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Biology

Demonstração do Ensaio de Fibras de DNA para Investigação de Danos ao DNA e Dinâmica de Reparo Induzidos por Nanopartículas

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64903
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

A metodologia auxilia na análise da variação na dinâmica de replicação do DNA na presença de nanopartículas. Diferentes metodologias podem ser adotadas com base no nível de citotoxicidade do material de interesse. Além disso, uma descrição da análise de imagem é fornecida para ajudar na análise de fibras de DNA.

Abstract

A exposição a nanomateriais pode causar estresse de replicação e instabilidade genômica nas células. O grau de instabilidade depende da química, tamanho e concentração dos nanomateriais, do tempo de exposição e do tipo de célula exposta. Vários métodos estabelecidos têm sido utilizados para elucidar como agentes endógenos/exógenos afetam a replicação global. No entanto, ensaios em nível de replicon, como o ensaio de fibra de DNA, são imperativos para entender como esses agentes influenciam o início da replicação, terminações e progressão da bifurcação de replicação. Saber disso permite entender melhor como os nanomateriais aumentam as chances de fixação de mutações e instabilidade genômica. Usamos macrófagos RAW 264.7 como células modelo para estudar a dinâmica de replicação sob exposição a nanopartículas de óxido de grafeno. Aqui, demonstramos o protocolo básico para o ensaio de fibras de DNA, que inclui marcação de pulso com análogos de nucleotídeos, lise celular, disseminação das fibras de DNA marcadas com pulso em lâminas, imunomarcação fluorescente dos análogos de nucleotídeos dentro das fibras de DNA, imagem dos intermediários de replicação dentro das fibras de DNA usando microscopia confocal e análise intermediária de replicação utilizando um software de pontuação e análise assistida por computador (CASA).

Introduction

Durante cada ciclo celular, a replicação do DNA garante a duplicação precisa do genoma1. A replicação cromossômica eucariótica depende essencialmente de três fatores: o momento do disparo de múltiplas origens de replicação, a velocidade dos garfos que emergem das origens disparadas e o término do processo de replicação quando dois garfos de replicação de origens adjacentes se encontram2. Para a transmissão de alta fidelidade da informação genética para as células filhas, bem como a preservação da integridade genética, a replicação precisa do DNA é crucial. Agentes que se desenvolvem a partir do metabolismo regular ou são devidos a materiais ambientais artificiais ou naturais estão constantemente atacando o genoma. Esses agentes endógenos e exógenos fazem com que os garfos de replicação diminuam ou parem devido ao encontro de danos no DNA causados por esses agentes, e os garfos temporariamente desacelerando ou parando em resposta a essas dificuldades é denominado estresse de replicação3. Em resposta ao estresse de replicação, as células desenvolveram várias vias moleculares que mantêm a estabilidade dos garfos de replicação perturbados e permitem que eles reiniciem4. Em termos de estabilidade genética, sobrevivência celular e doença humana, esses mecanismos de resposta ao estresse de replicação têm emergido como os fatores-chave para manter um genoma saudável, garantir a sobrevivência celular e diminuir a probabilidade de formação de doenças5.

Um dos agentes exógenos capazes de produzir estresse de replicação são as nanopartículas. Nanopartículas são partículas que variam em tamanho de 1 nm a 100 nm6. Devido às suas altas áreas superficiais, formas distintas e propriedades químicas únicas, as nanopartículas são utilizadas em várias aplicações médicas, farmacêuticas, ambientais e industriais 7,8. Embora as nanopartículas tenham muitos benefícios potenciais, algumas delas (devido à sua natureza hereditária ou longevidade) podem se tornar tóxicas. As nanopartículas também podem se formar devido ao desgaste natural dos implantes médicos e serem liberadas na região periprotética 9,10.

