Summary
Metodiken hjälper till vid analys av variation i DNA-replikationsdynamik i närvaro av nanopartiklar. Olika metoder kan antas baserat på cytotoxicitetsnivån för materialet av intresse. Dessutom tillhandahålls en beskrivning av bildanalysen för att hjälpa till vid DNA-fiberanalys.
Abstract
Exponering för nanomaterial kan orsaka replikationsstress och genomisk instabilitet i celler. Graden av instabilitet beror på nanomaterialens kemi, storlek och koncentration, exponeringstiden och den exponerade celltypen. Flera etablerade metoder har använts för att belysa hur endogena/exogena medel påverkar global replikering. Analyser på svarsnivå, såsom DNA-fiberanalysen, är dock absolut nödvändiga för att förstå hur dessa medel påverkar replikationsinitiering, avslutningar och replikationsgaffelprogression. Att veta detta gör att man bättre kan förstå hur nanomaterial ökar risken för mutationsfixering och genomisk instabilitet. Vi använde RAW 264.7 makrofager som modellceller för att studera replikationsdynamiken under exponering för grafenoxidnanopartiklar. Här demonstrerar vi det grundläggande protokollet för DNA-fiberanalysen, som inkluderar pulsmärkning med nukleotidanaloger, celllys, spridning av de pulsmärkta DNA-fibrerna på objektglas, fluorescerande immunfärgning av nukleotidanalogerna i DNA-fibrerna, avbildning av replikationsintermediärerna inom DNA-fibrerna med hjälp av konfokalmikroskopi och replikationsintermediär analys med hjälp av en datorstödd poäng- och analysprogramvara (CASA).
Introduction
Under varje cellcykel säkerställer DNA-replikation noggrann genomduplicering1. Eukaryot kromosomal replikation beror i huvudsak på tre faktorer: tidpunkten för avfyrningen av flera replikeringsursprung, hastigheten på gafflarna som kommer från de utlösta ursprungen och avslutningen av replikeringsprocessen när två replikeringsgafflar från intilliggande ursprung möts2. För högkvalitativ överföring av genetisk information till dotterceller, liksom bevarande av genetisk integritet, är korrekt DNA-replikation avgörande. Medel som utvecklas från regelbunden metabolism eller beror på konstgjorda eller naturliga miljömaterial attackerar ständigt genomet. Dessa endogena och exogena medel orsakar replikationsgafflar att sakta ner eller stoppa på grund av att de stöter på DNA-skador orsakade av dessa medel, och gafflarna som tillfälligt saktar ner eller stannar som svar på dessa svårigheter kallas replikationsstress3. Som svar på replikationsstress har celler utvecklat flera molekylära vägar som upprätthåller stabiliteten hos de störda replikationsgafflarna och tillåter dem att starta om4. När det gäller genetisk stabilitet, cellöverlevnad och mänsklig sjukdom har dessa replikationsstressresponsmekanismer framträtt som nyckelfaktorerna för att upprätthålla ett hälsosamt genom, säkerställa cellöverlevnad och minska sannolikheten för sjukdomsbildning5.
Ett av de exogena medel som kan producera replikationsstress är nanopartiklar. Nanopartiklar är partiklar som varierar i storlek från 1 nm till 100 nm6. På grund av deras höga ytor, distinkta former och unika kemiska egenskaper används nanopartiklar i olika medicinska, farmaceutiska, miljömässiga och industriella applikationer 7,8. Medan nanopartiklar har många potentiella fördelar kan vissa av dem (på grund av deras ärftliga natur eller livslängd) bli giftiga. Nanopartiklar kan också bildas på grund av det naturliga slitaget på medicinska implantat och släppas ut i periprotesregionen 9,10.
