬영과 같은 단일 분자 테스트를 사용하여 처음 개발되었습니다27,28. 탄소 코팅 그리드에 분산된 특정 분자에서 분지 복제 중간체의 직접적인 관찰은 전자 현미경에 의해 크게 촉진됩니다. 복제 포크에서 병리학적 변화를 추적하기 위해 오늘날에도 여전히 사용되고 있는 이 방법은 DNA 복제의 첫 번째 진핵생물 기원을 찾는 데 사용되었습니다28. 섬유 자가방사선 촬영은 새로 복제된 영역의 자가방사선 식별과 삼중수소화 티미딘이 있는 염색체의 펄스 태깅 개념을 중심으로 합니다. 후생동물 게놈 서열에서 기원 밀도 및 복제 포크 속도에 대한 최초의 정량적 평가는 DNA 섬유 자가방사선 촬영에 의해 가능했습니다29.
현재 섬유 형광 검사 방법이 자가방사선 촬영을 대신하고 있는데, 이는 주로 섬유 형광 검사가 자가방사선 촬영보다 훨씬 빠르기 때문입니다. 섬유 형광 검사에서, 브로모- (Br), 클로로 (Cl) 또는 요오도데옥시우리딘 (IdU)과 같은 두 개의 할로겐화 뉴클레오티드 유도체를 순차적으로 새로 복제된 DNA에 혼입시킨 다음, 항체를 이용한 간접 면역형광법에 의해 확인된다30. 하나 또는 두 개의 유사체를 통합한 초기 DNA의 현미경 관찰은 유사체 중 하나를 한 색상으로, 다른 유사체를 다른 색상으로 면역염색함으로써 가능합니다(예: IdU 적색 및 통합 CldU 녹색으로 초기 DNA 면역염색)(그림 1)21. 많은 상이한 유형의 복제 중간체가 DNA 섬유 분석에 의해 확인될 수 있다. 가장 일반적으로 연구되는 것은 개별 연신율 포크, 개시 및 종단입니다. 개별 길쭉한 포크는 빨간색과 녹색(빨간색-녹색; 그림 2A). 13 이러한 중간체의 길이는 포크 속도(즉, 포크 길이/펄스 시간) 또는 트랙 단축을 통한 초기 DNA의 외핵분해 분해를 측정하는 데 자주 사용됩니다(그림 2E)30,31,32. Mimitou et al.의 연구에서, DNA에서 이중 가닥 절단을 일으키는 복제 독인 하이드록시우레아에 장기간 노출되면 RE11이 모집되는 것으로 밝혀졌습니다33. MRE11은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성으로 알려진 엑소뉴클레아제이며 복구를 위해 DNA의 말단을 절단할 수 있습니다. 그러므로, 독성 물질에 노출될 때, DNA 손상 물질(34)에 대한 노출로 인해 DNA 가닥이 짧아지는 초기 DNA의 외핵분해 분해를 관찰할 수 있다.
물리적 장애(DNA-단백질 복합체 또는 DNA 병변), 화학적 장애 또는 돌연변이로 인한 복제 포크 파손은 복제를 중지하고 복제를 다시 시작하기 위해 상동 재조합이 필요할 수 있습니다. 이를 포크 진행 장애라고 합니다. 수많은 시험관내 및 생체 내 조사는 전사가 때때로 이러한 방식으로 복제 포크 진행을 방지할 수 있음을 나타냅니다35.
시작은 첫 번째 또는 두 번째 펄스 중에 시작되고 실행되는 복제 원본입니다. 첫 번째 펄스 동안 발사되고 계속 활성화되는 복제 포크가 있는 오리진은 녹색-빨간색-녹색 패턴을 갖습니다(그림 2B, 아래). 두 번째 펄스 동안 시작되는 원점은 녹색 전용 패턴(그림 2B, 위)을 가지며 새로 시작된 원점이라고도 하므로 이러한 원점을 첫 번째 펄스 동안 시작되는 원점과 구별할 수 있습니다. 두 실험 조건 사이에서 새로 발사된 기원의 상대적 비율을 비교하면 세포가 DNA 손상 인자 또는 단백질의 존재 또는 부재에 어떻게 반응하는지 이해할 수 있습니다. 종료는 인접한 replicon의 두 복제 분기가 병합될 때 생성되며 빨간색-녹색-빨간색 패턴이 있습니다(그림 2D)30.