Devido à exposição dos seres humanos a uma miríade de nanopartículas produzidas para diversas aplicações, a pesquisa na área de toxicidade de nanopartículas tem aumentado enormemente nos últimos 10 anos11. Embora esses esforços de pesquisa tenham revelado informações em abundância sobre a ameaça potencial que as nanopartículas representam para a saúde humana, o conhecimento sobre o potencial das nanopartículas para causar genotoxicidade ainda é limitado. O que foi descoberto até agora é que essas nanopartículas podem interagir fisicamente com o DNA, promover danos ao DNA e danificar ou interferir com as proteínas responsáveis por reparar ou replicar o DNA12. Para detectar como eles interferem na replicação do DNA, o penteamento de fibras de DNA, a síntese de DNA radiorresistente (SDR) e a análise de fibras de DNA são tipicamente usados13,14,15,16.

O método de pentear de fibras de DNA é flexível e fornece informações sobre a dinâmica da bifurcação de replicação no nível de molécula única17. Em essência, uma lamínula salinizada é suavemente retirada da solução de DNA assim que o DNA termina de se ligar a ela. As moléculas de DNA são retizadas e alinhadas pelo menisco da solução. A homogeneidade, o espaçamento e o alinhamento das fibras de DNA suportam medições precisas e confiáveis do comprimento do trato das fibras. Ao ajustar a duração e a sequência dos tratamentos e dos medicamentos usados para causar estresse ou danos, muitos aspectos do avanço do garfo podem ser monitorados usando este aplicativo. Nesse método, utiliza-se um sistema de dupla rotulagem, por meio do qual se avalia a velocidade e a progressão da bifurcação de replicação17,18. Por outro lado, a eletroforese em gel 2D aproveita o fato de que, na eletroforese em gel de agarose, estruturas ramificadas de DNA viajam mais lentamente do que moléculas lineares de DNA de mesma massa, permitindo a separação limpa das duas em uma corrida 2D. De fato, este método é investigado para segregar moléculas de DNA com base em sua massa na primeira corrida e com base em sua forma na segunda corrida ortogonal. Após a fragmentação do DNA genômico, os intermediários incomuns de replicação e recombinação desenvolvem uma forma ramificada, podendo ser distinguidos das moléculas lineares mais comuns no gel 2D19.

O método RDS é usado para determinar como a síntese global de DNA é afetada. Nesse método, o grau de inibição da replicação global é determinado comparando-se a quantidade de nucleotídeos radioativamente marcados incorporados, como a [14C] timidina, em células não tratadas versus tratadas14,20. A diferença percentual na marcação radioativa entre as células não tratadas e tratadas representa o grau em que o agente prejudicial ao DNA afeta a síntese de DNA. Semelhante a este, outro método utiliza a capacidade das células de integrar análogos de nucleotídeos como BrdU (5-bromo-2′-desoxiuridina) para citometria de fluxo para medir as taxas globais de síntese de DNA21,22. Embora esses métodos demonstrem como os agentes prejudiciais ao DNA afetam a síntese global de DNA, eles não mostram como os replicons individuais são afetados. De fato, ensaios em nível de replicon são imperativos para entender melhor o início e a extensão da instabilidade genômica em caso de exposição a partículas tóxicas (nanomateriais). A autorradiografia por fibras de DNA e a microscopia eletrônica são alguns métodos utilizados para sua determinação23,24,25,26.

Os conceitos de bolhas de replicação e replicação bidirecional a partir de fontes desigualmente espaçadas foram primeiramente desenvolvidos utilizando testes de molécula única, como microscopia eletrônica e autorradiografia por fibras deDNA27,28. A observação direta de intermediários de replicação ramificada em moléculas específicas dispersas através de uma grade revestida de carbono é grandemente facilitada pela microscopia eletrônica. Esse método, que ainda hoje é usado para rastrear desvios patológicos em bifurcações de replicação, foi utilizado para localizar a primeira origem eucariótica da replicação doDNA28. A autorradiografia por fibras está centrada no conceito de identificação autorradiográfica de áreas recém-replicadas e marcação de pulso de cromossomos com timidina tritiada. A primeira avaliação quantitativa das densidades de origem e das taxas de replicação em sequências genômicas de metazoários foi possível pela autorradiografia de fibras deDNA29.