På grund av människors exponering för en myriad av nanopartiklar som produceras för olika tillämpningar har forskningen inom nanopartikeltoxicitet ökat enormt under de senaste 10 åren11. Även om dessa forskningsinsatser har avslöjat information i överflöd om det potentiella hot som nanopartiklar utgör för människors hälsa, är kunskapen om potentialen för nanopartiklar att orsaka genotoxicitet fortfarande begränsad. Vad som hittills har upptäckts är att dessa nanopartiklar fysiskt kan interagera med DNA, främja DNA-skador och skada eller störa proteinerna som är ansvariga för att reparera eller replikera DNA12. För att upptäcka hur de stör DNA-replikation används vanligtvis DNA-fiberkamning, radioresistent DNA-syntes (RDS) och DNA-fiberanalys13,14,15,16.
DNA-fiberkamningsmetoden är flexibel och ger information om replikationsgaffeldynamik på enmolekylnivå17. I huvudsak dras ett saliniserat täckglas försiktigt från DNA-lösningen när DNA-ändarna binder till den. DNA-molekylerna rätas ut och justeras av lösningens menisk. DNA-fibrernas homogenitet, avstånd och inriktning stöder noggranna och pålitliga mätningar av fiberkanallängden. Genom att justera längden och sekvensen av behandlingarna och de läkemedel som används för att orsaka stress eller skada kan många aspekter av gaffelframsteg övervakas med hjälp av denna applikation. I denna metod används ett dubbelt märkningssystem, genom vilket replikeringsgaffelns hastighet och progression bedöms17,18. Å andra sidan utnyttjar 2D-gelelektrofores det faktum att i agarosgelelektrofores färdas förgrenande DNA-strukturer långsammare än linjära DNA-molekyler av samma massa, vilket möjliggör en ren separation av de två i en 2D-körning. Faktum är att denna metod undersöks för att segregera DNA-molekyler baserat på deras massa i den första körningen och baserat på deras form i den andra ortogonala körningen. Efter genomisk DNA-fragmentering utvecklar de ovanliga replikations- och rekombinationsintermediärerna en förgreningsform, och de kan särskiljas från de vanligare linjära molekylerna i 2D-gel19.
RDS-metoden används för att bestämma hur global DNA-syntes påverkas. I denna metod bestäms graden av hämning av global replikation genom att jämföra mängden inkorporerade radioaktivt märkta nukleotider, såsom [14C] tymidin, i obehandlade kontra behandlade celler14,20. Den procentuella skillnaden i radiomärkning mellan de obehandlade och behandlade cellerna representerar i vilken grad det DNA-skadliga medlet påverkar DNA-syntesen. I likhet med detta använder en annan metod cellernas förmåga att integrera nukleotidanaloger som BrdU (5-brom-2′-deoxiuridin) för flödescytometri för att mäta de totala hastigheterna för DNA-syntes21,22. Medan dessa metoder visar hur DNA-skadliga medel påverkar global DNA-syntes, visar de inte hur enskilda replicons påverkas. Analyser på svarsnivå är absolut nödvändiga för att bättre förstå initieringen och omfattningen av genomisk instabilitet i händelse av exponering för toxiska partiklar (nanomaterial). DNA-fiberautoradiografi och elektronmikroskopi är några metoder som används för att bestämma detta23,24,25,26.
Begreppen replikationsbubblor och dubbelriktad replikation från ojämnt fördelade källor utvecklades först med hjälp av enmolekylära tester som elektronmikroskopi och DNA-fiberautoradiografi27,28. Den direkta observationen av förgreningsreplikationsintermediärer på specifika molekyler dispergerade över ett kolbelagt rutnät underlättas avsevärt av elektronmikroskopi. Denna metod, som fortfarande används idag för att spåra patologiska skift vid replikationsgafflar, användes för att lokalisera det första eukaryota ursprunget till DNA-replikation28. Fiber autoradiografi är centrerad kring begreppet autoradiografisk identifiering av nyligen replikerade områden och pulsmärkning av kromosomer med tritierad tymidin. Den första kvantitativa utvärderingen av ursprungstätheter och replikationsgaffelhastigheter i metazoa genomiska sekvenser möjliggjordes av DNA-fiberautoradiografi29.