위에서 설명한 사실을 바탕으로 DNA 섬유 분석은 현재 나노 물질과 같은 독성 물질로 인한 DNA 복제 역학의 변화를 연구하는 데 선호되는 방법으로 간주됩니다. 연구자들은 이제 이 기술의 발견으로 인해 진핵생물에서 양적으로나 질적으로 게놈 전체의 DNA 복제 역학에 대해 잘 이해하고 지식을 갖게 되었습니다36. 결과 변수에 따라 몇 가지 방법론을 채택할 수 있습니다. 외부 작용제/나노입자에 의해 유도된 DNA 손상의 변화를 연구하는 방법의 몇 가지 예가 그림 3에 나와 있습니다. 이 연구에서 설명한 DNA 섬유 분석 방법의 전반적인 목표는 나노 입자가 시험관 내 복제 과정에 어떻게 영향을 미치고 다양한 조직에 차별적으로 영향을 미치는지를 결정하는 것입니다.
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Protocol
1. 항체 및 완충액의 제조
- 1 차 항체 용액 인 마우스 항 -BrdU를 5 % BSA에 1 : 300 희석으로, 5 % BSA에 1 : 500 희석으로 쥐 항 -BrdU를 준비합니다.
- 2차 항체 용액인 alexafluor 594 rabbit anti-mouse를 5% BSA에 1:300 희석으로, alexafluor 488 chicken anti-rat를 5% BSA에 1:500 희석하여 준비합니다.
- 3차 항체 용액인 alexafluor 594 염소 항토끼를 5% BSA에 1:1,000 희석으로, alexafluor 488 염소 항닭을 5% BSA에 1:1,000 희석하여 준비합니다.
- 1M Tris(pH 7.4) 2mL, 0.5M EDTA 1mL 및 10% SDS 0.5mL와 함께ddH2O에서 용해 완충액 10mL를 준비합니다.
2. 섬유 분석을 위한 준비
- 1일차: 섬유 분석을 위한 세포 배양 및 나노물질 처리
- RAW 264.5 대식세포 또는 관심있는 세포를 플레이트하여, 세포가 실험 당일에 그들의 성장의 로그 단계에 있도록 한다. RAW 세포의 경우 각 조건에 대해 5 x 104 세포/웰을 24웰 플레이트에 추가합니다. 세포를 5%CO2 및 98% 습도의 37°C 인큐베이터에 유지한다. 표 1은 사용된 매체의 구성 성분을 설명합니다. 세포가 75%-80% 밀도로 성장하도록 합니다17,37.
- 세포가 75%-80% 밀도의 수준에 도달한 후, 플레이트로부터 배지를 제거하고, 배지의 절반을 취하여 CldU 펄스(CldU reserve)를 위해 예비하고, 50 μM의 최종 농도에서 5 μL IdU를 다른 절반에 첨가한다. IdU가 있는 세포를 20분 동안 인큐베이터에 넣습니다.
- CldU 예비 배지를 37°C에 두어 예열 상태를 유지합니다. CldU 펄스 직전에 이 매체에 CldU를 추가합니다.
- 20분 후, IdU-배지 혼합물을 흡인하고, 플레이트를 부드럽게 회전시켜 500 μL의 포스페이트-완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 세포를 부드럽게 세척하였다. PBS를 폐기합니다.
- 배지 500μL에 다양한 농도의 나노입자로 세포를 처리하고 30분 더 배양합니다. 이 연구에서는 25μg/mL 농도로 처리된 산화 그래핀 나노입자를 사용합니다.