Atualmente, os métodos de fluorografia de fibras têm tomado o lugar da autorradiografia, principalmente porque a fluorografia de fibras é muito mais rápida do que a autorradiografia. Na fluorografia das fibras, dois derivados nucleotídicos halogenados, como bromo- (Br), cloro- (Cl) ou iododesoxiuridina (IdU), são incorporados sequencialmente ao DNA recém-replicado e então identificados por imunofluorescência indireta usando anticorpos30. A visualização microscópica do DNA nascente que incorporou um ou ambos os análogos é possível pela imunomarcação de um dos análogos em uma cor e o outro análogo em uma cor diferente (por exemplo, imunomarcação de DNA nascente com vermelho IdU incorporado e verde CldU incorporado) (Figura 1)21. Muitos tipos diferentes de intermediários de replicação podem ser identificados por análise de fibras de DNA. Os mais comumente estudados são garfos alongadores individuais, iniciações e terminações. Garfos alongadores individuais têm um padrão de replicação de vermelho seguido de verde (vermelho-verde; Figura 2A). 13 Os comprimentos desses intermediários são frequentemente usados para medir a velocidade da bifurcação (isto é, comprimento da bifurcação/tempo de pulso) ou a degradação exonucleolítica do DNA nascente através do encurtamento da pista (Figura 2E)30,31,32. Em um estudo realizado por Mimitou et al., verificou-se que, após exposição prolongada à hidroxiureia, um veneno de replicação que causa quebras de fita dupla no DNA, RE11 foi recrutado33. A MRE11 é uma exonuclease conhecida por sua atividade de exonuclease 3'-5', sendo capaz de cortar as extremidades do DNA para reparo. Portanto, quando expostos a agentes tóxicos, pode-se observar degradação exonucleolítica do DNA nascente, que é o encurtamento da fita de DNA devido à exposição a um agente lesivo ao DNA34.

Quebras de bifurcação de replicação provocadas por obstruções físicas (complexos DNA-proteína ou lesões de DNA), impedimentos químicos ou mutações podem interromper a replicação e necessitar de recombinação homóloga para reiniciá-la. Isso é conhecido como progressão de garfo prejudicada. Numerosas investigações in vitro e in vivo têm indicado que a transcrição pode, ocasionalmente, impedir o avanço da bifurcação de replicação dessa maneira35.

As iniciações são origens de replicação que iniciam e disparam durante o primeiro ou segundo pulso. As origens que disparam durante o primeiro pulso e têm bifurcações de replicação que continuam ativas têm um padrão verde-vermelho-verde (Figura 2B, abaixo). As origens que se iniciam durante o segundo pulso têm um padrão somente verde (Figura 2B, superior) e às vezes são chamadas de origens recém-iniciadas, de modo que essas origens podem ser diferenciadas daquelas que se iniciam durante o primeiro pulso. A comparação das porcentagens relativas de origens recém-queimadas entre duas condições experimentais permite entender como uma célula responde a um agente prejudicial ao DNA ou à presença ou ausência de uma proteína. As terminações são criadas quando duas bifurcações de replicação de replicons adjacentes se fundem e têm um padrão vermelho-verde-vermelho (Figura 2D)30.

Com base nos fatos descritos acima, a análise de fibras de DNA é atualmente considerada um método preferencial para estudar a variação na dinâmica de replicação do DNA causada por agentes tóxicos como nanomateriais. Os pesquisadores agora têm uma boa compreensão e conhecimento da dinâmica da replicação do DNA em todo o genoma em eucariotos, tanto quantitativa quanto qualitativamente, devido à descoberta dessa tecnologia36. Com base nas variáveis de desfecho, diversas metodologias podem ser adotadas. Alguns exemplos de métodos para estudar as variações nos danos ao DNA induzidos por agentes externos/nanopartículas são mostrados na Figura 3. O objetivo geral do método de análise de fibras de DNA descrito neste estudo é determinar como as nanopartículas impactam o processo de replicação in vitro e como elas afetam diferencialmente vários tecidos.