För närvarande har fiberfluorografimetoder tagit plats för autoradiografi, främst för att fiberfluorografi är mycket snabbare än autoradiografi. I fiberfluorografi införlivas två halogenerade nukleotidderivat, såsom brom- (Br), klor- (Cl) eller joddeoxiuridin (IdU), sekventiellt i nyligen replikerat DNA och identifieras sedan genom indirekt immunofluorescens med användning av antikroppar30. Mikroskopisk visning av det framväxande DNA som har införlivat en eller båda analogerna möjliggörs genom immunfärgning av en av analogerna i en färg och den andra analogen i en annan färg (t.ex. immunfärgning av begynnande DNA med inkorporerat IdU-rött och inkorporerat CldU-grönt) (figur 1)21. Många olika typer av replikationsintermediärer kan identifieras genom DNA-fiberanalys. De vanligast studerade är enskilda töjningsgafflar, initieringar och avslutningar. Enskilda töjbara gafflar har ett replikeringsmönster av rött följt av grönt (rödgrönt; Figur 2A). 13 Längden på dessa intermediärer används ofta för att mäta gaffelhastigheten (dvs. gaffellängd/pulstid) eller den exonukleolytiska nedbrytningen av begynnande DNA genom spårförkortning (figur 2E)30,31,32. I en studie av Mimitou et al. fann man att vid långvarig exponering för hydroxiurea, ett replikationsgift som orsakar dubbelsträngsbrott i DNA, rekryterades RE1133. MRE11 är ett exonukleas som är känt för sin 3'-5' exonukleasaktivitet, och det kan skära ändarna av DNA för reparation. Därför kan man, när man utsätts för giftiga ämnen, observera exonukleolytisk nedbrytning av begynnande DNA, vilket är förkortningen av DNA-strängen på grund av exponering för ett DNA-skadligt medel34.
Replikationsgaffelbrott orsakade av fysiska hinder (DNA-proteinkomplex eller DNA-lesioner), kemiska hinder eller mutationer kan stoppa replikationen och kräva homolog rekombination för att starta om den. Detta kallas nedsatt gaffelprogression. Många in vitro- och in vivo-undersökningar har indikerat att transkription ibland kan förhindra framsteg med replikationsgaffel på detta sätt35.
Initieringar är replikationsursprung som initierar och utlöses under den första eller andra pulsen. Ursprung som avfyras under den första pulsen och har replikationsgafflar som fortsätter att vara aktiva har ett grön-röd-grönt mönster (figur 2B, lägre). Ursprung som initieras under den andra pulsen har ett grönt mönster (figur 2B, övre) och kallas ibland nyinitierat ursprung, så dessa ursprung kan särskiljas från de som initieras under den första pulsen. Jämförelsen av de relativa procentandelarna av nyligen avfyrade ursprung mellan två experimentella förhållanden gör att man kan förstå hur en cell svarar på ett DNA-skadligt medel eller närvaron eller frånvaron av ett protein. Avslutningar skapas när två replikeringsgafflar från intilliggande replicons sammanfogas och de har ett röd-grön-rött mönster (figur 2D)30.
Baserat på de fakta som beskrivs ovan anses DNA-fiberanalys för närvarande vara en föredragen metod för att studera variationen i DNA-replikationsdynamik orsakad av giftiga ämnen såsom nanomaterial. Forskare har nu en god förståelse och kunskap om dynamiken i genomomfattande DNA-replikation i eukaryoter, både kvantitativt och kvalitativt, på grund av upptäckten av denna teknik36. Baserat på utfallsvariablerna kan flera metoder användas. Några exempel på metoder för att studera variationer i DNA-skador inducerade av externa agenter/nanopartiklar visas i figur 3. Det övergripande målet med DNA-fiberanalysmetoden som beskrivs i denna studie är att bestämma hur nanopartiklar påverkar replikationsprocessen in vitro och hur de påverkar olika vävnader differentiellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av antikroppar och buffert
- Bered den primära antikroppslösningen, mus-anti-BrdU i en spädning på 1:300 i 5 % BSA och anti-BrdU på råtta i en spädning på 1:500 i 5 % BSA.