- 처리-배지 혼합물을 흡인하고, 플레이트를 부드럽게 회전시켜 500 μL의 PBS로 세포를 부드럽게 세척한다. PBS를 폐기합니다. 5 μL의 CldU(최종 100 μM)를 추가합니다.
- 농도)를 CldU 예비 배지로 하고, CldU 예비 배지로 세포를 덮었다. 20분 동안 CldU 펄스 동안 세포를 인큐베이터에 넣습니다.
- PBS로 세포를 세척하고 3-4분 동안 긁어내거나 트립신화한 다음 배지 5mL를 플레이트에 넣고 세포를 수집합니다.
- 264 x g 에서 4분 동안 회전합니다. 배지를 제거하고, 세포를 1 mL의 얼음-차가운 PBS에 재현탁시켰다. 트립판 블루 분석(혈구계 계수)을 사용하여 세포 수를 결정한 다음 세포를 ~200-400 cells/μL로 희석합니다. 세포 계수 동안 세포 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오.
알림: 가능하면 세포가 얼음 위에 있는 시간을 제한하십시오. 이것은 슬라이드 상단을 따라 세포 용액의 비드를 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 얼음 위에 보관할 경우 30분 미만으로 두십시오.
- 1일차: DNA 섬유의 제조
- 연필을 사용하여 슬라이드(유리 슬라이드, 75mm x 25mm)에 실험 조건과 날짜를 표시합니다.
- 피펫에 세포 2μL를 넣고 피펫을 ~45° 각도로 잡고 피펫을 슬라이드 라벨 아래 약 1cm에 놓고 피펫을 슬라이드 라벨에 수평으로 이동합니다. 피펫이 슬라이드를 가로질러 이동함에 따라 한 번에 조금씩 세포 용액을 방출합니다. 각 슬라이드에 여러 줄의 셀을 만듭니다(중요 단계).
참고: 슬라이드 전체에 세포 현탁액의 수평선이 있어야 합니다. 세포 현탁액이 위로 구슬 모양으로 올라오면 세포 현탁액이 있는 용기에 5-10μL의 세포 배지를 추가하면 용액을 다시 적용할 때 슬라이드에 부착하는 데 도움이 될 수 있습니다. - 용액이 끈적거리고 끈적거리게 보일 때까지 세포가 있는 용액을 증발시키십시오. 이 시점에서 일부 액체는 세포와 관련이 있지만 많지는 않습니다. 이 단계는 8-20 분이 소요되며 공기 중의 습도에 따라 다릅니다.
알림: 모든 용액이 증발하지 않았는지 확인하십시오., DNA의 전부는 아닐지라도 대부분이 서로 달라붙어 분리될 수 없기 때문에 직선적이고 정렬된 DNA 섬유를 얻기가 매우 어렵기 때문입니다. - 용액이 점착성이 생기면 피펫 팁이 슬라이드에 닿지 않도록 주의하면서 각 세포 라인당 15μL의 확산(용해) 완충액으로 세포를 덮습니다. 10분 동안 기다립니다. 슬라이드를 25° 각도로 기울이고 슬라이드의 라벨을 튜브 랙의 가장자리에 수평으로 놓습니다(라벨의 하단 부분이 튜브 랙의 가장자리와 일직선이 되어야 함).
- DNA 스프레드가 마지막 슬라이드가 만들어진 시간으로부터 최소 4시간 동안 공기 중에서 건조되도록 합니다.
알림: 4시간에서 12시간 사이가 건조에 좋습니다. 그러나 밤새 말리지 마십시오. 하룻밤 동안 건조시키면 이완된 DNA는 많지만 곧고 정렬된 DNA 섬유는 거의 없습니다.
- 1일차: DNA 섬유 고정 및 동결
- 슬라이드가 건조되면 슬라이드를 2분 동안 담가 메탄올:아세트산(3:1)으로 슬라이드를 고정합니다. 후드 아래에서 이 단계를 수행하고 빛 노출이 제한된 장소에서 슬라이드를 밤새 건조시키거나 슬라이드를 은박지 텐트로 덮습니다.