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Protocol

1. Preparação de anticorpos e tampão

  1. Preparar a solução primária de anticorpos, camundongo anti-BrdU em uma diluição de 1:300 em BSA a 5% e anti-BrdU de rato a uma diluição de 1:500 em BSA a 5%.
  2. Preparar a solução de anticorpos secundários, alexafluor 594 coelho anti-rato numa diluição de 1:300 em BSA a 5% e alexafluor 488 anti-rato de frango numa diluição de 1:500 em BSA a 5%.
  3. Preparar a solução de anticorpos terciários, alexafluor 594 cabra anti-coelho numa diluição de 1:1.000 em BSA a 5% e alexafluor 488 cabra anti-frango numa diluição de 1:1.000 em BSA a 5%.
  4. Preparar 10 mL de tampão de lise em ddH 2 O com2mL de Tris 1M (pH 7,4), 1 mL de EDTA 0,5 M e 0,5 mL de SDS 10%.

2. Preparação para o ensaio da fibra

  1. Dia 1: Cultura de células e tratamento de nanomateriais para o ensaio de fibras
    1. Placa RAW 264,5 células de macrófagos ou as células de interesse, de modo que as células estejam na fase logarítmica de seu crescimento no dia do experimento. Para células RAW, adicione 5 x 104 células/poço a placas de 24 poços para cada condição. Manter as células em estufa a 37 °C com 5% de CO2 e 98% de umidade. A Tabela 1 descreve os constituintes dos meios utilizados. Permitir que as células cresçam até 75%-80% de confluência17,37.
    2. Depois que as células atingirem o nível de 75%-80% de confluência, remova o meio das placas, pegue metade do meio e reserve-o para o pulso CldU (reserva CldU), e adicione 5 μL IdU à outra metade em uma concentração final de 50 μM. Misture e adicione o meio contendo IdU de volta às placas. Coloque as células com IdU na incubadora por 20 min.
    3. Coloque o meio de reserva CldU a 37 °C para mantê-lo pré-aquecido. Adicione CldU a este meio imediatamente antes do pulso CldU.
    4. Após 20 min, aspirar a mistura de meio IdU e lavar suavemente as células com 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) girando suavemente a placa. Descarte o PBS.
    5. Tratar as células com várias concentrações de nanopartículas em 500 μL do meio e incubar por mais 30 min. Para este estudo, utilizar nanopartículas de óxido de grafeno tratadas na concentração de 25 μg/mL.
    6. Aspirar a mistura de meio de tratamento e lavar suavemente as células com 500 μL de PBS girando suavemente a placa. Descarte o PBS. Adicionar 5 μL de CldU (100 μM final
    7. concentração) para o meio de reserva CldU, e cobrir as células com o meio de reserva CldU. Coloque as células na incubadora durante o pulso de CldU por 20 min.
    8. Lave as células com PBS, raspe ou tripsinize por 3-4 minutos e, em seguida, adicione 5 mL de meio à placa e colete as células.
    9. Gire a 264 x g por 4 min. Retire o meio e ressuspenda as células em 1 mL de PBS gelado. Determine o número de células usando um ensaio de azul de tripano (contagem de hemocitômetros) e, em seguida, dilua as células para ~200-400 células/μL. Mantenha a suspensão celular no gelo durante a contagem celular.
      NOTA: Se possível, limite o tempo em que as células ficam no gelo. Isso pode ajudar a obter um talão de solução celular ao longo da parte superior da lâmina. Se forem mantidos no gelo, mantenha-os ligados por menos de 30 min.
  2. Dia 1: Preparação das fibras de DNA
    1. Com lápis, etiquetar as lâminas (lâmina de vidro, 75 mm x 25 mm) com a condição e data do experimento.
    2. Pegue 2 μL de células em uma pipeta, segure a pipeta em um ângulo de ~45°, coloque a pipeta cerca de 1 cm abaixo da etiqueta da lâmina e mova a pipeta horizontalmente para a etiqueta da lâmina. À medida que a pipeta se move através da lâmina, solte um pouco da solução da célula de cada vez. Crie várias linhas de células em cada slide (etapa crítica).
      Observação : deve haver uma linha horizontal de suspensão de célula em todo o slide. Se a suspensão da célula se acumular, adicione 5-10 μL de meio celular ao recipiente que tem a suspensão da célula, pois isso pode ajudar a solução a aderir à lâmina ao ser aplicada novamente.
    3. Deixe a solução com as células evaporar até que a solução pareça pegajosa e pegajosa. Neste ponto, algum líquido está associado às células, mas não muito. Esta etapa leva de 8 a 20 minutos e varia de acordo com a quantidade de umidade do ar.
      NOTA: Certifique-se de que toda a solução não evaporou, pois isso torna muito difícil obter fibras de DNA retas e alinhadas, pois a maioria, se não todas, do DNA ficará presa e incapaz de se separar.
    4. Quando a solução estiver pegajosa, sobreponha as células com 15 μL de tampão espalhador (lise) por cada linha de células, tomando cuidado para não deixar a ponta da pipeta tocar a lâmina. Aguarde 10 min. Incline a lâmina em um ângulo de 25° e coloque a etiqueta da lâmina horizontalmente contra a borda de um rack de tubo (a parte inferior da etiqueta deve se alinhar com a borda do rack de tubo).
    5. Deixe o DNA secar ao ar por um mínimo de 4 h a partir do momento em que as últimas lâminas foram feitas.
      OBS: Um período de 4 h a 12 h é bom para secagem. No entanto, não os deixe secar durante a noite. Se for permitido secar durante a noite, haverá muito DNA relaxado, mas muito poucas fibras de DNA retas e alinhadas.
  3. Dia 1: Fixação das fibras de DNA e congelamento
    1. Depois de secas, fixe as lâminas com metanol:ácido acético (3:1) mergulhando as lâminas por 2 min. Execute esta etapa sob um capô e deixe as lâminas secarem durante a noite em uma área com exposição limitada à luz, ou cubra as lâminas com uma barraca de folha de estanho.
  4. Dia 2
    1. Coloque as lâminas em um suporte de lâmina de vidro. Coloque as lâminas a -20 °C por um mínimo de 24 h. Esta etapa melhora a resolução ou a nitidez da imagem.