- Bered den sekundära antikroppslösningen, alexafluor 594 kaninantimus vid en spädning på 1:300 i 5% BSA och alexafluor 488 kycklingantiråtta vid en spädning på 1:500 i 5% BSA.
- Bered den tertiära antikroppslösningen, alexafluor 594 getantikanin i en spädning på 1:1 000 i 5 % BSA och alexafluor 488 getanti-kyckling i en spädning på 1:1 000 i 5 % BSA.
- Förbered 10 ml lysbuffert iddH2Omed 2 ml 1M Tris (pH 7,4), 1 ml 0,5 M EDTA och 0,5 ml 10% SDS.
2. Förberedelse för fiberanalysen
- Dag 1: Cellodling och nanomaterialbehandling för fiberanalysen
- Platta RAW 264.5 makrofagceller eller cellerna av intresse, så att cellerna befinner sig i logfasen av deras tillväxt på experimentdagen. För RAW-celler, lägg till 5 x 104 celler / brunn till 24-brunnsplattor för varje tillstånd. Behåll cellerna i en 37 °C inkubator med 5% CO2 och 98% luftfuktighet. I tabell 1 beskrivs beståndsdelarna i de medier som används. Låt cellerna växa till 75% -80% sammanflöde17,37.
- När cellerna når nivån 75% -80% sammanflöde, ta bort mediet från plattorna, ta hälften av mediet och reservera det för CldU-pulsen (CldU-reserven) och tillsätt 5 μL IdU till den andra halvan vid en slutlig koncentration av 50 μM. Blanda och tillsätt det IdU-innehållande mediet tillbaka till plattorna. Placera cellerna med IdU i inkubatorn i 20 min.
- Placera CldU-reservmediet vid 37 °C för att hålla det förvärmt. Lägg till CldU till detta medium strax före CldU-pulsen.
- Efter 20 minuter aspirerar du IdU-medelblandningen och tvättar försiktigt cellerna med 500 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) genom att försiktigt rotera plattan. Kassera PBS.
- Behandla cellerna med olika koncentrationer av nanopartiklar i 500 μL av mediet och inkubera i ytterligare 30 minuter. För denna studie, använd behandlade grafenoxidnanopartiklar vid en koncentration på 25 μg / ml.
- Aspirera blandningen av behandlingsmedium och tvätta försiktigt cellerna med 500 μL PBS genom att rotera plattan försiktigt. Kassera PBS. Tillsätt 5 μl CldU (100 μM slutlig
- koncentration) till CldU-reservmediet och täck cellerna med CldU-reservmediet. Placera celler i inkubatorn under CldU-pulsen i 20 minuter.
- Tvätta cellerna med PBS, skrapa av eller trypsinisera i 3-4 minuter och tillsätt sedan 5 ml medium till plattan och samla cellerna.
- Snurra vid 264 x g i 4 min. Ta bort mediet och suspendera cellerna igen i 1 ml iskall PBS. Bestäm cellnumren med hjälp av en trypanblå analys (hemocytometerräkning) och späd sedan cellerna till ~ 200-400 celler / μL. Håll cellsuspensionen på is under cellräkningen.
OBS: Om möjligt, begränsa tiden cellerna sitter på isen. Detta kan hjälpa till att få en pärla av celllösning längs toppen av bilden. Om de hålls på is, håll dem på i mindre än 30 minuter.
- Dag 1: Beredning av DNA-fibrerna
- Märk diabilderna (glasskiva, 75 mm x 25 mm) med experimentellt tillstånd och datum med en penna.
- Ta 2 μL celler i en pipett, håll pipetten i ~45° vinkel, placera pipetten ca 1 cm under glasetiketten och flytta pipetten horisontellt till glasetiketten. När pipetten rör sig över objektglaset, släpp lite av celllösningen åt gången. Gör flera rader med celler på varje bild (kritiskt steg).