- 2일차
- 슬라이드를 유리 슬라이드 캐리어에 넣습니다. 슬라이드를 -20°C에서 최소 24시간 동안 놓습니다. 이 단계는 이미지의 해상도 또는 선명도를 향상시킵니다.
3. DNA 섬유 분석 수행
- DNA의 변성
- 뚜껑이 있는 작은 피펫 팁 상자를 사용하여 가습 챔버를 준비합니다. 용기에 물을 반쯤 채우고 37°C 수조에 최소 1시간 동안 두십시오.
- -20°C에서 슬라이드를 꺼내 몇 초 동안 해동합니다. 코팅된 표면이 용기의 벽에 닿지 않도록 탈이온수(DI)가 들어 있는 Coplin 용기에 슬라이드를 조심스럽게 놓습니다. 슬라이드를 20 초 동안 배양 한 다음 조심스럽게 물을 부어 넣으십시오.
- 모든 슬라이드를 덮을 수 있도록 Coplin 용기에 2.5M HCL을 추가합니다. 80분 동안 기다립니다. 이것은 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 시간이 바뀌면 이미지의 결과가 바뀔 수 있습니다.
- 슬라이드를 PBS와 트윈(PBS + 0.1% 트윈[최종 농도])으로 1배 세척한 다음 실온(RT)에서 각각 3분 동안 PBS로 2배 세척합니다.
- 면역염색
- 다음 단계를 위해 슬라이드를 가습실에 보관하십시오. 슬라이드를 RT에서 30분 동안 PBS에서 5% BSA로 차단하고 커버슬립, 웨스턴 블롯 백으로 만든 커버슬립 또는 투명 플라스틱 시트로 덮습니다.
- 차단 후 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 차단 용액을 제거한 다음 종이 타월로 슬라이드를 닦아내고(슬라이드를 타월로 탭) 과도한 차단 용액을 제거합니다.
- 1차 항체 용액 100μL를 슬라이드 길이를 따라 추가합니다. 새 플라스틱 커버슬립을 추가하고 2시간 동안 기다립니다. 커버슬립을 추가할 때 기포가 생기지 않도록 하십시오.
- 2시간 후, 항체 용액을 떼어내고, 슬라이드를 PBS로 채워진 코플린 병에 2x RT로 헹굽니다.
- 각 슬라이드를 따라 5% BSA 200μL(3-4방울)를 추가하여 슬라이드를 다시 차단하고 플라스틱 커버슬립을 추가합니다. 15분 동안 기다립니다.
- 커버슬립을 벗기고 종이 타월로 여분의 BSA를 털어낸 다음 슬라이드 길이를 따라 100μL의 2차 항체 용액을 추가합니다. 새 플라스틱 커버슬립을 추가하고 1시간 동안 기다립니다.
- 커버슬립을 벗기고 종이 타월로 여분의 BSA를 털어낸 다음 RT에서 PBS로 슬라이드를 2번 씻습니다.
- 각 슬라이드를 따라 5% BSA 200μL(3-4방울)를 추가하여 슬라이드를 다시 차단하고 플라스틱 커버슬립을 추가합니다. 15분 동안 기다립니다.
- 필요한 경우 커버슬립을 제거하고 종이 타월로 여분의 BSA를 제거한 다음 슬라이드 길이를 따라 100μL의 3차 항체 용액을 추가합니다. 새 플라스틱 커버슬립을 추가하고 30분 동안 기다립니다.
- 슬라이드를 PBS 3x로 세척합니다. 여분의 PBS를 제거하고 완전히 건조시키십시오.
- 건조되면 장착 매체를 추가하고 기포가 발생하지 않도록 장착 매체 위에 유리 커버슬립(24mm x 60mm)을 조심스럽게 놓습니다. 슬라이드에 레이블을 다시 붙이고 밤새 어둠 속에 두십시오.
4. 이미지 획득
- 카메라, 60x 대물렌즈 및 적절한 필터 세트가 장착된 면역형광 현미경을 사용하여 면역염색된 DNA 섬유를 시각화하여 alexafluor 488 및 594 염료를 검출합니다.