3. Realização do ensaio de fibras de DNA

  1. Desnaturação do DNA
    1. Prepare uma câmara umidificada usando pequenas caixas de ponta de pipeta com tampas. Encha os recipientes com água pela metade e coloque-os em banho-maria a 37 °C por pelo menos 1 h.
    2. Retire as lâminas de -20 °C e descongele-as por alguns segundos. Coloque as lâminas cuidadosamente em um frasco Coplin contendo água deionizada (DI) para que as superfícies revestidas não toquem nas paredes do frasco. Incube a lâmina por 20 s e, em seguida, despeje cuidadosamente a água.
    3. Adicione 2,5 M de HCL ao frasco Coplin de modo que cubra todos os slides. Aguarde 80 min. Esta é uma etapa crítica do protocolo. Uma mudança no tempo pode alterar o resultado da imagem.
    4. Lave as lâminas 1x com PBS mais Tween (PBS + 0,1% Tween [concentração final]) e depois 2x com PBS por 3 min cada em temperatura ambiente (TR).
  2. Imunomarcação
    1. Mantenha as lâminas na câmara umidificada para as etapas seguintes. Bloqueie as lâminas em BSA 5% em PBS por 30 min no RT e cubra-as com lamínulas, lamínulas feitas de um saco Western blot ou folhas de plástico transparentes.
    2. Após o bloqueio, remova cuidadosamente a lamínula, remova a solução de bloqueio e coloque a lâmina em um papel toalha (toque na lâmina na toalha) para remover o excesso de solução de bloqueio.
    3. Adicionar 100 μL da solução de anticorpos primários ao longo do comprimento da lâmina. Adicione uma nova tampa plástica e aguarde 2 h. Ao adicionar a tampa, certifique-se de que não se formam bolhas.
    4. Após 2 h, retire a solução de anticorpos e enxágue as lâminas em um frasco de Coplin cheio de PBS 2x no RT. Use PBS fresco cada vez para lavar as lâminas.
    5. Bloqueie as lâminas novamente adicionando 200 μL (três a quatro gotas) de 5% de BSA ao longo de cada lâmina e adicione uma lamínula plástica. Aguarde 15 min.
    6. Retire a lamínula, retire o excesso de BSA em um papel toalha e adicione 100 μL da solução de anticorpos secundários ao longo do comprimento da lâmina. Adicione uma nova tampa plástica e aguarde 1 h.
    7. Retire a tampa, derrube o excesso de BSA em um papel toalha e lave as lâminas 2x em PBS no RT.
    8. Bloqueie as lâminas novamente adicionando 200 μL (três a quatro gotas) de 5% de BSA ao longo de cada lâmina e adicione uma lamínula plástica. Aguarde 15 min.
    9. Se necessário, remova a lamínula, remova o excesso de BSA em um papel toalha e adicione 100 μL de solução de anticorpos terciários ao longo do comprimento da lâmina. Adicione novas tampas plásticas e aguarde 30 min.
    10. Lave as lâminas com PBS 3x. Retire o excesso de PBS e deixe-os secar completamente.
    11. Depois de seco, adicione o meio de montagem e coloque cuidadosamente as lamínulas de vidro (24 mm x 60 mm) sobre o meio de montagem para evitar bolhas. Rerotule os slides e deixe-os no escuro durante a noite.