OBS: Det ska finnas en horisontell linje av cellsuspension över bilden. Om cellsuspensionen pärlar upp, tillsätt sedan 5-10 μL cellmedium till behållaren som har cellsuspensionen, eftersom detta kan hjälpa lösningen att fästa vid glaset när den appliceras igen. - Låt lösningen med cellerna avdunsta tills lösningen ser klibbig och klibbig ut. Vid denna tidpunkt är viss vätska associerad med cellerna, men inte mycket. Detta steg tar från 8-20 min och varierar beroende på hur mycket luftfuktighet som finns i luften.
OBS: Se till att all lösning inte har avdunstat, eftersom detta gör det mycket svårt att få raka och inriktade DNA-fibrer eftersom de flesta, om inte alla, DNA kommer att fastna ihop och inte kunna separera. - När lösningen är klibbig, täck över cellerna med 15 μL spridningsbuffert (lys) per varje cellrad, var försiktig så att pipettspetsen inte vidrör glaset. Vänta i 10 min. Luta bilden i 25° vinkel och placera etiketten på glaset horisontellt mot kanten på ett rörställ (den nedre delen av etiketten ska ligga i linje med kanten på rörstället).
- Låt DNA-spridningarna lufttorka i minst 4 timmar från det att de sista objektglasen gjordes.
OBS: En period på 4 h till 12 h är bra för torkning. Låt dem dock inte torka över natten. Om det får torka över natten kommer det att finnas mycket avslappnat DNA men väldigt få raka och inriktade DNA-fibrer.
- Dag 1: Fixering av DNA-fibrerna och frysning
- När objektglasen har torkat, fixera objektglasen med metanol:ättiksyra (3:1) genom att sänka ned objektglasen i 2 minuter. Utför detta steg under en huva och låt rutschkanorna torka över natten i ett område med begränsad ljusexponering, eller täck rutschbanorna med ett tennfolietält.
- Dag 2
- Placera objektglasen i en glasrutschkana. Placera objektglasen vid −20 °C i minst 24 timmar. Det här steget förbättrar bildens upplösning eller skarphet.
3. Utföra DNA-fiberanalysen
- Denaturering av DNA
- Förbered en fuktad kammare med små pipettspetslådor med lock. Fyll behållarna till hälften med vatten och placera dem i ett vattenbad på 37 °C i minst 1 timme.
- Ta ut glasen från −20 °C och tina dem i några sekunder. Placera glasen försiktigt i en Coplin -burk som innehåller avjoniserat (DI) vatten så att de belagda ytorna inte vidrör burkens väggar. Inkubera bilden i 20 s och häll sedan försiktigt ut vattnet.
- Tillsätt 2,5 M HCL i Coplin -burken så att den täcker alla bilder. Vänta i 80 minuter. Detta är ett kritiskt steg i protokollet. En ändring i tiden kan ändra resultatet av bilden.
- Tvätta objektglasen 1x med PBS plus Tween (PBS + 0,1 % Tween [slutlig koncentration]) och sedan 2x med PBS i 3 minuter vardera vid rumstemperatur (RT).
- Immunfärgning
- Håll glasen i den fuktade kammaren för följande steg. Blockera glasen i 5% BSA i PBS i 30 minuter vid RT och täck dem med täckglas, täckglas gjorda av en västerländsk fläckpåse eller genomskinliga plastark.
- Efter blockering, ta försiktigt bort täckglaset, ta bort blockeringslösningen och tappa bilden på en pappershandduk (knacka på bilden på handduken) för att ta bort överflödig blockeringslösning.
- Tillsätt 100 μl av den primära antikroppslösningen längs glaset. Lägg till ett nytt plastlock och vänta i 2 timmar. När du lägger till täckglaset, se till att inga bubblor bildas.
- Efter 2 timmar, slå av antikroppslösningen och skölj glasen i en PBS-fylld Coplin-burk 2x vid RT. Använd färsk PBS varje gång för att tvätta glasen.
- Blockera objektglasen igen genom att tillsätta 200 μL (tre till fyra droppar) 5 % BSA längs varje objektglas och lägg till ett plasttäckglas. Vänta i 15 minuter.