- 섬유가 잘 분리되고 얽히지 않은 영역에서 분석을 위해 이미지를 촬영합니다. 슬라이드의 한 부분에서만 이미지를 촬영하면 슬라이드에서 발견되는 모든 복제 중간체에 대한 대표 데이터를 제공하지 못할 수 있으므로 슬라이드를 따라 다른 영역에서 이미지를 캡처하는 것이 중요합니다.
- 가능하면 슬라이드의 20개 영역에서 섬유 이미지를 가져옵니다. 편향을 피하기 위해 하나의 채널만 사용하여 이미지를 촬영할 영역을 선택합니다.
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Representative Results
충분한 이미지(조건당 20-100개의 이미지)를 얻은 후 복제 중간체를 식별, 측정 및 계수해야 합니다. 섬유를 수동 또는 프로그램(38)을 통해 자동으로 분석하든, 섬유가 계수 또는 점수(또는 계수 또는 측정되지 않음)하기 위해 어떤 특성을 가져야 하는지 명확하게 정의할 필요가 있다(39). 예를 들어, 다음과 같은 질문들을 고려해 볼 수 있습니다. (1) 섬유 전체에서 100% 면역형광을 가진 섬유만 측정하고 계산해야 합니까, 아니면 면역형광이 없는 일부 영역을 포함할 수 있습니까(예: 그림 4Ai,ii,iii의 모든 중간체를 분석해야 합니까, 아니면 그 하위 집합만 분석해야 합니까?)? 신호 손실이 있는 광섬유를 분석하는 경우 광섬유 내에서 허용되는 최대 신호 손실은 얼마이며, 신호가 없을 수 있는 광섬유의 최대 연속 픽셀 수는 얼마입니까(예: 그림 3Aiv는 적색-녹색 또는 적색 전용 중간체로 간주됩니까?)? (2) 최소 및 최대 섬유 너비/길이는 얼마여야 합니까? (3) 광섬유를 측정해야 하는지 여부를 결정할 때 신호 대 잡음비(S:N)는 얼마여야 합니까(예: 분석을 위해 그림 4B에서 몇 개의 광섬유를 선택해야 합니까?)? (4) 광섬유가 계산되거나 측정되지 않기 전에 이미지 가장자리에 얼마나 가까이 있어야 합니까? (5) 형광 신호가 노란색이면 빨간색 또는 녹색으로 계산합니까(예: 그림 4C의 복제 중간체의 노란색 부분을 빨간색 또는 녹색으로 계산해야 합니까?)? (6) 색상 세그먼트가 실제 신호로 계산되려면 얼마나 오래 걸립니까(예: 그림 4D의 복제 중간체는 녹색 전용 트랙, 녹색-빨강-녹색 트랙 또는 녹색-빨간색 트랙입니까?)? (7) 자동화된 섬유 분석 프로그램을 사용하는 경우 프로그램이 방금 수행한 측정/카운트에 대해 얼마나 확신합니까? (8) 섬유를 수동으로 분석하는 경우 시간이 지남에 따라 그리고 개인 간에 분석이 얼마나 일관성이 있어야 합니까?
일반적으로 DNA 섬유 분석에 사용되는 매개변수는 다음과 같습니다.
신호 대 잡음비: 3(광섬유 강도는 배경 강도보다 3배 더 큽니다)
섬유 두께:폭 ≤8 픽셀
최소 크기 : 빨간색 또는 녹색 만 및 10 픽셀; 각 세그먼트가 있는 빨강-녹색 트랙≥10픽셀; 빨강-녹색-빨강 또는 녹색-빨강-녹색 트랙은 각 세그먼트가 ≥10픽셀입니다.
형광 신호의 연속성: 최소 80% 및 6픽셀보다 큰 신호에 간격 없음.
평가의 신뢰도: 신뢰도 값은 이미지에서 그리고 이미지 간에 서로 유사해야 합니다.
위에서 언급한 매개변수 외에도 또 다른 중요한 기준은 이미징 및 분석 중에 다른 섬유와 겹치지 않는 투명 섬유를 선택하는 것입니다.