4. Aquisição de imagens

  1. Visualize as fibras de DNA imunomarcadas usando um microscópio de imunofluorescência equipado com uma câmera, uma objetiva de 60x e conjuntos de filtros apropriados para detectar os corantes alexafluor 488 e 594.
  2. Tire imagens para a análise em regiões onde as fibras estão bem separadas e não emaranhadas. É importante capturar imagens em diferentes áreas ao longo da lâmina, pois a obtenção de imagens em apenas uma parte da lâmina pode não fornecer dados representativos em relação a todos os intermediários de replicação encontrados na lâmina.
  3. Se possível, obtenha imagens de fibra de 20 regiões diferentes em um slide. Use apenas um canal para selecionar as áreas para tirar imagens para evitar viés.

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Representative Results

Depois de obter imagens suficientes (de 20 a 100 imagens por condição), os intermediários de replicação precisam ser identificados, medidos e contados. Seja analisando as fibras manualmente ou automaticamente por meio de um programa38, é necessário definir claramente quais características uma fibra deve ter para que possa ser contada ou pontuada (ou não contada ou medida)39. Por exemplo, as seguintes questões podem ser consideradas. (1) Deve-se medir e contar apenas fibras com 100% de imunofluorescência em toda a fibra ou elas podem conter algumas regiões sem imunofluorescência (por exemplo, todos os intermediários da Figura 4Ai,ii,iii devem ser analisados ou apenas um subconjunto deles?)? Se analisarmos fibras com perda de sinal, qual é a perda máxima de sinal aceitável dentro de uma fibra e qual é o número máximo de pixels contínuos na fibra que podem ser desprovidos de qualquer sinal (por exemplo, a Figura 3Aiv seria considerada um intermediário vermelho-verde ou vermelho-somente?)? (2) Quais devem ser as larguras/comprimentos mínimos e máximos das fibras? (3) Qual deve ser a relação sinal-ruído (S:N) ao decidir se se deve ou não medir uma fibra (por exemplo, quantas fibras devem ser escolhidas na Figura 4B para analisar?)? (4) Quão perto da borda da imagem uma fibra precisa estar antes de não ser contada ou medida? (5) Se um sinal fluorescente é amarelo, conta-se isso como vermelho ou verde (por exemplo, a porção amarela do intermediário de replicação na Figura 4C deve ser contada como vermelha ou verde?)? (6) Quanto tempo um segmento de cor precisa ser para ser considerado um sinal verdadeiro (por exemplo, a replicação intermediária na Figura 4D é uma faixa somente verde, uma faixa verde-vermelho-verde ou uma faixa verde-vermelha?)? (7) Se estiver usando um programa automatizado de análise de fibras, quão confiante está o programa na medição/contagem que acabou de realizar? (8) Se as fibras estão sendo analisadas manualmente, quão consistente deve ser a análise ao longo do tempo e entre indivíduos?