- Ta av täckglaset, slå av överflödigt BSA på en pappershandduk och tillsätt 100 μL av den sekundära antikroppslösningen längs glasets längd. Lägg till ett nytt plastlock och vänta i 1 timme.
- Ta av täckglaset, slå av överflödig BSA på en pappershandduk och tvätta bilderna 2x i PBS vid RT.
- Blockera objektglasen igen genom att tillsätta 200 μL (tre till fyra droppar) 5 % BSA längs varje objektglas och lägg till ett plasttäckglas. Vänta i 15 minuter.
- Om det behövs, ta bort täckglaset, ta bort överskottet av BSA på en pappershandduk och tillsätt 100 μL tertiär antikroppslösning längs glasets längd. Lägg till nya plastlocksglas och vänta i 30 minuter.
- Tvätta bilderna med PBS 3x. Ta bort överflödigt PBS och låt dem torka helt.
- När det är torrt, tillsätt monteringsmediet och placera försiktigt glastäcken (24 mm x 60 mm) över monteringsmediet så att bubblor undviks. Märk om bilderna och lämna dem i mörkret över natten.
4. Bildinsamling
- Visualisera de immunfärgade DNA-fibrerna med hjälp av ett immunofluorescerande mikroskop utrustat med en kamera, ett 60x mål och lämpliga filteruppsättningar för att detektera alexafluor 488 och 594 färgämnen.
- Ta bilder för analysen i regioner där fibrerna är väl separerade och inte intrasslade. Det är viktigt att ta bilder i olika områden längs bilden, eftersom bilder i endast en del av bilden kanske inte ger representativa data om alla replikeringsmellanprodukter som finns på bilden.
- Om möjligt, skaffa fiberbilder från 20 olika regioner på en bild. Använd endast en kanal för att välja områden för att ta bilder för att undvika partiskhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När du har fått tillräckligt med bilder (från 20–100 bilder per villkor) måste replikeringsintermediärerna identifieras, mätas och räknas. Oavsett om fibrerna analyseras manuellt eller automatiskt via ett program38, är det nödvändigt att tydligt definiera vilka egenskaper en fiber måste ha för att den ska räknas eller poängsättas (eller inte räknas eller mätas)39. Till exempel kan följande frågor övervägas. (1) Ska man mäta och räkna endast fibrer med 100% immunofluorescens i hela fibern, eller kan de innehålla vissa regioner utan immunofluorescens (t.ex. ska alla intermediärer i figur 4Ai, ii, iii analyseras eller bara en delmängd av dem?)? Om du analyserar fibrer med signalförlust, vad är den maximala signalförlusten som är acceptabel i en fiber, och vad är det maximala antalet kontinuerliga pixlar i fibern som kan sakna någon signal (t.ex. skulle figur 3Aiv betraktas som en rödgrön eller endast röd mellanprodukt?)? (2) Vad ska minsta och maximala fiberbredder/fiberlängder vara? (3) Vad ska signal-brusförhållandet (S: N) vara när man bestämmer om man ska mäta en fiber eller inte (t.ex. hur många fibrer ska väljas i figur 4B för att analysera?)? (4) Hur nära bildkanten måste en fiber vara innan den inte räknas eller mäts? (5) Om en fluorescerande signal är gul, räknas den som röd eller grön (t.ex. ska den gula delen av replikationsintermediären i figur 4C räknas som röd eller grön?)? (6) Hur länge måste ett färgsegment vara för att räknas som en sann signal (t.ex. är replikationsintermediären i figur 4D ett spår med endast grönt, ett grönt-röd-grönt spår eller ett grön-rött spår?)? (7) Om du använder ett automatiserat fiberanalysprogram, hur säkert är programmet i mätningen / räkningen som det just har utfört? (8) Om fibrerna analyseras manuellt, hur konsekvent ska analysen vara över tid och mellan individer?