도 5A는 대조군(도 5Ai) 및 산화 그래핀 나노입자-처리된 대식세포 DNA(도 5Aii,iii)의 대표 이미지를 보여준다. 이미지는 대조군에 비해 그래핀 산화물 처리된 세포에서 읽기 전용 트랙(종결)의 증가와 새로 소성된 기원의 감소를 보여줍니다(그림 5C). 이미지 수와 이미지를 촬영한 슬라이드의 위치를 고려하는 것도 중요합니다. 그림 5Aiii,C에서 볼 수 있듯이 복제 중간체 패턴의 변화(대조군에 비해 새로운 기원의 증가)가 동일한 조건의 다른 영역에서 관찰되었습니다. 이러한 관찰 중 일부는 전체 결과에 영향을 미치지 않을 수 있지만 모든 대표 영역을 포함하여 슬라이드를 이미지화하는 데 주의를 기울여야 합니다. 슬라이드의 전체 영역을 5-6개 영역으로 나누고 각 영역에서 여러 이미지(예: 10개 이미지)를 가져와 각 슬라이드에 대한 결정적인 광섬유 데이터를 찾는 것이 이상적입니다. 여러 슬라이드/조건에서 약 500개의 중간체(그림 5B)를 선택하는 것이 이상적입니다. 이러한 복제 변이를 통해 DNA 섬유 분석의 중간 정량화를 사용하여 산화 그래핀 나노입자 또는 다른 나노물질의 유전독성으로 인한 DNA 복제 역학의 변이를 조사할 수 있습니다. 따라서 서론에서 언급한 다른 분석과 비교하여 이 새로운 방법론을 통해 게놈 전체 DNA 복제의 역학에 대한 정성적 및 정량적 이해를 모두 얻을 수 있습니다.
그림 1: DNA 섬유 분석. DNA 섬유 분석의 주요 단계에 대한 개요와 함께 분석의 개략도를 나타냅니다. 스케일: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DNA 복제 중간체의 면역염색. IdU(빨간색) 및 CldU(녹색)를 사용한 순차적 펄스 라벨링으로 식별된 다양한 복제 중간체의 개략도. 스케일: 5μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 나노 입자 노출. 나노 입자로 인한 DNA 손상의 변화를 연구하는 다양한 방법론. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 점수를 매길 DNA 섬유의 특성. 이미지에 있는 복제 중간의 예입니다. (A) 면역형광의 갭; (i) 복제 중간체에 걸쳐 0% 면역형광 신호 손실; (ii) ~7% 신호 손실; (iii) 50% 신호 손실; 및 (iv) >90% 신호 손실. (B) 겹치는 복제 중간체가 많은 영역(화살표는 투명 섬유 겹침이 있는 영역을 나타냄). (C) 노란색 영역을 가진 DNA 섬유. (D) 해석에 개방된 복제 중간체(화살표는 광섬유의 간격을 나타냄). 스케일: 5μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: DNA 섬유 분석 및 해석. (a) (i) 대조군 대식세포 및 (ii,iii) 25μg/mL 농도에서 20분 동안 나노입자로 처리된 대식세포의 대표적인 DNA 섬유 이미지. 이미지 ii와 iii은 슬라이드의 다른 영역에서 가져온 것입니다. (B) 대조군 및 나노입자 처리 조건의 대표적인 자동화 소프트웨어 분석. 이 분석을 위해 Wang et al.38에 의해 개발된 자동화된 DNA 섬유 추적 및 측정 프로그램을 사용했습니다. 그림의 숫자는 분석된 DNA 트랙의 수를 보여줍니다. (C) 대조군 및 나노입자 처리 조건의 소프트웨어 분석의 그래픽 표현. NP는 나노입자를 나타낸다. 중간 모집단의 상대적 백분율(예: 빨간색만)은 분석된 총 중간체에서 계산됩니다. NP 처리된 영상 1과 영상 2를 비교해 보면, 두 영상 사이에는 큰 차이가 있다. 따라서 실험 조건이 복제 프로세스에 어떤 영향을 미치는지 이해하기 위해 슬라이드 전체에서 많은 이미지를 얻는 것이 중요합니다. 약어: R = 빨간색; G = 녹색. 스케일: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 미디어 구성 |
| 10% 소 태아 혈청 |
| 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(10000단위/ml) |
| 1% L 글루타민(200mM) |
| Dulbecco's Modified Eagle's 미디엄 하이 글루코오스 |
표 1: 대식세포 배양에 사용된 배지 조성.