Normalmente, os parâmetros usados para a análise de fibras de DNA são os seguintes:
Relação sinal-ruído: 3 (a intensidade da fibra é três vezes maior que a intensidade de fundo)
Espessura da fibra: ≤8 pixels de largura
Tamanho mínimo: apenas vermelho ou verde e 10 pixels; faixas vermelho-verdes com cada segmento ≥10 pixels; faixas vermelho-verde-vermelho ou verde-vermelho-verde com cada segmento ≥10 pixels.
Continuidade do sinal fluorescente: pelo menos 80% e sem gaps no sinal maiores que 6 pixels.
Confiança na avaliação: os valores de confiança devem ser semelhantes entre si em uma imagem e entre imagens.

Além dos parâmetros citados acima, outro critério importante é a seleção de uma fibra clara que não se sobreponha a outras fibras durante a imagem e análise.

A Figura 5A mostra imagens representativas do controle (Figura 5Ai) e do DNA de macrófagos tratados com nanopartículas de óxido de grafeno (Figura 5Aii,iii). A imagem mostra um aumento nas trilhas somente leitura (terminações) e uma diminuição nas origens recém-queimadas nas células tratadas com óxido de grafeno em comparação com o controle (Figura 5C). Também é importante considerar o número de imagens e a posição do slide de onde as imagens são tiradas. Como mostrado na Figura 5Aiii,C, uma variação no padrão de replicação dos intermediários (aumento de novas origens em relação ao controle) foi observada em uma região diferente da mesma condição. Mesmo que algumas dessas observações possam não afetar o resultado geral, deve-se tomar cuidado para criar imagens do slide incluindo todas as áreas representativas. O ideal seria dividir a área total do slide em cinco a seis regiões e tirar várias imagens de cada região (exemplo: 10 imagens) para encontrar dados de fibra conclusivos para cada slide. É ideal para selecionar cerca de 500 intermediários (Figura 5B) a partir de múltiplas lâminas/condições. Com essas variações na replicação, a quantificação intermediária a partir da análise de fibras de DNA pode ser usada para investigar a variação na dinâmica de replicação do DNA causada por nanopartículas de óxido de grafeno ou a genotoxicidade de outros nanomateriais. Assim, uma compreensão qualitativa e quantitativa da dinâmica da replicação do DNA em todo o genoma pode ser obtida através desta nova metodologia em comparação com outras análises mencionadas na introdução.

Figure 1
Figura 1: Ensaio de fibras de DNA. Representação esquemática do ensaio com uma visão geral das principais etapas da análise das fibras de DNA. Escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imunomarcação dos intermediários de replicação do DNA. Representação esquemática de diferentes intermediários de replicação identificados por marcação de pulso sequencial com IdU (vermelho) e CldU (verde). Escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Exposição de nanopartículas. Diferentes metodologias para estudar variações em danos ao DNA induzidos por nanopartículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Características das fibras de DNA a serem pontuadas. Exemplos de intermediários de replicação em uma imagem. (A) Lacunas na imunofluorescência; (i) perda de sinal de imunofluorescência de 0% através do intermediário de replicação; (ii) ~7% de perda de sinal; (iii) 50% de perda de sinal; e (iv) perda de sinal de >90%. (B) Uma região com muitos intermediários de replicação sobrepostos (a seta indica a região com sobreposição clara de fibras). (C) Uma fibra de DNA com uma região amarela. (D) Um intermediário de replicação aberto à interpretação (a seta indica as lacunas na fibra). Escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise e interpretação das fibras de DNA. (A) Imagens representativas de fibras de DNA de (i) células de macrófagos controle e (ii,iii) células de macrófagos tratadas com nanopartículas por 20 min na concentração de 25 μg/mL. As imagens ii e iii foram obtidas de diferentes regiões da lâmina. (B) Análise automatizada representativa de software das condições de controle e tratadas com nanopartículas. Para essa análise, foi utilizado o programa automatizado de rastreamento e medição de fibras de DNA desenvolvido por Wang et al.38. Os números da figura mostram o número de rastros de DNA analisados. (C) Representação gráfica do software de análise das condições de controle e nanopartículas tratadas. NP representa nanopartículas. A porcentagem relativa da população intermediária (por exemplo, apenas para vermelho) é calculada a partir do total de intermediários analisados. Comparando a imagem 1 tratada com NP com a imagem 2, há grandes diferenças entre as duas imagens. Assim, é importante obter muitas imagens ao longo da lâmina para entender como uma condição experimental afeta o processo de replicação. Abreviações: R = vermelho; G = verde. Escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Composição da mídia
10% Soro Fetal Bovino
Solução de penicilina-estreptomicina a 1% (10000 unidades/ml)
1% L de Glutamina (200 mM)
Glicose média-alta da águia modificada de Dulbecco

Tabela 1: Composição dos meios utilizados para a cultura de células de macrófagos.