Vanligtvis är parametrarna som används för DNA-fiberanalys följande:
Signal-brusförhållande: 3 (fiberintensiteten är tre gånger större än bakgrundsintensiteten)
Fibertjocklek: ≤8 pixlar i bredd
Minsta storlek: endast röd eller grön och 10 pixlar; rödgröna spår med varje segment ≥10 pixlar; röd-grön-röd eller grön-röd-grön spår med varje segment ≥10 pixlar.
Kontinuitet i den fluorescerande signalen: minst 80% och inga luckor i signalen större än 6 pixlar.
Förtroende för bedömning: konfidensvärden ska likna varandra i en bild och mellan bilder.
Förutom de ovan nämnda parametrarna är ett annat viktigt kriterium valet av en klar fiber som inte överlappar andra fibrer under avbildning och analys.
Figur 5A visar representativa bilder av kontroll (figur 5Ai) och grafenoxidnanopartikelbehandlat makrofag-DNA (figur 5Aii,iii). Bilden visar en ökning av skrivskyddade spår (avslutningar) och en minskning av nyavfyrade ursprung i de grafenoxidbehandlade cellerna jämfört med kontrollen (figur 5C). Det är också viktigt att överväga antalet bilder och positionen för bilden från vilken bilderna tas. Som visas i figur 5Aiii,C observerades en variation i mönstret för replikationsintermediärer (en ökning av nya ursprung jämfört med kontroll) i en annan region med samma tillstånd. Även om några av dessa observationer kanske inte påverkar det övergripande resultatet, måste man vara noga med att avbilda bilden genom att inkludera alla representativa områden. Det skulle vara idealiskt att dela upp bildens totala yta i fem till sex regioner och ta flera bilder från varje region (exempel: 10 bilder) för att hitta avgörande fiberdata för varje bild. Det är idealiskt att välja cirka 500 mellanprodukter (figur 5B) från flera bilder / förhållanden. Med dessa variationer i replikation kan mellanliggande kvantifiering från DNA-fiberanalys användas för att undersöka variationen i DNA-replikationsdynamik orsakad av grafenoxidnanopartiklar eller genotoxiciteten hos andra nanomaterial. Därför kan både en kvalitativ och kvantitativ förståelse av dynamiken i genomomfattande DNA-replikation erhållas genom denna nya metod jämfört med andra analyser som nämns i inledningen.
Figur 1: DNA-fiberanalys. Schematisk representation av analysen med en översikt över de viktigaste stegen i DNA-fiberanalysen. Skala: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Immunfärgning av DNA-replikationsintermediärerna. Schematisk representation av olika replikationsintermediärer identifierade genom sekventiell pulsmärkning med IdU (röd) och CldU (grön). Skala: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exponering för nanopartiklar. Olika metoder för att studera variationer i nanopartikelinducerad DNA-skada. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Egenskaper hos DNA-fibrer som ska poängsättas. Exempel på replikeringsintermediärer i en bild. (A) Luckor i immunofluorescens; i) 0 % immunofluorescenssignalförlust över replikationsintermediären; (ii) ~ 7% signalförlust; (iii) 50% signalförlust; och (iv) >90% signalförlust. (B) En region med många överlappande replikeringsintermediärer (pilen anger regionen med tydlig fiberöverlappning). (C) En DNA-fiber med ett gult område. (D) En replikationsintermediär öppen för tolkning (pilen indikerar luckorna i fibern). Skala: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: DNA-fiberanalys och tolkning. (A) Representativa DNA-fiberbilder från (i) kontrollmakrofagceller och (ii,iii) makrofagceller behandlade med nanopartiklar i 20 minuter vid en koncentration på 25 μg/ml. Bilder ii och iii togs från olika regioner på bilden. (B) Representativ automatiserad programvaruanalys av kontroll- och nanopartikelbehandlade tillstånd. För denna analys använde vi det automatiserade DNA-fiberspårnings- och mätprogrammet som utvecklats av Wang et al.38. Siffrorna i figuren visar antalet analyserade DNA-spår. (C) Grafisk representation av programvaruanalysen av kontroll- och nanopartikelbehandlade förhållanden. NP representerar nanopartiklar. Den relativa procentandelen av den mellanliggande populationen (till exempel endast för rött) beräknas utifrån de totala intermediärer som analyserats. Om man jämför NP-behandlad bild 1 med bild 2 är det stora skillnader mellan de två bilderna. Därför är det viktigt att få många bilder i hela bilden för att förstå hur ett experimentellt tillstånd påverkar replikeringsprocessen. Förkortningar: R = röd; G = grön. Skala: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Mediernas sammansättning |
| 10% fetalt bovint serum |
| 1% Penicillin-streptomycinlösning (10000 enheter/ml) |
| 1% L glutamin (200 mM) |
| Dulbeccos modifierade örns medelhöga glukos |