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Discussion
여기서는 DNA 섬유 분석을 통해 나노입자가 존재할 때 DNA 복제 역학의 변화를 분석하는 데 도움이 되는 방법에 대해 논의합니다. 표준 분석과 관련된 주요 중요 단계는 프로토콜(단계 2.2.2 및 단계 3.1.3)에 설명되어 있습니다. 슬라이드에서 빛으로 인한 DNA 파손을 방지하고 재현성을 높이기 위해 항상 머리 위의 빛 노출이 제한되고 공기 흐름이 일정한 영역을 사용하는 것이 좋습니다. 슬라이드 상의 세포 용해물의 건조 기간에 세심한 주의가 요구된다. 과다 건조는 섬유 확산에 부정적인 영향을 미칩니다. 두 번째 중요한 단계는 산 용액을 사용한 섬유 변성입니다. 산성 세척 기간은 동일한 실험의 모든 슬라이드에 대해 동일하게 유지되어야 합니다. 최적의 조건(용해 시간, 슬라이드의 용해물 부피, 건조 시간 및 산 세척 시간)을 찾기 위한 이 두 단계에 대한 문제 해결은 다양한 세포 유형 및 실험실 환경에서 권장됩니다.
도 3에서 논의된 바와 같이, 나노입자의 노출 기간은 나노입자에 의해 유도된 DNA 복제 역학의 변화의 정량적 측정을 위해 변화될 수 있다. 복제 역학의 초기 영향을 결정하려면 다른 용량으로 1분, 20분 또는 30분과 같은 단기 노출이 적절할 것입니다. 나노 물질에 대한 세포의 장기간 노출 후 복제 패턴의 차이 (그림 2 참조)는 나노 입자 처리 전후의 IdU 및 CIdU 노출 패턴 (각각 20 분)을 비교하여 결정할 수 있습니다. 이 접근법은 나노물질에 대한 급성 및 만성 노출의 영향으로 해석될 수 있는 상이한 노출 시간에서의 포크 스톨링, 포크 감속, 및 기원 소성의 차이를 결정하는데 사용될 수 있다39,40.
DNA 빗질 및 RDS 방법과 같은 DNA 복제의 변이를 감지하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 유망한 기술이 있습니다. 그러나, 이러한 방법들과 비교하여, DNA 섬유 분석은 분석을 위한 고가의 기구를 필요로 하지 않고 편리하고 비용 효율적이다(41). 이 방법의 한계는 실험 기간, 정량화를 위해 충분한 이미지를 촬영하는 데 필요한 시간 및 소프트웨어 분석입니다. 그러나 확실히, 이 접근법은 세포주뿐만 아니라 다른 조직 샘플과 다른 종 사이의 입자로 인한 게놈 불안정성을 결정하는 나노독성학 연구를 지원할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 Blazer 재단, Biomedical Sciences의 Medical Biotechnology Program, UIC Rockford 및 UIC Rockford의 보건 과학 교육부의 재정 지원을 인정합니다. 저자는 프로젝트에 기여한 Ananya Sangineni와 James Bradley에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
| CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
| Rat anti-BrdU | Abcam | BU1--75(ICR1) | |
| Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
| Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
| Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
- Gambus, A.
- Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
- Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
- Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
- Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
- Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
- Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
- Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
- Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
- Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
- Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
- Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
- Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
- Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
- Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
- Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
- Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
- Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
- Brayner, R.
- Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
- Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
- Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
- Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
- Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
- Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
- Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
- Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
- Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
- Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).