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Discussion

Discutimos aqui um método para auxiliar na análise da variação na dinâmica de replicação do DNA na presença de nanopartículas através do ensaio de fibras de DNA. As principais etapas críticas envolvidas no ensaio padrão estão descritas no protocolo (passo 2.2.2 e passo 3.1.3). É sempre recomendado usar uma área com exposição limitada à luz aérea e fluxo de ar constante para evitar quebras de DNA induzidas pela luz nas lâminas, bem como para aumentar a reprodutibilidade. É necessária uma atenção cuidadosa na duração do tempo para a secagem do lisado celular nas lâminas. A secagem excessiva afetará negativamente a propagação da fibra. A segunda etapa crítica é a desnaturação da fibra usando uma solução ácida. A duração da lavagem ácida deve ser mantida igual para todas as lâminas no mesmo experimento. A solução de problemas para essas duas etapas para encontrar condições ideais (tempo de lise, volume de lisado na lâmina, tempo de secagem e tempo de lavagem ácida) é recomendada para diferentes tipos de células e ambientes de laboratório.

Como discutido na Figura 3, o tempo de exposição das nanopartículas pode ser variado para a determinação quantitativa da alteração na dinâmica de replicação do DNA induzida pelas nanopartículas. Para determinar o impacto inicial da dinâmica de replicação, uma exposição de curto prazo, como 1 min, 20 min ou 30 min com diferentes dosagens, seria apropriada. A diferença nos padrões de replicação (como mostrado na Figura 2) após a exposição de longo prazo das células aos nanomateriais pode ser determinada comparando-se os padrões de exposição a IdU e CIdU (20 min cada) antes e após o tratamento com nanopartículas. Essa abordagem pode ser usada para determinar o estagnação do garfo, a desaceleração do garfo e a diferença na origem do disparo em diferentes momentos de exposição, o que pode ser interpretado como os efeitos da exposição aguda e crônica aos nanomateriais39,40.

Existem várias técnicas promissoras disponíveis para detectar a variação na replicação do DNA, como o pentear de DNA e o método RDS; no entanto, em comparação com esses métodos, o ensaio de fibras de DNA é conveniente e custo-efetivo, sem a necessidade de instrumentos caros paraanálise41. As limitações deste método são a duração experimental, o tempo necessário para obter imagens suficientes para quantificação, bem como a análise do software. No entanto, certamente, esta abordagem apoiará a pesquisa em nanotoxicologia na determinação da instabilidade genômica causada por partículas em linhagens celulares, bem como em diferentes amostras de tecido e entre diferentes espécies.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

Os autores agradecem o apoio financeiro da fundação Blazer, do Programa de Biotecnologia Médica em Ciências Biomédicas, UIC Rockford, e do Departamento de Educação em Ciências da Saúde, UIC Rockford. Os autores agradecem a Ananya Sangineni e James Bradley por suas contribuições ao projeto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

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References

  1. Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
  2. Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
  3. Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
  4. Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
  5. Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
  6. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
  7. Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
  8. Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
  9. Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
  10. Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
  11. Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
  12. Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
  13. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  14. Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
  15. Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
  16. Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
  17. Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
  18. Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
  19. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
  20. Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
  21. Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
  22. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  23. Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
  24. Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
  25. Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
  27. Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
  28. Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
  29. Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
  30. Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
  31. Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
  32. Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
  33. Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
  34. Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
  35. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  36. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  37. Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
  38. Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
  39. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  40. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  41. Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).

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Biologia Edição 193
Demonstração do Ensaio de Fibras de DNA para Investigação de Danos ao DNA e Dinâmica de Reparo Induzidos por Nanopartículas
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Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

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