Tabell 1: Mediasammansättning som används för makrofagcellkulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi diskuterar här en metod för att hjälpa till med analysen av variationen i DNA-replikationsdynamik i närvaro av nanopartiklar genom DNA-fiberanalysen. Viktiga kritiska steg som ingår i standardtestet beskrivs i protokollet (steg 2.2.2 och steg 3.1.3). Det rekommenderas alltid att använda ett område med begränsad exponering för takljus och konstant luftflöde för att förhindra ljusinducerade DNA-brott i objektglasen samt för att förbättra reproducerbarheten. Noggrann uppmärksamhet krävs på tidslängden för torkning av celllysatet på objektglasen. Övertorkning kommer att påverka fiberspridningen negativt. Det andra kritiska steget är fiberdenaturering med en syralösning. Syratvättens varaktighet bör hållas lika för alla bilder i samma experiment. Felsökning för dessa två steg för att hitta optimala förhållanden (lyseringstid, lysatvolym på objektglaset, torktid och syratvättid) rekommenderas för olika celltyper och laboratoriemiljöer.
Som diskuteras i figur 3 kan exponeringstiden för nanopartiklar varieras för kvantitativ bestämning av förändring i DNA-replikationsdynamik inducerad av nanopartiklarna. För att bestämma den initiala effekten av replikationsdynamik skulle en kortvarig exponering såsom 1 min, 20 min eller 30 min med olika doser vara lämplig. Skillnaden i replikationsmönster (som visas i figur 2) efter långvarig exponering av cellerna för nanomaterialen kan bestämmas genom att jämföra mönstren för IdU- och CIdU-exponering (20 min vardera) före och efter nanopartikelbehandlingen. Detta tillvägagångssätt kan användas för att bestämma gaffelstopp, gaffelbromsning och skillnad i ursprungsbränning vid olika exponeringstidpunkter, vilket kan tolkas som effekterna av akut och kronisk exponering för nanomaterial39,40.
Det finns flera lovande tekniker tillgängliga för att detektera variationen i DNA-replikation, såsom DNA-kamning och RDS-metoden; I jämförelse med dessa metoder är emellertid DNA-fiberanalysen bekväm och kostnadseffektiv utan behov av dyra instrument för analys41. Begränsningarna med denna metod är den experimentella varaktigheten, den tid som krävs för att ta tillräckligt med bilder för kvantifiering samt mjukvaruanalysen. Detta tillvägagångssätt kommer dock säkert att stödja nanotoxikologisk forskning för att bestämma den genomiska instabilitet som orsakas av partiklar i cellinjer, liksom i olika vävnadsprover och mellan olika arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från Blazer-stiftelsen, Medical Biotechnology Program vid Biomedical Sciences, UIC Rockford och Institutionen för hälsovetenskaplig utbildning, UIC Rockford. Författarna tackar Ananya Sangineni och James Bradley för deras bidrag till projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
| CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
| Rat anti-BrdU | Abcam | BU1--75(ICR1) | |
| Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
| Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
| Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
- Gambus, A.
- Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
- Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
- Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
- Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
- Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
- Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
- Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
- Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
- Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
- Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
- Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
- Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
- Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
- Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
- Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
- Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
- Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
- Brayner, R.
- Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
- Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
- Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
- Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
- Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
- Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
- Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
- Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
- Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
- Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).
